專利名稱：胰高血糖素樣肽-1的類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)的類似物的多肽，該多肽具有降低血糖作 用，可用于治療2型糖尿病。本發(fā)明還提供了通過化學(xué)合成和重組DNA生產(chǎn)工藝生產(chǎn)這些 多肽的方法。
背景技術(shù)：
糖尿病已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后嚴(yán)重危害人類健康的第三大慢性病。隨 著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率逐年增加并演變?yōu)槭澜绶秶鷥?nèi)爆發(fā)流行的疾病， 而且有擴(kuò)大化和年輕化的傾向。隨著病程的進(jìn)展，患者會出現(xiàn)多種并發(fā)癥，如失明、腎功能 衰竭、肢體壞疽、心血管疾病和腦血管意外等。美國估計(jì)有二千零八十萬糖尿病患者，并還 在不斷增加，其中已經(jīng)診斷的約為一千四百六十萬，而六百二十萬患者尚未被診斷，每天新 診斷患者逾4100例。世界上糖尿病患病率增長最快的國家是中國(68%)和印度(59%)， 印度和中國的糖尿病人數(shù)位居世界前兩位，我國已跨入糖尿病中等患病率國家(3-10% ) 行列。根據(jù)糖尿病患病率資料估算，目前中國大約有3000-4000萬的糖尿病人，其中2型糖 尿病占90 %以上。我國城市人口中，成年人糖尿病發(fā)病率在年齡標(biāo)準(zhǔn)化后已達(dá)9. 7 %。2003 年，IDF衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)專門小組的研究人員估計(jì)全球每年的糖尿病醫(yī)療保健費(fèi)用在1530億一 2870億國際美元之間。世界各國糖尿病患者人數(shù)逐年增多，現(xiàn)在中國有5000萬，印度6000 萬，美國1800萬，日本600萬，全球已達(dá)2. 2億患者。糖尿病患者分為兩種，一是胰島素依 賴型糖尿病(1型糖尿病)和非胰島素依賴型糖尿病0型糖尿病)。其中，2型糖尿病占糖 尿病患者的90%以上。2型糖尿病患者表現(xiàn)了許多特征，如β -細(xì)胞減少，餐后胰島素分泌量不足，胰島 素分泌時(shí)間滯后，空腹及餐后血糖增高，糖化血紅蛋白HbAlc升高，胰島素抵抗等。根據(jù)美國UKPDS對2型糖尿病患者的多年跟蹤研究報(bào)告指出目前6類藥物對2型 糖尿病患者皆不能逆轉(zhuǎn)糖尿病進(jìn)程，不能遏制胰臟β細(xì)胞的不斷進(jìn)行性的凋亡，也不能阻 止糖尿病的并發(fā)癥如冠心病、腎功能衰竭的發(fā)生和發(fā)展，改變糖尿病患者預(yù)后。因此需要研 究新的2型糖尿病治療藥物。Exendin 4 禾口 Exendin 3 是南美產(chǎn)巨蜥蜴(Gila monster, Heloderme Su spec turn) 的唾液中分泌的兩種多肽，其中Exendin 4由39個(gè)氨基酸殘基組成，化學(xué)合成品作為抗2 型糖尿病藥物，2005年獲美國FDA批準(zhǔn)，商品名為Byetta，2009年中國上市。Exendin 4能促進(jìn)胰島素原的合成，促胰島素分泌，降低空腹、餐后血糖，當(dāng)血糖正 常之后不再繼續(xù)作用，因而不易產(chǎn)生低血糖昏迷、休克，安全性高。它能降低HbAlc，增加胰 腺β細(xì)胞數(shù)量及體積，增加2型糖尿病患者胰島素受體的敏感性，抑制胰高血糖素分泌等 作用。每日注射2次，每次5-10ug。但也存在不足，ExendiM來源于巨蜥蜴，而GLP-I是人的 內(nèi)源物質(zhì)，臨床試驗(yàn)報(bào)告Exendin 4有52%的患者產(chǎn)生抗體(Diabetes (1997) 46，433-439 ； Diabetes Care(2002) 25, 330-336 ；JAMA(2002) 287,373-379 ；Diabetes (1995)44, 1249-1258 ；Diatetes (2002) 512796-2803 ；Diabetes Care(2000) 2364-69 ；N.Engl.J. Med(2002)346，393-463 ；Lancet(1998)352,837-853)。雖然GLP-I和Exendin 4及其類似物被認(rèn)為是潛在的治療2型糖尿病的理想藥 物，但要真正實(shí)現(xiàn)其臨床應(yīng)用價(jià)值，尚存在不少有待解決的問題。主要有1.半衰期GLP-1 屬于人源多肽，半衰期太短，只有3-5分鐘；2.免疫源性Exendin 4由39個(gè)氨基酸組成，肽 鏈比GLP-I多9個(gè)氨基酸，會產(chǎn)生抗體引起過敏反應(yīng)。3. Exendin 4因?yàn)殡逆溳^長，其對胰 腺的刺激可能與胰腺炎有關(guān)。4.生產(chǎn)現(xiàn)已上市的Exendin 4類似物Exenatide為全合成 產(chǎn)物，價(jià)格昂貴，GLP-I 400$/mg，Exendin4 達(dá) 700$/mg。GLP-1 及 Exendin 4 化學(xué)合成會產(chǎn) 生一系列問題低產(chǎn)量，高價(jià)格，復(fù)雜的純化過程，雜質(zhì)殘留，生產(chǎn)過程中使用的有機(jī)溶劑和 化學(xué)品對環(huán)境造成污染。4. Novo Nordisk的Liraglutide是GLP-I的長效脂肪酸酰化后產(chǎn) 物，每天只需一次，但DPPIV酶位點(diǎn)仍存在，降糖效果差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)GLP-I和Exendin 4的效能及其內(nèi)在獨(dú)特的血糖依賴 性作用機(jī)制使其更適宜被制成緩釋制劑。我們在天然GLP-I和Exendin 4的基礎(chǔ)上，適 當(dāng)改變結(jié)構(gòu)，延長GLP-I的半衰期，將Exendin 4末端的3個(gè)氨基酸接在GLP-I末端，而以 His-Gly (1-2)作為肽鏈結(jié)構(gòu)的N-端以對抗DPPIV酶的水解，使其接近人源的GLP-1，減少 免疫源性帶來的副作用，比Exendin 4更接近天然的GLP-1，副作用更小。長鏈脂肪酸的酰 化衍生物屬于中長效藥物。這個(gè)結(jié)構(gòu)既能適應(yīng)基因工程的大量生產(chǎn)，大幅度降低成本，又保 持母體的生物活性。能適應(yīng)廣大2型糖尿病患者的需要。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，及其肉豆蔻酸衍生物而仍具有降血糖活 性的胰高血糖素樣肽-1 (簡稱GLP-1)類似物。本發(fā)明的的GLP-I類似物，其結(jié)構(gòu)式為GLP-I (1-33) 110His-Gly-Gly-Glu-Gly-Thr-Xl-Ile-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gl n-Ala-20Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-X2-X3-Gly-Pro-Pro-X4其中X1= Phe 或 Tyr ；X2 = Val 或 LysX3 = Gln 或 GlyX4 = Arg 或 OH 或 NH2。優(yōu)選地，Xl為 Phe 或 Tyr ；X2 為 Val 或 Lys ；X3 為 Gln 或 Gly ；X4 為 Arg, OH 或 NH2。本發(fā)明的另一方面提供了含有上述GLP-I類似物的藥物組合物，該組合物含有一 種或多種具有上述結(jié)構(gòu)式的化合物和一種藥學(xué)上可接受的稀釋劑或賦形劑，優(yōu)選的該組合 物為單位劑量形式，如片劑、丸劑、膠囊(包括持續(xù)釋放或延遲釋放形式)、粉劑、顆粒、酏 劑、酊劑、糖漿和乳液，消毒的注射用溶液或懸液，氣霧劑或液體噴劑，滴劑、針劑、自動(dòng)注射 裝置或栓劑。例如，以片劑或膠囊的形式口服給藥，上述活性藥物組分可以與一種口服的無 毒的藥學(xué)可接受的惰性載體，如乙醇、甘油、水及其類似物結(jié)合。另外，本發(fā)明還提供了上述 化合物及藥物組合的在制備治療疾病中的用途，優(yōu)選的該疾病是2型糖尿病。
本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了制備上述GLP-I類似物及衍生物的基因工程方法。對 于X4為Arg的上述化合物，可以用基因工程方法來合成，還可以通過化學(xué)方法來合成，但優(yōu) 選用基因工程方法來合成。。本說明提供一個(gè)GLP-I的33個(gè)氨基酸多肽衍生物。使其肽鏈長度與人源GLP-I相 近，降低其免疫源性。結(jié)構(gòu)中以His-Gly作為肽鏈結(jié)構(gòu)的N-端以對抗DPPIV酶的水解，將 Exendin-4末端的3個(gè)氨基酸接在GLP-I的C-末端，使肽鏈足夠長，以延長GLP-I的半衰 期，肉豆蔻酸酰化衍生物降糖效果明確，保持中長效的降糖時(shí)間，減少反復(fù)注射的痛苦。另 外本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，大量生產(chǎn)該多肽的工藝，能降低成本，為廣大2型糖尿病患者 提供一個(gè)新的治療藥物。


圖1是GLP-I類似物基因片斷的串聯(lián)圖；圖2是GLP-I降血糖作用的測定；
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一用基因工程方法生產(chǎn)GLP-I類似物材料GLP-I 類似物EcoRI Bgl II Arg His Gly Gly Glu Gly Thr Phe lie Ser Asp Val Tyr Leu^_ ^_ CGT CAC GGC GGC GAA GGC ACC TTC ATC AGC GAT GTT AGC CTGGlu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Gln Gly ProGAA GGC CAG GCG GCG MA GAA TTC ATC GCG TGG CTG GTT CAG GGC CCGGGATCC TAG <=>BamH I Sal I(1)根據(jù)GLP-I類似物的氨基酸序列及相應(yīng)DNA(正鏈)序列，合成DNA片段5 ‘ GGAATTCCAGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAG GCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCCTAGGTCGAC 3'下面是設(shè)計(jì)的引物
C05A--1CCAATGGAATTCCAGATCTCGTCACGGC
C05A--2TGAAGGTGCCTTCGCCGCCGTGACGAGATCTGG
C05A--3GGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAG
C05A--4CCTGGCCTTCCAGGTAGCTGCTCAGATCGCTGG
C05A--5CTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCG
C05A--6CCGTTAACCAGCCACGCGATGAACTCTTTCGCCG
C05A--7CGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGA
C05A--8CCAATGTCGACCTAGGATCCACGCGGCGGG
(2)按PCR常規(guī)方法，合成GLP-I類似物基因，經(jīng)EcoR I/Sal I雙酶切后，克隆到 含Lac啟動(dòng)子質(zhì)粒中，測定DNA序列與設(shè)計(jì)完全一致。(3)參見圖1，按圖示方案將GLP-I類似物基因進(jìn)行串聯(lián)，得到含8個(gè)拷貝基因的 質(zhì)粒。測定DNA全序列，符合設(shè)計(jì)，轉(zhuǎn)化E. coli JM109，構(gòu)建基因工程菌。8個(gè)串聯(lián)后的序列GGAATTCCAGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCC AGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTC ACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCG TGGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGT TCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGC AGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCTCGTCACGG CGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGG TTAACGGCCCGCCGCGTGGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGC CAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTT CACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGC GTGGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAG TTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCCTAGGTCGAC實(shí)施例二 GLP-I類似物的制備(A)GLP-I類似物基因工程菌接種于300ml X 2瓶LB培養(yǎng)基中，加氨芐西林 (Ampicillin)使其最后濃度為50 μ g/ml，37 °C，搖床培養(yǎng)過夜(150rpm)。第二日轉(zhuǎn)至 20L New Brimswik發(fā)酵罐培養(yǎng)，培養(yǎng)液組成為M9培養(yǎng)液，加葡萄糖濃度1%，氨芐西林 (Ampicillin)濃度為50 μ g/ml，通氣量為20L/min，溶氧維持在20%以上，防泡劑為國產(chǎn)泡 敵，PH維持在7 8，用氨水調(diào)節(jié)。當(dāng)菌體濃度達(dá)log曲線中線，加IPTG，濃度為0. 5mM，繼 續(xù)發(fā)酵4 6小時(shí)，離心收集菌體為濕重30 50g/L。(B)收集的菌體用pH 7. 0 Tris緩沖液20mM勻漿，之后加溶菌酶lg/L，37°C保溫 1小時(shí)，冷凍_20°C過夜，超聲破碎3次，每次1分鐘左右，離心收集沉淀，2M Urea打碎洗滌 1次，再打碎水洗1次。(C)分離、純化包涵體沉淀溶于8M尿素，分子篩kphadex G-100 A280nm檢測， 透析過夜，DEAE pH8. 0-9. 0梯度洗脫，蛋白電泳確定目標(biāo)蛋白。(D) 二羧酸溶解，pH7. 5條件下加入1 2%。高純度豬胰蛋白酶37°C攪拌2 3小 時(shí)，HPLC追蹤。完成酶解反應(yīng)后以蠕動(dòng)泵30000分子量超濾除去胰蛋白酶。(E)制備型HPLC純化。(F)冷凍干燥獲得產(chǎn)品。實(shí)施例三肉豆蔻酸酰化的GLP-I類似物的衍生物制備(A)取GLP-I類似物的融合蛋白IOg溶于IOOml水中，加鹽酸胍使其最終濃度為 5M，45°C保溫過夜。(B)稱取肉豆蔻酸(Maristic acid) 1. 14g，N-羥基琥珀酸亞胺(N-hydroxysuccinimide) 0. 6g, N, N，- 二環(huán)己基碳酰亞胺(DCCI) 1. 03g 溶于 50ml 二氧六 環(huán)(dioxane)中，室溫?cái)嚢瑁?小時(shí)后，過濾除去脲素衍生物，取清液20ml加入㈧中，加 100 μ 1四甲基胍(Tetrameltyl-guanidine)，室溫激烈攪拌下反應(yīng)4小時(shí)后用2N HCl調(diào)至 PH 3-4，SOOOrpm離心，將沉淀用乙醇洗滌2次，將脂肪酸?；腉LP-I類似物溶于水中，以 碳酸氫鈉粉末調(diào)至pH7 8，按重量的1 2%。加高純度豬胰蛋白酶37°C攪拌反應(yīng)2 3小 時(shí)，HPLC追蹤。制備型HPLC純化。冷凍干燥獲得產(chǎn)品。實(shí)施例四GLP-I類似物降血糖作用的測定，參見圖2。C57BL/6的8周齡小鼠，禁食過夜(只給飲水)對照組、GLP-Ianalog 組每組4只，腹腔注射藥物一次，GLP-I類似物為2 μ g/小鼠，然后注射30%葡萄糖 溶液300 μ 1，每2小時(shí)注射一次葡萄糖，20分鐘后眼眶旁取靜脈血5 μ 1，以葡萄糖氧化酶 試紙測定快速血糖，圖2結(jié)果表明GLP-I類似物的降血糖作用明確，有效持續(xù)時(shí)間8小時(shí)以 上。
權(quán)利要求
1.胰高血糖素樣肽-1(簡稱GLP-1)的類似物，其結(jié)構(gòu)式為 GLP-I(1-33) 1 10His-Gly-Gly-Glu-Gly-Thr-Xl-Ile-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GIu-Gly-Gln-Ala-20Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-X2-X3-Gly-Pro-Pro-X4 其中=X1 =Phe 或 Tyr ； X2 = Val 或 Lys X3 = Gln 或 Gly X4 = Arg 或 OH 或 NH2。
2.如權(quán)利要求1或2所述的GLP-I類似物，其中，肽鏈長度為33個(gè)氨基酸。
3.權(quán)利要求1或2所述的GLP-I類似物，其中，Lys21的ε( ε 印silon的縮寫)-NH2 可以經(jīng)肉豆蔻酸(C-14羧酸)?；?br> 4.權(quán)利要求1或2所述的GLP-I類似物，其中，所述的X4是Arg或OH或_NH2。
5.一種含有如權(quán)利要求1所述的GLP-I類似物的藥物組合物，其進(jìn)一步含有藥學(xué)上可 接受的稀釋劑、賦形劑或載體。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中，所述的載體選自于如下一組物質(zhì)乙醇、甘 油和水。
7.如權(quán)利要求1所述的GLP-I類似物，其用途為用于制備治療糖尿病的藥物，其中， 所述的糖尿病是2型糖尿病。
8.如權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物，其用途為用于制備治療糖尿病的藥物，其 中，所述的糖尿病是2型糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明提供了胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的類似物及含有該GLP-1類似物的藥物組合物，多肽(1-33)藥物，該多肽與天然GLP-1相比，在C一端增加3個(gè)氨基酸，在N-端改變結(jié)構(gòu)為His-Gly(1-2)，具有降低血糖作用，可用于治療2型糖尿病，能對抗DPPIV酶的水解作用，作用時(shí)間可以延長，結(jié)構(gòu)接近人源GLP-1。本發(fā)明還提供了含有該多肽的藥物組合物和通過化學(xué)合成和重組DNA進(jìn)行生產(chǎn)。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，大量生產(chǎn)該多肽的工藝，能降低成本，為廣大2型糖尿病患者提供一個(gè)新的治療藥物。
文檔編號A61K38/26GK102093475SQ200910200399
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者吳曉琰, 孫玉琨 申請人:上海捷辰生物科技有限公司, 吳曉琰, 孫玉琨