專利名稱：類胰高血素肽－1融合蛋白及其制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地說，涉及用于治療非胰島素依賴型糖尿病及肥胖癥的長效類胰高血糖素肽-1融合蛋白、其制備方法、包含該胰高血糖素肽-1融合蛋白的藥物組合物及其用途。
背景技術(shù)：
1.糖尿病隨著現(xiàn)代人類勞動強度顯著下降和飲食習慣的改變，糖尿病的發(fā)病率迅速上升，據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計，全世界有糖尿病患者1.25億，平均每分鐘就有6人因患糖尿病死亡，糖尿病造成的死亡，已居當今世界死亡原因的第五位。糖尿病通常分為I型糖尿病和II型糖尿病兩種。I型糖尿病，約占糖尿病病人總數(shù)的10％，常發(fā)生于兒童和青少年，病因是患者體內(nèi)胰腺產(chǎn)生胰島素的細胞已經(jīng)徹底損壞，從而完全失去了產(chǎn)生胰島素的功能。患者需依靠外源胰島素存活，一旦中止胰島素治療則威脅生命。II型糖尿病，約占糖尿病病人總數(shù)的90％，發(fā)病年齡多數(shù)在35歲以后。II型糖尿病，即非胰島素依賴型糖尿病的確切發(fā)生機制，目前仍無定論；但推測可能受遺傳及飲食失節(jié)、缺乏運動、形體肥胖、情志失調(diào)、化學藥物等的影響，逐漸形成的一種內(nèi)分泌失衡之疾病。主要根源于胰島之β細胞受損，致胰島素分泌不足；或是胰島受體障礙而不能正常利用胰島素；甚有報告指出α細胞所分泌之高血糖素相對太高亦是原因之一。II型糖尿病(NIDDM)在美國、瑞典、日本、智利、阿根廷等國患病率約5％～7％，西歐、東歐、蘇聯(lián)、加拿大、澳大利亞等國患病率約為2％～5％，印度、菲律賓等國患病率約為1％～4％，不同種族之間有差別，城市高于農(nóng)村。據(jù)估計目前全世界約有糖尿病患者1億2千萬，美國約有糖尿病人1600萬，中國糖尿病人約有3000萬。據(jù)WHO最新數(shù)據(jù)預測，到2010年中國糖尿病人將達到目前的4倍，亞洲及非洲的糖尿病人將是目前的3倍，全世界將會有2.4億糖尿病患者，同時糖尿病人群的發(fā)展正趨于低齡化。因此防治糖尿病已是一個迫不及待的緊急任務(wù)。
2.肥胖癥肥胖，特別是上身肥胖，是世界上營養(yǎng)過剩的人群當中最常見的營養(yǎng)紊亂。大量研究證實，減輕體重可大大降低慢性疾病的危險，所述慢性疾病如糖尿病、高血壓、高脂血癥、冠心病和肌骨骼病。減輕體重是許多慢性疾病治療的一個具體目標。
目前幫助減輕體重的方法均不能讓人完全滿意。某些肥胖癥患者可通過刻意調(diào)整行為來減輕體重，如改變飲食和增加運動，通過這些方法未能減輕體重可能是由于某些遺傳因素，它們引起食欲增加，導致偏好高脂食物或脂肪生成代謝紊亂的傾向。不幸的是，每年用于減輕體重的措施上花費估計有330億元，而這些措施中大部分沒有效果。因此，急需幫助減輕體重的新方法和組合物(如藥物)來補充舊的方法。
3.類胰高血素肽-1類胰高血素肽-1(Glucogan Like Peptide 1，簡稱GLP-1，)是一個含37個氨基酸的短肽，具有在血糖濃度較高情況下促進胰島素分泌的功能。GLP-1在調(diào)節(jié)高血糖中的一個優(yōu)勢是其本身受血糖水平的調(diào)節(jié)，在高血糖時活性增加，而低血糖時則相應(yīng)降低，因此GLP-1在調(diào)節(jié)高血糖時不會產(chǎn)生低血糖副作用。又因GLP-1(7-36)酰胺可以抑制食欲，減緩胃液分泌和胃排空(Nauck，1993；Gutniak et al，1992)，所以也可將其作為控制體重的藥物。根據(jù)這些特點，GLP-1受到廣泛重視，期望能開發(fā)成治療糖尿病和肥胖癥的新一代藥物。但是大量的研究表明，GLP-1無法作為藥物在臨床中使用，原因是GLP-1非常不穩(wěn)定，在人體內(nèi)會迅速降解，在血清中的半衰期只有1-2分鐘，因此無法發(fā)揮其生物學功能。所以，開發(fā)出生物利用度更好的GLP-1類似物，是GLP-1研究領(lǐng)域所面臨的挑戰(zhàn)。
研究表明，一些GLP-1的衍生物和類似物具有更好的生物活性和穩(wěn)定性，這些被稱為GLP-1化合物。例如，Amylin公司的Exenatide/Exendin-4，每天注射2次可改善血漿葡萄糖水平，同時在24周后體重也減少3.4kg。但是Exenatide/Exendin-4也有其缺點，主要是副作用較強，會導致惡心、嘔吐、甚至休克等副作用。由于副作用強，目前Exenatide/Exendin-4的臨床劑量范圍非常窄，劑量也很小，需要每天注射兩次，很不方便。再有，HGS公司的Albugon，它是GLP-1和白蛋白的融合蛋白，它在猴子體內(nèi)的半衰期可達3天。然后是N Nordisk公司的NN2211(Liraglutide)，它是GLP7-37，但帶有一條與氨基酸26并連的16-碳脂肪酸尾，和一個碳終端突變。這條尾略微降低GLP-1的活性，但更重要的是，這個新GLP自我聯(lián)系和結(jié)合血漿白蛋白，致使血漿半衰期超過10小時。此外，該化合物抑制細胞因子介導的胰β細胞程序死亡?？偟脕碇v，目前開發(fā)的一些GLP-1類似物，表現(xiàn)了比GLP-1更好的生物活性和穩(wěn)定性。但是在此領(lǐng)域中，人們迫切希望開發(fā)一種活性更高、穩(wěn)定性更好而且副作用較低的用于治療糖尿病和肥胖癥的藥物。
4.白蛋白白蛋白是人血清中的主要蛋白組分，占血清總蛋白量的一半。人血清白蛋白由585個氨基酸組成，分子量為66KD。人血清白蛋白表現(xiàn)出多樣性，有30種變異分子。人血清白蛋白基因已經(jīng)被克隆(A.Drgaiczyk et al，PNAS，7971-75，1982)，并被成功地在多種體外表達系統(tǒng)中進行表達。
人血清白蛋白生物學功能不詳，但是其功能可能是多方面的。白蛋白在正常生理狀態(tài)下不易透過腎小球，在血清中的半衰期達14-21天，作為血清中的主要成分，其存在可能對維持血液的穩(wěn)定性有關(guān)鍵的作用。例如，大量白蛋白的存在可以保持血液的滲透壓，離子強度等的穩(wěn)定。同時，白蛋白由于具有較長的半衰期，也可以作為一種載體通過與血液中的其它因子，包括生物活性蛋白的結(jié)合，從而保持或延長其它因子在體內(nèi)的生物活性。
事實上，白蛋白作為一種藥物載體，在臨床上已經(jīng)獲得了應(yīng)用。使用白蛋白作為載體，既可以延長藥物的半衰期，也可以提高藥物的使用劑量。近年來，利用基因工程技術(shù)，將白蛋白與具有生物活性的蛋白分子進行重組表達的融合蛋白，已經(jīng)成為開發(fā)長效蛋白藥物的一個重要手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)一類具有高活性、高穩(wěn)定性、低副作用的類胰高血素肽，使之成為新一代治療糖尿病和肥胖癥的藥物。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供了一種分離的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽的N端或C端與第二多肽的N端或C端直接相連，其中所述第一多肽為多個類胰高血素肽-1以同一方向依次串聯(lián)而成的類胰高血素肽-1重復序列，所述類胰高血素肽-1具有以下的氨基酸序列(a)序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；
(b)相對于SEQ ID NO2所示的氨基酸序列有一個或多個氨基酸缺失、替代或插入且具有與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；(c)相對于SEQ ID NO2所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；其中所述第二多肽選自人血清白蛋白、免疫球蛋白、鐵蛋白、類固醇結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、α-2巨球蛋白和觸珠蛋白多肽。
在一個較佳的實施方案中，所述第二多肽選自人血清白蛋白多肽，所述多肽具有以下的氨基酸序列(a)序列表SEQ ID NO1所示的氨基酸序列；(b)相對于SEQ ID NO1所示的氨基酸序列有一個或多個氨基酸缺失、替代或插入且具有與SEQ ID NO1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；(c)相對于SEQ ID NO1所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有與SEQ ID NO1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。
本發(fā)明另一方面提供了一種分離的核酸序列，其特征在于，它具有編碼上述融合蛋白的核酸序列或其互補序列。
本發(fā)明另一方面提供了一種載體，其特征在于，它含有上述核酸序列。
本發(fā)明另一方面提供了一種宿主細胞，其特征在于，它被上述載體轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明另一方面提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明所述融合蛋白的方法，其特征在于，該方法包括(a)提供一宿主細胞，該宿主細胞包含一表達載體，該表達載體包含本發(fā)明所述的核酸序列以及與其操作性相連的表達調(diào)控序列；(b)在適合蛋白表達的條件下，培養(yǎng)步驟(a)所述的宿主細胞；(c)分離出所述融合蛋白。
本發(fā)明另一方面提供了一種用于治療非胰島素依賴型糖尿病和肥胖癥的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有本發(fā)明所述的融合蛋白以及藥學上可接受的載體。
本發(fā)明另一方面提供了本發(fā)明所述的融合蛋白在制備用于治療非胰島素依賴型糖尿病和肥胖癥的藥物中的用途。
本發(fā)明另一方面提供了本發(fā)明所述的融合蛋白在制備用于使哺乳動物血糖水平正?；乃幬镏械挠猛?。
本發(fā)明中的藥物通過融合多個GLP-1多肽重復序列和人血清白蛋白、免疫球蛋白、鐵蛋白、類固醇結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、α-2巨球蛋白和觸珠蛋白等蛋白，從而達到延長GLP-1在體內(nèi)的作用時間的目的。本發(fā)明使用遺傳工程技術(shù)，制備人GLP-1化合物長效融合蛋白。其長效效果主要通過兩種設(shè)計來實現(xiàn)。一是該融合蛋白中含有多個GLP-1化合物重復銜接，二是該融合蛋白含有在人血液中具有長半衰期的人血清白蛋白、免疫球蛋白、鐵蛋白、類固醇結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、α-2巨球蛋白和觸珠蛋白。通過生化以及細胞和動物實驗驗證，融合蛋白具有生物活性和生物功能，而且融合蛋白與天然GLP-1相比具有更好的穩(wěn)定性和體內(nèi)半衰期。
附圖簡述

圖1顯示了本發(fā)明所用表達載體質(zhì)粒圖譜。
圖2顯示了HSA/GLP-1融合蛋白表達的SDS-PAGE電泳結(jié)果。
圖3顯示HSA/GLP-1融合蛋白表達的Western印跡結(jié)果。
圖4表明HSA/GLP-1融合蛋白具有激活人GLP-1受體的生物活性。
圖5顯示了小鼠注射HSA和HSA/GLP-1前后的濃度。
圖6顯示了小鼠注射HSA和HSA/GLP-1后20分鐘后的血漿中胰島素含量。
具體實施方案本發(fā)明第一方面提供了一種分離的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽的N端或C端與第二多肽的N端或C端直接相連，其中所述第一多肽為多個類胰高血素肽-1以同一方向依次串聯(lián)而成的類胰高血素肽-1重復序列，所述類胰高血素肽-1具有以下的氨基酸序列(a)序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(b)相對于SEQ ID NO2所示的氨基酸序列有一個或多個氨基酸缺失、替代或插入且具有與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；(c)相對于SEQ ID NO2所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；其中所述第二多肽選自人血清白蛋白、免疫球蛋白、鐵蛋白、類固醇結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、α-2巨球蛋白和觸珠蛋白多肽。
在一個較佳的實施方案中，所述第二多肽是人血清白蛋白多肽，所述多肽具有以下的氨基酸序列(a)序列表SEQ ID NO1所示的氨基酸序列；(b)相對于SEQ ID NO1所示的氨基酸序列有一個或多個氨基酸缺失、替代或插入且具有與SEQ ID NO1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；(c)相對于SEQ ID NO1所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有與SEQ ID NO1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。
在本發(fā)明中，術(shù)語“分離的”在用于核酸或蛋白質(zhì)時，表示核酸或蛋白質(zhì)基本上不含其它在天然狀態(tài)下相關(guān)的細胞成分，其最好呈均質(zhì)狀態(tài)，但也可以是干的或水溶液。純度和均一性通?？捎梅治龌瘜W方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法來測定。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”或“多肽”可互換使用。它們指通過肽鍵或酰胺鍵連接在一起的兩個或多個氨基酸的鏈，無論是否經(jīng)過翻譯后修飾(例如，糖基化或磷酸化)。該定義范圍中特別包括抗體。本發(fā)明的多肽還可包含一個以上的亞基，每個亞基一條由分開的DNA序列編碼。
在該技術(shù)方案中，術(shù)語“第一多肽的N端或C端與第二多肽的N端或C端直接相連”是指這兩種多肽/蛋白質(zhì)分子間的連接無任何連接多肽，這避免了因不必要的連接肽可能導致的免疫原性。連接方式可以是以第一多肽的N-末端直接連接在第二多肽的C末端或N末端上，也可以是第一多肽的C-末端直接連接在第二多肽的C末端或N末端上。優(yōu)選連接方式是第一多肽的N-末端直接連接在第二多肽的C末端。
本發(fā)明融合蛋白中的“第一多肽”是類胰高血素肽-1(即GLP-1)重復序列，它由多個(較佳的為2-10個，更佳的為2-5個)類胰高血素肽-1單體以同一方向依次串聯(lián)而成。術(shù)語“類胰高血素肽-1單體”是相對于“重復序列”而言，其指單個類胰高血素肽-1多肽。術(shù)語“同一方向依次串聯(lián)”指每個GLP-1單體的N-末端直接連接在上一個多肽GLP-1單體的C-末端上，或者也可以是每一個GLP-1單體的C-末端直接連接在上一個GLP-1化合物單體的N-末端上。
本發(fā)明的術(shù)語“類胰高血素肽-1”和“人白蛋白多肽”的含義中不僅包括了具有如SEQ ID NO2(類胰高血素肽-1第7-36位氨基酸)和SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，而且還包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似生物活性或功能的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)相對于所述多肽的氨基酸序列有若干個(較佳地1-10個，更佳為1-5個，最佳為1-3個)氨基酸的缺失、插入和/或取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可發(fā)生在C末端和/或N末端(通常有20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi)的氨基酸缺失或增加)。在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。提供功能相似氨基酸的保守性置換表是本領(lǐng)域所熟知的。下列5組各自含有能相互保守置換的氨基酸脂族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)；芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；堿性精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H)；酸性天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另外，該術(shù)語還包括了類胰高血素肽-1和人白蛋白的片段或衍生物，較佳的是該片段或衍生物保留了所需的蛋白生物活性。
就類胰高血素肽-1而言，其“生物活性或功能”指的是激活類胰高血素肽-1受體、降低血糖和升高血漿胰島素等活性或功能。對于人白蛋白、免疫球蛋白、鐵蛋白、類固醇結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、α-2巨球蛋白和觸珠蛋白多肽而言，其“生物活性或功能”指的是延長類胰高血素肽-1體內(nèi)半衰期的功能。
上述變異形式還包括上述蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異和/或不影響序列的修飾形式上的差異。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。
本發(fā)明的術(shù)語“類胰高血素肽-1”和“人白蛋白多肽”還包括與其相同(同源)或基本上相同(同源)的多肽，例如，有至少60％、更佳70％、還要佳80％、90％、甚至95％以上的同源性或相同性的多肽。
在兩個或多個核酸或多肽序列的情況下，術(shù)語“相同”或“相同性百分數(shù)”是指，當比較和排列對比其最大一致性(用下列序列對比算法之一(或本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的其他算法)或目視觀察來測定)時，兩個或多個序列或亞序列相同，或具有指定百分數(shù)的相同氨基酸殘基或核苷酸。術(shù)語“基本上相同”是指，當比較和排列對比其最大一致性(用下列序列對比算法之一或目視觀察來測定)時，兩個或多個序列或亞序列具有至少60％、較佳的80％、最佳的90-95％的核苷酸或氨基酸殘基相同性。這樣的“基本上相同的”序列通常被認為是同源的。為了比較序列和確定同源性，通常將一個序列作為參比序列與測試序列比較。當用序列對比算法時，將測試和參比序列輸入計算機內(nèi)，指定亞序列坐標，如果需要，指定序列算法程序參數(shù)。然后，序列比較算法根據(jù)指定的程序參數(shù)計算測試序列相對于參比序列的序列相同性百分數(shù)。序列比較的最優(yōu)序列排列對比可采用例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)中的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)中的同源性排列算法、Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci(USA)852444(1988)中的相似性搜尋方法、這些算法的計算機化操作(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics軟件包，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)來進行。
具體地說，由如上所述的與SEQ ID NO2所示氨基酸序列有至少90％同源性、更佳有95％同源性的類胰高血素肽-1的多個重復序列以及與SEQID NO1所示氨基酸序列有至少90％同源性、更佳有95％同源性的人白蛋白多肽構(gòu)成的融合蛋白也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要該融合蛋白表現(xiàn)出所述類胰高血素肽-1活性半衰期延長、穩(wěn)定性好的效果。
在本發(fā)明的一個較佳實施方案中，本發(fā)明的所述融合蛋白具有選自下列的氨基酸序列(a)序列表SEQ ID NO3所示的氨基酸序列；(b)相對于SEQ ID NO3所示的氨基酸序列有一個或多個氨基酸缺失、替代或插入且具有與SEQ ID NO3所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；(c)相對于SEQ ID NO3所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有與SEQ ID NO3所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。
本發(fā)明另一方面提供了一種分離的核酸序列，其特征在于，它具有編碼上述融合蛋白的核酸序列或其互補序列。另外，本發(fā)明的核酸序列的范圍內(nèi)還涵蓋了與相同(同源)或基本上相同(同源)以下的核酸序列，如有至少60％、更佳70％、還要佳80％、90％、甚至95％以上的同源性或相同性的核酸序列。兩個核酸序列基本上相同/同源的另一個指標是兩個核酸序列在高度嚴謹條件下相互雜交。因此，本發(fā)明的核酸序列的范圍內(nèi)還涵蓋了在中度嚴謹條件下，更佳的在高度嚴謹條件下與本發(fā)明核酸序列雜交的核酸序列。
本發(fā)明的核酸序列通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，通常可通過重疊(overlapping)擴增，例如進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
本發(fā)明的融合蛋白可用固相技術(shù)通過直接合成肽而加以生產(chǎn)，也可以分別化學合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。在一個較佳的方案中，本發(fā)明的融合蛋白用重組方法來制備。具體地說，首先用常規(guī)手段克隆獲得編碼HSA多肽和GLP-1多肽重復序列的核酸序列。具體是從適當?shù)慕M織、細胞提取mRNA，通過RT-PCR獲得相應(yīng)的cDNA。也可以從適當?shù)腸DNA文庫直接獲得相應(yīng)的cDNA。還可以通過人工合成獲得。人工合成的核苷酸序列可適當進行密碼子的改變，以便在相應(yīng)的蛋白表達宿主中獲得表達蛋白的最佳效果。
隨后，將編碼HSA多肽的核酸序列與編碼GLP-1多肽重復序列的核酸序列連接起來。優(yōu)選的合成方法為Overlap PCR的方法合成。然后，上述重組核酸序列被克隆到表達載體質(zhì)粒中，使該核酸序列與表達調(diào)控序列操作性相連。本文所用的術(shù)語“表達調(diào)控序列”通常指參與控制核苷酸序列表達的序列。表達調(diào)控序列包括與目標核苷酸序列操作性相連的啟動子和終止信號。它們通常還包括核苷酸序列適當翻譯所需的序列。“操作性相連”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。
例如，如果啟動子或增強子增加了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列是操作性相連的。本發(fā)明選用的表達質(zhì)粒載體，包括適合在不同細胞宿主中表達融合蛋白的各種質(zhì)粒，優(yōu)選的質(zhì)粒是表達載體質(zhì)粒pYES3/CT(Novogen)，可以在市場上獲得。
然后，將上述表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到重組工程細胞宿主內(nèi)，從而構(gòu)建表達本發(fā)明融合蛋白的重組工程細胞宿主。這些重組工程細胞可以是來源于動物，植物，昆蟲，真菌，酵母，細菌等。質(zhì)粒pYES3/CT適合在酵母工程菌中表達融合蛋白，因此優(yōu)選的重組工程細胞宿主為酵母工程菌，更優(yōu)選的酵母工程菌為釀酒酵母工程菌BJ5457。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將含有感興趣的核酸的表達載體直接導入宿主細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化方法因宿主細胞類型而異，通常包括電轉(zhuǎn)化；采用氯化鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質(zhì)的轉(zhuǎn)染；微粒轟擊；脂轉(zhuǎn)染；感染和其它方法(見Sambrook等人的《分子克隆實驗指南》第2版，1989年)。較佳的方法是電轉(zhuǎn)化方法。
隨后，在適合本發(fā)明融合蛋白表達的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)試驗就能選擇和確定培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、時間等條件。采用本領(lǐng)域常規(guī)檢測手段，如SDS-PAGE，Western印跡等，可以檢測出本發(fā)明融合蛋白的表達。最后，可用常規(guī)的蛋白分離純化技術(shù)，進行融合蛋白的純化，其包括離心，沉淀，過濾，層析等手段。具體地，層析方法又包括親和法，凝膠過濾，離子交換，疏水層析，以及反向?qū)游龅?。本發(fā)明提供的本發(fā)明的融合蛋白的分離純化方法也包括上述各種方法的適當組合。
本發(fā)明也提供了一種鑒定HSA/GLP-1重復序列的融合蛋白的生物活性的方法。具體而言，本發(fā)明采用了HEK-293 Aurora CRE-BLAM體外測定方法對HSA/GLP-1融合蛋白進行活性測定。該方法具體是測定HSA/GLP-1融合蛋白激活GLP-1受體的能力，并與Exendin 4激活GLP-1受體的能力進行比較。HEK-293 Aurora CRE-BLAM是表達人GLP-1受體的細胞系，GLP-1及激動劑可誘導該細胞系產(chǎn)生cAMP，并通過一系反應(yīng)元件產(chǎn)生熒光，且產(chǎn)生的熒光強度與GLP-1及激動劑的活性呈正相關(guān)。
本發(fā)明還提供了測定本發(fā)明的融合蛋白體內(nèi)半衰期鑒定的方法。具體地，檢測方法包括測定融合蛋白在動物以及人類體內(nèi)的活性半衰期。動物包括但不限制于小鼠，狗，猴子。
本發(fā)明的融合蛋白可以用作藥物，以治療非胰島素依賴型糖尿病和肥胖癥等病癥。因此，本發(fā)明另一方面還提供了一種藥物組合物，該組合物含有藥學上有效量的本發(fā)明融合蛋白以及藥學上可接受的載體。術(shù)語“藥學上可接受的”是指當分子本體和組合物適當?shù)亟o予動物或人時，它們不會產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)。本文所用的“載體”應(yīng)當與本發(fā)明的融合蛋白相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低藥物組合物的藥效。可作為藥學上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。
本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)需要制成各種劑型(如注射劑、片劑、膠囊劑、噴霧劑、顆粒劑、散劑、鼻用制劑等)，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量，通過是注射，口服，鼻內(nèi)，呼吸道等方式進行施用。為了提高用藥效果，本發(fā)明的融合蛋白也可以與其他藥物，如用于治療非胰島素依賴型糖尿病和肥胖癥的藥物共同使用。
本發(fā)明另一方面還提供了本發(fā)明融合蛋白在制備用于治療非胰島素依賴型糖尿病和肥胖癥的藥物中的用途。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有描述，本發(fā)明的實施將采用分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下列文獻中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆實驗指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編輯，1984)；《核酸雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯.1984)；《蛋白質(zhì)純化原理和實踐》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《實驗免疫學手冊》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell編輯1986)。或者，可按照試劑生產(chǎn)商所提供的說明書進行。
實施例實施例1白蛋白基因克隆白蛋白基因可以通過RT-PCR獲得。首先取正常人外周血獲得人白細胞，并從中制備RNA。然后通過反轉(zhuǎn)錄方法獲得cDNA。再用PCR分子克隆技術(shù)擴增獲得白蛋白基因。具體說明如下首先制備總RNA。具體是取正常人外周血人白細胞，然后在白細胞中加入1ml Trizol試劑裂解細胞，再以氯仿和異丙醇進行抽提RNA，用乙醇進行洗滌，RNA便可以進行RT-PCR反轉(zhuǎn)錄了。
RT-PCR使用寶生物公司mRNA Selective PCR試劑盒。具體條件如下。
2xmRNA Selective PCR緩沖液I，25μl，MgCl2，10μl，dNTP/類似物混合物，5μl，RNase抑制劑，1μl，AMV RNase XL，1μl，Oligo dT引物，1μl，RNA，1μl，RNase Free dH2O，6μl。根據(jù)下列的程序進行反應(yīng)30℃，10min，42℃，30min，5℃，5min。合成的cDNA可以在-20℃保存。
也可以用常規(guī)的PCR方法擴增HSA基因。條件如下擴增HSA所用的引物為HSA引物1TTTAAGAAGTAAGGAAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATC(SEQID NO4)和HSA引物2CCCctcgag(XhoI)TTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT(SEQ ID NO5)。
反應(yīng)條件為人胚胎cDNA文庫，1μl；HSA引物1，2.5μl；HSA引物2，2.5μl；Premix Taq(Ex Taq)，25μl；ddH2O，19μl。
PCR根據(jù)下列的程序進行反應(yīng)。開始，94℃；5min；然后，94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，一共30個循環(huán)。最后，72℃，5min。
然后用常用的分子生物學方法，分離獲得HSA基因。具體是用1％的瓊脂糖膠電泳酶切產(chǎn)物，然后切下1800bp左右的目的條帶，再用博大泰克公司<<PCR產(chǎn)物快速膠回收試劑盒>>回收切膠產(chǎn)物。電泳檢測回收產(chǎn)物的粗濃度后-20℃保存。
實施例2GLP-1基因克隆GLP-1基因的克隆，是利用人工合成方法獲得的。以下以2XGLP(含兩個GLP的重復序列)的DNA合成進行說明。
首先，在保持氨基酸序列不變的情況下，兩段GLP分別進行人工合成。然后，使用PCR方法，用兩段GLP相互為引物PCR，合成2XGLP的DNA。具體條件如下兩段人工合成的GLP，10μl；10×pfu Buffer，5μl；dNTP混合物，2μl；pfu DNA Polymerase，0.5μl；ddH2O，32.5μl。然后，把加好樣品的PCR管放到PCR儀的96孔中，根據(jù)下列的程序進行反應(yīng)。開始，94℃；5min；然后，94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，一共10個循環(huán)。最后，72℃，5min。
在兩段GLP融合前加入一前導肽。以PCR方法獲得，具體如下。
兩條引物，加上了KEX的前導肽，分別為GLP1CCCggtacc(KpnI)ATGAAGTGGGTAAGCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCGGTTCTTTGGATAAGAGCACGGTGAAGGTACTTTCAC(SEQ ID NO6)GLP2CCTCACTGTTGTGTGCATGCCTTCCTTTTACTAAC(SEQ IDNO7)然后，用常規(guī)的PCR方法擴增前導肽和兩段GLP融合DNA。一般體系為，GLP合成PCR產(chǎn)物，10μl；10×pfu Buffer，5μl；dNTP混合物，2μl；GLP1，2.5μl；GLP2，2.5μl；pfu DNA Polymerase，0.5μl；ddH2O，26.5μl。
PCR條件為開始，94℃；5min；然后，94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，一共30個循環(huán)。最后，72℃，5min。
所產(chǎn)生的PCR反應(yīng)產(chǎn)物使用瓊脂糖電泳方法進行分析。在紫外燈下觀察電泳情況。如果只有一對引物可以擴出300bp條帶時，切膠回收條帶。如果不只一對以上的引物可以擴出400bp的條帶時，重復前面的實驗，提高PCR的退火溫度，至只有一條引物對可以擴出400bp的條帶為止，再回收特異條帶。
PCR反應(yīng)產(chǎn)物最后進行序列測定，以保證克隆的正確。
實施例3融合基因克隆本實驗以HSA基因和GLP-1基因形成HSA/GLP-1融合基因為例，說明融合基因的克隆方法。本方法也適合HSA基因與其它GLP-1化合物基因形成融合基因的克隆。
融合蛋白基因的克隆使用Overlap PCR的反應(yīng)方法獲得。具體如下。
Overlap PCR的反應(yīng)體系為GLP DNA，2μl；HSA DNA，2ul；PremixTaq(Ex Taq)，50μl；ddH2O，36μl。
PCR條件為開始，94℃；5min；然后，94℃，1min；55℃，1min，72℃，2min，一共5個循環(huán)。然后，加入引物GLP-11 5ul和HSA2 5ul。進入下個程序94℃，1min；55℃，1min，72℃，2min，一共30個循環(huán)。最后，72℃，5min。
然后用常用的分子生物學方法，分離獲得融合基因克隆。電泳檢測回收產(chǎn)物的粗濃度后-20℃保存。
實施例4HSA/GLP-1載體質(zhì)粒的構(gòu)建以下以HSA/GLP-1融合基因為例，說明表達載體質(zhì)粒的構(gòu)建。
本實驗采用PYES3/CT為表達載體質(zhì)粒，其制備方法為常用分子生物學方法。即，通過培養(yǎng)含有表達載體的菌種，提取獲得該質(zhì)粒。制備好的質(zhì)粒-20℃保存待用。
為了將HSA/GLP-1融合基因克隆到pYES3/CT表達載體質(zhì)粒中，先對表達載體質(zhì)粒PYES3/CT和GLP-1-HSA雙酶切。具體條件如下。
37℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)3小時，酶切體系如下酶切體系表達載體質(zhì)粒HSA/GLP-1，10ul；KpnI，1ul；XhoI，1ul；10xM，2ul；ddH2O，6ul。
然后用常用的分子生物學方法，分離獲得HSA/GLP-1融合基因。具體是用agarose膠電泳酶切產(chǎn)物，然后切下目的條帶，再用博大泰克公司<<PCR產(chǎn)物快速膠回收試劑盒>>回收切膠產(chǎn)物。電泳檢測回收產(chǎn)物的粗濃度后-20℃保存。
然后，對酶切產(chǎn)物進行連接，獲得HSA/GLP-1融合基因表達載體。具體如下連接體系一般為10ul，solution I連接酶占體系的一半，剩下一半體系中表達載體與雙酶切HSA/GLP-1的摩爾比為1∶2-10，不足補加無菌水。16℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)2小時。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細胞。轉(zhuǎn)化反應(yīng)用博大泰克生物基因技術(shù)有限公司的高效DH5α感受態(tài)及配帶的試劑操作。
轉(zhuǎn)化體系為連接產(chǎn)物，10ul，無菌水，30ul，酶A，10ul。
取一管感受態(tài)DH5α細胞加入上述混合液中，輕柔混勻后冰上放置30分鐘再37℃放置10分鐘。加入500ul LB液體培養(yǎng)基37℃180rpm搖30分鐘。取100ul轉(zhuǎn)化液涂氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時。
陽性克隆的鑒定是通過挑選陽性克隆抽提質(zhì)粒，進行酶切和測序結(jié)果來確定。
實施例5HSA/GLP-1融合蛋白表達工程菌的構(gòu)建本實施例利用電轉(zhuǎn)化方法和HSA/GLP-1融合基因為例，構(gòu)建HSA/GLP-1融合蛋白表達工程菌的構(gòu)建。具體方法如下。
首先挑選含有HSA/GLP-1融合基因的表達載體質(zhì)粒的細菌克隆，提取表達載體質(zhì)粒。然后，用電轉(zhuǎn)化的方法把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母。提取方法為常用的分子生物學方法。
電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化釀酒酵母具體如下先進行菌體的準備。挑取酵母單菌落，接種至含有5ml YPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培養(yǎng)過夜。然后取100-500μl的培養(yǎng)物接種至含有500ml新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，28～30℃、250-300r/min培養(yǎng)過夜，至OD600達到1.3～1.5。再將細胞培養(yǎng)物于4℃，1500g離心5min，用500ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸。離心后，再用250ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸。再離心，用20ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸。再離心，用1ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為1.5ml。
然后用電擊方法進行轉(zhuǎn)化。具體如下。
將5～20μgHSA/GLP-1融合基因的表達載體質(zhì)粒DNA溶解于5～10μlTris緩沖液中，與80μl的上述步驟6所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預冷的電轉(zhuǎn)化杯中。將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min。然后根據(jù)相應(yīng)的電轉(zhuǎn)化儀，采用優(yōu)化的電壓、電流、電容等參數(shù)，進行電擊。電擊完畢后，加入1ml冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1.5ml的Eppendorf管中，將菌體懸液涂布于山梨醇平板上，每200～600μl涂布一塊平板。將平板置于30℃培養(yǎng)，直至單個菌落出現(xiàn)。
實施例6HSA/GLP-1融合蛋白表達和純化實施例5中構(gòu)建的HSA/GLP-1融合蛋白表達工程細胞，可以用以下的方法表達融合蛋白并進行純化。以下是HSA/GLP-1融合基因的表達方法。
將酵母接種于500ml的SDA培養(yǎng)基中，搖床30℃，180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)24小時。然后，接種至裝有5升YPD(蛋白胨2％，酵母提取物1％，葡萄糖2％)的發(fā)酵罐中，高壓滅菌30分鐘。發(fā)酵過程控溫在30℃，溶氧始終大于20％的飽和度。PH不能低于5。培養(yǎng)至密度OD600為8。
利用常用的重組蛋白分離方法，獲得以上酵母所表達的融合蛋白初提物。具體地，可以利用離心，超濾濃縮等方法。然后，可以利用層析方法，進一步純化融合蛋白。具體地，可以采用Sepharose SP XL層析柱用于融合蛋白的捕獲，再利用Butyl Sepharose FF層析柱，Ceramic Hydroxyapatite層析柱，以及DEAE Sepharose FF層析柱，進行更高的純化。
融合蛋白表達和純化結(jié)果通過常用的蛋白分析方法進行鑒定，包括但不限制于SDS-PAGE，Western印跡等方法。圖2為HSA/GLP-1融合蛋白表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示73 KDa的蛋白質(zhì)條帶，Western印跡方法證明該蛋白質(zhì)條帶為HSA/GLP-1融合蛋白(圖3)。
實施例7HSA/GLP-1融合蛋白的活性本實施例中采用HEK-293 Aurora CRE-BLAM體外測定方法對HSA/GLP-1融合蛋白進行活性測定。具體是測定HSA/GLP-1融合蛋白激活GLP-1受體的能力，并與Exendin 4激活GLP-1受體的能力進行比較。HEK-293 Aurora CRE-BLAM是表達人GLP-1受體的細胞系，GLP-1及激動劑可誘導該細胞系產(chǎn)生cAMP，并通過一系反應(yīng)元件產(chǎn)生熒光，且產(chǎn)生的熒光強度與GLP-1及激動劑的活性呈正相關(guān)。具體方法如下按20,000至40,000細胞/孔(96孔黑亮底平板)的量，接種HEK-293Aurora CRE-BLAM細胞(中科院生化細胞研究所)，培養(yǎng)一天后換用無血漿培養(yǎng)3天后分別加入不同濃度的HSA/GLP-1融合蛋白，Exendin 4或HSA，培育5小時后再添加β-內(nèi)酰胺酶繼續(xù)溫育1小時，在熒光測定儀上測定熒光。結(jié)果表明，HSA/GLP-1融合蛋白具有與GLP-1(7-37)-OH類似的激活人GLP-1受體的功能(結(jié)果見圖4)。
實施例8小鼠耐糖試驗小鼠禁食過夜(15小時)后按每公斤小鼠體重腹腔內(nèi)注射HSA/GLP-1融合蛋白或白蛋白5mg。一小時后小鼠再口飼料葡萄糖2mg/kg小鼠體重，不同的時間段取血樣測定其葡萄糖含量，結(jié)果顯示HSA/GLP-1融合蛋白組小鼠能明顯降低血糖(結(jié)果見圖5)。
實施例9血漿胰島素測定小鼠禁食過夜(15小時)后按每公斤小鼠體重腹腔內(nèi)注射HSA/GLP-1融合蛋白或白蛋白5mg。一小時后小鼠再口飼料葡萄糖2mg/kg小鼠體重，以20分鐘時間段時取血樣測定其胰島素含量，結(jié)果顯示HSA/GLP-1融合蛋白組小鼠能明顯升高血漿胰島素含量(結(jié)果見圖6)。
實施例10HSA/GLP-1融合蛋白的體內(nèi)藥代動力學采用Beagle犬兩個組，每組4只單劑量靜脈(IV)或皮下(SC)注射0.2mg/kgHSA/GLP-1融合蛋白，在0、15、30分鐘、1、4、8、12、24、48、96、144、192、240小時分別取1ml的加入抗凝劑(EDTA)的血，離心后取上清液，-20℃保存待測定。在完成全部取樣后，用免疫法測定血樣中HSA/GLP-1融合蛋白含量，并計算該藥在獼猴體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)。結(jié)果表明IV給于HSA/GLP-1融合蛋白在Beagle犬體內(nèi)的平均半衰期為約44小時。SC給于HSA/GLP-1融合蛋白在Beagle犬體內(nèi)的平均消除半衰期為約62小時。而文獻報道的GLP-1在體內(nèi)的半衰期僅為數(shù)分種?？梢奌SA/GLP-1融合蛋白在體內(nèi)具有長效作用的藥代動力學特征。
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動。本文引用的所有出版物、專利和專利申請均納入本文作參考。
序列表<110>浙江我武生物技術(shù)有限公司浙江德清安平生物制藥有限公司<120>類胰高血素肽-1融合蛋白及其制備和用途<130>056414<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>585<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu1 5 10 15Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln20 25 30Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu35 40 45Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys50 55 60Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu65 70 75 80Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro85 90 95Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu100 105 110Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His115 120 125Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg130 135 140Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg145 150 155 160Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala165 170 175Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser180 185 190Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro210 215 220Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys225 230 235 240Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp245 250 255Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser260 265 270Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His275 280 285Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser290 295 300Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala305 310 315 320Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg325 330 335Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr340 345 350Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu355 360 365Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro370 375 380Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu385 390 395 400Tyr Lys Phe Gln Ash Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro405 410 415Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys420 425 430Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys435 440 445Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His450 455 460Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser465 470 475 480Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr485 490 495Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala515 520 525Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu530 535 540Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys545 550 555 560Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val565 570 575Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu580 585<210>2<211>30<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>3<211>645<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His Gly20 25 30Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala35 40 45Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Asp Ala His Lys50 55 60Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys65 70 75 80Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe85 90 95Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr100 105 110Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr115 120 125
Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr130 135 140Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu145 150 155 160Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val165 170 175Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu180 185 190Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr195 200 205Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala210 215 220Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro225 230 235 240Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln245 250 255Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys260 265 270Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe275 280 285Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu290 295 300Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu305 310 315 320Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys325 330 335Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu340 345 350Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp355 360 365Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp370 375 380Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp385 390 395 400Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr405 410 415Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys420 425 430
Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile435 440 445Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln450 455 460Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr465 470 475 480Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys485 490 495Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr500 505 510Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro515 520 525Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg530 535 540Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys545 550 555 560Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu565 570 575Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu580 585 590Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met595 600 605Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys610 615 620Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln625 630 635 640Ala Ala Leu Gly Leu645<210>4<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc feature<223>引物<400>4tttaagaagt aaggaagatg cacacaagag tgaggttgct catc44<210>5<211>34<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc feature<223>引物<400>5cccctcgagt tataagccta aggcagcttg actt 34<210>6<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc feature<223>引物<400>6cccggtacca tgaagtgggt aagctttatt tcccttcttt ttctctttag ctcggcttat 60tccggttctt tggataagag cacggtgaag gtactttcac100<210>7<211>35<212>DNA<213>智人<400>7cctcactgtt gtgtgcatgc cttcctttta ctaac 3權(quán)利要求
1.一種分離的融合蛋白，其特征是含有2個多肽區(qū)，其中第一多肽由多個類胰高血素肽-1重復序列組成，并通過其C-末端與第二多肽的N-末端，或者第二多肽的C末端和第一多肽的N末端直接連接，其中所述第一多肽為多個類胰高血素肽-1以同一方向依次串聯(lián)而成的類胰高血素肽-1重復序列，所述類胰高血素肽-1具有以下的氨基酸序列(a)序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(b)相對于SEQ ID NO2所示的氨基酸序列有一個或多個氨基酸缺失、替代或插入且具有與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；(c)相對于SEQ ID NO2所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；其中所述第二多肽選自人血清白蛋白、免疫球蛋白、鐵蛋白、類固醇結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、α-2巨球蛋白和觸珠蛋白多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二多肽為人血清白蛋白多肽，所述多肽具有以下的氨基酸序列(a)序列表SEQ ID NO1所示的氨基酸序列；(b)相對于SEQ ID NO1所示的氨基酸序列有一個或多個氨基酸缺失、替代或插入且具有與SEQ ID NO1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；(c)相對于SEQ ID NO1所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有與SEQ ID NO1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一多肽中的類胰高血素肽-1重復序列數(shù)為2-10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有選自下列的氨基酸序列(a)序列表SEQ ID NO3所示的氨基酸序列；(b)相對于SEQ ID NO3所示的氨基酸序列有一個或多個氨基酸缺失、替代或插入且具有與SEQ ID NO3所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；(c)相對于SEQ ID NO3所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有與SEQ ID NO3所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。
5.一種分離的核酸序列，其特征在于，它具有編碼權(quán)利要求1所述的融合蛋白的核酸序列或其互補序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的核酸序列。
7.一種宿主細胞，其特征在于，它被權(quán)利要求6所述的載體轉(zhuǎn)化。
8.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，該方法包括(a)提供一宿主細胞，該宿主細胞包含一表達載體，該表達載體包含權(quán)利要求5所述的核酸序列以及與其操作性相連的表達調(diào)控序列；(b)在適合蛋白表達的條件下，培養(yǎng)步驟(a)所述的宿主細胞；(c)分離出權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
9.一種用于治療非胰島素依賴型糖尿病和肥胖癥的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有權(quán)利要求1所述的融合蛋白以及藥學上可接受的載體。
10.權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備用于治療非胰島素依賴型糖尿病和肥胖癥的藥物或使哺乳動物血糖水平正?；乃幬镏械挠猛?。
全文摘要
本發(fā)明提供一種類胰高血素肽－1重復序列與人血清白蛋白、免疫球蛋白、鐵蛋白、類固醇結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、α－2巨球蛋白和觸珠蛋白形成的融合蛋白。本發(fā)明還提供了該融合蛋白的編碼序列、含有該編碼鏈的載體和宿主。本發(fā)明還提供了該融合蛋白的制備方法及其用途。本發(fā)明的融合蛋白可用于非胰島素依賴型糖尿病及各種癥狀和肥胖癥的治療，其具有更好的穩(wěn)定性和體內(nèi)半衰期。
文檔編號A61P3/00GK1962695SQ20051011014
公開日2007年5月16日 申請日期2005年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月9日
發(fā)明者胡賡熙 申請人:浙江我武生物科技有限公司, 浙江德清安平生物制藥有限公司