專(zhuān)利名稱：SEA突變基因及其與ScFv基因的融合蛋白的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，具體地說(shuō)是超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)的突變基因及該突變基因seam與抗黑色素瘤單鏈抗體(ScFv)融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)作為一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑和增效劑，能夠通過(guò)激活腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞，達(dá)到排斥腫瘤的目的。天然的SEA編碼基因存在較多的稀有密碼子，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)表達(dá)量低；并且，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷缺乏選擇性，不僅能夠殺傷MHCII類(lèi)分子陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常的機(jī)體細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生一定的殺傷作用。因此，對(duì)SEA基因[蛋白]進(jìn)行改造提高其表達(dá)量，賦予SEA靶向性，把活化的T細(xì)胞限定在腫瘤局部，降低對(duì)機(jī)體的毒副作用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高表達(dá)的SEA突變基因及其與ScFv基因的融合蛋白的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為SEA的突變基因具有序列表SEQ ID NO1中的堿基序列。
序列表SEQ ID NO1中的基因可與抗腫瘤相關(guān)抗原的抗體或抗體片段基因融合，構(gòu)建重組免疫毒素；所述的抗腫瘤相關(guān)抗原的抗體或抗體片段基因?yàn)镠B8759，其具有序列表SEQ ID NO2中的堿基序列；所述融合基因具有序列表SEQ ID NO3中的堿基序列。
突變SEA前體蛋白基因的694-714堿基之間的稀有密碼子，實(shí)現(xiàn)sea基因的高表達(dá)，并將突變后的seam基因與基因工程技術(shù)改造的不同抗體或抗體片斷基因融合，開(kāi)展抗體導(dǎo)向的SEA抗腫瘤研究；例如抗黑色素瘤單鏈抗體HB8759，抗VEGF受體抗體，抗HER-2抗體等。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.sea的突變的位點(diǎn)較少，限定在694-714堿基之間、兩個(gè)相鄰的AGG及其附近的稀有密碼子，沒(méi)有改變天然蛋白的氨基酸序列，實(shí)現(xiàn)了較高的蛋白表達(dá)。
2.構(gòu)建了抗黑色素瘤單鏈抗體噬菌體庫(kù)，用固相抗原篩選出了具有較高親和活性的單鏈抗體，完成抗體的小型化，為開(kāi)展抗黑色素瘤靶向治療研究提供了有效載體。單鏈抗體與完整的抗體分子相比具有分子量小，免疫原性低，穿透性強(qiáng)，在癌組織中分布均勻，易和毒素及其它效應(yīng)分子連接等多種優(yōu)點(diǎn)，因此應(yīng)用前景更廣泛。
3.抗體片斷-SEA融合蛋白將抗體的導(dǎo)向作用和SEA激活大量T細(xì)胞的功能合二為一。既能提高SEA定向結(jié)合到腫瘤細(xì)胞的能力[靶向性強(qiáng)]，又可以克服大分子單抗不易滲透到腫瘤組織的不足，比單純的SEA抗腫瘤效果更明顯、更穩(wěn)定。


圖1為sea突變基因在工程菌中的細(xì)胞全蛋白電泳圖譜。其中M為中分子量蛋白marker，1為E.Coli JM109(DE3)空菌落，2為工程菌全蛋白電泳。
圖2為復(fù)性純化后的ScFv-SEA融合蛋白電泳圖譜。其中1為中分子量蛋白marker，2為包涵體中的ScFv-SEA融合蛋白，3為純化、復(fù)性后的ScFv-SEA融合蛋白。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一種sea的突變基因，具有序列表SEQ ID NO1所示的堿基序列(其中SEA的信號(hào)肽基因用下劃線標(biāo)出)atgaaaaaaa cagcatttac attactttta ttcattgccc taacgttgac aacaagtcca60cttgtaaatg gtagcgagaa aagcgaagaa ataaatgaaa aagatttgcg aaaaaagtct 120gaattgcagg gaacagcttt aggcaatctt aaacaaatct attattacaa tgaaaaagct180aaaactgaaa ataaagagag tcacgatcaa tttttacagc atactatatt gtttaaaggc240ttttttacag atcattcgtg gtataacgat ttattagtag attttgattc aaaggatatt300gttgataaat ataaagggaa aaaagtagac ttgtatggtg cttattatgg ttatcaatgt360gcgggtggta caccaaacaa aacagcttgt atgtatggtg gtgtaacgtt acatgataat420aatcgattga ccgaagagaa aaaagtgccg atcaatttat ggctagacgg taaacaaaat480acagtacctt tggaaacggt taaaacgaat aagaaaaatg taactgttca ggagttggat540cttcaagcaa gacgttattt acaggaaaaa tataatttat ataactctga tgtttttgat600gggaaggttc agaggggatt aatcgtgttt catacttcta cagaaccttc ggttaattac660gatttatttg gtgctcaagg acagtattca aataccctgt tacgtatcta tcgtgataat720aaaacgatta actctgaaaa catgcatatt gatatatatt tatatacaag ttaa 774(1)SEQ ID NO1的信息(參見(jiàn)序列表)(a)序列特征*長(zhǎng)度774堿基對(duì)*類(lèi)型核酸*鏈型雙鏈*拓樸結(jié)構(gòu)線性(b)分子類(lèi)型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源金黃色葡萄球菌腸毒素A(拉丁文名稱Staphylococcusaureus)(2)sea基因全序列的擴(kuò)增從金黃色葡萄球菌腸毒素A標(biāo)準(zhǔn)菌株STS基因組中通過(guò)PCR擴(kuò)增sea基因全序列。擴(kuò)增引物為SEA F5′TAGAGGAGGGCAAAATGAAAA3′和SEA R 5′TGTTTAACTTGTATATAATA3′。
擴(kuò)增條件為第一階段97℃，1分鐘；第二階段95℃，40s；40℃，30s；72℃，30s；共30個(gè)循環(huán)；第三階段72℃，5分鐘。PCR產(chǎn)物與pUC19-T載體連接，連接物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，重組質(zhì)粒命名為pUC19-sea。感受態(tài)的制備，電擊轉(zhuǎn)化方法，質(zhì)粒DNA的提取鑒定按《分子克隆試驗(yàn)指南》[J.薩姆布魯克，1998]中的方法操作。
(3)sea基因突變位點(diǎn)的引入擬突變的sea位點(diǎn)是232，233，235，236，238位。232ACA→ACC；233CTA→CTG；235AGA→CGT；236ATA→ATC；238AGA→CGT。設(shè)計(jì)兩組PCR引物，每組含一條帶突變堿基的引物。
第一組SEA F5′ATGAATCCATATGAAAAAAACAGCATTTAC 3′Mu R5′ACGATAGATACGTAACAGGGTATTTGAATAC 3′第二組Mu F5′ACCCTGTTACGTATCTATCGTGATTAATAAAAC 3′SEA R5′GGAAGCTTCTATTAACTGGTATAT 3′以pUC19-sea為模板，以第一組引物擴(kuò)增出715bp，第二組引物擴(kuò)增出94bp小片斷。第一組引物擴(kuò)增的條件為97℃ 1分鐘；95℃ 40s，45℃ 30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘。第二組引物擴(kuò)增條件為97℃ 1分鐘；95℃ 40s，24℃ 30s，72℃ 15s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘。將兩片斷混合加入dNTP，pfu酶，pfu buffer，97℃ 1分鐘；95℃ 40s，50℃ 30s，72℃ 1分鐘，3個(gè)循環(huán)，再加入SEA F和SEA R引物，按sea擴(kuò)增條件進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，電泳回收PCR產(chǎn)物。
(4)seam基因工程菌的構(gòu)建seam基因的PCR產(chǎn)物用NdeI和HindIII雙酶切、連到同樣雙酶切的7ZTS載體(參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)02109681.3)上，轉(zhuǎn)化E.coli JM109(DE3)，重組質(zhì)粒命名為7ZTS-seam。
工程菌中seam的表達(dá)參見(jiàn)附圖1所示；工程菌的細(xì)胞全蛋白電泳圖譜中有一明顯表達(dá)帶，分子量約29000dalton；OD560薄層掃描顯示此表達(dá)蛋白占菌體總蛋白的40％。
seam基因測(cè)序(采用雙脫氧末端終止法)結(jié)果證實(shí)，seam的突變位點(diǎn)完全正確。
實(shí)施例2抗黑色素瘤單鏈抗體的構(gòu)建與篩選，具有序列表SEQ ID NO2所示的堿基序列caggtgaagc tgcaggagtc aggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60tcctgtgttg tctctggatt cactttcagt aattactgga tgaactgggt ccgccagtct120ccagagaagg ggcttgagtg gattgcagaa attagattga aatccaataa ttttgcaaga180tattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt240gtctacctgc aaatgatcaa cctaagagct gaagatactg gcatttatta ctgtaccagt300tatggtaact acgttgggca ctattttgac cactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc360tcctcatgtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggacattgag420ctcacccagt ctccaaaatt catgtccaca tcagtaggag acagggtcag cgtcacctgc480aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcctggtatc aacaaaaacc agggcaatct540
cctgaaccac tgcttttctc ggcatcctac cgttacactg gagtccctga tcgcttcaca600ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca atgtgcagtc tgaagacttg660gcagagtatt tctgtcagca atataacagc tatcctctga cgttcggtgg aggcaccaag720ctggaaatca aacgg 735SEQ ID NO2的信息(參見(jiàn)序列表)(a)序列特征*長(zhǎng)度735堿基對(duì)*類(lèi)型核酸*鏈型雙鏈*拓樸結(jié)構(gòu)線性(b)分子類(lèi)型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源雜交瘤細(xì)胞株HB8759(英文名稱hybridoma cell)根據(jù)已發(fā)表的小鼠可變區(qū)序列的保守性，參照最新分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，合成了可變區(qū)的通用引物。(B＝C/T D＝A/G/T H＝A/C/T V＝A/C/G K＝G/TM＝A/C R＝A/G S＝C/G W＝A/T X＝C/T)VHfor 5’ TGA GGA GAC GGT GAC GGT GGT CCC 3’VHBack5’ CAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG 3’VLfor 5’ CCG TTA GAT CTC CAR BTT KGT SCS 3’VLBack5’ GAC ATT CAG CTG ACC CAG WCT SMH 3’Linkerfor 5’TGG AGA CTG GGT GAG CTC AAT GTC 3’LinkerBack5’GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 3’加SfiI酶切位點(diǎn)引物5’GTC CTC GCA ACTGCG GCC CAG CCG GCCATG GCCSfiICAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG 3’加NotI酶切位點(diǎn)引物5’GAG TCA TTC TGC GGC CGC CCGTTT GAT TTC CAGNotICTT GGT GCC 3’(1)提取雜交瘤細(xì)胞的總RNA。
(2)反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。
(3)以cDNA為模板，分別用輕、重鏈可變區(qū)引物擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)(VH、VL)基因。PCR擴(kuò)增條件為95℃ 1分鐘；94℃30s，57℃30s，72℃ 30s，30循環(huán)；72延伸10min。回收VH，VL擴(kuò)增產(chǎn)物。
(4)按[Expression Module/Recombinant Phage Antibody System]說(shuō)明，將VH、VL DNA和linker-Primer等摩爾混合，按94℃ 1min，63℃ 4min，7個(gè)循環(huán)進(jìn)行重疊PCR反應(yīng)，將全套的VH、VL拼接為ScFv cDNA；加入帶SfiI和NotI限制性酶切位點(diǎn)引物，按94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，30循環(huán)，72℃保溫10min進(jìn)行聚合酶聯(lián)反應(yīng)，在ScFv DNA的兩端分別引入SfiI位點(diǎn)和NotI位點(diǎn)。
(5)單鏈抗體基因用用SfiI及NotI兩步酶切，并與相同酶切的pCANTAB5E載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的E.coliTGI；(6)噬菌體單鏈抗體文庫(kù)的制備和篩選；用LB收集全部轉(zhuǎn)化菌落，1∶100接種于10ml的2×YT-G(2％G)中，37℃搖1h，加入氨芐青霉素(100ug/ml)和4×1010pfu的輔助噬菌體M13K07，37℃搖1h，離心棄上清。沉淀用2×YT-AK(氨芐青霉素100ug/ml，卡那霉素70ug/ml)重懸，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，離心取上清。0.2倍體積20％的PEG8000/2.5mol/LNaCl沉淀噬菌體。適量的2×YT培養(yǎng)基溶解沉淀，過(guò)濾除菌。
(7)抗原的親和富集向長(zhǎng)滿LiBr黑色素瘤細(xì)胞(表達(dá)相關(guān)抗原)的平皿中加入含10％脫脂奶粉的PBS封閉緩沖液，37℃封閉30分鐘。加入上面制備的重組噬菌體6ml，37℃孵育90分鐘。PBS充分洗滌10次，每次3min。再用0.1％Tween20-PBS洗滌10次，每次3min。加入4ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌TG1，37℃感染1小時(shí)。取100ul鋪SOBAG平板(1∶1、1∶10)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，待長(zhǎng)出菌落后酶切鑒定，并用2×YT-AG培養(yǎng)基從SOBAG平板上洗下菌液，然后按f步驟重新制備重組噬菌體，再進(jìn)行“吸附-洗脫-擴(kuò)增”，重復(fù)3輪。
(8)細(xì)胞ELISA篩選從三輪篩選后涂布的平板上隨機(jī)挑取30個(gè)單克隆，加入5ml的2×YT-GA中搖至OD600＝0.8(3-4h)，加入4×1010pfu的M13K07輔助噬菌體，37℃搖2小時(shí)，離心棄上清，2×YT-AK重懸，培養(yǎng)過(guò)夜，離心取上清用10％的脫脂奶粉封阻后，取100ul加入包被有LiBr細(xì)胞并被封閉的96孔酶標(biāo)板中，37℃反應(yīng)1小時(shí)，用PBS充分洗滌，加入100ulHRP標(biāo)記的抗M13K07噬菌體VIII蛋白的抗體，反應(yīng)1小時(shí)，充分洗滌后加入ABTS顯色，監(jiān)測(cè)OD410的A值，以M13K07為陰性對(duì)照。
結(jié)果獲得兩株具有較高親和活力的單鏈抗體分別命名為pCAS1、pCAS2。pCAS1測(cè)序結(jié)果具有SEQ ID NO2的序列；VH基因366bp，編碼122個(gè)氨基酸殘基，位于單鏈抗體基因的5’端；VL基因324bp，編碼108個(gè)氨基酸殘基，位于單鏈抗體的3’端，在VH、VL之間是編碼(Gly4Ser)3連接肽的DNA序列；VH、VL基因的氨基酸序列均為開(kāi)放讀框，有明確的4個(gè)框架區(qū)和三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)，含有2個(gè)抗體可變區(qū)特征性的半胱氨酸，符合小鼠抗體可變區(qū)特征。
實(shí)施例3超抗原SEA與抗黑色素瘤ScFv重組免疫毒素的構(gòu)建，具有序列表SEQ IDNO3所示的堿基序列(其中酶切連接位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出)caggtgaagc tgcaggagtc aggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc60tcctgtgttg tctctggatt cactttcagt aattactgga tgaactgggt ccgccagtct120ccagagaagg ggcttgagtg gattgcagaa attagattga aatccaataa ttttgcaaga180tattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt240gtctacctgc aaatgatcaa cctaagagct gaagatactg gcatttatta ctgtaccagt300tatggtaact acgttgggca ctattttgac cactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc360tcctcatgtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggacattgag420ctcacccagt ctccaaaatt catgtccaca tcagtaggag acagggtcag cgtcacctgc480aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcctggtatc aacaaaaacc agggcaatct540
cctgaaccac tgcttttctc ggcatcctac cgttacactg gagtccctga tcgcttcaca600ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca atgtgcagtc tgaagacttg660gcagagtatt tctgtcagca atataacagc tatcctctga cgttcggtgg aggcaccaag720ctggaaatca aacgggaatt cagcgagaaa agcgaagaaa taaatgaaaa agatttgcga 780aaaaagtctg aattgcaggg aacagcttta ggcaatctta aacaaatcta ttattacaat840gaaaaagcta aaactgaaaa taaagagagt cacgatcaat ttttacagca tactatattg900tttaaaggct tttttacaga tcattcgtgg tataacgatt tattagtaga ttttgattca960aaggatattg ttgataaata taaagggaaa aaagtagact tgtatggtgc ttattatggt1020tatcaatgtg cgggtggtac accaaacaaa acagcttgta tgtatggtgg tgtaacgtta1080catgataata atcgattgac cgaagagaaa aaagtgccga tcaatttatg gctagacggt1140aaacaaaata cagtaccttt ggaaacggtt aaaacgaata agaaaaatgt aactgttcag1200gagttggatc ttcaagcaag acgttattta caggaaaaat ataatttata taactctgat1260gtttttgatg ggaaggttca gaggggatta atcgtgtttc atacttctac agaaccttcg1320gttaattacg atttatttgg tgctcaagga cagtattcaa ataccctgtt acgtatctat1380cgtgataata aaacgattaa ctctgaaaac atgcatattg atatatattt atatacaagt1440taa 1443SEQ ID NO3的信息(參見(jiàn)序列表)(a)序列特征*長(zhǎng)度1443堿基對(duì)*類(lèi)型核酸*鏈型雙鏈*拓樸結(jié)構(gòu)線性(b)分子類(lèi)型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源seam工程菌和抗黑色素瘤單鏈抗體重組質(zhì)粒pCAS1根據(jù)單鏈抗體和sea基因的已知序列，遵循引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)兩組引物，采用酶切連接方法構(gòu)建ScFv-SEA融合基因。
第一組ScFv F5’CATATGCAGGTGAAGCTGCAGCAGTC 3’NdeIScFv R5’GAATTCCCGTTTGATTTCCAGCTT 3’EcoRI第二組SEA F5’AAGCTTTTAACTTGTATATAAATATATATC 3’EcoRISEA R 5’GAATTCAGCGAGAAAAGCGAAGAAATA 3’HindIII(1)ScFv基因的擴(kuò)增以重組質(zhì)粒pCAS1為模板，用第一組引物擴(kuò)增ScFv DNA。PCR條件為95℃ 1分鐘；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 40s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。ScFv兩端被引入NdeI、EcoRI酶切位點(diǎn)。
(2)seam基因的擴(kuò)增以7ZTS-seam為模板，用第二組引物擴(kuò)增seam基因，擴(kuò)增條件為95℃ 1分鐘；94℃ 30s，45℃ 30s，72℃ 40s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。seam兩端分別被引入EcoRI、HindIII酶切位點(diǎn)。
(3)pGEMT-ScFv、pGEMT-SEA、pET28ScFv-SEA重組質(zhì)粒的構(gòu)建將ScFv和seamPCR產(chǎn)物克隆到pGEM T-easy載體中，篩選陽(yáng)性克隆。pGEMT-ScFv質(zhì)粒DNA用NdeI、EcoRI雙酶切，分離約750bp DNA片段；pGEMT-SEA質(zhì)粒DNA用EcoRI、HindIII酶切，分離約750bp DNA片段；pET28a載體用NdeI、HindIII酶切，分離約5000bp的DNA片段；將三者按5∶5∶1的摩爾比混合，用T4 DNA連接酶16℃連接16-18h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.col BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，采用酶切鑒定和PCR鑒定兩種方法篩選陽(yáng)性克隆。
(4)質(zhì)粒和菌株的保存質(zhì)粒冰凍保存于-20℃，菌株在含10％ DMSO的培養(yǎng)液中保存于-70℃(5)ScFv-SEA融合蛋白的表達(dá)挑取含ScFv-SEA重組質(zhì)粒的單菌落，接種于含有25μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)至OD600為0.61時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃、200r/min繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心收集菌體，SDS-PAGE分析。
結(jié)果工程菌全蛋白電泳圖譜在50kD處出現(xiàn)明顯誘導(dǎo)條帶，與預(yù)期的目的蛋白分子量相符。凝膠灰度掃描顯示融合蛋白占總蛋白的30％?？购谏亓鯯cFv基因和seam基因的融合基因測(cè)序(采用雙脫氧末端終止法)結(jié)果表明，ScFv-SEA融合基因與設(shè)計(jì)的完全一致。
實(shí)施例4 超抗原SEA與ScFv重組免疫毒素的分離、純化鹽酸胍裂解液、變性結(jié)合緩沖液、不同pH值變性清洗緩沖液及變性洗脫緩沖液按照Invitrogen公司[ProBond.Purification System]操作手冊(cè)配制。
(1)細(xì)菌的裂解取50mL細(xì)菌培養(yǎng)液，6000g離心15min，棄凈上清，收集菌體。加入8mL的鹽酸胍裂解液，室溫緩慢震蕩5-10min。將菌液置于冰上，超聲探頭深入液面3厘米，中等功率超聲破菌，每次5秒，間隔10秒，3-5次，至菌液變澄清。5000g離心15min，保留沉淀。
(2)包涵體的洗滌沉淀用9倍體積的洗滌緩沖液(含4mol/L尿素、20mmol/L Tris、2mmol/L EDTA、1％Triton X100)重懸，室溫靜置5min，5000g離心15min，重復(fù)洗滌4遍。
(3)Ni-NTA親合柱的預(yù)處理取一支預(yù)裝好的Ni-NTA金屬螯合柱，緩慢顛倒數(shù)次使樹(shù)脂重新懸浮混勻，靜置或800g低速離心2分鐘，讓樹(shù)脂均勻下沉。倒去柱內(nèi)酒精，以6mL的蒸餾水清洗兩次。6mL變性結(jié)合緩沖液洗滌3次。
(4)包涵體的純化與復(fù)性①洗滌后的包涵體，用8mL的裂解緩沖液重新懸浮，加入預(yù)處理好Ni-NTA金屬親合柱。室溫緩慢震蕩15至30分鐘，800g離心1分鐘，棄上清。
②加入4mL變性結(jié)合緩沖液(pH7.8)重懸樹(shù)脂，震蕩2分鐘，800g離心1分鐘，去上清，重復(fù)1次。
③加入4mL變性清洗緩沖液(pH6.0)重懸樹(shù)脂，震蕩2分鐘，800g離心1分鐘，棄上清，重復(fù)一次。
④加入4mL變性清洗緩沖液(pH5.3)重懸樹(shù)脂，震蕩2分鐘，800g離心1分鐘，棄上清，重復(fù)一次。
⑤將Ni-NTA柱垂直固定，剪去下端的封閉口，用4mL變性洗脫緩沖液(pH4.0)洗柱，每管收集1mL洗脫液，檢測(cè)洗脫液中蛋白含量。
⑥用含8M尿素的PBS緩沖液將蛋白稀釋到100mg/ml，對(duì)含0.5mmol/L L-精氨酸，0.1mmol/L Triton-100，1.0mmol/L還原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化性谷胱甘肽，10mM Tris的復(fù)性緩沖液，4℃透析24h，更換緩沖液3次。
⑦將蛋白溶液4℃ 8000r/min，離心20min，去除聚集物；聚乙二醇20000濃縮，蛋白定量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論工程菌中ScFv-SEA融合蛋白的表達(dá)及目的蛋白純化、復(fù)性后的SDS-PAGE如圖2所示。復(fù)性后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定呈現(xiàn)了單一條帶，凝膠成像系統(tǒng)分析純度達(dá)90％以上，蛋白定量達(dá)0.47mg/ml。
實(shí)施例5 超抗原SEA與ScFv重組免疫毒素對(duì)黑色素瘤細(xì)胞株的抑制作用(1)細(xì)胞系黑色素瘤細(xì)胞株LiBr購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞菌種庫(kù)(Americar Type CultureCollection，ATCC)，表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂(GD2)抗原。乳腺癌細(xì)胞株MCF7為天津腫瘤醫(yī)院免疫室提供，無(wú)GD2表達(dá)。
(2)方法LDH釋放法測(cè)定融合蛋白的細(xì)胞毒效應(yīng)①將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LiBr黑色素瘤細(xì)胞濃度調(diào)整到4×105/ml。
②取100μl LiBr黑色素瘤細(xì)胞加入U(xiǎn)型、96孔板中，加入ScFv-SEA融合蛋白使藥物終濃度分0.10、1.0、2.0、5.0、10.0μg/ml幾個(gè)等級(jí)。37℃溫育30min后，加入外周血單個(gè)核細(xì)胞100μl(效靶比為10∶1)。效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔加單個(gè)核細(xì)胞、RPMI1640各100μl，同樣方法加入ScFv-SEA融合蛋白；PBMC對(duì)照孔加PMBC和LiBr細(xì)胞各100μl；靶細(xì)胞最大釋放孔和靶細(xì)胞最小釋放孔加入LiBr細(xì)胞和RPMI1640各100μl，不加ScFv-SEA，以上各項(xiàng)均設(shè)三個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立乳腺癌MCF7+外周血單個(gè)核細(xì)胞+ScFv-SEA對(duì)照組。37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h。
③將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100μl，反應(yīng)3min，每孔加入1mol/LHCl 30μL，在酶標(biāo)儀490nm測(cè)定光密度值(OD)。
④用方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，按下式計(jì)算細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷率，受試組的死亡率顯著高于對(duì)照組(顯著性水平選擇為0.05)，即可判定該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。
殺傷效應(yīng)(％)＝(實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放OD值-靶細(xì)胞最小釋放OD值)/(靶細(xì)胞最大釋放OD值-靶細(xì)胞最小釋放OD值)×100(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論當(dāng)效靶比為10∶1時(shí)，隨著融合蛋白濃度的增大，對(duì)黑色素瘤細(xì)胞LiBr的抑制率逐漸增大，當(dāng)融合蛋白濃度為2μg/mL時(shí)，抑制率最高達(dá)58％-69％，大于2μg/mL抑制率不再增加。單加PBMC，單加融合蛋白對(duì)LiBr無(wú)明顯影響。
結(jié)論對(duì)表達(dá)相關(guān)抗原的黑色素瘤細(xì)胞LiBr的抑制效應(yīng)明顯優(yōu)于對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7抑制(抑制率見(jiàn)表1)，說(shuō)明融合蛋白賦予了SEA抗腫瘤特異性。
表1 抗黑色素瘤ScFv-SEA融合蛋白對(duì)LiBr和MCF7細(xì)胞的抑制率

SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所<120>sea突變基因及其與ScFv基因的融合蛋白的應(yīng)用<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>774<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<220>
<221>old_sequence<222>(1)..(774)<223>
<400>1atgaaaaaaa cagcatttac attactttta ttcattgccc taacgttgac aacaagtcca 60cttgtaaatg gtagcgagaa aagcgaagaa ataaatgaaa aagatttgcg aaaaaagtct 120gaattgcagg gaacagcttt aggcaatctt aaacaaatct attattacaa tgaaaaagct 180aaaactgaaa ataaagagag tcacgatcaa tttttacagc atactatatt gtttaaaggc 240ttttttacag atcattcgtg gtataacgat ttattagtag attttgattc aaaggatatt 300gttgataaat ataaagggaa aaaagtagac ttgtatggtg cttattatgg ttatcaatgt 360gcgggtggta caccaaacaa aacagcttgt atgtatggtg gtgtaacgtt acatgataat 420aatcgattga ccgaagagaa aaaagtgccg atcaatttat ggctagacgg taaacaaaat 480acagtacctt tggaaacggt taaaacgaat aagaaaaatg taactgttca ggagttggat 540cttcaagcaa gacgttattt acaggaaaaa tataatttat ataactctga tgtttttgat 600
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<221>V_region<222>(1)..(735)<223>
<400>2caggtgaagc tgcaggagtc aggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc60tcctgtgttg tctctggatt cactttcagt aattactgga tgaactgggt ccgccagtct120ccagagaagg ggcttgagtg gattgcagaa attagattga aatccaataa ttttgcaaga180tattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt240gtctacctgc aaatgatcaa cctaagagct gaagatactg gcatttatta ctgtaccagt300tatggtaact acgttgggca ctattttgac cactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc360tcctcatgtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggacattgag420ctcacccagt ctccaaaatt catgtccaca tcagtaggag acagggtcag cgtcacctgc480aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcctggtatc aacaaaaacc agggcaatct540cctgaaccac tgcttttctc ggcatcctac cgttacactg gagtccctga tcgcttcaca600ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca atgtgcagtc tgaagacttg660gcagagtatt tctgtcagca atataacagc tatcctctga cgttcggtgg aggcaccaag720ctggaaatca aacgg 735
<210>3<211>1443<212>DNA<213>融合基因<220>
<221>gene<222>(1)..(1443)<223>
<400>3caggtgaagc tgcaggagtc aggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc60tcctgtgttg tctctggatt cactttcagt aattactgga tgaactgggt ccgccagtct120ccagagaagg ggcttgagtg gattgcagaa attagattga aatccaataa ttttgcaaga180tattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt240gtctacctgc aaatgatcaa cctaagagct gaagatactg gcatttatta ctgtaccagt300tatggtaact acgttgggca ctattttgac cactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc360tcctcatgtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggacattgag420ctcacccagt ctccaaaatt catgtccaca tcagtaggag acagggtcag cgtcacctgc480aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcctggtatc aacaaaaacc agggcaatct540cctgaaccac tgcttttctc ggcatcctac cgttacactg gagtccctga tcgcttcaca600ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca atgtgcagtc tgaagacttg660gcagagtatt tctgtcagca atataacagc tatcctctga cgttcggtgg aggcaccaag720ctggaaatca aacgggaatt cagcgagaaa agcgaagaaa taaatgaaaa agatttgcga780aaaaagtctg aattgcaggg aacagcttta ggcaatctta aacaaatcta ttattacaat840gaaaaagcta aaactgaaaa taaagagagt cacgatcaat ttttacagca tactatattg900
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1.一種SEA的突變基因，其特征在于具有序列表SEQ ID NO1中的堿基序列。
2.一種SEA的突變基因的應(yīng)用，其特征在于將序列表SEQ ID NO1中的基因與抗腫瘤相關(guān)抗原的抗體或抗體片段基因融合，構(gòu)建重組免疫毒素。
3.按照權(quán)利要求2所述SEA的突變基因的應(yīng)用，其特征在于所述的抗腫瘤相關(guān)抗原的抗體或抗體片段基因?yàn)镠B8759，其具有序列表SEQ IDNO2中的堿基序列。
4.按照權(quán)利要求2所述SEA的突變基因的應(yīng)用，其特征在于所述融合基因具有序列表SEQ ID NO3中的堿基序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，具體地說(shuō)是SEA突變基因及其與ScFv基因融合蛋白的應(yīng)用，采用基因工程手段突變了超抗原SEA基因，其具有序列表1的堿基序列；將其與通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得的抗黑色素瘤單鏈抗體(ScFv)基因融合構(gòu)建了ScFv－SEA重組免疫毒素；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)該融合蛋白對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用明顯優(yōu)于其它腫瘤，該融合蛋白對(duì)黑色素瘤細(xì)胞具有明確的靶向殺傷效應(yīng)，在治療黑色素瘤的藥物開(kāi)發(fā)中具有較好的應(yīng)用前景。超抗原SEA作為一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑和增效劑，為腫瘤的免疫治療提供了新途徑。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1569880SQ0313379
公開(kāi)日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者吳文芳, 孫靜, 時(shí)成波, 呂安國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所, 屹昌科技集團(tuán)有限公司