專利名稱：包含hpv－16病毒的突變e7蛋白的非免疫抑制免疫原性組合物或疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與通過HPV-16型乳頭瘤病毒感染相關(guān)的一些癌癥的預(yù)防或治療的領(lǐng)域。
現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)今認(rèn)為一些人乳頭瘤病毒或者HPV是癌癥的致病原。具體地，16、18、31、33和51型HPV經(jīng)常與肛門和生殖器癌癥，包括婦女宮頸癌相關(guān)。
宮頸中50％以上的鱗狀癌與HPV-16型乳頭瘤病毒相關(guān)。
HPV E6和E7病毒癌蛋白強烈參與這些病毒導(dǎo)致發(fā)生此類癌癥的分子機理。這兩種癌蛋白使p53蛋白和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白形成的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子失活，由此導(dǎo)致啟動癌癥的多步發(fā)展事件。
通常，惡性腫瘤存在于具有相關(guān)抗原(TAA)或特異抗原(TSA)的癌細(xì)胞和特定基質(zhì)微環(huán)境，其特征是過度血管形成，或者新血管生成，其通常與免疫細(xì)胞的麻痹，即處于免疫抑制狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。最初，免疫抑制的存在僅限于腫瘤水平，因為個體仍然能夠保護自身抵抗其他侵入如感染。
然而，隨著轉(zhuǎn)移性擴散，免疫抑制可擴散并全身化，這可通過患有終末期癌的癌癥患者易受感染來證明。這種免疫抑制包括癌性細(xì)胞或來自它們所在環(huán)境的細(xì)胞產(chǎn)生的麻痹因子。免疫系統(tǒng)細(xì)胞的局部麻痹，或者免疫抑制，因此代表使得癌性細(xì)胞逃避宿主免疫系統(tǒng)的一種主要武器。
在由HPV-16感染導(dǎo)致的癌中也觀察到這種免疫抑制狀況。這種免疫抑制是現(xiàn)今抗HPV-16感染導(dǎo)致的癌癥的預(yù)防性或治療性疫苗組合物的開發(fā)中一個主要的技術(shù)障礙。實際上，當(dāng)今抗HPV-16疫苗策略支持當(dāng)HPV-16產(chǎn)生的一些抗原，尤其是E6和E7蛋白與受感染癌性細(xì)胞膜表面的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)I類抗原結(jié)合時，誘導(dǎo)特異識別HPV-16產(chǎn)生的這些抗原的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增殖。
一些作者將在HPV-16導(dǎo)致的癌中觀察到的免疫抑制與宮頸的癌性細(xì)胞表面MHC I類分子的表達(dá)水平降低(Cruz等，1999)，或者與表現(xiàn)出前腫瘤發(fā)育異常的患者中T細(xì)胞受體(TCR)δ鏈的表達(dá)減少聯(lián)系起來(Muderspach等，2000)。其他作者將免疫抑制狀況與T細(xì)胞對由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生并被傳送到免疫細(xì)胞的可能信號的應(yīng)答缺乏，由此導(dǎo)致它們的凋亡(例如，因為Fas/Fas配體相互作用)聯(lián)系起來(Schoell等，1999)。
其他作者觀察到與HPV感染導(dǎo)致的癌癥相關(guān)的免疫抑制伴隨著IL-10增加(EI Sherif等，2001；Giannini等1998；Giannini等2002)和TGF-β-1增加(Giannini等1998)，以及上皮下IFN-γ的減少(EI Sherif等，2001)。
在國際申請WO 00/03732中公開的發(fā)明人的已有工作表明對于HPV導(dǎo)致的宮頸癌，乳頭瘤病毒E7蛋白參與腫瘤或被感染的細(xì)胞水平上的局部免疫抑制。
E7蛋白誘導(dǎo)的免疫抑制的特征在于抑制PPD或破傷風(fēng)類毒素刺激的T細(xì)胞增殖、抑制同種異體細(xì)胞刺激的T細(xì)胞增殖、抗原呈遞細(xì)胞(APC)的α-IFN(免疫抑制細(xì)胞因子)過量產(chǎn)生。為了減小或阻斷HPV的可溶E7蛋白誘導(dǎo)的免疫抑制，已經(jīng)建議使用E7蛋白的非毒性衍生物作為抗原以誘導(dǎo)特異抗胞外E7蛋白的抗體。為了產(chǎn)生沒有天然蛋白毒性作用的E7衍生的免疫原性化合物，已經(jīng)建議通過化學(xué)修飾或者遺傳修飾，包括通過產(chǎn)生氨基酸殘基的插入、缺失或替換以減小或抑制天然蛋白的毒性功能位點來修飾天然E7蛋白。在這種背景下，已經(jīng)公開了通過戊二醛處理天然E7蛋白得到的經(jīng)化學(xué)修飾E7蛋白，其缺少免疫抑制活性。
如在文獻(xiàn)陳述中公開的被建議降低或阻斷天然E7蛋白的免疫抑制性質(zhì)的化學(xué)修飾的目標(biāo)是通過用醛、氨甲酰或馬來酰亞胺官能團偶聯(lián)這種蛋白的氨基酸之一的反應(yīng)性官能團將化學(xué)基團加入到天然E7蛋白的碳骨架，而不改變這種天然蛋白的氨基酸序列，即不對E7蛋白的一級結(jié)構(gòu)帶來任何明顯的修飾。
實際上，如在文獻(xiàn)的陳述中公開的各種抗E7免疫原性組合物，為了產(chǎn)生抗由HPV-16感染引起的癌癥的預(yù)防或治療性疫苗制劑，主要旨在通過產(chǎn)生針對受感染的細(xì)胞表面表達(dá)的E7蛋白的特異細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，這些組合物含有作為抗原的完整E7蛋白，任選地為經(jīng)化學(xué)修飾的(Gerard等，2001)，或含有衍生自E7蛋白的肽(Muderspach等，2000；Schoell，1999-見上面)。在所有情況下，包括當(dāng)使用衍生自天然E7蛋白的肽時，在天然蛋白的氨基酸序列中沒有導(dǎo)入修飾，因此，對氨基酸的最初一級結(jié)構(gòu)沒有修飾。這可簡單地解釋為希望保持天然E7蛋白中目標(biāo)表位的完整以便有利于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，尤其是產(chǎn)生能夠特異并有效地識別受感染細(xì)胞產(chǎn)生的天然E7蛋白的CTL細(xì)胞。
甚至當(dāng)考慮重排E7蛋白的一級氨基酸結(jié)構(gòu)，以期產(chǎn)生具有減小的致癌性或轉(zhuǎn)化性質(zhì)的免疫原性蛋白時，所關(guān)注的是在重排的免疫原性化合物中保持E7蛋白序列的至少一份完整拷貝，以便在所述免疫原性化合物中存在所有天然E7蛋白的潛在表位。
從而，Osen等(2001)已經(jīng)公開了產(chǎn)生編碼免疫原性化合物的DNA，該免疫原性化合物易于誘導(dǎo)特異識別在HPV-16感染的癌性細(xì)胞表面表達(dá)的天然E7蛋白的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)的產(chǎn)生，該方法使用DNA的抗HPV疫苗策略，而不是直接使用肽免疫原性化合物。為了避免可導(dǎo)致天然E7蛋白被過表達(dá)的重組事件，或者至少具有天然E7蛋白的致癌性質(zhì)的重組蛋白，這些作者構(gòu)建了編碼這樣的免疫原性蛋白的DNA，其中天然E7蛋白的所有表位都被表現(xiàn)，盡管分別為(i)結(jié)構(gòu)域1-10，(ii)結(jié)構(gòu)域11-40，(iii)結(jié)構(gòu)域41-70和(iv)結(jié)構(gòu)域71-98的肽結(jié)構(gòu)域的每一個都已經(jīng)被顛倒到最終的免疫原性肽化合物中。所述作者堅持認(rèn)為需要產(chǎn)生保持天然E7蛋白的所有潛在CTL表位而同時喪失其細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)化性質(zhì)的免疫原性肽化合物。最后這些作者進(jìn)一步建議鑒于其致癌能力，應(yīng)增加重排的免疫原性肽化合物的無毒性，從而抑制天然E7蛋白與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤pRB蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域從E7的21號氨基酸到26號氨基酸，負(fù)責(zé)天然E7蛋白的致癌活性。然而，非致癌性免疫原性肽化合物的這種實施方案還沒有被具體地實現(xiàn)。
發(fā)明描述令人驚奇地，現(xiàn)在根據(jù)本發(fā)明表明可通過對編碼天然E7蛋白的DNA的定向誘變得到具有誘導(dǎo)對天然E7蛋白的特異免疫應(yīng)答的相同能力，甚至更高的能力的突變蛋白，并且其中天然E7蛋白的免疫抑制性質(zhì)已經(jīng)被阻斷。
從而第一次根據(jù)本發(fā)明表明，令人驚奇地，位于HPV-16乳頭瘤病毒的天然E7蛋白的氨基酸位置20(Thr或T)至氨基酸位置29(Asn或N)的區(qū)域中的肽片段負(fù)責(zé)所述蛋白的免疫抑制活性。
為了本發(fā)明公開的目的，當(dāng)氨基酸中一個或幾個氨基酸的不同之處位于序列SEQ ID No.3的天然E7蛋白的相應(yīng)20-29肽區(qū)域中時，與具有SEQID No.3的HPV-16天然E7蛋白相比至少一個氨基酸不同的蛋白被稱為根據(jù)本發(fā)明的“突變的”E7蛋白。
具體地，根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)表明與天然E7蛋白的序列SEQ ID No.3相比含有至少一個氨基酸，優(yōu)選至少2個氨基酸替代的突變E7蛋白已經(jīng)喪失了誘導(dǎo)以前關(guān)于天然E7蛋白所報導(dǎo)的免疫抑制的性質(zhì)。從而已經(jīng)表明與天然的E7蛋白的序列SEQ ID No.3相比24位半胱氨酸殘基被甘氨酸殘基替代(CYS24GLY)和26位谷氨酸殘基被谷氨酰胺殘基替代(GLU26GLN)的突變E7蛋白已經(jīng)喪失了天然E7蛋白的免疫抑制性質(zhì)。同樣，已經(jīng)表明與天然的E7蛋白的序列SEQ ID No.3相比24位半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代(CYS24SER)和26位谷氨酸殘基被谷氨酰胺殘基替代(GLU26GLN)的突變E7蛋白已經(jīng)喪失了天然E7蛋白免疫抑制性質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)表明含有與天然E7蛋白的SEQ ID No.3氨基酸序列相比，根據(jù)序列SEQ ID No.3的編號，在序列SEQ ID No.3氨基酸位置20到氨基酸位置29的相應(yīng)多肽區(qū)域中至少4個，優(yōu)選4、5、6、7、8、9或10個連續(xù)氨基酸缺失的突變E7蛋白已經(jīng)喪失了對天然E7蛋白所觀察到的免疫抑制性質(zhì)。
具體地，已經(jīng)表明含有根據(jù)序列SEQ ID No.3的編號，肽片段21(Asp或D)到26(Glu或E)缺失的突變E7蛋白已經(jīng)喪失了為天然E7蛋白觀察到的免疫抑制性質(zhì)。其相應(yīng)于天然E7蛋白的21號氨基酸到26號氨基酸缺失的突變E7蛋白為了本說明書的目的被稱為E7Δ21-26。
同樣，D’Anna等(2001，J.Natl.Cancer Inst.卷93(24)1843-1851)公開了通過遺傳重組產(chǎn)生的E7Δ21-26蛋白。
類似地，已表明根據(jù)序列SEQ ID No.3的編號，含有肽片段21(Asp或D)到25(Tyr或Y)缺失的突變E7蛋白已經(jīng)喪失了為天然E7蛋白觀察到的免疫抑制性質(zhì)。其相應(yīng)于天然E7蛋白的21到25號氨基酸區(qū)域缺失的突變E7蛋白為了本說明書的目的被稱為E7Δ21-25。
從而根據(jù)本發(fā)明表明天然E7蛋白的20-29肽區(qū)域中氨基酸的簡單替代使得可能阻斷為該天然蛋白觀察到的免疫抑制活性。從而，天然E7蛋白一級結(jié)構(gòu)的小改變(20-29號肽區(qū)域)破壞了天然E7蛋白的典型的免疫抑制性質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)?shù)鞍讓碜越臃N了抗破傷風(fēng)(破傷風(fēng)類毒素抗原)和/或白喉(“結(jié)核菌素純化的蛋白衍生物”或“PPD”型)疫苗的個體的人外周血單核細(xì)胞體外增殖抑制至少60％，優(yōu)選至少70％時，該蛋白是“免疫抑制的”，所述單核細(xì)胞增殖通過將所述細(xì)胞與(I)PPD抗原，(ii)類毒素破傷風(fēng)抗原，(iii)PPD抗原和類毒素破傷風(fēng)抗原的結(jié)合或者以及(iv)與相對于所述單核細(xì)胞為同種異體的細(xì)胞孵育進(jìn)行誘導(dǎo)。在這種試驗中，潛在免疫抑制蛋白使用的濃度為根據(jù)效果-劑量曲線誘導(dǎo)最大增殖抑制值的濃度。實施例6給出了這種試驗的闡述。
而且，當(dāng)這種蛋白誘導(dǎo)免疫抑制細(xì)胞因子的異常體外產(chǎn)生水平時是“免疫抑制的”，這些免疫抑制細(xì)胞因子分別是外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10和具有抗原的細(xì)胞(APC)產(chǎn)生的α-IFN或IL-10。
此外，如將在該公開的下文中進(jìn)一步詳述的和如在實施例中闡明的，上面的突變E7蛋白除了它們的非抑制性質(zhì)之外還共有刺激產(chǎn)生針對天然E7蛋白的“中和”抗體，即產(chǎn)生識別天然E7蛋白并阻斷對免疫系統(tǒng)的細(xì)胞有害的天然E7蛋白的免疫抑制活性的能力。根據(jù)本發(fā)明，包括根據(jù)實施例1中進(jìn)一步描述的試驗，當(dāng)抗-E7抗體阻斷天然E7蛋白刺激通過γ-IFN預(yù)處理的人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生α-TNF時，該抗-E7抗體稱為“中和的”抗體。
這些結(jié)果使得可定義突變E7蛋白家族，這些蛋白與天然E7蛋白的氨基酸序列相比都具有氨基酸突變、替代或缺失。
一般來說，根據(jù)本發(fā)明的非免疫抑制的“突變E7”蛋白含有以下氨基酸序列(從N末端到C末端)i.序列SEQ ID No.3的1-19位氨基酸序列；ii.具有(a)與SEQ ID No.3的相應(yīng)20-29位氨基酸序列相比至少一個，優(yōu)選至少2個氨基酸替代的氨基酸序列或者(b)與SEQ ID No.3的相應(yīng)20-29位氨基酸序列相比至少4個連續(xù)氨基酸缺失的氨基酸序列；和iii.SEQ ID No.3的30-98位氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，“含有”如上定義的氨基酸序列的突變E7蛋白為這樣的蛋白，其氨基酸序列“基本在于”上面提到的氨基酸序列。換句話說，根據(jù)本發(fā)明的突變E7蛋白可除了上面提到的氨基酸序列，還含有至多20個，優(yōu)選至多15個，優(yōu)選至多10個，最優(yōu)選至多6個氨基酸的一段或兩段額外的氨基酸序列，該額外的氨基酸序列分別位于區(qū)域(i)的N-末端或區(qū)域(ii)的C末端，并且在一些情況下位于區(qū)域(i)的N-末端和區(qū)域(ii)的C-末端。對于后一情況，位于區(qū)域(i)N末端的額外序列可以與位于C末端的額外序列不同，或者為相反情況，即兩個額外的序列可以是相同的。通常，根據(jù)本發(fā)明的突變E7蛋白含有與對其定義的上面的氨基酸序列相比，單個額外的氨基酸序列，如多(組氨酸)氨基酸序列，例如含有6個組氨酸殘基聚合物的序列。
從上面提到的定義得到根據(jù)本發(fā)明的突變E7蛋白具有與序列SEQ IDNo.3的相應(yīng)肽區(qū)域相同的2個氨基酸區(qū)域，它們分別是與序列SEQ ID No.3的天然E7蛋白中1到19號肽區(qū)域相同的氨基酸區(qū)域(i)和與序列SEQ IDNo.3的天然E7蛋白中30到98號肽區(qū)域相同的氨基酸區(qū)域(iii)。突變E7蛋白的中心氨基酸區(qū)(ii)與序列SEQ ID No.3的相應(yīng)20-29號肽區(qū)域相比，含有氨基酸的一處或多處替代，或另外地含有一個至少4個氨基酸的缺失。
根據(jù)第一個可變方案，突變E7蛋白的氨基酸區(qū)域(ii)與天然蛋白序列SEQ ID No.3的相應(yīng)20-29號肽區(qū)域相比，優(yōu)選含有至少2個氨基酸替代，并且可含有3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸替代。在其中突變E7蛋白的氨基酸區(qū)域(ii)含有10個氨基酸替代的實施方案中，突變E7蛋白的氨基酸區(qū)域(ii)與序列SEQ ID No.3的天然E7蛋白中20到29號肽區(qū)域完全不同。
為了得到根據(jù)本發(fā)明的突變E7蛋白，優(yōu)選進(jìn)行天然E7蛋白中20到29號肽區(qū)域中氨基酸的每個替代，從而突變E7蛋白中被替代的氨基酸屬于與相應(yīng)于天然E7蛋白的氨基酸不同的“類別”，其中分別為芳香族、疏水的、極性的、堿性的、酸性氨基酸類別或者小氨基酸，優(yōu)選如下-20位的Thr殘基被非Ala、Ser、Met和Gly的殘基替代；-21位的Asp殘基被非Glu的殘基替代；-22位的Leu殘基被非Ile和Val殘基替代；-23位的Tyr殘基被非Phe和Trp殘基替代；-24位的Cys殘基被任何不同的氨基酸殘基替代；-25位的Tyr殘基被非Phe和Trp的殘基替代；-26位的Glu殘基被非Asp的殘基替代；-27位的Gln殘基被非Asn殘基替代；-28位的Leu殘基被非Ile和Val的殘基替代；和-29位的Asn殘基被非Gln的殘基替代。
該氨基酸組由下面的氨基酸形成Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val，以及對它們一個或多個如下化學(xué)基團進(jìn)行化學(xué)修飾的衍生物，所述化學(xué)基團不參與結(jié)合本發(fā)明的突變E7蛋白序列中的另一個氨基酸。
優(yōu)選的突變E7蛋白質(zhì)家族包括在它們的24位Cys殘基和26位Glu被取代的蛋白質(zhì)家族。
第一個尤其優(yōu)選的含有兩個單核苷酸替代的突變E7蛋白是這樣的E7蛋白(CYS24GLY，GLU26GLN)。
第二個尤其優(yōu)選的含有兩個單核苷酸替代的突變E7蛋白是這樣的E7蛋白(CYS24SER，GLU26GLN)。
根據(jù)第二個可變方案，氨基酸區(qū)(ii)與序列SEQ ID No.3的相應(yīng)20-29號氨基酸序列相比含有5、6、7、8、9或10個連續(xù)氨基酸缺失。當(dāng)氨基酸區(qū)(ii)含有10個氨基酸缺失時，所述區(qū)域(ii)不含有任何氨基酸并且所得突變E7蛋白從N末端到C末端含有序列SEQ ID No.3的1-19區(qū)(i)，其通過肽結(jié)合直接與序列SEQ ID No.3的30-98區(qū)(iii)相連。
根據(jù)上面提到的第二個可變方案第一優(yōu)選的突變E7蛋白質(zhì)家族為與序列SEQ ID No.3的20-29號氨基酸相應(yīng)的序列相比含有區(qū)域(ii)中6個連續(xù)氨基酸缺失的蛋白質(zhì)家族。
根據(jù)本發(fā)明第三個優(yōu)選的突變E7蛋白在于在蛋白中其氨基酸序列含有天然E7蛋白中序列SEQ ID No.3的21到26號氨基酸缺失。這種突變E7蛋白，也稱作E7Δ21-26，具有氨基酸序列SEQ ID No.1并被序列SEQID No.2的核酸所編碼。E7Δ21-26蛋白的區(qū)域(ii)與序列SEQ ID No.3的20-29號氨基酸相應(yīng)的序列相比含有區(qū)域(ii)中6個連續(xù)氨基酸缺失。
根據(jù)上面提到的第二個可變方案第二優(yōu)選的突變E7蛋白質(zhì)家族為與序列SEQ ID No.3的20-29號氨基酸相應(yīng)的序列相比含有區(qū)域(ii)中5個連續(xù)氨基酸缺失的蛋白質(zhì)家族。
根據(jù)本發(fā)明第四個優(yōu)選的突變E7蛋白在于該蛋白具有其中氨基酸序列含有天然E7蛋白中序列SEQ ID No.3的相應(yīng)21-25號氨基酸缺失。這種突變的E7蛋白在本公開中也被稱作E7Δ21-25。E7Δ21-25蛋白的區(qū)域(ii)與序列SEQ ID No.3的20-29號氨基酸相應(yīng)的序列相比具有5個連續(xù)氨基酸缺失。
根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)表明編碼HPV-16突變E7蛋白(如上面定義的)的DNA的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)與合適的免疫佐劑組合時，能夠在小鼠中產(chǎn)生特異體液和細(xì)胞應(yīng)答，由此允許誘導(dǎo)可與通過天然E7蛋白誘導(dǎo)的相當(dāng)?shù)?如果不是更高的話)保護性抗腫瘤免疫。
如此處所用的，編碼突變E7蛋白的DNA的“表達(dá)產(chǎn)物”指宿主細(xì)胞中從編碼如此處上面定義的突變E7蛋白的DNA翻譯(或者相應(yīng)的RNA信使的翻譯)導(dǎo)致的蛋白。
此外，還表明編碼本發(fā)明HPV-16的突變E7蛋白的表達(dá)產(chǎn)物具有等于或高于天然E7蛋白的抗腫瘤治療活性。
而且，編碼本發(fā)明突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物一方面在于缺乏其直接的免疫抑制活性，另一方面在于誘導(dǎo)對癌性細(xì)胞分泌的天然E7蛋白所誘導(dǎo)的免疫抑制阻斷。
本發(fā)明的一個目的是提供誘導(dǎo)抗HPV-16乳頭瘤病毒的天然E7蛋白的免疫應(yīng)答而同時不誘導(dǎo)免疫抑制的免疫原性組合物，該組合物含有作為活性成分的如在本公開的上文中定義的非免疫抑制性突變E7蛋白，如果需要，與一種或多種賦形劑或佐劑組合在一起以得到生理可相容的免疫。
本發(fā)明還涉及對乳頭瘤病毒感染導(dǎo)致的癌癥沒有任何預(yù)防性或治療性免疫抑制性質(zhì)的疫苗組合物，其特征是該組合物含有與一種或多種生理可相容的免疫佐劑結(jié)合的如在本公開的上文中定義的作為活性成分的非免疫抑制性突變E7蛋白。
本發(fā)明還涉及如上文定義的非免疫抑制性突變E7蛋白的用途，用于制備免疫原性組合物或非免疫抑制的疫苗組合物和誘導(dǎo)產(chǎn)生中和天然E7蛋白的免疫抑制活性的抗體。
如在實施例中所闡明的，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物誘導(dǎo)針對表達(dá)天然E7蛋白的細(xì)胞，或者表達(dá)衍生自天然E7蛋白的肽的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性細(xì)胞免疫應(yīng)答。具體地，在實施例中表明根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物誘導(dǎo)針對表達(dá)天然E7蛋白或者衍生自天然E7蛋白的肽的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性細(xì)胞免疫應(yīng)答。
HPV-16天然E7蛋白的參考氨基酸序列為例如，Seedorf等(1985)公開的序列，其在Swissprot數(shù)據(jù)庫中的登錄號為P03129，并且其在本公開中被復(fù)制為序列SEQ ID No.3。編碼HPV-16天然E7蛋白的核酸含有核苷酸序列SEQ ID No.4。
突變E7蛋白(如在本公開中定義的)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的蛋白質(zhì)合成常規(guī)技術(shù)制備。
例如，可通過重組DNA技術(shù)，例如，通過在重組細(xì)菌細(xì)胞系統(tǒng)，如重組大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞中過表達(dá)編碼突變E7蛋白的核酸來制備該突變E7蛋白，如Kieder等(1996)和Tucker等(1996)所述。
也可通過化學(xué)合成，在均勻溶液中或者在固相中制備突變的E7蛋白。合適的化學(xué)合成技術(shù)的第一個例證是例如Houben Weyl所公開的(1974)。
而且，可通過化學(xué)合成技術(shù)在溶液或固相中通過連續(xù)偶聯(lián)將要被摻入的不同氨基酸殘基(在液相中從N末端到C末端，或者在固相中從C末端到N末端)來制備突變的E7蛋白，一種合成技術(shù)在于其中氨基酸殘基N末端和側(cè)鏈被事先通過合適的保護性化學(xué)基團封閉?？捎糜诤铣赏蛔僂7蛋白的這種技術(shù)的一個例證是如Merrifield(1965a；1965b)所公開的。
本發(fā)明所使用的核酸根據(jù)本發(fā)明，可通過翻譯編碼所述突變E7蛋白的核酸，例如，編碼SEQ ID No.1的突變E7蛋白的核酸來產(chǎn)生突變E7蛋白。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的任何核酸和任何多肽都是分離的或純化的形式。
術(shù)語“純化的”不需要物質(zhì)以絕對純的形式，排除任何其他化合物的存在而存在。其是相對定義。當(dāng)起始材料或者天然材料被純化至少1個數(shù)量級，優(yōu)選2或3個，優(yōu)選4或5個數(shù)量級時，那么多核苷酸或多肽處于純化的狀態(tài)。
表述“核酸”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”以及“核苷酸序列”包括處于單鏈形式或雙鏈體形式的RNA、DNA、cDNA序列以及至少兩種核苷酸的RNA/DNA雜交序列。
術(shù)語“核苷酸”指天然核苷酸(A、T、G、C)以及含有至少一種修飾，如(i)嘌呤類似物，(ii)嘧啶類似物或(iii)糖類似物的經(jīng)修飾核苷酸，這種經(jīng)修飾核苷酸在例如PCT申請WO 95/04064中公開。
為了本發(fā)明的目的，當(dāng)?shù)谝缓塑账岬拿恳粔A基與方向相反的第二多核苷酸的互補堿基偶聯(lián)時，認(rèn)為第一核苷酸與第二多核苷酸是“互補的”?；パa堿基為A和T(或A和U)，C和G。
根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，編碼序列SEQ ID No.1的突變E7蛋白的核酸含有核苷酸序列SEQ ID No.2。
如上定義的核酸主要用于實現(xiàn)產(chǎn)生相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物。
因此，編碼突變E7蛋白的核酸優(yōu)選地含有控制原核或真核宿主細(xì)胞中突變E7蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)性多核苷酸。
該調(diào)節(jié)性多核苷酸含有至少一個能夠啟動編碼突變E7蛋白的DNA在所選擇的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子序列。這種調(diào)節(jié)性多核苷酸也可以含有支持編碼突變E7蛋白的DNA表達(dá)的其他核苷酸序列，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的轉(zhuǎn)錄活化序列。
優(yōu)選地，選擇所謂的“可誘導(dǎo)的”啟動子，即對誘導(dǎo)劑存在應(yīng)答的啟動子，僅在存在誘導(dǎo)化合物時所述啟動子管理處于其控制下的DNA的轉(zhuǎn)錄。
LacZ啟動子是這種可誘導(dǎo)的啟動子的一個例證性實例。
根據(jù)本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA常規(guī)技術(shù)以制備如下文定義的核酸。這種技術(shù)由例如Sambrook等(1989)，Glover(1985)、Gait(1984)和Ausubel等(1989)公開。
置于如上定義的調(diào)節(jié)性多核苷酸控制下的含有編碼本發(fā)明突變E7蛋白的DNA的核酸包括在表達(dá)盒中。
表達(dá)盒這種表達(dá)盒除了含有調(diào)節(jié)編碼突變E7蛋白的DNA的多核苷酸外，還可含有能夠增加表達(dá)產(chǎn)物翻譯的位于可讀框5’側(cè)的非翻譯序列，即所謂的“前導(dǎo)”序列，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的所謂“終止子”序列。
最優(yōu)選地，如上文定義的表達(dá)盒還含有編碼信號肽的序列，為了產(chǎn)生包含所述信號肽和突變E7蛋白的融合蛋白，例如，為了所述信號肽和E7Δ21-26蛋白的融合蛋白的產(chǎn)生，以便有利于編碼突變E7蛋白的DNA表達(dá)產(chǎn)物的分泌和發(fā)現(xiàn)突變E7蛋白主要在細(xì)胞外，例如在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。優(yōu)選地，編碼信號肽的核苷酸序列位于緊挨編碼突變E7蛋白的核苷酸序列的5’側(cè)。
通常，如下文定義的表達(dá)盒還含有選擇性標(biāo)記多核苷酸，例如，his基因，以便確實地選擇被該多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
重組載體編碼突變E7蛋白的核酸(如在本公開中所定義的)如果需要，在被插入表達(dá)盒后，優(yōu)選被導(dǎo)入克隆和/或表達(dá)重組載體，該載體含有所述核酸或所述表達(dá)盒，如上面定義的表達(dá)盒。
如此處所用的，術(shù)語“載體”指處于單鏈形式或雙鏈形式的環(huán)狀或線性DNA或RNA分子。
重組載體可以為克隆載體或表達(dá)載體。
其可以是來自細(xì)菌或病毒的載體。
本發(fā)明優(yōu)選的細(xì)菌載體為例如pBR322載體(ATCC37017)或者如PAA233-3(Pharmacia，Uppsala，瑞典)和pGEM1(Promega Biotech，Madison，WI，USA)的載體。
已上市的載體的其他實例包括pQE70、pQE60、pWE9(Qiagen)、psiX174、pBluescript SA、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI、pSG(Stratagene)載體。
根據(jù)第一個實施方案，使用如上文定義的重組載體在轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞宿主后用于擴增被插入其中的核酸或表達(dá)盒。
根據(jù)第二個實施方案，其可以是含有如上面定義的核酸或表達(dá)盒的表達(dá)載體，目的是轉(zhuǎn)化所選擇的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生編碼本發(fā)明突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物。
如上面定義的重組載體還有利地含有具有適宜轉(zhuǎn)錄的啟動和中止序列。
如上面定義的表達(dá)盒是本發(fā)明重組載體的一個特定實施方案。
為了允許編碼本發(fā)明突變E7蛋白的核酸表達(dá)，如上面定義的核酸、表達(dá)盒或重組載體應(yīng)該被導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
重組宿主細(xì)胞為了實現(xiàn)如在本公開中定義的突變E7蛋白的一些產(chǎn)生模式，優(yōu)選使用被如上面定義的核酸、表達(dá)盒或重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞有利地為細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞，或者酵母細(xì)胞，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞。
被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞有利地為真核細(xì)胞。
一類優(yōu)選的重組宿主細(xì)胞為被根據(jù)本發(fā)明的核酸、表達(dá)盒以及重組載體轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞如小鼠細(xì)胞。
得到編碼E7Δ21-26蛋白的核酸的方法本發(fā)明公開了產(chǎn)生如在本公開中定義的編碼突變E7蛋白的核酸的方法，所示方法包括下面的步驟(a)對編碼天然E7蛋白的核酸進(jìn)行定向誘變，這通過分別將第一核苷酸引物和第二核苷酸引物與編碼天然E7蛋白的DNA的3’末端雜交而擴增所述核酸實現(xiàn)；和(b)回收所擴增的DNA。
第一核苷酸引物在其序列中含有編碼將要被插入起始天然E7蛋白氨基酸序列中的突變的密碼子序列。
從而，如果考慮制備其區(qū)域(ii)含有一個或多個單氨基酸替代的突變E7蛋白，那么第一引物的序列含有編碼將要被替代的一個或多個氨基酸的適宜密碼子。
根據(jù)另一個備選方案，如果考慮制備與序列SEQ ID No.3的20-29號氨基酸相應(yīng)序列相比，其區(qū)域(ii)含有4、5、6、8、9或10個連續(xù)氨基酸缺失的突變E7蛋白，那么第一引物在其序列中含有編碼緊挨將要被缺失的肽片段的N-末端氨基酸的第一個密碼子，所述第一個密碼子緊靠第二個密碼子前，所述第二個密碼子編碼緊挨將要被缺失的肽片段N末端氨基酸。
第一引物的使用使得可以擴增將要被產(chǎn)生的最終產(chǎn)物，其中期望的密碼子已經(jīng)被修飾，所述擴增終產(chǎn)物編碼目的突變E7蛋白。
擴增步驟(a)中使用的第二核苷酸引物除了含有與編碼天然E7蛋白的DNA的3’端雜交的序列外，還含有一個或多個內(nèi)切酶識別位點。
在例如通過限制性內(nèi)切酶，優(yōu)選在多克隆位點處進(jìn)行核苷酸切割事先打開宿主載體后，將編碼突變E7蛋白的核酸在預(yù)定的插入位點插入到克隆載體或者表達(dá)載體，例如通過將所述核酸與載體的核酸連接。
本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供含有突變E7蛋白(如在本公開中所定義的)的組合物，優(yōu)選含有所述突變E7蛋白的免疫原性組合物或者疫苗組合物。
含有本發(fā)明非免疫抑制性突變E7蛋白的組合物本發(fā)明的一個目的是提供含有本發(fā)明非免疫抑制性突變E7蛋白的組合物，如含有序列SEQ ID No.1的氨基酸序列的突變E7蛋白的組合物。
本發(fā)明的另一個目的是含有編碼本發(fā)明突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物，如SEQ ID No.2的E7Δ21-26蛋白的組合物。
根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)表明如在本公開中定義的突變E7蛋白缺乏免疫抑制性質(zhì)，如在實施例中所闡明的。
具體地，已經(jīng)表明E7Δ21-26蛋白當(dāng)與適宜的免疫佐劑結(jié)合被施用于哺乳動物時不誘導(dǎo)任何免疫抑制。
已經(jīng)表明突變的E7蛋白—分別為E7蛋白(CYS24GLY，GLU26GLN)和E7蛋白(CYS24SER，GLU26GLN)當(dāng)與適宜的免疫佐劑結(jié)合被施用于哺乳動物時不誘導(dǎo)免疫抑制。
如前面已經(jīng)簡略解釋的，編碼序列SEQ ID No.1的突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)與天然E7蛋白自身誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答至少相同數(shù)量級的針對天然E7蛋白的免疫應(yīng)答，并且本發(fā)明的突變E7蛋白對人免疫細(xì)胞缺乏天然E7蛋白的免疫抑制性質(zhì)。
因此本發(fā)明的另一個目的是提供HPV-16感染更特別是提供HPV-16誘導(dǎo)的癌癥的預(yù)防性或治療性藥物組合物，其特征在于其包含作為主要活性成分的編碼如上面定義的突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物，如果需要，其與一種或多種生理可相容的賦形劑結(jié)合。
優(yōu)選地，所述藥物組合物以適于每周施用用量為10到1000μg突變E7蛋白，或者編碼該突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物的形式存在。
根據(jù)本發(fā)明表明編碼序列SEQ ID No.1的突變E7蛋白的表達(dá)產(chǎn)物當(dāng)與適宜的免疫佐劑組合施用時，能夠產(chǎn)生針對天然E7蛋白的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而允許誘導(dǎo)針對腫瘤的預(yù)防性免疫性。此外，通過施用編碼突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物而導(dǎo)致的誘導(dǎo)抗腫瘤抗性狀況的保護性免疫等于或高于以前施用天然E7蛋白后得到的保護性免疫。
還表明編碼序列SEQ ID No.1的突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物在這種蛋白與適宜的免疫佐劑結(jié)合施用于已經(jīng)患有腫瘤的個體時能夠誘導(dǎo)治療性抗腫瘤免疫。由編碼突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)的治療性抗腫瘤免疫應(yīng)答明顯高于施用天然E7蛋白后可以得到的治療性抗腫瘤免疫應(yīng)答。
這些結(jié)果在實施例3中闡明，其中在鼠模型中表明，與施用天然E7蛋白動物的平均壽命相比較，通過編碼突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)的抗腫瘤治療性免疫使得可以延長動物的平均壽命1.5倍。
還表明通過編碼突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)的治療性抗腫瘤免疫是由于對特異體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的同時誘導(dǎo)。
從而，實施例的結(jié)果表明如在本公開中定義的突變E7蛋白能夠誘導(dǎo)針對天然E7蛋白的全身性體液應(yīng)答。更具體地還表明產(chǎn)生了高水平的IgG同種型抗E7抗體，主要是IgG2b和IgG1同種型抗體。
此外，在適宜的條件下，將本發(fā)明的突變E7蛋白施用于個體也使得可能誘導(dǎo)粘膜免疫性，如通過在實施例3中給出的IgA同種型抗體應(yīng)答的高水平所證明的。
此外，根據(jù)突變E7蛋白的基本特征，這種本身缺乏天然E7蛋白的任何直接免疫抑制活性的蛋白也允許通過用所述突變E7蛋白免疫后所產(chǎn)生抗體的中和特性阻斷癌細(xì)胞分泌的可溶E7蛋白的免疫抑制活性，如通過實施例2中的結(jié)果所證明的。
實施例的結(jié)果還表明本發(fā)明的突變E7蛋白允許特異識別天然E7蛋白的CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖，這種細(xì)胞增殖伴隨著γ-IFN細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生。
本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)針對HPV-16乳頭瘤病毒天然E7蛋白的免疫應(yīng)答，而不同時誘導(dǎo)免疫抑制的免疫原性組合物，所述組合物含有與一種或多種生理可相容的免疫賦形劑或佐劑結(jié)合的作為活性成分的非免疫抑制的突變E7蛋白，其氨基酸序列從N末端到C末端含有i.序列SEQ ID No.3的1-19號氨基酸序列；ii.(a)與序列SEQ ID No.3的20-29號相應(yīng)氨基酸相比具有至少一個氨基酸替代或者(b)與序列SEQ ID No.3的20-29號相應(yīng)氨基酸相比具有至少4個連續(xù)氨基酸缺失的氨基酸序列；和iii.序列SEQ ID No.3的30-98號氨基酸序列。
這種免疫原性組合物可以預(yù)防性使用，其目的是誘導(dǎo)針對HPV-16感染的保護性抗腫瘤免疫。
這種免疫原性組合物也可以用于治療或者治愈HPV-16感染，尤其是HPV-16感染導(dǎo)致的癌癥。
本發(fā)明還涉及如在本公開中定義的突變E7蛋白的用途，用于制備藥物組合物，或者用于制備如上文描述的免疫原性組合物。
本發(fā)明的另一個目的是旨在誘導(dǎo)抗HPV-16感染導(dǎo)致的癌癥的預(yù)防性保護性免疫或者治療性免疫，而阻斷天然E7蛋白誘導(dǎo)的免疫抑制狀況的藥物組合物或者免疫原性組合物的制備方法，其特征是其包括其中如上文定義的突變E7蛋白與一種或多種生理可相容的免疫佐劑組合的步驟。
本發(fā)明還涉及乳頭瘤病毒感染導(dǎo)致的癌癥的預(yù)防性或治療性疫苗組合物，其特征在于其包含與一種或多種生理可相容的免疫佐劑結(jié)合的作為活性成分的非免疫抑制性突變E7蛋白，其氨基酸序列從N末端到C末端含有i.序列SEQ ID No.3的1-19號氨基酸序列；ii.(a)與序列SEQ ID No.3的20-29號相應(yīng)氨基酸相比具有至少一個氨基酸替代或者(b)與序列SEQ ID No.3的20-29號相應(yīng)氨基酸相比具有至少4個連續(xù)氨基酸缺失的氨基酸序列；和
iii.序列SEQ ID No.3的30-98號氨基酸序列。
為了抵抗胞外E7蛋白誘導(dǎo)的對HPV-16感染的癌性細(xì)胞水平上局部免疫抑制，然后刺激針對這些癌性細(xì)胞的有效免疫應(yīng)答(這些癌性細(xì)胞的膜表面具有與MHC I類抗原結(jié)合的天然E7蛋白，或者胞內(nèi)成熟后衍生自天然E7蛋白的肽)，重要的是誘導(dǎo)能夠中和HPV-16病毒感染的癌性細(xì)胞所分泌的可溶E7蛋白產(chǎn)生的免疫抑制作用的抗體，特別是IgG同種型抗體的產(chǎn)生。此外，必須同時誘導(dǎo)能夠特異識別暴露于癌性細(xì)胞膜表面的天然E7蛋白或者由其衍生的的肽的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)保護，以便破壞這些細(xì)胞。為了實現(xiàn)這些目的，需要誘導(dǎo)全身性免疫應(yīng)答。
此外，由于人乳頭瘤病毒主要在粘膜癌，尤其是在肛門與生殖器癌，包括婦女的宮頸癌中被檢測到，因此重要的是通過在粘膜上誘導(dǎo)粘膜型免疫應(yīng)答，更特別地在局部水平刺激IgA同種型抗體的產(chǎn)生以實現(xiàn)全身性免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的預(yù)防性或治療性效果。
根據(jù)所要達(dá)到的目的，使用能夠使應(yīng)答指向全身免疫或粘膜免疫的免疫佐劑。
在全身免疫性佐劑中，優(yōu)選使用IFA型佐劑(不完全弗氏佐劑)、磷酸鈣或氫氧化鋁。也可使用丹麥Brenntay Biosector上市的QuilA佐劑。在粘膜免疫佐劑中，優(yōu)選使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的如霍亂毒素B(CTB)以及LT毒素突變體(LTμ)佐劑。
誘導(dǎo)全身型和/或粘膜型免疫應(yīng)答也受到本發(fā)明疫苗組合物的施用途徑影響。
從而，通過腸胃外、皮下或皮內(nèi)施用疫苗組合物將有助于誘導(dǎo)全身性免疫途徑，如果需要也伴隨著粘膜免疫反應(yīng)。
從而，局部水平上的本發(fā)明疫苗組合物的施用(例如通過鼻灌注，以及通過在粘膜表面的局部應(yīng)用)將有助于粘膜型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。
本發(fā)明的另一個目的是HPV-16感染導(dǎo)致的癌癥的預(yù)防性或治療性治療的方法，其特征在于包括其中患者被施用免疫有效量的如在本說明書中定義的疫苗組合物的步驟。
優(yōu)選地，患者被施用適于全身性和/或粘膜施用形式的針對需要該治療的受試者的預(yù)防或治療有效量的本發(fā)明疫苗組合物。突變E7蛋白或編碼突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物的施用劑量可以是10到1000μg，通過腸胃外途徑，每周一次，持續(xù)2個月，然后根據(jù)誘導(dǎo)的細(xì)胞或體液應(yīng)答的水平周期性地施用，例如每2到6個月施用。
根據(jù)第一個方面，本發(fā)明的疫苗組合物的特征在于其包含至少一種能夠優(yōu)選將免疫應(yīng)答導(dǎo)向產(chǎn)生中和野生型E7蛋白的免疫抑制活性的抗體的佐劑。
根據(jù)第一個特定實施方案，所述疫苗組合物的特征在于其包含至少一種能夠優(yōu)選將免疫應(yīng)答導(dǎo)向產(chǎn)生IgA同種型抗體的佐劑。
根據(jù)第二個優(yōu)選的實施方案，所述疫苗組合物的特征在于其包含至少一種能夠優(yōu)選將免疫應(yīng)答導(dǎo)向產(chǎn)生IgG同種型抗體的佐劑。
根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，所述疫苗組合物的特征在于其包含(i)能夠優(yōu)選將免疫應(yīng)答導(dǎo)向產(chǎn)生IgA同種型抗體的佐劑和(ii)能夠優(yōu)選將免疫應(yīng)答導(dǎo)向產(chǎn)生IgG同種型抗體的佐劑的組合。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的特征在于其包含至少一種能夠誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答這兩者的免疫佐劑。
優(yōu)選地，將尋找細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)，其特征尤其在于表達(dá)CD8抗原并特異識別野生E7蛋白，如在癌性細(xì)胞表明與MHC I類抗原結(jié)合的野生E7蛋白的T淋巴細(xì)胞的增殖。
根據(jù)本發(fā)明疫苗組合物的另一個特定實施方案，這種疫苗組合物可含有一種或多種其他HPV抗原性或免疫原性化合物。例如，在本發(fā)明的疫苗組合物中，編碼突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物可以與一種或多種HPV-16衣殼蛋白或者從此類衣殼蛋白得到的肽，尤其是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的HPV-16的L1和L2蛋白結(jié)合。
根據(jù)另一個特定實施方案，本發(fā)明的疫苗組合物可以含有能夠誘導(dǎo)針對與HPV-16不同的HPV型，優(yōu)選針對導(dǎo)致癌癥的HPV型，如HPV-18、31、33和51的細(xì)胞免疫應(yīng)答或體液免疫應(yīng)答的一種或多種抗原性或免疫原性化合物。
在本發(fā)明疫苗制劑的另一個特定實施方案中，編碼突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物可以與能夠誘導(dǎo)針對具有免疫抑制或血管生成性質(zhì)的可溶因子，如αIFN、βTGF、αTNF或甚至VEGF產(chǎn)生抗體的一種或多種抗原性或免疫原性化合物組合。優(yōu)選地，此類抗原性或免疫原性化合物分別為經(jīng)化學(xué)修飾的αIFN、βTGF、αTNF或VEGF以便誘導(dǎo)它們的免疫抑制性質(zhì)和/或穩(wěn)定它們。這種化學(xué)修飾(例如通過羧甲基化)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些化學(xué)修飾由Frankel等(1988)更具體地描述。
根據(jù)本發(fā)明疫苗組合物的這種特定實施方案的一個優(yōu)選方面，編碼突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物和至少一種抗原性或免疫原性化合物被化學(xué)相連以形成超級免疫原性化合物，如在以NEOVACS公司的名義在2001年8月10日提交的法國專利申請No.01/10751中所公開的。
復(fù)合超免疫原這種復(fù)合超免疫原含有物理上相互連接的兩個不同的免疫原性多肽，兩個多肽分別在于(a)第一免疫原性多肽，其誘導(dǎo)抗HPV-16細(xì)胞病原性抗原結(jié)構(gòu)的細(xì)胞免疫反應(yīng)或細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)；(b)第二免疫原性多肽，其誘導(dǎo)產(chǎn)生抗基質(zhì)局部循環(huán)蛋白的中和或阻斷抗體，所述基質(zhì)局部循環(huán)蛋白為細(xì)胞因子或者具有免疫毒性或血管生成性質(zhì)的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，此類因子由癌性細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞和具有抗原的細(xì)胞(APC)產(chǎn)生。
根據(jù)本發(fā)明使用的復(fù)合超免疫原被稱為“雙功能的”，因為兩種多肽(a)和(b)(它們是構(gòu)造該超免疫原的兩個基本部分)使得可以同時誘導(dǎo)針對兩種不同靶標(biāo)—病原性抗原性結(jié)構(gòu)和基質(zhì)的局部循環(huán)蛋白—的免疫反應(yīng)。然而，本發(fā)明的雙功能復(fù)合超免疫原在其結(jié)構(gòu)中可分別地含有多肽(a)和/或多肽(b)的許多拷貝。
構(gòu)成本發(fā)明復(fù)合超免疫原性化合物的多肽(a)和多肽(b)之所以被稱為相互“物理連接的”是因為它們在所有情況下均包括在相同物理結(jié)構(gòu)、分子或顆粒(微?；蚣{粒)中，其中它們在一定程度上相互分開。由于它們在復(fù)合超免疫原中被物理相互連接，多肽(a)和多肽(b)被一起呈遞給相同的具有免疫能力的細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞、T或B淋巴細(xì)胞。
根據(jù)復(fù)合超免疫原的第一個優(yōu)選的實施方案，多肽(a)和(b)分別選自-多肽(a)HPV-16乳頭瘤病毒的L1和L2蛋白，如果需要被脫毒或穩(wěn)定化，這些蛋白的免疫原性片段，或者從中衍生的免疫原性蛋白(LeBuanec等，1999)。
-多肽(b)本發(fā)明的突變E7蛋白，例如，序列SEQ ID No.1的突變E7蛋白。
根據(jù)復(fù)合超免疫原的第二個優(yōu)選的實施方案，多肽(a)和(b)分別選自-多肽(a)本發(fā)明的突變E7蛋白，例如，序列SEQ ID No.1的突變E7蛋白。
-多肽(b)IFNα、TGFβ、TNFα和VEGF蛋白，如果需要被脫毒或穩(wěn)定化，這些蛋白的免疫原性片段，或者從中衍生的免疫原性蛋白。
根據(jù)一個有利的實施方案，本發(fā)明還涉及含有通過突變E7蛋白的身份區(qū)別的幾種復(fù)合超免疫原(多肽(a)或多肽(b)，依賴于復(fù)合超免疫原的類型)的組合物。
為了制備根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合超免疫原，通過化學(xué)途徑或者通過遺傳重組在多肽(a)和多肽(b)之間產(chǎn)生偶聯(lián)。
在本發(fā)明的免疫原性肽偶聯(lián)物的一個特定實施方案中，多肽(a)和(b)相互之間直接共價相連，例如通過肽-CO-NH連接相連。
然而，為了在免疫原性肽偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生一些彈性，更尤其為了允許免疫原性肽偶聯(lián)物中關(guān)于相互的多肽(a)和(b)的空間具有一定的可動性，優(yōu)選其中多肽(a)和(b)在所述偶聯(lián)物中通過間隔鏈相互分開的肽偶聯(lián)物。
根據(jù)免疫原性肽偶聯(lián)物的第一個優(yōu)選的實施方案，多肽(a)和(b)在所述偶聯(lián)物中通過選自SMCC或SIAB(兩種都是雙功能化合物)的間隔鏈相互分開。
SIAB化合物由HermansonG.T.(1996，Bioconjugate techniques，SanDiegoAcademic Press，239-242頁)描述，其是具有下式(I)的化合物 SIAB化合物含有兩個反應(yīng)基團，分別是碘代乙酸基團和硫代-NHS酯基團，這些基團分別與氨基和巰基反應(yīng)。
SMCC化合物由Samoszuk M.K.等(1989，Antibody，Immunoconjugates Radiopharm.，2(1)37-46)描述，是具有下式(II)的化合物 SMCC化合物含有兩個反應(yīng)基團，分別是硫代-NHS酯基團和馬來酰亞胺基團，分別與氨基和巰基基團反應(yīng)。
根據(jù)第二個優(yōu)選的實施方案，復(fù)合超免疫原含有包含線性間隔肽的間隔鏈。優(yōu)選地所選的線性間隔肽長3到30個氨基酸，優(yōu)選5到20個氨基酸，最優(yōu)選7到15個氨基酸。
優(yōu)選地，線性間隔肽基本上甚至唯一地由帶正電或負(fù)電的氨基酸組成，pH等于7以增加所述復(fù)合超免疫原的總親水性。應(yīng)該理解應(yīng)避免施用含有疏水氨基酸的間隔肽。優(yōu)選地，間隔肽的特征是其由3到30個賴氨酸殘基，優(yōu)選5到20，最優(yōu)選7到15個賴氨酸殘基長的聚(賴氨酸)鏈組成。
根據(jù)本發(fā)明復(fù)合超免疫原的另一個實施方案，在所述肽偶聯(lián)物中，多肽(a)和(b)通過由一個分枝的間隔肽，優(yōu)選聚(賴氨酸)寡樹枝狀結(jié)構(gòu)(如Basak等(1995)所描述的)組成的間隔鏈相互分開。
在本發(fā)明復(fù)合超免疫原的后一個實施方案中，所述肽偶聯(lián)物中每個偶聯(lián)物分子可含有多肽(a)和(b)的幾份拷貝，有利地，多肽(a)和(b)的2到8份拷貝，優(yōu)選地，每個偶聯(lián)物分子中的每個多肽(a)和(b)具有不超過4份的拷貝。
多肽(a)和(b)也可以被包括在單個物理結(jié)構(gòu)中，例如直徑10到500納米，優(yōu)選10到200納米，最優(yōu)選10到100納米的納顆粒上，例如如Aucouturier等(2001)描述的IMS的納顆粒，如Skaugrud等(1999)描述的脫乙酰殼多糖的納顆粒，脂質(zhì)體或生物可降解顆粒(如Baras等(1999)描述的酸性聚交酯(PLA)、聚-ε-己內(nèi)酯(PLC)或聚(丙交酯-共-乙醇酸交酯))的納顆粒。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，多肽(a)和(b)在單個載體結(jié)構(gòu)中被物理相連，使得它們可同時被呈遞到免疫系統(tǒng)的細(xì)胞上。在這個特定實施方案中，多肽(a)和(b)被固定在納顆粒，例如脫乙酰殼多糖、由直徑100到300納米的脂質(zhì)納顆粒組成的IMS(可從法國的Seppic公司得到的免疫調(diào)節(jié)劑)或脂質(zhì)體上。
優(yōu)選地，這種納顆粒具有小的尺寸，從而同時將多肽(a)和(b)呈遞到細(xì)胞，就像這些多肽在相同的分子中被共價連接一樣。有利地，納顆粒的直徑為10到1000nm，優(yōu)選10到500nm，更優(yōu)選10到300nm，最優(yōu)選10到200nm。
含有編碼本發(fā)明突變E7蛋白的核酸的疫苗組合物本發(fā)明的另一個目的是提供沒有預(yù)防性或治療性免疫抑制性質(zhì)的用于乳頭瘤病毒感染導(dǎo)致癌癥的免疫原性組合物或者疫苗組合物，其特征是該組合物含有免疫有效量的編碼如在本公開中定義的突變E7蛋白的核酸、如在本公開中定義的表達(dá)盒或者重組載體。
為了實現(xiàn)上面提到的疫苗組合物，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或者腺伴隨病毒載體(AAV)被優(yōu)選作為表達(dá)載體。這種腺伴隨病毒載體為例如Flotte等(1992)，Samulski等(1989)或者M(jìn)cLaughlin等(1996)描述的腺伴隨病毒載體。為了將核酸、表達(dá)盒或載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以有利地利用各種技術(shù)，如磷酸鈣沉淀技術(shù)(Graham等，1973，Chen等，1987)、葡聚糖DEAE(Gopal，1985)、電穿孔(Turkaspa，1986，Potter等1984)、直接微注射(Harland等，1985)或者裝載DNA的脂質(zhì)體(Nicolau等，1987；Fraley等，1980)。
根據(jù)一個特定實施方案，將本發(fā)明的核酸或表達(dá)盒體內(nèi)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，尤其是來自哺乳動物的宿主細(xì)胞的方法包括將含有在藥學(xué)可接受載體中的核酸或表達(dá)盒的制劑通過對所選組織，例如平滑肌組織或粘膜組織進(jìn)行局部注射導(dǎo)入，核酸和表達(dá)盒被這種組織的細(xì)胞吸收。
體外或體內(nèi)使用含有“裸”核酸或表達(dá)盒的組合物為，例如，在PCT申請WO 95/11307以及Tacson等(1996)和Huygen等(1996)的文章中公開的組合物。
其也可以是腺病毒載體，如2或5型人腺病毒載體。
注射到所選宿主生物體的載體量依賴于注射部位。作為說明，在患者身體中可注射約10μg到1000μg編碼本發(fā)明突變E7蛋白的核酸或表達(dá)盒。
適用于抗腫瘤被動接種的組合物如在本公開中清除地闡明的，為了阻斷HPV-16感染的癌性細(xì)胞分泌的E7蛋白的免疫抑制性質(zhì)，全身性抗體或粘膜抗體的產(chǎn)生是必需的。
對于含有本發(fā)明突變E7蛋白的疫苗組合物或者含有編碼突變E7蛋白的核酸、表達(dá)盒或重組載體的疫苗組合物被治療性地使用，即HPV-16感染之后使用這一情況，有利地是快速阻斷癌性細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的E7蛋白的免疫抑制作用以便有助于通過所述疫苗組合物快速誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其目的是進(jìn)一步增加其效率。
通過使用與一種或多種免疫佐劑結(jié)合的作為抗原性或免疫原性化合物的本發(fā)明突變E7蛋白對人或動物免疫后得到的有效量針對天然E7蛋白的中和抗體施用于患者可以實現(xiàn)對受感染細(xì)胞所產(chǎn)生的E7蛋白的免疫抑制作用進(jìn)行早期阻斷。
本發(fā)明還涉及分離可中和HPV-16天然E7蛋白的免疫抑制作用的抗體的方法，特征在于其包括使用本發(fā)明的突變E7蛋白免疫哺乳動物(包括人)，然后回收所得抗體的步驟。
本發(fā)明還涉及抗本發(fā)明的突變E7蛋白的抗體。這種抗體更具體的特征在于它們是中和性的，即它們中和天然E7蛋白的免疫抑制作用。
本發(fā)明的另一個目的是含有中和HPV-16天然E7蛋白尤其是中和受HPV-16感染的細(xì)胞分泌的E7蛋白的免疫抑制作用的抗體的藥物組合物，所述抗體抗本發(fā)明的突變E7蛋白。
還涉及用于抗HPV-16感染，包括抗HPV-16感染導(dǎo)致的癌癥的被動接種組合物，其為含有如上定義的抗體的組合物。
為了檢查本發(fā)明抗體的中和能力，本領(lǐng)域技術(shù)人員可有利地參考實施例1中描述的試驗，其包括定量暴露于天然E7蛋白的人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的α-IFN或α-TNF的抑制百分?jǐn)?shù)。
本發(fā)明的另一個目的是阻斷HPV-16病毒感染的細(xì)胞所產(chǎn)生E7蛋白的免疫抑制作用的方法，其特征是患者被施用中和量的用如在本公開中定義的突變E7蛋白免疫人或動物后得到的抗體。
待施用于患者的抗體的“中和量”依賴于HPV感染程度。通常，在實施例1中描述的免疫抑制試驗中，患者被施用的中和抗體的量對應(yīng)于需要阻斷免疫抑制量的天然E7蛋白的中和抗體的量，為從100ng到1mg。
抗體可以是IgA同種型或IgG同種型抗體。它們可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的抗體也包括F(ab’)2或F(ab)片段。
含有用本發(fā)明的突變E7蛋白處理的樹突狀細(xì)胞的疫苗組合物樹突狀細(xì)胞是在T細(xì)胞免疫啟動中特化的抗原呈遞細(xì)胞(APC)。T細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)需要樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的物理接觸。樹突狀細(xì)胞通過兩個信號步驟活化給定抗原的特異免疫應(yīng)答。第一個信號步驟涉及抗原性肽-MHC/T細(xì)胞受體(TCR)相互作用。第二個信號步驟涉及共-刺激分子，如細(xì)胞表面標(biāo)記或細(xì)胞因子。
樹突狀細(xì)胞當(dāng)呈遞抗原到T細(xì)胞時產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，影響細(xì)胞因子微環(huán)境，然后導(dǎo)致免疫應(yīng)答。
更特別地，公知用樹突狀細(xì)胞接種使得可以打破針對腫瘤細(xì)胞的免疫系統(tǒng)耐受性和通過Th1型T細(xì)胞免疫應(yīng)答的刺激在宿主生物體中誘導(dǎo)腫瘤的裂解，至少隨著腫瘤發(fā)展沒有相伴的免疫抑制情況。
根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)表明個體的樹突狀細(xì)胞群體與適量的突變E7蛋白(如在本公開中定義的)的體外孵育使樹突狀細(xì)胞能夠隨后將所述的突變E7蛋白呈遞到從同一個體得到的自體單核細(xì)胞群體中的T細(xì)胞，并且誘導(dǎo)E7蛋白的特異T細(xì)胞的活化，這可通過這種T細(xì)胞的增殖來顯現(xiàn)。可通過例如在實施例中闡明的[3H]胸苷的胞內(nèi)摻入量來測定T細(xì)胞的活化。
在類似的但是其中樹突狀細(xì)胞事先與天然E7蛋白體外孵育的實驗中，沒有觀察到T細(xì)胞活化，如在缺乏外來抗原時孵育的對照樹突狀細(xì)胞的群體中一樣。在這種系統(tǒng)中，可再一次觀察到天然E7蛋白的免疫抑制活性。
相反，本發(fā)明的突變E7蛋白缺乏任何免疫抑制活性并允許誘導(dǎo)抗天然E7蛋白的有效特異T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的另一個目的是提供缺乏對乳頭瘤病毒導(dǎo)致的癌癥產(chǎn)生預(yù)防性或治療性免疫抑制性質(zhì)的疫苗組合物，其特征在于其包含適宜量的作為活性成分的針對所要治療個體的自體或同種異體的樹突狀細(xì)胞，所述自體樹突狀細(xì)胞已經(jīng)被與如在本發(fā)明中定義的突變E7蛋白孵育，從而使得能夠?qū)⒃撍鐾蛔僂7蛋白呈遞給特異識別該蛋白的T細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個目的是預(yù)防或治療乳頭瘤病毒感染導(dǎo)致的癌癥的方法，其特征是其包括以下步驟個體被施用合適量針對所要治療的個體的自體(等基因的)或同種異體的樹突狀細(xì)胞，所述自體(等基因的)或同種異體的樹突狀細(xì)胞在被施用于個體前已經(jīng)與如在本公開中定義的突變E7蛋白孵育，從而使得能夠?qū)⒃撍鐾蛔兊腅7蛋白呈遞給特異識別該蛋白的T細(xì)胞。
優(yōu)選地，通過對從人外周血淘洗制備的單核細(xì)胞進(jìn)行分化得到樹突狀細(xì)胞，該人外周血是患者的血液或者來自與患者共有主要組織相容性復(fù)合體的單倍型，如HLA-A2單倍型的個體的血液。
優(yōu)選地，樹突狀細(xì)胞一旦從患者得到，就被培養(yǎng)在用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的適宜培養(yǎng)基，如HL1培養(yǎng)基(Bio Whittaker)中，如果需要培養(yǎng)基被加入谷氨酰胺，任選一種或多種抗生素如鏈霉素，并在37℃培養(yǎng)箱的濕潤空氣中以5％(V/V)CO2進(jìn)行培養(yǎng)。
然后將培養(yǎng)物中樹突狀細(xì)胞與選擇量的，優(yōu)選5到50μg/ml突變E7蛋白一起孵育。
優(yōu)選地，樹突狀細(xì)胞與突變的E7蛋白孵育，與每106個樹突狀細(xì)胞孵育的突變E7蛋白的量為1到50μg。
優(yōu)選地，將要被治療的患者被施用101到500×106個用本發(fā)明的突變E7蛋白處理的樹突狀細(xì)胞。
有利地，通過經(jīng)過腸胃外途徑的注射將用突變E7蛋白處理的樹突狀細(xì)胞單次施用于患者。如果需要，根據(jù)導(dǎo)致的抗E7免疫應(yīng)答的強度，可以對患者施用多次注射，例如，每月、每兩個月、每季度或每年兩次施用被處理的樹突狀細(xì)胞。
還通過下面的附圖和實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明而對本發(fā)明沒有限制。


圖1是E7Δ21-26制劑免疫之前和之后小鼠血清抗E7 IgG抗體滴度圖；圖2是E7Δ21-26制劑免疫之前和之后小鼠血清抗E7 IgG抗體的中和百分率圖；圖3是未免疫小鼠脾細(xì)胞和用E7Δ21-26制劑免疫后的小鼠脾細(xì)胞在存在天然E7蛋白培養(yǎng)時的Ip增殖指數(shù)圖；圖4是未免疫小鼠脾細(xì)胞和用E7Δ21-26制劑免疫后的小鼠脾細(xì)胞在存在天然E7蛋白培養(yǎng)時的γ-IFN圖；圖5到8顯示了E7Δ21-26制劑免疫之前和之后小鼠血清抗E7 IgG抗體的滴度圖和小鼠血清抗E7 IgG抗體的中和百分率圖9到10顯示了E7Δ21-26制劑免疫之前和之后小鼠血清抗E7 IgG抗體的滴度圖和小鼠血清抗E7 IgG抗體的中和百分率圖；圖11是顯示E7Δ21-26制劑免疫之前和之后小鼠陰道分泌物中存在的IgA圖。
圖12和13顯示了E7Δ21-26制劑免疫之前和之后小鼠血清抗E7 IgG抗體的滴度圖和小鼠血清抗E7 IgG抗體的中和百分率圖；圖14是顯示E7Δ21-26制劑免疫之前和之后小鼠陰道分泌物中存在的IgA圖。
圖15是顯示將C3細(xì)胞注射到用或不用E7Δ21-26制劑免疫的小鼠中的腫瘤生長圖。
圖16闡明了顯示在接受7×103個表達(dá)HPV-16 E7的C3細(xì)胞的小鼠中C3腫瘤的發(fā)育圖；圖16A代表對照小鼠，而圖B代表用E7Δ21-26處理的小鼠；橫坐標(biāo)代表注射C3細(xì)胞后的天數(shù)；縱坐標(biāo)代表腫瘤表面；圖17闡明了顯示在接受“9×103”個表達(dá)HPV-16 E7的C3細(xì)胞的小鼠中C3腫瘤的發(fā)育的圖；圖18是顯示了混合淋巴反應(yīng)水平的圖，該反應(yīng)水平通過用對照樹突狀細(xì)胞(空菱形)、用天然E7蛋白預(yù)處理(滿圓形)或用E7Δ21-26蛋白預(yù)處理(陰影線的正方形)的樹突狀細(xì)胞刺激效應(yīng)者單核細(xì)胞的增殖水平來測量?？v坐標(biāo)給出了通過[3H]胸苷的摻入顯現(xiàn)的效應(yīng)者單核細(xì)胞的增殖，而橫坐標(biāo)給出了刺激細(xì)胞數(shù)(樹突狀細(xì)胞)與效應(yīng)細(xì)胞數(shù)(T細(xì)胞)之間的比。
實施例1全身性(體液和細(xì)胞)免疫應(yīng)答實施例1.1存在弗氏完全(ACF)和不完全(AIF)佐劑時E7Δ21-26蛋白的免疫原活性存在ACF和AIF時對購自Charles River的6周齡C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究E7Δ21-26制劑的免疫原性(體液和細(xì)胞)活性。
A.材料與方法在第0天，一組6只小鼠通過肌內(nèi)途徑接受0.2ml(50μg)ACF乳液注射。在第21天和60天進(jìn)行AIF 5μg加強注射。
在第一次注射前2天和在最后一次免疫后12天從每只小鼠眼球后采集血樣。
8只對照小鼠接受相同的無免疫原制劑。
3只小鼠接受100μg制劑并在注射后的7天期間研究疾病癥狀的缺乏。
將小鼠在最后一次免疫12天后用C3細(xì)胞刺激。C3細(xì)胞是來自C57BL/6，用完整HPV16基因組和ras癌基因轉(zhuǎn)化的胚胎細(xì)胞(Feltkamp，M.C.，H.L.Smits，M.P.Vierboom，R.P.Minnaar，B.M.de Jongh，J.W.Drijhout，J.terSchegget，C.J.Melief和W.M.Kast.1993.用含有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位的肽接種保護免受人乳頭瘤病毒16型轉(zhuǎn)化的細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤，Eur.J.Immunol.232242-2249)。它們在含有7％CO2的濕潤空氣中于37℃下在加入10％FCS、50U/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素和250ng/ml兩性霉素B的DMEM培養(yǎng)基(Bio-Whittaker)中培養(yǎng)。將欲注射到小鼠的細(xì)胞在從使用胰蛋白酶的塑料制品移走后用無血清的培養(yǎng)基洗滌。
制劑毒性的缺乏通過缺乏臨床跡象(行為、頭發(fā)、體重)和通過尸檢后的解剖學(xué)研究來測量。
B.結(jié)果在存在ACF和AIF時通過E7Δ21-26制劑免疫的小鼠沒有顯示出任何臨床跡象并且無解剖學(xué)損傷。
用100μg制劑免疫的三只小鼠中沒有一只在注射7天后顯示出任何疾病癥狀。
通過體液應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答測量免疫應(yīng)答1.體液應(yīng)答血清中抗天然E7重組蛋白的IgG型抗體的存在通過ELISA測定并以滴度(給出高于0.3的光密度的稀釋度的倒數(shù))表達(dá)。
圖1在存在ACF和AIF時通過E7Δ21-26制劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgG型抗體滴度。
使用下面的免疫抑制試驗測量這種抗體的中和活性。在-2天和72天采集的血清的1/50稀釋液與50ng/ml天然E7孵育2小時。然后將這些稀釋液應(yīng)用于用γ-IFN預(yù)處理16小時的人巨噬細(xì)胞。培養(yǎng)24小時后，回收培養(yǎng)上清液并通過ELISA試驗、DTA50 DuoSet(R&D)測量產(chǎn)生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白誘導(dǎo)α-TNF的表達(dá)，而非中和血清允許該細(xì)胞因子的合成。
結(jié)果以中和％給出。
圖2存在ACF然后是AIF時通過E7Δ21-26制劑誘導(dǎo)的抗體具有非常高的中和能力。
2.細(xì)胞應(yīng)答2.1細(xì)胞增殖將來自免疫小鼠和對照小鼠的脾細(xì)胞分離然后以100,000個細(xì)胞/孔培養(yǎng)于存在天然E7的微培養(yǎng)板的圓底孔中。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃裝有5％CO2的濕潤空氣中繼續(xù)6小時。孵育結(jié)束前18小時，加入0.5μCi氚化的胸苷/孔。免疫應(yīng)答的強度與Ip增殖指數(shù)成比例。
Ip＝給定抗原的spm(脈沖(strokes)/分鐘)/對照smp圖3從存在ACF和AIF時用E7Δ21-26制劑免疫的小鼠得到的脾細(xì)胞當(dāng)體外用天然E7蛋白活化時增殖。
2.2.γ-IFN的產(chǎn)生使用ELISA試驗(LO-IMEX，比利時)，在培養(yǎng)72小時后確定存在10μg/ml天然E7時培養(yǎng)的脾細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中γIFN的存在，如以前描述的進(jìn)行(De Smedt，T.，B.Pajak，E.Muraille，L.Lespagnard，E.Heinen，P.De Baetselier，J.Urbain，O.Leo和M.Moser.1996.通過脂多糖體內(nèi)調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞數(shù)及成熟.J.Ex.Med.1841413-1424)。這些結(jié)果以IU/ml表達(dá)。
圖4從存在ACF然后是AIF時用E7Δ21-26制劑免疫的小鼠得到的脾細(xì)胞當(dāng)體外用天然E7蛋白活化時產(chǎn)生大量γIFN。
實施例1.2存在弗氏不完全佐劑(AIF)時E7Δ21-26蛋白的免疫原性活性存在AIF時對從Charles River購買的6周齡C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究E7Δ21-26制劑的免疫原性(體液)活性。
A.材料與方法在第0天，一組6只小鼠通過肌內(nèi)途徑接受存在1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的0.2ml(50μg)AIF乳液注射。在第21天和60天進(jìn)行AIF5μg加強注射。
在第一次注射前2天和在最后一次免疫后12天從每只小鼠眼球后采集血樣。
6只對照小鼠接受相同的無免疫原制劑。
3只小鼠接受100μg制劑并在注射后的7天期間研究疾病癥狀的缺乏。
制劑毒性的缺乏通過缺乏臨床跡象(行為、頭發(fā)、體重)和通過尸檢后的解剖學(xué)研究來測量。
B.結(jié)果在存在AIF時通過E7Δ21-26制劑免疫的小鼠沒有顯示出任何臨床跡象并且無解剖學(xué)損傷。
用100μg制劑免疫的三只小鼠中沒有一只在注射后7天期間顯示出任何疾病癥狀。
通過體液應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答測量免疫應(yīng)答1.體液應(yīng)答血清中抗天然E7重組蛋白的IgG型抗體的存在通過ELISA測定并以滴度(給出高于0.3的光密度的稀釋度的倒數(shù))表示。
圖5在存在AIF時通過E7Δ21-26制劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgG型抗體滴度。
使用下面的免疫抑制試驗測量這種抗體的中和活性。在-2天和72天采集的血清的1/50稀釋液與50ng/ml天然E7孵育2小時。然后將這些稀釋液應(yīng)用于用γ-IFN預(yù)處理16小時的人巨噬細(xì)胞。培養(yǎng)24小時后，回收培養(yǎng)上清液并通過ELISA試驗、DTA50 DuoSet(R&D)測量產(chǎn)生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白誘導(dǎo)α-TNF的表達(dá)，而非中和血清允許該細(xì)胞因子的合成。
結(jié)果以中和％給出。
圖6存在AIF時通過E7Δ21-26制劑誘導(dǎo)的抗體具有非常高的中和能力。
實施例1.3存在弗氏不完全佐劑(AIF)時包埋于脫乙酰殼多糖納顆粒中的E7Δ21-26的免疫原活性存在AIF時對從Charles River購買的6周齡C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究包埋于脫乙酰殼多糖納顆粒中的E7Δ21-26制劑的免疫原(體液)活性。
A.材料與方法在第0天，一組6只小鼠通過肌內(nèi)途徑接受存在1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的0.2ml(50μg)AIF乳液注射。在第21天和60天進(jìn)行AIF5μg加強注射。
在第一次注射前2天和在最后一次免疫后12天從每只小鼠眼球后采集血樣。
6只對照小鼠接受相同的無免疫原制劑。
3只小鼠接受100μg制劑并在注射后的7天期間研究疾病癥狀的缺乏。
制劑毒性的缺乏通過缺乏臨床跡象(行為、頭發(fā)、體重)和通過尸檢后的解剖學(xué)研究來測量。
B.結(jié)果存在AIF時通過包埋于脫乙酰殼多糖納顆粒中的E7Δ21-26制劑免疫的小鼠沒有顯示出任何臨床跡象并且無解剖學(xué)損傷。
用100μg制劑免疫的三只小鼠中沒有一只在注射后7天顯示出任何疾病癥狀。
通過體液應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答測量免疫應(yīng)答1.體液應(yīng)答血清中抗天然E7重組蛋白的IgG型抗體的存在通過ELISA測定并以滴度(給出高于0.3的光密度的稀釋度的倒數(shù))表示。
圖7存在AIF時通過包埋于脫乙酰殼多糖納顆粒中E7Δ21-26制劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgG型抗體滴度。
使用下面的免疫抑制試驗測量這種抗體的中和活性。在-2天和72天采集的血清的1/50稀釋液與50ng/ml天然E7孵育2小時。然后將這些稀釋液應(yīng)用于用γ-IFN預(yù)處理16小時的人巨噬細(xì)胞。培養(yǎng)24小時后，回收培養(yǎng)上清液并通過ELISA試驗、DTA50 DuoSet(R&D)測量產(chǎn)生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白誘導(dǎo)α-TNF的表達(dá)，而非中和血清允許該細(xì)胞因子的合成。
結(jié)果以中和％給出。
圖8存在AIF時通過包埋于脫乙酰殼多糖納顆粒中的E7Δ21-26制劑誘導(dǎo)的抗體具有非常高的中和能力。
實施例2全身性和粘膜免疫應(yīng)答實施例2.1存在IMS 1113(SEPPIC)時E7Δ21-26蛋白的免疫原活性存在IMS 1113(SEPPIC)時對從Charles River購買的6周齡C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究E7Δ21-26制劑的免疫原(體液)活性。
A.材料與方法在第0天，一組6只小鼠通過肌內(nèi)途徑注射存在IMS 1113和1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的0.2ml含有50μg E7Δ21-26，以及通過鼻內(nèi)途徑給予的20μg相同制劑。
在第7、14和21天，這些小鼠通過鼻內(nèi)途徑接受20μl，即20μg IMS1113制劑。
在第60天，這些小鼠接受0.2ml含有5μg IMS 1113制劑的注射和通過鼻內(nèi)途徑的20μl含有20μg的相同制劑。
在第一次注射前2天和在最后一次免疫后12天從每只小鼠眼球后采集血樣。
6只對照小鼠接受相同的無免疫原制劑。
3只小鼠接受100μg制劑并在注射后的7天中研究疾病癥狀的缺乏。
制劑毒性的缺乏通過缺乏臨床跡象(行為、頭發(fā)、體重)和通過尸檢后的解剖學(xué)研究來測量。
B.結(jié)果存在IMS 1113時用E7Δ21-26制劑免疫的小鼠沒有顯示出任何臨床跡象并且無解剖學(xué)損傷。
用100μg制劑免疫的三只小鼠中沒有一只在注射后7天顯示出任何疾病癥狀。
通過體液應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答測定免疫應(yīng)答1.體液應(yīng)答1.1.血清中IgG同種型抗體的產(chǎn)生血清中抗天然E7重組蛋白的IgG型抗體的存在通過ELISA測定并以滴度(給出高于0.3的光密度的稀釋度的倒數(shù))表示。
圖9存在IMS 1113時用E7Δ21-26制劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7IgG型抗體滴度。
使用下面的免疫抑制試驗測量這種抗體的中和活性。在-2天和72天采集的血清的1/50稀釋液與50ng/ml天然E7孵育2小時。然后將這些稀釋液應(yīng)用于用γ-IFN預(yù)處理16小時的人巨噬細(xì)胞。培養(yǎng)24小時后，回收培養(yǎng)上清液并通過ELISA試驗、DTA50 DuoSet(R&D)測量產(chǎn)生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白誘導(dǎo)α-TNF的表達(dá)，而非中和血清允許該細(xì)胞因子的合成。
結(jié)果以中和％給出。
圖101.2.陰道分泌物中同種型IgA抗體的產(chǎn)生血清中抗天然E7重組蛋白的IgA型抗體的存在通過ELISA測量并以滴度(給出高于0.3的光密度的稀釋度的倒數(shù))表示。
圖11存在IMS 1113時用E7Δ21-26制劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7IgA型抗體滴度。
實施例2.2存在AIF(全身途徑)或者存在PBS(鼻途徑)時包埋于脫乙酰殼多糖中的E7Δ21-26制劑的免疫原活性對從Charles River購買的6周齡C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究包埋于脫乙酰殼多糖中的E7Δ21-26制劑的免疫原(體液)活性。
A.材料與方法在第0天，一組6只小鼠通過肌內(nèi)途徑接受存在AIF和1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的0.2ml含有50μg E7Δ21-26的注射，以及通過鼻內(nèi)途徑的存在PBS加入1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的20μg相同制劑。
在第7、14和21天，這些小鼠通過鼻內(nèi)途徑接受20μl，即20μg存在PBS時包埋于脫乙酰殼多糖中的E7Δ21-26。
在第60天，這些小鼠接受0.2ml含有5μg AIF制劑的注射和通過鼻內(nèi)途徑接受存在PBS的20μl含有20μg的相同制劑。
在第一次注射前2天和在最后一次免疫后12天從每只小鼠眼球后采集血樣以及陰道分泌物樣品。
6只對照小鼠接受相同的無免疫原制劑。
3只小鼠接受100μg制劑并在注射后的7天期間研究疾病癥狀的缺乏。
制劑毒性的缺乏通過缺乏臨床跡象(行為、頭發(fā)、體重)和通過尸檢后的解剖學(xué)研究來測量。
B.結(jié)果通過包埋于脫乙酰殼多糖中的E7Δ21-26制劑免疫的小鼠沒有顯示出任何臨床跡象并且無解剖學(xué)損傷。
用100μg制劑免疫的三只小鼠中沒有一只在注射后7天顯示出任何疾病癥狀。
通過體液應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答測量免疫應(yīng)答1.體液應(yīng)答1.1.血清中G同種型抗體的產(chǎn)生血清中抗天然E7重組蛋白的IgG型抗體的存在通過ELISA測量并以滴度(給出高于0.3的光密度的稀釋度的倒數(shù))表示。
圖12用包埋于脫乙酰殼多糖中的E7Δ21-26制劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgG型抗體滴度。
使用下面的免疫抑制試驗測量這種抗體的中和活性。在-2天和72天采集的血清的1/50稀釋液與50ng/ml天然E7孵育2小時。然后將這些稀釋液應(yīng)用于用γ-IFN預(yù)處理16小時的人巨噬細(xì)胞。培養(yǎng)24小時后，回收培養(yǎng)上清液并通過ELISA試驗、DTA50 DuoSet(R&D)測量產(chǎn)生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白誘導(dǎo)α-TNF的表達(dá)，而非中和血清允許該細(xì)胞因子的合成。
結(jié)果以中和％給出。
圖131.2.陰道分泌物中同種型A抗體的產(chǎn)生血清中抗天然E7重組蛋白的IgA型抗體的存在通過ELISA測量并以滴度(給出高于0.3的光密度的稀釋度的倒數(shù))表示。
圖14用包埋于脫乙酰殼多糖中的E7Δ21-26制劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgA型抗體滴度。
實施例3保護性抗腫瘤應(yīng)答實施例3.1存在ACF然后存在AIF時E7Δ21-26蛋白的注射產(chǎn)生抗腫瘤抗性如下測試了存在ACF然后存在AIF時用E7Δ21-26制劑免疫的小鼠(實施例1.1)保護性抗腫瘤應(yīng)答。
最后一次免疫后12天，通過皮下途徑(s-c)在側(cè)腹中用500,000個C3細(xì)胞注射小鼠。C3細(xì)胞是源自C57BL/6、用完整HPV16基因組和ras癌基因轉(zhuǎn)化的胚胎細(xì)胞。
圖15腫瘤在所有僅用佐劑治療的對照小鼠中生長。在存在ACF然后AIF時用E7Δ21-26制劑免疫的6只小鼠中4只小鼠不長腫瘤，在1只小鼠中，腫瘤生長，然后穩(wěn)定，在1只小鼠中，腫瘤生長。
存在ACF和AIF時，E7Δ21-26在小鼠中產(chǎn)生特異抗16型人乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的腫瘤的特異性免疫應(yīng)答。
實施例4治療性抗腫瘤應(yīng)答存在AIF時E7Δ21-26誘導(dǎo)對預(yù)先植入的C3腫瘤的排斥已經(jīng)如下在C57BL/6(H-2b)小鼠中檢驗。
實施例4.1治療模型的制備A.材料與方法小鼠(8只一組)被用數(shù)量增加0；5×102；5×103；5×104和5×105的C3細(xì)胞皮下注射入側(cè)腹。通過測量腫瘤表面每周一次評價腫瘤生長。
B.結(jié)果表I通過測量腫瘤表面評價腫瘤生長*
*以mm2表示的表面代表從測量8個腫瘤的表面得到的平均值。
已經(jīng)接受5×105個細(xì)胞的小鼠在細(xì)胞注射后12天都生長腫瘤(8/8)。
在接受5×104個細(xì)胞的小鼠中，8只中的4只小鼠在細(xì)胞注射后21天長腫瘤，8只中的4只在注射后28天后長腫瘤。
在接受5×103個細(xì)胞的小鼠中，8只中的1只小鼠在細(xì)胞注射后35天長出腫瘤，8只中的3只在注射后42-60天后長腫瘤，并且另外4只仍然沒有顯示任何腫瘤。
在接受5×102個細(xì)胞的小鼠中，8只中的1只小鼠在細(xì)胞注射后35天長腫瘤，其他7只仍然沒有長腫瘤。
實施例4.2在接受7×103和9×103劑量的表達(dá)E7蛋白的C3細(xì)胞的小鼠中抗腫瘤應(yīng)答A.材料與方法將小鼠首先從側(cè)腹皮下注射7,000或9,000個C3細(xì)胞(第0天)。在第2、9、16和23天，小鼠接受AIF和1μg GM-CSF和鼠IL2中的10μg E7Δ21-26制劑的肌內(nèi)注射。在第9、16、23和60天，小鼠接受AIF中的10μgE7Δ21-26制劑的肌內(nèi)注射。
如上面實施例4.1中所描述的每周兩次測量腫瘤的大小。
B.結(jié)果圖16和17顯示了所得結(jié)果。
對照小鼠在注射C3細(xì)胞后10到20天都長腫瘤(8/8)而80％(注射7,000個細(xì)胞-圖16)和75％(注射9,000個細(xì)胞-圖17)免疫的小鼠不長腫瘤。
實施例5用E7Δ21-26突變的E7蛋白預(yù)處理的樹突狀細(xì)胞刺激混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)單向自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)包括在攜帶抗原的樹突狀細(xì)胞(刺激細(xì)胞)上共培養(yǎng)個體的單核細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞或應(yīng)答細(xì)胞)。具有對刺激細(xì)胞攜帶的抗原特異的受體的效應(yīng)細(xì)胞增殖。通過氚化的胸苷摻入試驗測量增殖。
樹突狀細(xì)胞來自通過從供體的外周血PBMCs淘析的單核細(xì)胞的分化(Sallusto等，Journal of Experimental Medicine，1994，179，1109-18)。單核細(xì)胞(2.5×106個細(xì)胞/ml)被培養(yǎng)于富含SAB(10％)、GMC-SF(50ng/ml)和IL4(1,000單位/ml)的RPMI 1640中的特氟隆小瓶中。培養(yǎng)6天后，那些細(xì)胞顯示出分化的樹突狀細(xì)胞的表型。
從而將這些所得的樹突狀細(xì)胞用3μg/ml劑量的天然E7、或E7Δ21-26和/或培養(yǎng)基處理，然后在圓底96孔板中與同一供體的PBMCs共培養(yǎng)，PBMCs的比例為1/10；3/10和10/10。反應(yīng)結(jié)束前18小時，加入0.5μCi氚化的胸苷/孔。結(jié)果(以每分鐘的脈沖給出)在圖18中給出。
當(dāng)樹突狀細(xì)胞與天然E7蛋白預(yù)孵育，然后與應(yīng)答細(xì)胞培養(yǎng)時，沒有觀察到增殖(因為天然E7蛋白的免疫抑制活性)。當(dāng)樹突狀細(xì)胞與突變的E7蛋白(缺少天然蛋白的免疫抑制活性)預(yù)孵育時，觀察到刺激細(xì)胞的增殖。
實施例6突變的E7蛋白缺乏免疫抑制活性使用細(xì)胞增殖試驗測定體外免疫抑制活性的缺乏。將人外周血單核細(xì)胞分離，然后在存在3μg/ml不同天然E7蛋白和它們的各自突變體或者存在E7 HPV 16(Δ21-25)疫苗培養(yǎng)物(MP Kieny，Transgene贈送)的培養(yǎng)上清液(SN)時和存在加強抗原(PPD+TT)時將這些單核細(xì)胞以150,000個細(xì)胞/孔培養(yǎng)于圓底孔中。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃下裝有5％CO2的濕潤空氣中持續(xù)6天。通過氚化的胸苷摻入試驗測量細(xì)胞增殖。結(jié)果(以每分鐘脈沖給出)總結(jié)于后面的表II中。
表II
所得結(jié)果表明突變體被脫毒(喪失天然蛋白的免疫抑制活性)。
參考文獻(xiàn)●AUSUBEL F M，Brent R.Kingstone Re，Moore DD，Seidaman JG，Snith JA Struhl K編輯，(1989)，Current protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience●AUCOUTURIER等人，2001，Vaccine，192666-2672●BARAS等人，1999，Infect.Immun.，672643-2648●BASAK等人，1995，J.Pept.Sci.，1(6)383-395●CHEN等人，1987，Mol.Cell.Biol.卷72745-2752●CRUZ，I.等人，1999，Br.J.Cancer，卷81881-889●De SMEDT，T.，B.Pajak，E.Muraille，L.Lespagnard，E.Heinen，P.De Baetselier，J.Urbain，O.Leo和M.Moser.1996.通過脂多糖體內(nèi)調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞數(shù)和成熟，J.Exp.Med.1841413-1424●EL SHERIF AM等人，2001，J.Pathol，195(2)179-185●Frankel等人，1988，Cell，卷55●FELTKAMP，M.C.，H.L.Smits，M.P.Vierboom，R.P.Minnaar，B.M.de Jongh，J.W.Drijfhout，J.ter Schegget，C.J.Melief和W.M.Kast1993.用含有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位的肽接種保護免受人乳頭瘤病毒16型轉(zhuǎn)化的細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤，Eur.J.Immunol.232242-2249
●FRALEY 1980，J.Biol，Chem.，卷25510431●FLOTTE等人，1992，Am.J.Respir.cell Mol.Biol.，卷7349-356●GAIT(編輯)，1984，Nucleic acid hybridization●GERARD C M，2001，Vaccine，卷192583-2589●GIANNINI等人，1998，Clin.EXP.Immunol，113(2)183-189●GIANNINI等人，2002，Int.J.CACER，97(5)654-659●GOPAL 1985，Mol.Cell.Biol.，卷51188-1190●GLOVER(編輯)，1985，DNA CloningA practical approach，卷I和II.Oligonuclotide synthesis，MRL Press，Ltd，Oxford，U.K.
●GRAHAM等人，1973，Virology，卷52456-457●HOUBEN WEYL，1974，Methode der Organischen Chemie，E.Wunsch編輯，卷15-I和15-II，Thieme，Stuttgart●HUYGEN等人，1996，Nature Medicine，卷2(8)893-898●HARLAND等人，1985，J.Cell.Biol.卷1011094-4095●KIEFER H.等人，1996，Biochemistry，卷35(50)16077-16084●MCLAUGHLIN B A等人，1996，Am.J.Hum.Genet，卷59561-569●NERRIFIELD RB，1965a，Nature，卷207(996)522-523●NERRIFIELD，1965b，Science，卷150(693)178-185●MUDERSPACH L.等人，2000，Clinical Cancer Research，卷63406-3416●NICOLAU等人，1987，Methods enzymol.，卷149L157-176●OSEN W等人，2001，Vaccine，卷194276-4286●POTTER等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷81(22)7161-7165●TPCKER J.，GRISSHAMMER R.，Biochem J.，1996，vol.，317(Pt3)891-899●SAMBROOK J FRITSCH E F et MANIATIS T，1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，2 ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York●SAMULSKI等人1989，J.Virol.，卷633822-3828●SCHOELL W M J，1999，Gynecologic Oncology，卷74448-455●SEEDORFK，1985，Virology，卷145(1)181-185●SKAUGRUD等人，1999，Biotechnol.Genet Eng.Rev.，1623-40●TACSON等人，1996，Nature Medicine，卷2(8)888-892●TUR-KASPA.1986，Mol.Cell.Biol，vol，6716-718
序列表<110>尼奧瓦克斯公司<120>包含HPV-16病毒的突變E7蛋白的非免疫抑制免疫原性組合物或疫苗組合物<130>尼奧瓦克斯公司-N729-PCT<140>
<141>
<150>FR0205173<151>2002-04-24<160>4<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>92<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述E7Δ21-26<400>1Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln1 5 10 15Pro Glu Thr Thr Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile20 25 30Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile35 40 45Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln50 55 60Ser Thr His Val Asp Ile Cys Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr65 70 75 80Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Arg Lys Pro85 90
<210>2<211>276<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述E7Δ21-26<400>2catggagata cacctacatt gcatgaatat atgttagatt tgcaaccaga gacaactcaa 60ttaaatgaca gctcagagga ggaggatgaa atagatggtc cagctggaca agcagaaccg 120gacagagccc attacaatat tgtaaccttt tgttgcaagt gtgactctac gcttcggttg 180tgcgtacaaa gcacacacgt agacattcgt actttggaag acctgttaat gggcacacta 240ggaattgtgt gccccatctg ttctcagaaa ccataa 276<210>3<211>98<212>PRT<213>人乳頭瘤病毒16型<400>3Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln1 5 10 15Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser20 25 30Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp35 40 45Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr50 55 60Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Cys Thr Leu Glu65 70 75 80Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Arg85 90 95Lys Pro
<210>4<211>294<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒16型<400>4catggagata cacctacatt gcatgaatat atgttagat ttgcaaccaga gacaactgat 60ctctactgtt atgagcaatt aaatgacagc tcagaggagg aggatgaaat agatggtcca 120gctggacaag cagaaccgga cagagcccat tacaatattg taaccttttg ttgcaagtgt 180gactctacgc ttcggttgtg cgtacaaagc acacacgtag acattcgtac tttggaagac 240ctgttaatgg gcacactagg aattgtgtgc cccatctgtt ctcagaaacc ataa 29權(quán)利要求
1.缺乏針對乳頭瘤病毒感染所致癌癥的預(yù)防性或治療性免疫抑制特性的疫苗組合物，其特征在于其包含與一種或多種生理可相容的免疫佐劑結(jié)合的作為活性成分的非免疫抑制性突變E7蛋白，該突變E7蛋白從N-末端到C-末端含有下列氨基酸序列i.序列SEQ ID No.3的1-19位氨基酸序列；ii.具有(a)與序列SEQ ID No.3的相應(yīng)20-29位氨基酸序列相比至少一個氨基酸替代的氨基酸序列或者(b)與序列SEQ ID No.3的相應(yīng)20-29位氨基酸序列相比至少4個連續(xù)氨基酸缺失的氨基酸序列；和iii.序列SEQ ID No.3的30-98位氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白的特征在于所述突變的E7蛋白的氨基酸區(qū)域(ii)與天然蛋白的序列SEQ ID No.3的氨基酸對應(yīng)的20-29位肽區(qū)域相比包含至少2個氨基酸替代。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白的特征在于所述突變的E7蛋白的氨基酸區(qū)域(ii)與天然蛋白的序列SEQ ID No.3的氨基酸對應(yīng)的20-29位肽區(qū)域相比包含3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸替代。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白的特征在于24位的Cys殘基和26位的Glu已經(jīng)用不同的氨基酸殘基替代。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白是(CYS24GLY，GLU26GLN)E7蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白是(CYS24SER，GLU26GLN)E7蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白的特征在于所述突變的E7蛋白的氨基酸區(qū)域(ii)與SEQ ID No.3的相應(yīng)20-29位氨基酸序列相比包含5、6、7、8、9或10個連續(xù)氨基酸的缺失。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白的特征在于所述突變的E7蛋白的氨基酸區(qū)域(ii)與SEQ ID No.3的相應(yīng)20-29位氨基酸序列相比包含6個連續(xù)氨基酸的缺失。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白在于該突變的E7蛋白具有包含對天然E7蛋白的SEQ ID No.3序列的相應(yīng)氨基酸21-26位缺失的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白的特征在于所述突變的E7蛋白的氨基酸區(qū)域(ii)與SEQ ID No.3的相應(yīng)20-29位氨基酸序列相比包含5個連續(xù)氨基酸的缺失。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白在于該突變的E7蛋白具有包含對天然E7蛋白的SEQ ID No.3序列的相應(yīng)氨基酸21-25位缺失的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任意一項所述的疫苗組合物，其特征在于其包含至少一種能夠優(yōu)選地將免疫應(yīng)答定向到產(chǎn)生中和天然E7蛋白免疫抑制活性的抗體的佐劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的疫苗組合物，其特征在于其包含至少一種能夠優(yōu)選地將免疫應(yīng)答定向到產(chǎn)生IgA同種型抗體的佐劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的疫苗組合物，其特征在于其包含至少一種能夠優(yōu)選地將免疫應(yīng)答定向到產(chǎn)生IgG同種型抗體的佐劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的疫苗組合物，其特征在于其包含(i)能夠優(yōu)選地將免疫應(yīng)答定向到產(chǎn)生IgA同種型抗體的佐劑和(ii)能夠優(yōu)選地將免疫應(yīng)答定向到產(chǎn)生IgG同種型抗體的佐劑的組合。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的疫苗組合物，其特征在于其包含至少一種能夠誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的免疫佐劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求7的疫苗組合物，其特征在于細(xì)胞應(yīng)答更特別地通過表達(dá)CD8抗原并特異識別野生型E7蛋白的淋巴細(xì)胞的增殖而表征。
18.誘導(dǎo)針對HPV-16乳頭瘤病毒天然E7蛋白的免疫應(yīng)答而不同時誘導(dǎo)免疫抑制的免疫原性組合物，所述組合物包含與一種或多種生理學(xué)上可相容的賦形劑或免疫佐劑結(jié)合的作為活性成分的非免疫抑制的突變E7蛋白，該突變蛋白從N-末端到C-末端包含以下氨基酸序列i.序列SEQ ID No.3的1-19位氨基酸序列；ii.具有(a)與序列SEQ ID No.3的相應(yīng)20-29位氨基酸序列相比至少一個氨基酸替代的氨基酸序列或者(b)與序列SEQ ID No.3的相應(yīng)20-29位氨基酸序列相比至少4個連續(xù)氨基酸缺失的氨基酸序列；和iii.序列SEQ ID No.3的30-98位氨基酸序列。
19.用于HPV-16感染所致癌癥的預(yù)防性或治療性疫苗組合物，其特征在于其包含免疫有效量的編碼如在權(quán)利要求1到11之一中定義的突變E7蛋白的核酸、含有所述核酸的表達(dá)盒或含有所述表達(dá)盒的重組載體。
20.如在權(quán)利要求1到11中任意一項所定義的非免疫抑制性突變E7蛋白的用途，用于制備非免疫抑制的免疫原性組合物或疫苗組合物，其中所述組合物誘導(dǎo)產(chǎn)生中和天然E7蛋白免疫抑制活性的抗體。
21.中和抗體，其抗編碼如根據(jù)權(quán)利要求1到11之一中定義的突變E7蛋白的DNA的表達(dá)產(chǎn)物。
22.用于針對HPV-16感染的被動接種的組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求21的抗體。
23.缺乏針對乳頭瘤病毒感染所致癌癥的任何預(yù)防性或治療性免疫抑制特性的疫苗組合物，其特征在于其包含適宜量的對待治療個體而言為自體或同種異體樹突狀細(xì)胞作為活性成分，所述自體樹突狀細(xì)胞已經(jīng)與如在權(quán)利要求1到11之一定義的突變E7蛋白孵育，從而使得能夠?qū)⑺鐾蛔兊腅7蛋白呈遞給T細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)針對HPV－16乳頭瘤病毒天然E7蛋白的免疫應(yīng)答而同時不誘導(dǎo)免疫抑制的免疫原性組合物或疫苗組合物，所述組合物包含作為活性成分的非免疫抑制的突變E7蛋白，該突變蛋白從N－末端到C－末端包含的氨基酸序列如下i.序列SEQ ID No.3的1－19位氨基酸序列；ii.具有(a)與序列SEQ ID No.3的相應(yīng)20－29位氫基酸序列相比至少一個氨基酸替代的氨基酸序列或者(b)與序列SEQ ID No.3的相應(yīng)20－29位氨基酸序列相比至少4個連續(xù)氨基酸缺失的氨基酸序列；和iii.序列SEQ ID No.3的30－98位氨基酸序列。
文檔編號C07K14/16GK1656116SQ03811786
公開日2005年8月17日 申請日期2003年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月24日
發(fā)明者D·扎古里, H·勒布阿內(nèi)克, B·比其尼, P·科昂 申請人:尼奧瓦克斯公司