專利名稱：腫瘤壞死因子突變蛋白的制作方法
腫瘤壞死因子，更具體地說，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，是一種主要由受刺激的巨噬細胞產(chǎn)生的細胞素，它不僅對各種腫瘤細胞顯示出顯著的細胞毒性(Carswell等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 723666-3670，1975)，而且在炎癥和免疫反應(yīng)中起多種介導(dǎo)物的作用(綜述見Beutler和Cerami，Ann.Rev.Immunol.7625-655，1989;Bonavista和Granger編“腫瘤壞死因子結(jié)構(gòu)、作用機理、以及在疾病和治療中的作用”，Karger，Basel，1990)。已經(jīng)從大腸桿菌中克隆和表達的cDNA的核苷酸順序，推導(dǎo)出了人腫瘤壞死因子α-(hTNF-α)的一級結(jié)構(gòu)(Pennica等，Nature 312724-729，1984;Marmenout等，Europ.J.Biochem.152515-522，1985;Wang等，Science 228149-154，1985;Shirai等，Nature 313803-806，1985)。已發(fā)現(xiàn)hTNF-α和人淋巴細胞毒素的氨基酸順序有顯著的同源性(30%)。人淋巴細胞毒素常被稱作人腫瘤壞死因子β(hTNF-β)，是一種主要由淋巴細胞產(chǎn)生的細胞素(Gray等，Nature 312721-724，1984;Fiers等，Cold Spring Harbour Symp.51587-595，1986)。
本領(lǐng)域內(nèi)還曾描述了氨基酸順序經(jīng)過修飾的hTNF-α，即所謂的TNF-α突變蛋白(例如見Yamagishi等，Protein Engineering3713-719，1990;或Fiers在Aggarwal和Vilcek編的“腫瘤壞死因子結(jié)構(gòu)、功能和作用機理”一書中的文章，Marcel Dekker，Inc.，New York，印刷中;或Fiers等人在Bonavista和Granger編的書中第77-81頁的文章(同上))。此外，TNF-α突變蛋白也曾是許多專利申請的主題，例如國際專利申請公開WO 86/02381、WO 86/04606、WO 88/06625;歐洲專利申請公開155，549;158，286;168，214;251，037和340，333;以及德國公開說明書3843534。
本領(lǐng)域中還曾公開了淋巴細胞毒素的突變蛋白，例如見歐洲專利申請公開250，000;314094和336，383。
TNF的生物學(xué)效應(yīng)是通過兩種特異性受體介導(dǎo)的，一種受體經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定的表觀分子量為55kD(p55-TNF-R)，另一種受體經(jīng)SDS-PAGE測定的表觀分子量為75kD(p75-TNF-R)。這兩種形式的TNF受體都已被克隆，具體地說，p55-TNF-R已由Loetscher等人克隆(Cell 61351-359，1990)，p75-TNF-R已由(例如)Dembic等人克隆(Cytokine 253-58，1990)(關(guān)于這兩種受體還可參閱歐洲專利申請90116707.2)。最近發(fā)現(xiàn)，兩種受體都不僅與TNF-α結(jié)合，而且還以高親和性與TNF-β結(jié)合(Sch
nfeld等，J.Biol.Chem.2663863-3869，1991)。
本領(lǐng)域公知，根據(jù)TNF-α的生物活性，它可能是治療各種疾病的一種有價值的化合物。例如，單獨應(yīng)用TNF-α或與干擾素合并應(yīng)用，都可能是一種有效的抗腫瘤劑(Brouckaert等，Int.J.Cancer 38763-769，1986)。然而，其全身性毒性是更廣泛的治療性應(yīng)用的主要限制(Taguchi T.和Sohmura Y.，Biotherapy 3177-186，1991)。
現(xiàn)已證明，在小鼠中，只與較小的小鼠TNF受體(鼠p55-TNF-R)結(jié)合的人TNF-α(hTNF-α)，其毒性比既與p55-TNF-R又與p75-TNF-R結(jié)合的鼠TNF-α(mTNF-α)要小得多。例如，在C57B16小鼠中，mTNF-α和hTNF-α的LD50分別約為10μg/小鼠和500μg/小鼠(Brouckaert等，Agents and Actions 26196-198，1989;Everaerdt，B.等，Biochem.Biophys.Res.Comm.163378-385，1989;Lewis，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882830，1991)。因此，p75-TNF-R在全身性毒性中可能起特殊作用。
hTNF-α和mTNF-α與人p55-TNF-R和人p75-TNF-R幾乎同等地結(jié)合。然而，保留了通過hp55-TNF-R介導(dǎo)的生物活性，而又幾乎完全喪失對hp75-TNF-R活性的hTNF-α突變蛋白，在鼠體系中的功能與hTNF-α等價，預(yù)計這些突變蛋白在靈長類中的全身性毒性較低。
在歐洲專利申請公開486，908中，描述了與人p75-腫瘤壞死因子受體(hp75-TNF-R)和人p55-腫瘤壞死因子受體(hp55-TNF-R)的結(jié)合親和力明顯不同的人腫瘤壞死因子突變蛋白。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，具有人腫瘤壞死因子的氨基酸順序，但至少在86位有變化(由蘇氨酸代替絲氨酸殘基)的hTNF突變蛋白或其可藥用鹽，保留了與hp55-TNF-R結(jié)合的活性，但幾乎完全喪失了與hp75-TNF-R結(jié)合的活性。另外，發(fā)現(xiàn)這些hTNF突變蛋白保留了通過hp55-TNF-R介導(dǎo)的生物活性，但卻不再與hp75-TNF-R結(jié)合。然而，本發(fā)明的hTNF突變蛋白并不僅限于這種類型的突變蛋白。本發(fā)明還包括另一種類型的突變蛋白，這類突變蛋白仍然只與hp55-TNF-R結(jié)合，但卻喪失了誘發(fā)功能性細胞反應(yīng)的能力。
因此，本發(fā)明提供了對人p55-腫瘤壞死因子受體(hp55-TNF-R)具有選擇性結(jié)合親和性的人腫瘤壞死因子突變蛋白或其可藥用鹽，其特征在于，人腫瘤壞死因子的氨基酸順序至少在86位有變化，由蘇氨酸代替了絲氨酸殘基。
如Pennica等人(同上)所公開的人TNF-α的氨基酸順序如下1 10VAL ARG SER SER SER ARG THR PRO SER ASP LYS PRO VAL ALA HIS20 30VAL VAL ALA ASN PRO GLN ALA GLU GLY GLN LEU GLN TRP LEU ASN40ARG ARG ALA ASN ALA LEU LEU ALA ASN GLY VAL GLU LEU ARG ASP50 60ASN GLN LEU VAL VAL PRO SER GLU GLY LEU TYR LEU ILE TYR SER70GLN VAL LEU PHE LYS GLY GIN GLY CYS PRO SER THR HIS VAL LEU80 90LEU THR HIS THR ILE SER ARG ILE ALA VAL SER TYR GLN GHR LYS100VAL ASN LEU LEU SER ALA ILE LYS SER PRO CYS GIN ARG GLU THR110 120PRO GLU GLY ALA GLU ALA LYS PRO TRP TYR GLU PRO ILE TYR LEU130GLY GLY VAL PHE GLN LEU GLU LYS GLY ASP ARG LEU SER ALA GLU
140150ILE ASN ARG PRO ASP TYR LEU ASP PHE ALA GLU SER GLY GLN VAL157TYR PHE GLY ILE ILE ALA LEU或者是如Marmenout等人(同上)或Wang等人(同上)或Shirai等人所公開的順序，或者更具體地說，如編碼成熟TNF-α的質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(見

圖1a和圖1b及實施例Ⅰ)插入片段的核苷酸順序所編碼的順序。
如上定義的hTNF突變蛋白，可能在一個或更多個另外位置上改變了hTNF的氨基酸順序，優(yōu)選一個或兩個另外位置，其中特別優(yōu)選是29、31、32、29和32、或31和32位。在這些額外位置上可以使用任何氨基酸，優(yōu)選任何天然存在的氨基酸。對29位的置換來說，優(yōu)選谷氨酸、甘氨酸或酪氨酸，特別優(yōu)選絲氨酸。對31位的置換來說，優(yōu)選谷氨酸或天冬酰胺。對32位的置換來說，優(yōu)選酪氨酸、色氨酸或蘇氨酸，特別優(yōu)選色氨酸和蘇氨酸。
本發(fā)明的hTNF突變蛋白可以含有進一步的氨基酸置換，其前提是這些置換不改變突變蛋白與p55-TNF-R的選擇性結(jié)合親和性。蛋白質(zhì)和多肽中基本不改變生物活性的氨基酸置換在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并由(例如)H.Neurath和R.L.Hill在《蛋白質(zhì)》一書(Academic Press，New York，1979)，尤其是該書第14頁的圖6中作了敘述。最常見的氨基酸置換有Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly，反之亦然。本發(fā)明的hTNF突變蛋白還可含有由“接頭”順序編碼的若干氨基酸的順序。這些順序可能是由于用表達載體來表達如上所限定的hTNF突變蛋白而出現(xiàn)的。
本發(fā)明的hTNF突變蛋白還可含有一些特異性順序，這些順序最好能與親和性載體物質(zhì)結(jié)合。這類順序的實例是至少含有兩個相鄰組氨酸殘基的順序(在這方面可參閱歐洲專利申請公開282，042)。這些順序能與次氮基三乙酸鎳螯合物樹脂選擇性結(jié)合(Hochuli和D
beli，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 368748，1987;歐洲專利申請公開253，303)。含有這樣一個特異性順序的hTNF突變蛋白，既可以與hTNF突變蛋白氨基酸順序的C末端或N末端連接，也可以與兩個末端都連接。
本發(fā)明的hTNF突變蛋白也可以與不同的免疫球蛋白重鏈或輕鏈多肽組合，這將得到體內(nèi)半壽期較長的嵌合hTNF突變蛋白免疫球蛋白多肽。業(yè)已證明，例如由哺乳動物免疫球蛋白重鏈或輕鏈恒定區(qū)的頭兩個結(jié)構(gòu)域組成的嵌合多肽，其體內(nèi)半壽期延長(見Traunecker等，Nature 33184-86，1988;歐洲專利申請公開394，827)。
hTNF突變蛋白還可以與聚合物，例如分子量為500至20，000道爾頓的聚乙二醇或聚丙二醇偶聯(lián)，這將得到可能基本上無免疫原性的受護hTNF突變蛋白組合物?，F(xiàn)已有許多使聚合物與多肽偶聯(lián)的方式，例如見美國專利4，179，337。
特別優(yōu)選的本發(fā)明hTNF突變蛋白為Thr86-TNF-α、Ser-Thr86-TNF-α、Glu31-Thr86-TNF-α、Trp32-Thr86-TNF-α、Ser29-Trp32-Thr86-TNF-α或Asn31-Thr32-Thr86-TNF-α。
本發(fā)明的hTNF突變蛋白可以用本領(lǐng)域已知的方法來制備，例如Sambrook等人(《分子克隆實驗室手冊》1989年第二版，冷泉港實驗室，美國冷泉港實驗室出版社)所述的方法或以下段落所述的方法?？梢杂靡韵聦嵤├龅姆椒ù_定這些hTNF突變蛋白是否仍對p55-TNF-R具有選擇性結(jié)合親和性。另外，本發(fā)明的hTNF突變蛋白也可用本領(lǐng)域已知的標準方法化學(xué)合成，優(yōu)選固態(tài)法，例如Merrifield的方法(J.Am.Chem.Soc.852149-2154，1963)。此外，這些突變蛋白的鹽類也是本發(fā)明的目的。這些鹽可以用本領(lǐng)域已知的方法來制備。
據(jù)信，利用與一種或另一種TNF受體特異結(jié)合的化合物(如本發(fā)明的hTNF突變蛋白)將有利和不利的TNF-α活性分割開來的對策，可通用于TNF起作用的其他疾病狀態(tài)。
含有編碼上述hTNF突變蛋白的DNA順序的DNA順序，也是本發(fā)明的目的。這些DNA順序可以象本領(lǐng)域所公開的那樣(同上)，利用已知的體外誘變法(參見例如Sambrook等，1989)，由編碼hTNF的基因組順序或cDNA順序起始來構(gòu)建。這種誘變法可以隨機進行，以獲得大量的突變體，然后可以用適當?shù)臋z測體系檢驗這些突變體是否具有所要的性質(zhì);或者，為了在給定DNA順序中的確定位置誘變，可以用所謂的定位誘變法(參見例如Sambrook等，15.51-15.113，1989)進行誘變，或者利用聚合酶鏈反應(yīng)進行誘變(參見例如White等，Trends in Genetics 5185-189，1989)。
一種常用于隨機誘變的化學(xué)誘變劑是亞硫酸氫鈉，它使胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶殘基，從而造成“C”變“T”(核苷酸的標準縮寫)的轉(zhuǎn)換(誘變方法參見例如Shortle和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 752170-2174，1978或Pine和Huang，Meth.Enzym.154415-430，1987)。這種誘變劑只作用于單鏈DNA，而誘變后靶DNA順序的表達則要用雙鏈質(zhì)粒載體來實現(xiàn)。為了免去在誘變中重新克隆及表達載體的必要，一種可能的方法就是使用所謂的“噬?！?phasmids)。這類載體除攜有質(zhì)粒復(fù)制起點外，還攜有來自絲狀噬菌體的復(fù)制起點。這類噬粒的實例有如Stanssen等人所述的pMa和pMc噬粒(Nucleic Acids Res.174441-4454，1989)。利用這一表達體系，可以構(gòu)建出所謂的“缺口雙螺旋”(gap-duplex)結(jié)構(gòu)(還可參閱Kramer等，Nucl.Acids Res.129441-9456，1984)，該結(jié)構(gòu)中只有TNF編碼順序(同上)處于單鏈狀態(tài)，因而易受到特定化學(xué)誘變劑的作用?？梢园碨tanssen等人(同上)所述的位點特異性誘變法來構(gòu)建準備用于隨機誘變的“缺口雙螺旋”，但不同的是(-)鏈含有與(+)鏈相同的活性抗生素抗性基因。利用編碼hTNF-α的DNA順序內(nèi)不同的限制性位點，有可能使缺口的寬度發(fā)生變化。這類限制位點的例子有ClaI-SalI位點(470個核苷酸)、BstXI-BstXI位點(237個核苷酸)或StyI-StyI位點(68個核苷酸)。然后可以如Shortle和Nathans(同上)所述，用濃度遞增(最高4M)的亞硫酸氫鹽處理這些缺口雙螺旋構(gòu)建體，隨后進行若干次透析。然后可以按本領(lǐng)域已知的方法，如Sambrook等人(同上)所述的方法，用這類噬粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的原核宿主細胞。合適的原核宿主細胞在這里是指該宿主細胞有某種特異修復(fù)功能缺陷，從而使DNA中的一個尿嘧啶殘基在復(fù)制過程中保留下來，而且該宿主細胞能夠表達相應(yīng)的突變TNF。這些特定的宿主細胞株是本領(lǐng)域已知的，例如大腸桿菌株BW313(Kunkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492，1985)。然后可以用適當?shù)臋z測體系篩選出所得克隆中表達一種所要的hTNF突變蛋白的克隆。例如，可以把每個菌落接種在微量滴定板中含有相關(guān)抗生素的合適培養(yǎng)基中?？梢约尤肴芫甘辜毎芙?，隨后進行依次的凍融循環(huán)。沉淀出核酸并離心后，可以用實施例Ⅱa和Ⅱb或?qū)嵤├龅倪m當檢測法，直接使用每個菌落的上清液，測定與活細胞表面上的或純態(tài)的p75-TNF-R和p55-TNF-R的結(jié)合作用。
如果需要，可以用限制片段分析法(參見例如Sambrook等，同上)確定特異性突變位點。通過測定這些片段的DNA順序，就能確定確切的突變位置;如果這一突變導(dǎo)致氨基酸置換，則可由所測出的DNA順序推出這個新的氨基酸。DNA順序測定可以按本領(lǐng)域已知的方法進行，例如用市售測序試劑盒(Pharmacia，Uppsala，Sweden)利用T7聚合酶測定超螺旋DNA的順序。
如上所述，使給定DNA順序突變的另一種可能方法是“定位誘變”。由Hutchinson和Edgell(J.Virol.8181，1971)最先提出的一種廣泛用于這種誘變法的對策包括，使攜有所需核苷酸置換的合成寡核苷酸與應(yīng)引入突變的單鏈DNA順序的靶區(qū)退火(綜述見Smith，Annual.Rev.Genet.19423，1985;改進方法見Stanssen等人(1989)文章中的參考文獻2-6)。
這類方法中有一種優(yōu)選方法是Stanssen等人(1989)的方法之一，該方法除使用Stanssen等人(1989，同上)所述的噬粒技術(shù)外，還使用了最早由Kramer等人(1984)提出的“缺口雙螺旋DNA”(見上述文獻及Kramer和Fritz，Methods in Enzymology，1987，Academic Press，Inc.USA)，但使用抗生素抗性基團代替M13功能基團來選擇含突變鏈。這一方法的優(yōu)點還在于，能夠進行連續(xù)的誘變循環(huán)而無需將基因轉(zhuǎn)移到新的誘變載體中，即，第二輪誘變的不同之處僅在于對另一種抗生素標記進行選擇(Stanssen等，同上)。對照實驗可以采用突變體向野生型TNF的位點特異性回復(fù)誘變。此外，利用寡核苷酸在TNF基因中建立或破壞某個限制位點，就不僅能通過與用于定位誘變的寡核苷酸雜交來控制突變體，而且能通過限制位點存在與否來控制突變體。為了制出一組在氨基酸順序的確定位置上野生型氨基酸被任何天然存在氨基酸置換的hTNF突變蛋白，使用了一組所有可能的密碼子都在確定位置上的寡核苷酸。
如前面已經(jīng)提到的，使給定DNA順序突變的另一可能方法是利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進行誘變。這一方法的原理由例如White等(1989)作了概述，而其改進方法見Innis等所述(PCR程序方法及應(yīng)用指南，Academic Press，Inc.1990)。
PCR是一種由少量模板DNA制備大量確定長度和順序的特異DNA片段的體外方法。PCR的基礎(chǔ)是側(cè)接兩個寡核苷酸引物的DNA片段的酶促擴增，而這兩個引物能與靶順序的相反鏈雜交。這兩個引物的取向是它們的3′端彼此相對。使模板熱變性，使引物與其互補順序退火，用DNA聚合酶使退火后的引物延伸，這些步驟反復(fù)循環(huán)使PCR引物5′端之間的區(qū)段擴增。由于每個引物的延伸產(chǎn)物都能作為另一延伸產(chǎn)物的模板，所以每次循環(huán)基本上都使前一次循環(huán)產(chǎn)生的DNA片段的量加倍。由于引物是物理摻入擴增產(chǎn)物的，而且引物5′端和模板之間的錯配對擴增效率沒有顯著影響，所以有可能改變擴增出的順序從而在擴增后的DNA中引入所需的突變。利用從嗜熱菌水生棲熱菌分離出的熱穩(wěn)定性Taq DNA聚合酶，已有可能避免聚合酶的變性，這樣就不必在每個熱變性步驟之后補加酶。這一進展使PCR得以用各種簡單的溫度循環(huán)裝置自動進行。此外，由于允許使用更高的引物退火和延伸溫度，擴增反應(yīng)的特異性提高了。特異性提高則由于減少了非靶片段對酶和引物的競爭而改善了擴增產(chǎn)物的總收率。
寡核苷酸的設(shè)計和合成可以按本領(lǐng)域已知的方法進行，如Sambrook等(1989)所述的方法或前面引用的有關(guān)定位誘變的參考文獻之一所述的方法。
制出編碼本發(fā)明的hTNF突變蛋白的DNA順序后，就可以利用如上所述的噬粒技術(shù)，或者使用本領(lǐng)域公知的任何合適的原核或真核表達體系(參見例如Sambrook等，同上)，立即開始進行表達。
優(yōu)選在原核細胞如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等中進行表達，其中優(yōu)選大腸桿菌，尤其是大腸桿菌K12株，例如M15株(被Villarejo等人稱為DZ291，見J.Bacteriol.120466-474，1974)、HB101(ATCC33694)、WK6(Stanssen等，同上)或大腸桿菌SG13009(Gottesman等，J.Bacteriol.148265-273，1981)。本發(fā)明hTNF突變蛋白的表達也可在低等或高等真核細胞中進行，例如酵母細胞(如畢赤酵母等)、絲狀真菌(如曲霉等)或細胞系(如中國倉鼠卵細胞系等)，其中優(yōu)選在酵母細胞中表達(見Sreekrishna等，Biochem.284117-4125，1989;Hitzeman等，Nature 293717-722，1981;歐洲專利申請公開263，311)。本發(fā)明hTNF突變蛋白在這些體系中的表達既可能在細胞內(nèi)發(fā)生，也可能在經(jīng)過適當?shù)幕蜻m應(yīng)后在細胞外發(fā)生(見Leemans等，Gene 8599-108，1989)。
Sambrook等(同上)和Fiers等(“第八屆國際生物技術(shù)討論會匯編”，Soc.Franc.de Microbiol.，Paris，Durand等編碼中680-697頁，1988)提到了用于在大腸桿菌中表達的合適載體，更具體地說，pDS家族的載體(Bujard等人，Methods in Enzymology，Wu和Grossmann編，Academic Press，Inc.1987年第155卷第416-433頁;Stüber等，Immunological Methods，Lefkovits和Pernis編，Academic Press，Inc.，1990年第Ⅳ卷第121-152頁)，例如pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(THr86)(見實施例Ⅰ)、或pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32Thr86)(見實施例Ⅲ)、或pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29Thr86)、或pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29Trp32Thr86)、或pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Asn31Thr32Thr86)、或pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Glu31Thr86)(見實施例Ⅳ)。這些特異性pDS56/RBSⅡ質(zhì)粒是由于它們具有特異的可調(diào)控啟動子/操縱基因成分和核糖體結(jié)合位點才達到高水平的表達，所以，只有在啟動子/操縱基因成分的活性由于lac阻遏物與操縱基因結(jié)合而受到阻遏時，這些質(zhì)粒才能在大腸桿菌細胞中保留。啟動子的活性可以通過加入IPTG而在所需的細胞密度下得到恢復(fù)，IPTG的作用是使阻遏物失活從而使啟動子復(fù)原。大多數(shù)大腸桿菌菌株所能提供的阻遏物分子都不足以完全阻遏這些高拷貝數(shù)質(zhì)粒中存在的啟動子順序的功能，所以，這些大腸桿菌菌株(如大腸桿菌M15或SG13009)必須先用編碼lac阻遏物的質(zhì)粒如pREP4(見圖2a和2b)轉(zhuǎn)化，然后再用本發(fā)明的特異性pDS56/RBSⅡ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，這樣這些質(zhì)粒就能穩(wěn)定地保留在大腸桿菌細胞中。pREP4除編碼lac阻遏物外還含有質(zhì)粒pACYC184的一個區(qū)域(Chang和Cohen，J.Bacteriol.1341141-1156，1978)，該區(qū)域含有復(fù)制及向子細胞穩(wěn)定遺傳所需的所有信息(進一步的資料還可參閱Stüber等，“供在大腸桿菌中高水平生產(chǎn)和快速純化重組蛋白的體系在抗原決定基圖譜測定、抗體制備及結(jié)構(gòu)功能分析中的應(yīng)用”，Immunological Methods，Lefkovits和Pernis編，1990年第Ⅳ卷第121-152頁，Academic Press，New York)。
可以借助任何常規(guī)方法(參見例如Sambrook等人，同上)用如上所述的載體轉(zhuǎn)化宿主細胞。如果宿主細胞是原核細胞，例如大腸桿菌，則由指數(shù)生長期后收集的細胞制備能夠吸收DNA的感受態(tài)細胞，隨后再按已知的CaCl2法進行處理。轉(zhuǎn)化也可以將宿主細胞制成原生質(zhì)體后進行，或者用本領(lǐng)域已知的其他方法進行，例如Sambrook等人(同上)所述的方法。所以，含有編碼上述hTNF突變蛋白的DNA順序的載體，尤其是用于在原核或低等真核宿主細胞中表達的載體，以及用這樣一種載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，尤其是原核宿主細胞如大腸桿菌或低等真核宿主細胞，也是本發(fā)明的目的。
通常，含有所需表達載體的宿主有機體是在最適于其生長的條件下培養(yǎng)的。如果是處于指數(shù)生長末期的原核宿主，則當每單位時間增加的細胞數(shù)下降時誘導(dǎo)所需hTNF突變蛋白的表達，即轉(zhuǎn)錄編碼所需hTNF突變蛋白的DNA并轉(zhuǎn)譯轉(zhuǎn)錄出的mRNA。進行誘導(dǎo)時可以在生長培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物或去阻遏劑，或者改變物理參數(shù)，如改變溫度。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中所用的表達載體中，表達受lac阻遏物的控制。通過加入異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)使表達調(diào)控順序去阻遏，從而誘導(dǎo)所需hTNF突變蛋白的合成。
由上述轉(zhuǎn)化宿主細胞產(chǎn)生的本發(fā)明hTNF突變蛋白，可以從培養(yǎng)基中回收，也可以在使細胞破碎和/或用蛋白質(zhì)和肽化學(xué)中已知的任何適當方法提取后回收，提取方法的例子有用硫酸銨沉淀、透析、超濾、凝膠過濾或離子交換色譜、凝膠電泳、等電聚焦、親和色譜(如免疫親和色譜)、HPLC等。特別優(yōu)選的方法是用硫酸銨和/或聚乙烯亞胺沉淀、透析、親和色譜(例如苯基瓊脂糖特別是苯基Sepharose親和色譜)或離子交換色譜(特別是在MONO-Q和/或MONO-S基質(zhì)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上進行離子交換色譜)，更具體地說是如Tavernier等人所述的方法(J.Mol.Biol.211493-501，1990)和實施例Ⅴ所公開的方法。
因此，本發(fā)明的目的還在于提供一種制備如上所述的hTNF突變蛋白的方法，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述的轉(zhuǎn)化宿主細胞，并從培養(yǎng)上清液或宿主細胞本身分離突變蛋白，需要時將所述突變蛋白轉(zhuǎn)化為可藥用的鹽。按這樣一種方法制備的化合物也是本發(fā)明的目的。
本發(fā)明hTNF突變蛋白的特征是對人p55-TNF-R具有選擇性結(jié)合親和性。這種性質(zhì)可以用本領(lǐng)域已知的測定結(jié)合親和性的任何測定方法來測定。例如，TNF本身及本發(fā)明突變蛋白的結(jié)合作用可以用細胞培養(yǎng)中兩類TNF受體表達程度不同的細胞來測定，例如使用只表達人p55-TNF-R的Hep-2細胞，以及除p55-TNF-R之外還表達人p75-TNF-R的U937或HL60細胞(見Brockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 873127-3131，1990;Hohmann等，J.Biol.Chem.26414927-14934，1989;Loetscher等，1990;Dembic等，1990)。當然，也可以使用如實施例中所詳細描述的純化的天然或重組p55-TNF-R的p75-TNF-R，或使用這些受體的相應(yīng)可溶性類似物，直接測定結(jié)合親和性。
在本發(fā)明的意義上，術(shù)語“對人p55-腫瘤壞死因子受體具有選擇性結(jié)合親和性”是指，就所用的檢測體系而言，與兩類TNF受體的結(jié)合親和性的差異顯著到足以認為，本發(fā)明突變蛋白與野生型TNF類似地與p55TNF受體選擇性結(jié)合，但卻基本喪失了在功能上相關(guān)的與hp75-TNF-R結(jié)合的能力。更具體地說，這一術(shù)語就實施例中的檢測體系而言是指，用體外結(jié)合測定法對重組可溶性hp75-TNF-R測定時，本發(fā)明特定hTNF的KD值至少比野生型TNF-α大10倍或更多倍，特別優(yōu)選的是至少大102倍，而用體外結(jié)合測定法對重組可溶性hp55-TNF-R測定時，同-hTNF突變蛋白的KD值與野生型TNF-α相差不超過2倍，但是應(yīng)該理解，給出這些具體的KD值只是為了舉例說明，決不應(yīng)認為是限定性的。
本發(fā)明hTNF突變蛋白可以用本領(lǐng)域已知的方法由其抗腫瘤活性來鑒定。
hTNF突變蛋白可以以可藥用的口服、注射或局部組合物和給藥方式使用，可單獨給藥也可與一種或更多種本發(fā)明其他化合物配伍使用。給藥劑量應(yīng)使該組合物在患者體內(nèi)的數(shù)量有效地改善與hTNF突變蛋白功能有關(guān)的生物功能。
因此，含有hTNF突變蛋白及可配伍的藥用載體物質(zhì)的藥物組合物，是本發(fā)明的另一個目的?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)載體物質(zhì)。載體物質(zhì)可以是適于腸內(nèi)、經(jīng)皮或腸胃外給藥的有機或無機載體。合適的載體包括水、明膠、阿拉伯樹膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石、植物油、聚二醇、礦脂等。此外，這些藥物制劑可以含有其他有藥物活性的試劑?？梢园此幬锱渲祁I(lǐng)域的普遍作法加入其他添加劑，如調(diào)味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑等。
這些藥物制劑可以制成任何常規(guī)形式，包括a)供口服給藥的固體形式，如片劑、膠囊劑、丸劑、粉劑、粒劑等;b)供口服給藥的液體形式，如溶液、糖漿劑、懸浮劑、酏劑等;c)供腸胃外給藥的制劑，如無菌溶液、懸浮劑或乳劑;d)供局部給藥的制劑，如溶液、懸浮劑、軟膏劑、霜劑、凝膠劑、碎粉劑、氣霧劑等。藥物制劑可以進行滅菌，并且/或者可以含有助劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類和/或緩沖劑。
腸胃外劑型可以是輸注液或注射液，可以靜脈或肌內(nèi)注射。這些制劑也可以含有其他有醫(yī)藥活性的物質(zhì)。可以按藥物配制領(lǐng)域的普遍作法加入其他添加劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑等。
因此，本發(fā)明的目的還在于提供一種制備藥物組合物的方法，該方法的特征在于，將本發(fā)明方法制得的化合物及必要的其他有藥物活性的物質(zhì)與醫(yī)療上可配伍的惰性無毒載體混合，并將該混合物制成蓋侖(galenical)劑型。
另外，按本發(fā)明方法制備的化合物在制備上述藥物組合物中的應(yīng)用，也是本發(fā)明的目的。
最后，可以針對本發(fā)明hTNF突變蛋白產(chǎn)生抗體。這些抗體可以以公知方式用于診斷或治療及純化。這類抗體可以用以下方法來制備用足量的含本發(fā)明hTNF突變蛋白和可配伍藥物載體的疫苗制劑注射哺乳類或鳥類動物，從而誘發(fā)抗所述hTNF突變蛋白抗體的產(chǎn)生。所需的hTNF突變蛋白的適當數(shù)量，對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，或者可以用常規(guī)實驗來確定。本發(fā)明所用的術(shù)語“藥物載體”既可以指適于人體給藥的標準組合物，也可以指動物疫苗接種中所用的典型佐劑。
TNF是一種強效的多效性細胞素。它有許多不同的活性，例如免疫細胞生長因子活性、炎癥介體活性、或上皮內(nèi)特異基因誘導(dǎo)物活性，這些活性都可以在宿主對感染和損傷的防御過程中觀察到。TNF還具有高度的全身性毒性。菌血癥和敗血性休克或細菌性腦膜炎的有害作用在很大程度上是由內(nèi)源性細胞素介導(dǎo)的，而在這些細胞素中TNF具有早期而且重要的作用。另外，許多細胞和細胞系都對TNF的直接細胞毒活性敏感。各種不同的全身性效應(yīng)和細胞毒性可能都綜合在動物實驗中所觀察到的TNF的抗腫瘤活性中。
這些事實構(gòu)成了用本發(fā)明hTNF突變蛋白建立新的治療方案的合理基礎(chǔ)，特別是，應(yīng)充分利用分割許多不同hTNF活性的可能性，使不利的毒性與所需的活性分開。舉一個例子，由于本發(fā)明hTNF突變蛋白可能具有較低的全身性毒性，有可能用其高劑量作為抗腫瘤劑，這樣便克服了毒性對劑量的限制，而這種毒性可能嚴重地限制了野生型hTNF在癌癥患者中的使用。然而，本發(fā)明hTNF突變蛋白的可能應(yīng)用并不局限于癌癥的治療。任何疾病，只要TNF能作為細菌感染的宿主防御因子(例如Kindler，V等，Cell 56731-740，1989;Nakano，Y.等，J.Immunol.1441935，1990)或作為炎癥介體而起有益作用，就能從55KD TNF受體型特異藥物如本發(fā)明hTNF突變蛋白中受益。還已證明，TNF在惡病質(zhì)中起作用(例如Beutler，B.和Cerami，同上)，而且，具有低全身性毒性的本發(fā)明TNF突變蛋白可用于減肥治療。即使是以TNF釋放過量而產(chǎn)生毒性活性為特征的疾病狀態(tài)，如敗血性休克或細菌性腦膜炎，也可從55KD TNF受體特異性激動劑(如上述的本發(fā)明突變蛋白)或該激動劑與TNF拮抗劑的配伍中受益。
現(xiàn)已出版了一部有關(guān)TNF在新療法中的突出作用的簡明概要，從中可以預(yù)計，具有較低的全身性毒性并能選擇性地只觸發(fā)許多不同的TNF活性中的某些活性的p55-TNF受體型特異激動劑，與野生型TNF相比具有顯著的優(yōu)點(《腫瘤壞死因子分子及其在醫(yī)學(xué)中的突出作用》，B.Beutler編，Raven Press，1992，ISBN 0-88167-852-X)。這種作用包括TNF在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞自身穩(wěn)定性質(zhì)和中性粒細胞粘附中的活性、在組織缺血和再灌損傷中的活性、在骨吸收中對成骨細胞和破骨細胞的活性、作為生長因子對許多細胞的普遍活性和在造血中的活性、以及在代謝和營養(yǎng)效應(yīng)中的活性。提供細胞保持機制的特異基因的誘導(dǎo)，例如已知處于p55-TNFR調(diào)控下的Mn一超氧化物歧化酶的誘導(dǎo)(Lewis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882830，1991;Tartaglia等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 889292，1991)，或者TNF在某些細胞中的直接細胞毒性，都為使用受體型特異TNF激動劑的新治療方案提供了合理的基礎(chǔ)。TNF作為生長/分化因子在淋巴細胞活素激活的殺傷細胞(LAK)生成中的作用，看來對TNF的抗腫瘤活性有貢獻。
一個重要的方面是，所有這些活性都可以通過與其他重組細胞素如干擾素-γ配伍而得到增強或調(diào)節(jié)。
前面已從總體上描述了本發(fā)明，下面的實施例準備結(jié)合下列附圖來詳細說明本發(fā)明，但決不因此而限制本發(fā)明。
以下所用的縮寫和符號為B、E、H、S、Xb和X，分別表示BglⅠ、EcoRⅠ、Hind Ⅲ、SalⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ的限制性酶切位點。
代表可調(diào)控的啟動子/操縱基因單元N25OPSN25OP29;
代表合成的核糖體結(jié)合位點RBSⅡ，SphⅠ;
代表TNFα基因(TNFα)、β-內(nèi)酰胺酶基因(bla)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、lac阻遏物基因(lacⅠ)和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo);
代表噬菌體λ(t0)的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)t0和大腸桿菌rrnB操縱子(T1)的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)T1; ()/() 代表質(zhì)粒pBR322和pREP4的復(fù)制區(qū)(repl.);→代表處于
N25OPSN250P29和RBSⅡ，SphⅠ調(diào)控下的編碼區(qū)。
圖1a是質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的示意圖。
圖1b顯示了質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的完整核苷酸順序。在該順序中標出了圖1a中所畫出的限制酶識別順序。所示的氨基酸順序以三字母代碼表示成熟TNFα的順序(157個氨基酸)。
圖2a是質(zhì)粒pREP4的示意圖。
圖2b顯示了質(zhì)粒pREP4的完整核苷酸順序。在該順序中標出了圖2a中所畫出的限制酶識別順序。
圖3概括了編碼TNF-α突變蛋白Thr86-TNFα的EcoRⅠ-HindⅢ片段的制備。
圖4顯示了質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32)中片段1的核苷酸順序。
圖5顯示了質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29)中片段1的核苷酸順序。
圖6顯示了質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29Trp32)中片段1的核苷酸順序。
圖7顯示了野生型人TNFα及Thr86、Trp32-Thr86和Ser29-Trp32-Thr86突變蛋白與重組人p-75 TNFR和p-55 TNFR的競爭性結(jié)合。用重組人p75 TNFR-IgGγ3融合蛋白(A組)和重組人p55TNFR-IgGγ3融合蛋白(B組)涂布微量滴定板，在不同濃度的野生型TNFα(實心圓)、Thr86突變蛋白(空心圓)、Trp32-Thr86突變蛋白(空心方塊)和Ser29-Trp32-Thr86突變蛋白(空心三角)存在下，使微量滴定板與放射標記的人TNFα一起保溫。室溫下三小時后，用γ計數(shù)器計數(shù)結(jié)合的放射性。
圖8顯示了野生型人TNFα及Ser29-Thr86、Glu31-Thr86和Asn31-Thr32-Thr86突變蛋白與重組人p75TNFR和p55TNFR的競爭性結(jié)合。用重組人p75 TNFR-IgGγ3融合蛋白(A組)和重組人p55TNFR-IgGγ3融合蛋白(B組)涂布微量滴定板，在不同濃度的野生型TNFα(實心圓)、Ser29-Thr86突變蛋白(空心圓)、Asn31-Thr32-Thr86突變蛋白(空心方塊)和Glu31-Thr86突變蛋白(空心三角)存在下，使微量滴定板與放射標記的人TNFα一起保溫。室溫下三小時后，用γ計數(shù)器計數(shù)結(jié)合的放射性。
除非另外指出，以下給出的固固混合物、液液混合物和固液混合物中的百分比，分別按重量/重量、體積/體積和重量/體積計算。
實施例ⅠThr86-TNFα的制備質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα用人TNFα表達質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(見圖1)作為TNFα基因的來源用于制備本發(fā)明的各種TNFα突變蛋白。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌M15株(pREP4;pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα)已為專利目的而按布達佩斯條約于1991年9月8日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)(Braunschweig，BRD)，保藏號為DSM6713。
用PCR法誘變TNFα基因利用Perkin-Elmer Cetus GeneAmpTMDNA擴增試劑盒及AmpliTaqTM重組Taq DNA聚合酶，用質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(圖1)作模板DNA進行兩個PCR反應(yīng)(見圖3)。
反應(yīng)Ⅰ用引物17/F(5′-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3;引物17／包含質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα核苷酸3949-3970)和29/M22(5′-GTAGGTGACGGCGATGCGGCTGATGGT-3′;引物29/M22包含與質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸378-352互補的核苷酸，劃下線的是突變堿基)進行。
反應(yīng)Ⅱ用引物29/MR1(5′CAGACCAAGGTCAACCTCCTC-3′;引物29/MR1包含質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸379-399)和17/O(5′-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3′;引物17/O包含與質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNF的核苷酸748-727互補的核苷酸)進行。
在一個典型的實驗中，在Eppendorf管中混合下列物質(zhì)10μl模板DNA(10ng)、兩種引物各5μl(各100皮摩爾)、16μl dNTP混合物(1.25mM dATP、dGTP、dCTP和dTTP)、10μl 10X反應(yīng)緩沖液(100mM Tris-HCl pH8.3，500mM KCl、15mM MgCl2、0.1%明膠)、1μl(5單位)AmpliTaqTMDNA聚合酶和53μl H2O。在該混合物上鋪80ml礦物油(Perkin-Elmer Cetus)。將各管移入DNA熱循環(huán)儀(TRIO-Thermoblock，Biometra)中，于94℃下保持1分鐘，然后進行35次DNA熔化(94℃，1分鐘)、引物退火(50℃，1分鐘)、引物延伸(72℃，3分鐘)的循環(huán)。于72℃下再經(jīng)2分鐘后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，用氯仿萃取。用乙醇沉淀出水相中所含的DNA，在6%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳(Sambrook等，1989)。用溴化乙錠染色DNA后，從凝膠中分離出片段Ⅰ和Ⅱ(見圖3)并進行純化(Sambrook等，1989)。
制備編碼Thr86-TNFα的DNA片段使片段Ⅰ和Ⅱ酶促磷酸化，然后使其彼此連接(Sambrook等，1989)。使連接酶熱失活并用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ消化后，在6%聚丙烯酰胺凝膠中對DNA進行電泳。用溴化乙錠染色DNA后，從凝膠中分離出EcoRⅠ-HindⅢ片段A(見圖3)并純化(同上)。
制備編碼Thr86-TNFα的質(zhì)粒按標準方法(Sambrook等，1989)將EcoRⅠ-HindⅢ片段A插入已用EcoRⅠ-HindⅢ開環(huán)的質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα中，產(chǎn)生質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Thr86)。制備質(zhì)粒DNA(Birnboim等，1979)，通過測定雙鏈DNA的順序TNFα突變蛋白編碼區(qū)正確與否(Sambrook等，1989)。
產(chǎn)生Thr86-TNFα用標準方法(同上)將質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Thr86)轉(zhuǎn)化到已含有質(zhì)粒pREP4的大腸桿菌M15細胞中。于37℃下在含有100mg/l氨芐青霉素和25mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基(Sambrook等，1989)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞。在600nm處光密度約為0.7-1.0時，加入IPTG至終濃度為2mM。于37℃下再過2.5至5小時后，離心收集細胞。
實施例ⅡGlu31-TNFα和Asn31Thr32-TNFα的制備原理TNFα突變蛋白Glu31-TNFα和Asn31Thr32-TNFα是按照實施例Ⅰ所詳述的制備Thr86-TNFα的方法來制備的。因此，在對上列TNFα突變蛋白的制備所作的描述中，只指出了用于PCR反應(yīng)Ⅰ和Ⅱ的引物。另外還給出了編碼各種TNFα突變蛋白的表達質(zhì)粒的名稱。
制備Glu31-TNFαPCR反應(yīng)Ⅰ用引物17/F(5′-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3′;引物17/F包含質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸3949-3970)和21/M5(5′-ATTGGCCCGCTCGTTCAGCCACTGGAGCTGCCCCTC-3′;引物21/M5包含與質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸219-184互補的核苷酸，劃下線的是突變堿基)進行。PCR反應(yīng)Ⅱ用引物21/MR(5′-GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGG-3′;引物21/MR包含質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸220-241)和17/O(5′-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3′;引物17/O包含與質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸748-727互補的核苷酸)進行。
所得的表達質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Glu31)用于產(chǎn)生Glu31-TNFα和構(gòu)建質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Glu31Thr86)(見實施例Ⅳ)。
制備Asn31Thr32-TNFαPCR反應(yīng)Ⅰ用引物17/F(5′-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3′;引物17/F包含質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸3949-3970)和21/M6(5′-ATTGGCAGTGTTGTTCAGCCACTGGAGCTGCCCCTC-3′;引物21/M6包含與質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸219-184互補的核苷酸，劃下線的是突變堿基)進行。PCR反應(yīng)Ⅱ用引物21/MR(5′-GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGG-3′;引物21/MR包含質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸220-241)和17/O(5′-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3′;引物17/O包含與質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸748-727互補的核苷酸)進行。
所得的表達質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Asn31Thr32)用于產(chǎn)生Asn31Thr32-TNFα和構(gòu)建質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Asn 31Thr32Thr86)(見實施例Ⅳ)。
實施例ⅢTrp32Thr86-TNFα的制備原理為制備Trp32Thr86-TNFα，構(gòu)建表達質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32Thr86)，然后將該質(zhì)粒用于在大腸桿菌中產(chǎn)生Trp32Thr86-TNFα。
構(gòu)建質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32Thr86)實施例Ⅰ和Ⅱ所述的所有表達質(zhì)粒都含有與質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα相同的兩個限制酶BglⅠ位點(見圖1)。這兩個位點中一個位于β-內(nèi)酰胺酶基因內(nèi)，另一個則位于TNFα基因內(nèi)。后一個位點將TNFα的編碼區(qū)分隔為兩部分一部分編碼TNFα的1-36位氨基酸，另一部分則編碼TNFα的37-157位氨基酸(見圖1b)。
為構(gòu)建質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32Thr86)，按標準方法制備DNA片段1和2(Sambrook等，1989)。片段1(順序見圖4)為質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32)的小BglⅠ片段加上可調(diào)控的啟動子和Trp32-TNFα到36位氨基酸為止的編碼區(qū)。片段2為質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Thr86)的大BglⅠ片段加上Thr86-TNFα從37位氨基酸起始的編碼區(qū)和該質(zhì)粒的復(fù)制區(qū)。使片段1與經(jīng)過酶促脫磷酸化的片段2彼此連接(Sambrook等，1989)，生成質(zhì)粒PDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32Thr86)。
M15(pREP4;pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32))細胞已為專利目的而按布達佩斯條約于1990年11月19日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)(Braunschweig，BRD)，保藏號為DSM6241。
產(chǎn)生Trp32Thr86-TNFα用標準方法(同上)將質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32Thr86)轉(zhuǎn)化到已含有質(zhì)粒pREP4的大腸桿菌M15細胞中。于37℃下，在含有100mg/l氨芐青霉素和25mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基(同上)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞。在600nm處的光密度約為0.7至1.0時，加入IPTG至終濃度為2mM。于37℃下再經(jīng)2.5-5小時后，離心收集細胞。
實施例ⅣSer29Thr86-TNFα、Ser29Trp32Thr86-TNFα、Glu31Thr86-TNFα和Asn31Thr32-Thr86-TNFα的制備原理
TNFα突變蛋白Ser29Thr86-TNFα、Ser29Trp32Thr86-TNFα、Glu31Thr86-TNFα和Asn31Thr32-Thr86-TNFα，是按照實施例Ⅲ中所詳述的制備Trp32Thr86-TNFα的方法來制備的。因此，在對上列TNFα突變蛋白的制備所作的描述中，只指出了相應(yīng)于實施例Ⅲ中片段1的DNA片段。另外還給出了編碼各種TNFα突變蛋白的表達質(zhì)粒的名稱。
制備Ser29Thr86-TNFα片段1(順序見圖5)為質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29)的小BglⅠ片段加上可調(diào)控的啟動子和Ser29-TNFα到36位氨基酸為止的編碼區(qū)。使片段1與經(jīng)過酶促脫磷酸化的片段2(見實施例Ⅲ)彼此連接(Sambrook等，1989)，生成質(zhì)粒pDS 56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29Thr86)，然后將該質(zhì)粒用于在大腸桿菌中產(chǎn)生Ser29Thr86-TNFα。
M15(pREP4;pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29))細胞已為專利目的而按布達佩斯條約于1990年11月19日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)(Braunschweig，BRD)，保藏號為DSM6240。
制備Ser29Trp32Thr86-TNFα片段1(順序見圖6)為質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29TrP32)的小BglⅠ片段加上可調(diào)控的啟動子和Ser29Trp32-TNFα到36位氨基酸為止的編碼區(qū)。使片段1和經(jīng)過酶促脫磷酸化的片段2(見實施例Ⅲ)彼此連接(Sambrook等，1989)，生成質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29Trp32Thr86)，然后將該質(zhì)粒用于在大腸桿菌中產(chǎn)生Ser29Trp32Thr86-TNFα。
制備Glu31Thr86-TNFα片段1為質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Glu31)的小BglⅠ片段加上可調(diào)控的啟動子和Glu31-TNFα到36位氨基酸為止的編碼區(qū)。使片段1和經(jīng)過酶促脫磷酸化的片段2(見實施例Ⅲ)彼此連接(Sambrook等，1989)，生成質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Glu31Thr86)，然后將該質(zhì)粒用于在大腸桿菌中產(chǎn)生Glu31Thr86-TNFα。
制備Asn31Thr32Thr86-TNFα片段1為質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Asn31Thr32)的小BglⅠ片段加上可調(diào)控的啟動子和Asn31Thr32-TNFα到36位氨基酸為止的編碼區(qū)。使片段1與經(jīng)過酶促脫磷酸化的片段2(見實施例Ⅲ)彼此連接(Sambrook等，1989)，生成質(zhì)粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Asn31Thr32Thr86)，然后將該質(zhì)粒用于在大腸桿菌中產(chǎn)生Asn31Thr32Thr86-TNFα。
實施例Ⅴ純化人TNFα突變蛋白離心收集1升如上所述轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)的大腸桿菌細胞過夜培養(yǎng)物，并重新懸浮于20ml 50mM Tris pH7.2、200mM KCl、50mM MgCl2、5%甘油中。在法式壓榨器中以20000磅/英寸2的壓力將細胞打碎。離心(70000Xg，30分，4℃)澄清后，加入固體硫酸銨至終濃度為30%。溶液于室溫下攪拌1小時，然后在4℃下以10000Xg離心20分。上清液用0.45μm濾器過濾，并調(diào)至硫酸銨濃度為70%。離心收集沉淀出的蛋白，溶于20ml 20mM Tris pH9.0中，于4℃下對同一緩沖液透析過夜。以1ml為1份，將各等份經(jīng)過透析的樣品加到用20mM Tris pH9.0平衡過的MonoQ柱(HR 5/5，LKB-Pharmacia)上，用線性NaCl梯度(在20mM Tris pH9.0中0-400mM)洗脫，流速為0.5ml/分。以0.5ml為一份收集各級分，并用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)分析其中是否含有TNFα突變蛋白。合并陽性級分，對20mM 2-嗎啉代乙磺酸(MES)pH6.0透析，再加到用20mM MES pH6.0平衡過的MonoS柱(HR5/5，LKB-Pharmacia)上。用線性NaCl梯度(在20mM MES pH6.0中0-400mM)以0.5ml/分的流速洗脫蛋白質(zhì)。在250mM和350mM NaCl之間洗脫出電泳純的各種TNFα突變蛋白。對磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)透析后，以BCA蛋白測定法(Pierce化學(xué)公司)用野生型人TNFα作標準物測定蛋白濃度。
實施例Ⅵ人TNFα和突變蛋白與重組人p75-TNFR和p55-TNFR的競爭性結(jié)合為進行競爭性結(jié)合試驗，將重組人p75-TNFR-人IgGγ3和p55-TNFR-人ⅠgGγ3融合蛋白分別是以0.3μg/ml和0.1μg/ml溶于PBS，用這兩種融合蛋白涂布微量滴定板(100μl/孔4℃下過夜)(Loetscher，H.等，J.Biol.Chem.26618324-18329，1991;Lesslauser，W.等，Eur.J.Immunol.212883-2886，1991)。用封閉緩沖液(50mM Tris pH7.4、140mM NaCl、5mM EDTA、0.02% NaN3、1%脫脂奶粉)封閉后，將微量滴定板用PBS洗滌，在不同濃度的突變蛋白存在下，與10mg/ml人125Ⅰ-TNFα(用Iodogen法(Pierce化學(xué)公司)標記至比放射性約為30μCi/μg)一起保溫。體積為100μl/孔，每個濃度做三次平行測定。室溫下3小時后，用PBS充分洗滌各小孔，并用γ計數(shù)器計數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種對人p55-腫瘤壞死因子受體具有選擇性結(jié)合親和性的人腫瘤壞死因子突變蛋白或其可藥用鹽，其特征在于，人腫瘤壞死因子的氨基酸順序至少在86位上有變化，以蘇氨酸代替了絲氨酸殘基。
2.如權(quán)利要求1所述的突變蛋白或其可藥用鹽，其中所述氨基酸順序還在一個或更多個額外位置上有變化，優(yōu)選在一個或二個額外位置上有變化。
3.如權(quán)利要求2所述的突變蛋白或其可藥用鹽，其中所述氨基酸順序在29和86位、31和86位、32和86位、29、32和86位、以及31、32和86位有變化。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的突變蛋白或其可藥用鹽，該突變蛋白為Thr86-TNFα、Ser29-Thr86-TNFα、Glu31-Thr86-TNFα、Trp32-Thr86-TNFα、Ser29-Trp32-Thr86-TNFα、或Asn31-Thr32-Thr86-TNFα。
5.一種DNA順序，該順序包含編碼如權(quán)利要求1-4中任一項所述的突變蛋白的DNA順序。
6.一種載體，尤其是用于在原核或低等真核宿主細胞中表達的載體，該載體包含如權(quán)利要求5所述的DNA順序。
7.一種宿主細胞，尤其是原核或低等真核宿主細胞，該宿主細胞已用如權(quán)利要求6所述的載體轉(zhuǎn)化。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細胞，該宿主細胞為大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的化合物，該化合物用于治療疾病。
10.一種制備如權(quán)利要求1-4中任一項所述的化合物的方法，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求7或8所述的宿主細胞，從培養(yǎng)上清液或宿主細胞本身分離突變蛋白，并在需要時將所述突變蛋白轉(zhuǎn)化為可藥用鹽。
11.一種藥物組合物，該組合物含有一種或更多種如權(quán)利要求1-4中任一項所述的化合物，需要時與其他有藥物活性的物質(zhì)和/或在治療上可配伍的惰性無毒載體物質(zhì)配伍。
12.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的化合物在疾病治療中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及對人p55腫瘤壞死因子受體具有選擇性結(jié)合親和性的人腫瘤壞死因子突變蛋白或其可藥用鹽，其特征在于，人腫瘤壞死因子的氨基酸順序至少在86位上有變化，由蘇氨酸代替了絲氨酸殘基。本發(fā)明還涉及編碼該突變蛋白的DNA順序、包含該DNA順序的載體、由該載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞、由該宿主細胞產(chǎn)生上述突變蛋白的方法、含有該突變蛋白的藥物組合物，以及該突變蛋白在疾病治療中的應(yīng)用。
文檔編號A61K38/00GK1079225SQ93103419
公開日1993年12月8日 申請日期1993年4月1日 優(yōu)先權(quán)日1992年4月2日
發(fā)明者W·列斯勞爾, H·勒舍, D·施特伯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司