腫瘤壞死因子α因子蛋白的全序列及其蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種腫瘤壞死因子a因子蛋白的全序列及其蛋白的制備方法，尤其 涉及一種池蝶蛘的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子a因子（Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor, LITAF)蛋白的全序列及其蛋白的制備方法,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子 a 因子（Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor, LITAF)是一種轉(zhuǎn)錄因子，它可調(diào)控腫瘤壞死因子TNF-a轉(zhuǎn)錄表達(dá)，引起多種炎癥反 應(yīng)和腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。
[0003] 我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，以池蝶蛘等為育珠蛘的珍珠養(yǎng)殖是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的主導(dǎo)產(chǎn) 業(yè)之一。池蝶蛘等淡水貝類具有個體大、營養(yǎng)豐富等特點，其提取物還具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌 等多種生物學(xué)活性效應(yīng)。目前國內(nèi)外已通過提取貝類多糖等生理活性物質(zhì)，開發(fā)出了保健 食品和藥品。但以上提取物由于貝類體內(nèi)本身含量低等原因，以及提取制備步驟繁瑣、工藝 復(fù)雜等原因，目前多為純度較低的多糖等物質(zhì)的混合物，具有一定免疫調(diào)節(jié)等功效，但對腫 瘤細(xì)胞的毒性作用較低，對其功效及副作用藥理和毒理研究尚缺乏認(rèn)識。而利用現(xiàn)代基因 工程技術(shù)開發(fā)的池蝶蛘中LITAF重組蛋白產(chǎn)品，對人類來源的腫瘤細(xì)胞如A549等細(xì)胞株具 有特異性和安全性高、殺傷性好、來源穩(wěn)定和易于貯存等優(yōu)點，并具有廣闊的市場前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供了一種池蝶蛘的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子a因子 (Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor, LITAF)蛋白的全序列及其蛋白的制 備方法，通過設(shè)計擴(kuò)增池蝶蛘中LITAF開放閱讀框序列的寡核苷酸引物，獲得了池蝶蛘中 LITAF蛋白的全序列。
[0005] 為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是：一種腫瘤壞死因子a因子蛋白的全序 列，具有序列表中SEQ ID NO. 1所示的來自于a因子體內(nèi)的LITAF蛋白的核酸全序列和具 有序列表中SEQ ID N0. 2所示的來自于a因子體內(nèi)的LITAF蛋白的氨基酸序列。
[0006] 腫瘤壞死因子蛋白的制備方法，包括如下步驟：提取池蝶蛘的總RNA，反轉(zhuǎn)錄 成cDNA后，以該cDNA為模板，利用設(shè)計好的寡聚核苷酸引物序列，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)，得到編碼LITAF蛋白的基因全序列；構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32c (+)-LITAF，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌感受態(tài)BL21 (DE3)，經(jīng)鑒定為陽性后，在體外利用0. lmmol/L異丙基-P-D-硫代吡 喃半乳糖苷（IPTG)于30°C誘導(dǎo)LITAF蛋白表達(dá)；最后分離純化目的蛋白，獲得LITAF重組 蛋白，所制備得到的蛋白具有序列表中SEQ ID NO. 1所示的來自于池蝶蛘體內(nèi)特有的LITAF 蛋白的核酸全序列及SEQ ID NO. 2所示的來自于池蝶蛘體內(nèi)特有的LITAF蛋白的氨基酸序 列。
[0007] 所述步驟具體為：
[0008] 1)以池蝶蛘的cDNA為模板，設(shè)計擴(kuò)增LITAF基因的引物，利用該引物進(jìn)行聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到編碼LITAF蛋白的基因全序列；
[0009] 2)利用基因重組技術(shù)將LITAF基因片段克隆到PMD19-T載體中，再經(jīng)限制 性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET-32c(+)原核表達(dá)載體相連接，獲得表達(dá)重組載體 pET-32c (+) -LITAF ;該重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21 (DE3)，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，利用PCR法 篩選、鑒定陽性克隆，經(jīng)測序鑒定獲得編碼框正確的重組表達(dá)載體pET-32c(+)-LITAF ;
[0010] 3)取陽性重組質(zhì)粒pET-32c(+)-LITAF，在體外利用0? lmmol/LIPTG于30°C，6h誘 導(dǎo)LITAF蛋白表達(dá)；利用Western-blot和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法鑒定目的蛋白；[0011] 4)用組氨酸親和層析柱法分離純化目的蛋白，從而獲得LITAF重組蛋白。
[0012] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明設(shè)計了擴(kuò)增池蝶蛘中LITAF編碼序列的寡聚核苷酸 引物，獲得了池蝶蛘中LITAF蛋白的全序列，所得到的LITAF重組蛋白是利用基因工程技術(shù) 開發(fā)的池蝶蛘中LITAF蛋白產(chǎn)品，對人類腫瘤細(xì)胞A549等多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性強(qiáng)、 特異性高、安全性好、可大量重復(fù)生產(chǎn)和易于貯存等優(yōu)點，LITAF重組蛋白可用于制備新型 基因工程抗癌藥物，防治人類癌癥，具有廣闊的市場前景。
【具體實施方式】
[0013] 下面實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步驟的說明。
[0014] 本實施例的一種腫瘤壞死因子c[因子蛋白的全序列，具有序列表中SEQ ID NO. 1 所示的來自于池蝶蛘體內(nèi)的LITAF蛋白的核酸全序列和具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的 來自于池蝶蛘體內(nèi)的LITAF蛋白的氨基酸序列。
[0015] 一種腫瘤壞死因子蛋白的制備方法，包括如下步驟：
[0016] 1. LITAF基因序列的PCR擴(kuò)增：取池蝶蛘的外套膜組織，加液氮研磨后，用 TRIzol法（立菲生物，美國）提取池蝶蛘的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（立菲生物，美 國）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得池蝶蛘的cDNA。以該cDNA為模板，設(shè)計擴(kuò)增LITAF蛋白基因 的引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)的參數(shù)為：94°C預(yù)變性5min ;35個循環(huán)： 94°C 40sec, 56°C 40sec, 72°C lmin ;72°C 10min ;得到編碼 LITAF 蛋白基因的全序列。
[0017] 2.重組表達(dá)載體pET-32c(+)-LITAF的構(gòu)建：將得到的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體 (TAKARA，日本）相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞（TAKARA，日本)，涂布到含氨芐青 霉素的LB篩選平板（四季青，中國），經(jīng)10h培養(yǎng)后，挑取若干個菌落進(jìn)行PCR鑒定，PCR反 應(yīng)參數(shù)和條件同上；取一經(jīng)鑒定過的陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，以堿裂解法抽提質(zhì)粒，將純化后的 質(zhì)粒以Hind I和BamH I限制性內(nèi)切酶（上海生工，加拿大）雙酶切，再插入經(jīng)過同樣雙酶 切的pET-32c (+)載體（Novagen，美國）的相應(yīng)位點上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3) (天根，德國）。利用PCR法篩選陽性克隆，經(jīng)測序鑒定獲得編碼框正確的重組表達(dá)載體 pET-32c(+)-LITAF。
[0018] 3.重組蛋白的表達(dá)與鑒定：將陽性重組質(zhì)粒pET-32c(+)-LITAF
[0019] 轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)(天根，德國）感受態(tài)，涂布含氨芐青霉素的LB (四季 青，中國)平板，37°C倒置培養(yǎng)過夜。挑取一個單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)液（四季青，中國)， 37°C振蕩培養(yǎng)10。取適量菌液，按1:100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)至0D600為0. 4-0. 5時，將菌液 分為若干等份，不加或分別加入IPTG (上海生工，加拿大）（終濃度在0-1. 0mm〇l/L)，繼續(xù)培 養(yǎng)6h，離心法收集菌體。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解后，離心分離上清液和沉淀，再分別上樣，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳（SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳）鑒定目的蛋白。
[0020] 4.重組蛋白的純化與抗體制備：利用組氨酸親和層析柱（Novagen，美國）對表達(dá) 產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。用上述方法大量制備超聲裂解的菌液，離心分離上清液，進(jìn)行蛋白的純 化和洗脫操作，再進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳鑒定，所制備得到的蛋白具有序列表中SEQ ID NO. 1所示的來自于池蝶蛘體內(nèi)特有的LITAF蛋白的核酸全序列及SEQ ID NO. 2所示的來自 于池蝶蛘體內(nèi)特有的LITAF蛋白的氨基酸序列。
[0021] 挑選體重約1. 5kg的健康新西蘭白雄兔進(jìn)行免疫。經(jīng)過一次初始免疫和兩次加強(qiáng) 免