變體激活素受體多肽及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供了能夠結合且抑制激活素A、肌抑素或GDF?11的活性的變體激活素IIB可溶性受體多肽和蛋白質。本發(fā)明還提供了能夠產(chǎn)生變體多肽和蛋白質的多核苷酸、載體和宿主細胞。還提供了用于治療肌肉消耗以及其他疾病和病癥的組合物和方法。
【專利說明】變體激活素受體多化及其用途
[0001 ] 本申請是申請日為2008年03月06日的200880007116.0號發(fā)明專利申請(發(fā)明名 稱:變體激活素受體多膚及其用途)的分案申請。
[0002] 與相關申請的交叉參照
[0003] 本申請要求于2008年2月11日提交的美國臨時申請序列號61/065,474,和于2007 年3月6日提交的美國臨時申請序列號60/905，459的利益，所述專利申請的公開內(nèi)容被依賴 且引入本文作為參考。
[0004] 本發(fā)明的技術領域
[0005] 本發(fā)明的技術領域設及轉化生長因子-e(TGF-e)家族成員和可溶性TGF-0受體，W 及調(diào)節(jié)TGF-0家族成員的活性、用于治療各種病癥的方法。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 蛋白質的轉化生長因子e(TGF-e)家族包括轉化生長因子-e(TGF-e)、激活素、骨形 態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)、神經(jīng)生長因子(NGFs)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(m)NF)、和生長/分化因子 (GDFs)。運些家族成員設及廣泛范圍的生物過程，包括細胞增殖、分化和其他功能的調(diào)節(jié)。 [000引生長/分化因子S(GDF-S)也稱為肌抑素(myos化tin),是大多數(shù)情況下在發(fā)育中的 和成人骨骼肌組織的細胞中表達的TGF-0家族成員。肌抑素看起來在負控制骨骼肌生長中 發(fā)揮關鍵作用(McPherron等人，化ture (Xondon) 387，83-90 (1997))。括抗肌抑素已顯示增 加動物中的無脂肪肌肉量(McFerron等人，同上，Zimmers等人，Science 296:1486(2002))
[0009] 蛋白質的TGF-e家族的另一個成員是相關生長/分化因子GDF-11dGDF-11具有肌抑 素氨基酸序列約90%的同一性。GDF-Il在發(fā)育中的動物的軸向模式中具有作用（Oh等人， Genes Dev 11:1812-26(1997))，并且看起來也在骨骼肌發(fā)育和生長中發(fā)揮作用。
[0010] 激活素 A、B和AB分別是具有兩條多膚鏈M和郎的同二聚體和異二聚體(Vale等人 化ture 321,776-779(1986) ,Ling等人，化ture 321,779-782(1986))。激活素最初作為設 及濾泡刺激激素合成調(diào)節(jié)的性腺膚而發(fā)現(xiàn)，并且目前被認為設及許多生物活性的調(diào)節(jié)。激 活素 A是占優(yōu)勢形式的激活素。
[0011] 激活素、肌抑素、GDF-Il和TGF-0超家族的其他成員結合激活素 II型和激活素 IIB 型受體且通過所述受體的組合發(fā)信號，所述2種受體都是跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶 化arrison等人，J. Biol. Chem. 279,28036-28044(2004))。交聯(lián)研究已測定肌抑素能夠在體 外結合激活素 II型受體ActRIIA和ActRIIB(Lee等人，PNAS USA 98:9306-11(2001))。還存 在GDF-Il與ActRIIA和ActRIIB結合的證據(jù)(Oh等人，Genes Dev 16:2749-54(2002))。
[0012] 已知TGF-0蛋白質表達與各種疾病和病癥相關。因此，能夠括抗幾種TGF-0蛋白質 的治療分子同時可能是對于運些疾病和病癥特別有效的。
[0013] 此外，蛋白質治療的產(chǎn)生可能合并在蛋白質表達和純化過程中發(fā)生的問題。一個 問題是在表達或純化過程中蛋白質的聚集。在細胞培養(yǎng)條件過程中高水平蛋白質的積累可 能導致聚集。純化過程可能使蛋白質暴露于促進進一步聚集的另外因素(Cromwell, M.E.M. 等人，The AAPS Journal 8:E572-E579,2006)。可W嘗試減輕引起聚集的因素，然而，存在 蛋白質設計為具有減少形成聚集物的傾向的需要。本發(fā)明滿足了對治療分子的需要，所述 治療分子與多種配體結合，并且具有減少的聚集且因此具有改善的可制造性，W便有效產(chǎn) 生對于治療TGF-0相關疾病狀態(tài)有用的蛋白質。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 本發(fā)明提供了包含變體人激活素受體IIB(命名為vActRIIB)多膚的分離蛋白質。 如本文所使用的，術語vActRIIB多膚指人vActRIIB多膚和人vActRIIB5多膚兩者。在一個實 施方案中，蛋白質包含具有SEQ ID N0:2或18的氨基酸序列的多膚，其中在位置E28或R40或 者位置E28和R40兩者處的氨基酸由另一非天然氨基酸取代，并且其中所述多膚能夠結合肌 抑素、激活素 A或GDF-11。在一個實施方案中，蛋白質包含具有SEQ ID N0:2或18的氨基酸序 列的多膚，其中在位置E28或R40或者位置E28和R40兩者處的氨基酸由非天然氨基酸取代， 并且其中信號膚被去除，并且其中所述多膚能夠結合肌抑素、激活素 A或GDF-11。在一個實 施方案中，蛋白質包含具有SEQ ID N0:2或18的氨基酸序列的多膚，其中在位置E28或R40或 者位置E28和R40兩者處的氨基酸由另一氨基酸取代，其中信號膚被去除，并且其中成熟多 膚的N末端被截短，并且其中所述多膚能夠結合肌抑素、激活素 A或GDF-11。在一個實施方案 中，N末端成熟截短的vActRIIB多膚缺乏成熟序列的N末端4個氨基酸或N末端6個氨基酸，其 中所述多膚能夠結合肌抑素、激活素 A或GDF-11。在一個實施方案中，在位置E28處的取代選 自W、Y和A。在一個進一步的實施方案中，在位置E28處的取代選自氨基酸A、F、Q、V、I、L、M、K、 H、W和Y。在一個進一步的實施方案中，在位置E40處的取代選自氨基酸G、Q、M、H、K和N。在一 個進一步的實施方案中，在位置E28處的取代選自氨基酸A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W和Y，并且在 位置E40處的取代選自氨基酸A、G、Q、M、H、K和N。在一個進一步的實施方案中，多膚進一步包 含異源蛋白質。在一個實施方案中，異源蛋白質是化結構域。在一個進一步的實施方案中， Fc結構域是人IgG Fc結構域。
[0016] 在一個實施方案中，蛋白質包含具有SEQ ID N0:4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、 26、 28、30、32、：34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、70、72、87、88、91、93、95和 97中所示氨基酸序列的多膚。
[0017] 在另一個實施方案中，蛋白質包含由具有SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、 23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94、96中 所示序列或其互補序列的多核巧酸編碼的多膚。
[0018] 在另一個方面，本發(fā)明提供了包含編碼vActRIIB多膚的多核巧酸的分離核酸分 子。在一個實施方案中，核酸分子包含具有沈Q ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、23、25、 27、 29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、69、71、92、94、96中所示核酸序 列或其互補序列的多核巧酸。
[0019] 在另一個實施方案中，核酸分子包含編碼多膚的多核巧酸，所述多膚由SEQ ID N0:4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、 62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97中所示氨基酸序列組成。在一個進一步的實施方 案中，核酸分子進一步包含轉錄或翻譯調(diào)節(jié)序列。在另一個方面，提供了包含vActRIIB核酸 分子的重組載體。在另一個方面，提供了包含重組載體的宿主細胞，并且提供了生產(chǎn) vActRIIB多膚的方法。
[0020] 本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明的至少一種vActRIIB多膚或蛋白質的組合物。在 一個實施方案中，組合物是包含與藥學上可接受的載體混合的vActRIIB多膚或蛋白質的藥 物組合物。
[0021] 在另一個方面，本發(fā)明提供了通過給受試者施用包含vActRIIB多膚或蛋白質的治 療組合物，治療或預防患有肌肉消耗疾病的受試者中的此種病癥的方法。肌肉消耗疾病包 括或起因于，但不限于下述狀況:癌癥惡病質、肌營養(yǎng)不良、肌萎縮性側索硬化、充血性阻塞 性肺疾病、慢性屯、力衰竭、化學性惡病質、來自HIV/AIDS的惡病質、腎衰竭、尿毒癥、類風濕 性關節(jié)炎、老年性骨骼肌減少癥（age-reIated sarcopenia)、老年性脆性（age-related fragility)、器官萎縮、腕管綜合征、雄激素剝奪、和由于長期邸床休息導致的不活動引起 的肌肉消耗、脊髓損傷、中風、骨折和衰老。肌肉消耗還可W起因于太空飛行引起的失重、膜 島素抵抗、由于燒傷引起的肌肉消耗、雄激素剝奪、和其他病癥。在另一個方面，本發(fā)明提供 了治療與激活素 A表達相關的疾病的方法。在一個實施方案中，疾病是癌癥。在另一個方面， 本發(fā)明提供了治療代謝素亂的方法，其包括給需要此種治療的受試者施用治療組合物，其 中代謝素亂選自骨丟失、糖尿病、肥胖、葡萄糖耐受不良、高血糖癥、雄激素剝奪、和代謝綜 合征。在另一個方面，本發(fā)明提供了治療組合物在制備用于治療上述病癥的藥物中的用途。 在另一個方面，本發(fā)明提供了基因治療方法，其包括給有需要的受試者施用編碼本發(fā)明的 vActRIIB多膚或蛋白質的載體，其中載體能夠在受試者中表達vActRIIB多膚或蛋白質。
[0022] 特別地，本發(fā)明設及W下各項：
[0023] 1.包含變體激活素 IIB受體多膚(vActRIIB)的分離的蛋白質，其中所述多膚包含 SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 18的多膚序列，但在位置28或位置40處有單氨基酸取代，并且其 中所述多膚能夠結合肌抑素、激活素 A或GDF-11。
[0024] 2.包含變體激活素 IIB受體多膚(vActRIIB)的分離的蛋白質，其中所述多膚包含 SEQ ID NO: 2或18的多膚序列，但在位置28和位置40處有單氨基酸取代，并且其中所述多膚 能夠結合肌抑素、激活素 A或GDF-11。
[00巧]3.第1項的蛋白質，其中所述vActRIIB多膚在位置28處的取代選自A、F、Q、V、I、L、 1、1(、山￥和￥取代6。
[00%] 4.第2項的蛋白質，其中所述vActRIIB多膚在位置28處的取代選自A、F、Q、V、I、L、 1、1(、山￥和￥取代6。
[0027] 5.第1項的蛋白質，其中所述vActRIIB多膚在位置28處的取代選自氨基酸A、W和Y 取代E。
[0028] 6.第2項的蛋白質，其中所述vActRIIB多膚在位置28處的取代選自氨基酸A、W和Y 取代E。
[0029] 7.第1項的蛋白質，其中所述vActRIIB多膚在位置40處的取代選自氨基酸G、Q、M、 H、K和N取代R。
[0030] 8.第2項的蛋白質，其中所述vActRIIB多膚在位置40處的取代選自氨基酸A、G、Q、 M、H、K和N取代R。
[0031] 9.第2項的蛋白質，其中所述vActRIIB多膚在位置28處的取代選自氨基酸A、F、Q、 ￥、1、1^、1、1(、山￥和￥取代6，并且在位置40處的取代選自氨基酸4、6、9、1、山1(和閑^代尺。
[0032] 10.第1項的蛋白質，其中所述vActRIIB多膚在位置28處的取代是W取代E。
[0033] 11.第2項的蛋白質，其中所述vActRIIB多膚在位置28處的取代是A取代E，并且在 位置40處的取代是A取代R。
[0034] 12.第1-11項中任一項的蛋白質，其中所述vActRIIB多膚缺乏N末端信號序列。
[0035] 13.第1-11項中任一項的蛋白質，其中所述vActRIIB多膚缺乏N末端信號序列和成 熟的N末端4或6個氨基酸。
[0036] 14.第12項的蛋白質，其中所述vActRIIB多膚與至少一種異源多膚融合。
[0037] 15.第13項的蛋白質，其中所述vActRIIB多膚與至少一種異源多膚融合。
[0038] 16.第14項的蛋白質，其中所述異源多膚是人化結構域。
[0039] 17.第15項的蛋白質，其中所述異源多膚是人化結構域。
[0040] 18.第16項的蛋白質，其中所述多膚選自沈Q ID ^:60、62、64、68、70和72。
[0041 ] 19.第17項的蛋白質，其中所述多膚選自SEQ ID N0:91、93、95和97。
[0042] 20.包含vActRIIB多膚的分離的蛋白質，其中所述多膚選自具有序列SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、 64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97的多膚。
[0043] 21.分離的核酸分子，其包含選自下述的多核巧酸：
[0044] (a)具有SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、 41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94 和 96 中所示序列或其互補序列的多核 巧酸;和
[0045] (b)編碼具有沈Q ID N0:4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、：M、36、38、 40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97中所示氨基酸序列 的多膚的多核巧酸。
[0046] 22.第21項的核酸分子，其中所述多核巧酸與轉錄或翻譯調(diào)節(jié)序列可操作地連接。
[0047] 23.第22項的核酸分子，其中所述轉錄或翻譯序列包含轉錄啟動子或增強子。
[004引24.重組載體，其指導第21項的核酸分子的表達。
[0049] 25.宿主細胞，其進行了基因工程化W表達第21項的核酸分子。
[0050] 26.第25項的宿主細胞，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。
[0051] 27.宿主細胞，其進行了基因工程化W產(chǎn)生第20項的蛋白質。
[0052] 28.生產(chǎn)vActRIIB多膚的方法，其包括在促進蛋白質表達的條件下培養(yǎng)第27項的 宿主細胞，和回收所述蛋白質。
[0053] 29.藥物組合物，其包含與藥學上可接受的載體混合的有效量的第20項的蛋白質。
[0054] 30.抑制受試者中的肌抑素活性的方法，所述受試者需要此種治療，該方法包括給 所述受試者施用治療有效量的第29項的組合物。
[0055] 31.增加受試者中的無脂肪肌肉量的方法，所述受試者需要此種治療，該方法包括 給所述受試者施用治療有效量的第29項的組合物。
[0056] 32.增加受試者中的無脂肪肌肉量與脂肪的比例的方法，所述受試者需要此種治 療，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的第29項的組合物。
[0057] 33.治療受試者中的肌肉消耗疾病或病癥的方法，所述受試者需要此種治療，該方 法包括給所述受試者施用治療有效量的第29項的組合物。
[005引34.第33項的方法，其中所述肌肉消耗疾病是癌癥惡病質。
[0059] 35.第33項的方法，其中所述肌肉消耗疾病或病癥選自肌營養(yǎng)不良、肌萎縮性側索 硬化、充血性阻塞性肺疾病、慢性屯、力衰竭、癌癥惡病質、AIDS、腎衰竭、尿毒癥、類風濕性關 節(jié)炎、老年性骨骼肌減少癥、器官萎縮、腕管綜合征、雄激素剝奪、燒傷、糖尿病、和由于長期 邸床休息導致的肌肉消耗、脊髓損傷、中風、骨折、衰老或暴露于微重力。
[0060] 36.治療受試者中的代謝素亂的方法，所述受試者需要此種治療，該方法包括給所 述受試者施用治療有效量的第29項的組合物。
[0061] 37.第36項的方法，其中所述代謝素亂選自糖尿病、肥胖、高血糖癥和骨丟失。
[0062] 38.第36項的方法，其中所述代謝素亂是骨丟失。
[0063] 39.治療受試者中的一種疾病的方法，激活素在所述疾病中超量表達，并且所述受 試者需要此種治療，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的第29項的組合物。
[0064] 40.第39項的方法，其中所述疾病是癌癥。
[0065] 41.第40項的方法，其中所述疾病是睪丸或卵巢癌。
[0066] 42.治療受試者中的惡病質的方法，所述受試者需要此種治療，該方法包括給所述 受試者施用治療有效量的第29項的組合物。
[0067] 43.第42項的方法，其中所述惡病質起因于癌癥、糖尿病腎病、燒傷、腎衰竭和類風 濕性關節(jié)炎。
[0068] 44.減少受試者中的腫瘤團塊大小的方法，所述受試者需要此種治療，該方法包括 給所述受試者施用治療有效量的第29項的組合物。
[0069] 45.第44項的方法，其中所述腫瘤團塊起因于睪丸或卵巢癌。
[0070] 46.治療受試者中的肌肉消耗病癥的方法，所述受試者需要此種治療，該方法包括 給所述受試者施用第24項的載體，其中所述載體能夠指導VActRIIB多膚在所述受試者中的 表達。
[0071 ] 47.第46項的方法，其中所述載體是AAV載體。
[0072] 附圖簡述
[0073] 圖1。圖1顯示野生型可溶性ActRIIB-人IgGl化的氨基酸序列（SEQ ID N0:98)。信 號膚序列是粗體的，隨后為成熟的ActRIIB細胞外結構域，W及斜體的人IgGl化，包括部分 較鏈區(qū)。氨基酸E28和R40是有下劃線的。接頭序列GGGGS(SEQ ID N0:75)是斜體且有下劃線 的。
[0074] 圖2。圖2顯示可溶性ActRIIBS-人IgGlFc的氨基酸序列（SEQ ID NO:99)。信號膚序 列是粗體的，隨后為成熟的ActRIIBS可溶性結構域，并且人IgG Wc，包括部分較鏈區(qū)是斜體 的。E28和R40是有下劃線的。接頭序列GGGGS(SEQ ID N0:75)是斜體且有下劃線的。
[00巧]圖3。圖3顯示可溶性vActRIIB-Fc E28W處理對抑制素-a敲除小鼠中的睪丸（圖3A) 和卵巢(圖3B)的影響。
[0076] 圖4。圖4顯示可溶性vActRIIB-Fc E28W處理對雄性（圖4A)和雌性（圖4B)抑制素 -a 敲除小鼠中的存活率的影響。
[0077] 圖5。圖5顯示可溶性vActRIIB-Fc E28W處理對攜帶結腸26腫瘤的小鼠中的體重的 影響。
[007引圖6。圖6顯示可溶性vActRIIB-Fc E28W處理對攜帶結腸26腫瘤的小鼠中的存活的 影響。
[0079] 詳述
[0080] 公開了包含變體人激活素 IIB受體(VActRIIB)多膚的蛋白質。運些蛋白質和多膚 的特征在于它們與巧中TGF-e蛋白質，即肌抑素(GDF-8)、激活素 A和GDF-Il中的至少一種結 合，且抑制運些蛋白質的活性的能力。與不包含本文公開的修飾的多膚比較，運些蛋白質和 多膚還顯示出減少的聚集傾向。參照登記號NP_001097(SEQ ID N0:47)的野生型ActRIIB、 ^及4。11?118(沈9 10^:18)或4(311?1185(569 10顯:2)的細胞外結構域，修飾由在位置 28、40或28和40運兩者處的氨基酸取代組成。
[0081] 如本文所使用的，術語"TGF-0家族成員"或叮GF-P蛋白質"指轉化生長因子家族的 結構上相關的生長因子，包括激活素，W及生長和分化因子(GDF)蛋白質化ingsley等人 Genes Dev. 8:133-146( 1994) ,McPherron等人Growth factors and cytokines in health and disease,第IB卷，D丄eRoith和C.Bondy.編輯，JAI Press Inc. ,Greenwich,Conn,USA: 第357-393頁）。
[0082] GDF-8也稱為肌抑素，是骨骼肌組織的負調(diào)節(jié)物(McPherron等人PNAS USA 94: 12457-12461(1997))。肌抑素作為長度約375個氨基酸的無活性蛋白質復合物合成，對于人 具有GenBank登記號AAB86694(SEQ ID N0:49)。前體蛋白質通過在四堿基加工位點處的蛋 白酶解切割激活，W產(chǎn)生N末端無活性前結構域和約109個氨基酸的C末端蛋白質，其二聚化 W形成約25kDa的同二聚體。運種同二聚體是成熟的、生物活性蛋白質（Zimmers等人， Science 296,1486(2002))〇
[0083] 如本文所使用的，術語"前結構域"或"前膚"指無活性的N末端蛋白質，其進行切割 W釋放活性C末端蛋白質。如本文所使用的，術語"肌抑素"或"成熟的肌抑素"指單體、二聚 體或其他形式的成熟的、生物活性C末端多膚，W及生物活性片段或相關多膚，包括等位基 因變體、剪接變體、W及融合膚和多膚。已報告成熟的肌抑素在許多物種，包括人、小鼠、雞、 豬、火雞和大鼠中具有100%序列同一性化ee等人，PNAS 98,9306(2001))。
[0084] 如本文所使用的，GDF-Il指具有Swissprot登記號095390(SEQ ID N0:50)的BMP (骨形態(tài)發(fā)生蛋白），W及那種蛋白質的變體和物種同源物。GDF-Il在氨基酸水平上與肌抑 素具有約90%同一性。GDF-Il設及中軸骨骼的前/后模式形成的調(diào)節(jié)(McPherron等人， NaUire Genet.22(93) :260-264(1999) ;Gamer等人，Dev.Biol.208(1 ),222-232(1999)),但 出生后功能未知。
[0085] 激活素 A是多膚鏈M的同二聚體。如本文所使用的，術語"激活素 A"指具有GenBank 登記號：NM_002192 (SEQ ID NO: 48)的激活素蛋白質，W及那種蛋白質的變體和物種同源 物。 隣]激活素受體
[0087]如本文所使用的，術語激活素 II B型受體(ActRIIB)指具有登記號NP_001097(SEQ ID N0:47)的人激活素受體。術語可溶性ActRIIB包含ActRIIB(SEQ ID N0:18)、ActRIIB5 (SEQ ID N0:2)的細胞外結構域，W及其中在位置64處的精氨酸由丙氨酸取代的運些序列。 [00則 變體可溶性ActRIIB多膚
[0089]本發(fā)明提供了包含人變體可溶性ActIIB受體多膚(本文稱為vActRIIB多膚、或變 體多膚）的分離蛋白質。如本文所使用的，術語"vActRIIB蛋白質"指包含VActRIIB多膚的蛋 白質。如本文所使用的，術語"分離的"指由內(nèi)源材料純化至一定程度的蛋白質或多膚分子。 運些多膚和蛋白質的特征在于具有結合且抑制激活素 A、肌抑素或GDF-Il中的任何一種的 活性的能力。在某些實施方案中，與野生型多膚比較，激活素 A、肌抑素或GDF-Il的變體多膚 的結合親和力得到改善。
[0090] 在一個實施方案中，VActRIIB多膚具有SEQ ID N0:2或18的氨基酸序列，其中在位 置E28或R40或者位置E28和R40兩者處的氨基酸由另一非天然氨基酸取代，并且其中所述多 膚能夠結合肌抑素、激活素 A或GDF-11。在另一個實施方案中，vActRIIB多膚是運些序列的 成熟形式、或截短的成熟形式。如本文所使用的，術語"成熟的VActRIIB多膚"指氨基酸信號 序列被去除的多膚。在一個實施方案中，成熟序列是例如SEQ ID N0:2的氨基酸19-160,和 SEQ ID NO: 18的氨基酸19-134,其中在位置28和40處的一個或全部兩個氨基酸由另一非天 然氨基酸取代，并且多膚保留與激活素 A、肌抑素或GDF-Il結合的能力。如本文所使用的，術 語截短的成熟的VActRIIB多膚指具有信號序列并且來自成熟多膚的N末端的氨基酸被去除 的多膚。在一個實施方案中，成熟多膚的成熟的N末端4個氨基酸或N末端6個氨基酸被去除。 在運個實施方案中，截短的成熟序列是例如SEQ ID N0:2的氨基酸23-160,或SEQ ID N0:2 的氨基酸25-160;和沈Q ID NO: 18的氨基酸23-134,或沈Q ID NO: 18的氨基酸25-134,其中 在位置28和40處的一個或全部兩個氨基酸由非野生型氨基酸取代，其保留與激活素 A、肌抑 素或GDF-Il結合的能力。如本文所使用的，術語"位置28"和"位置40"(即，E28和R40)指參照 包括18個氨基酸的信號序列的序列SEQ ID N0:2和18而言的氨基酸位置。為了一致性，如果 針對成熟的或截短的成熟序列，成熟的VActRIIB多膚具有在位置10和/或位置22處的取代， 或截短的成熟多膚具有在位置6和/或位置18處的取代，或在位置4和/或位置16處的取代， 那么運些變體仍將針對全長SEQ ID N0:2和18而言，或如圖1或2中所示，即在位置E28和/或 R40處的氨基酸取代。此種成熟的實施方案或N末端截短的實施方案在下文例示。
[0091] 在一個實施方案中，在位置E28處的取代選自氨基酸W、Y和A。在一個實施方案中， 在位置28處的取代是W。在一個進一步的實施方案中，在位置28處的取代選自氨基酸A、F、Q、 V、I、L、M、K、H、W和Y。在一個進一步的實施方案中，在位置40處的取代選自氨基酸G、Q、M、H、K 和N。在一個進一步的實施方案中，在位置28處的取代選自氨基酸4少、9、￥、1、^1、1(、山胖和 Y，并且在位置40處的取代選自氨基酸A、G、Q、M、H、K和N。在一個實施方案中，蛋白質包含具 有選自沈Q ID N0:4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97的氨基酸序列的多膚。在另一個實 施方案中，蛋白質包含由具有沈Q ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、 35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94、96中所示序列或其互補序 列的多核巧酸編碼的多膚。
[0092] 在一個實施方案中，信號序列從VActRIIB多膚中去除，留下成熟的變體多膚。各種 信號膚可W在本申請的多膚制備中使用。信號膚可W具有圖1和2中所示的序列（SEQ ID N0:73)或可替代的信號序列，例如SEQ ID N0:74,即SEQ ID N0:2和18的信號序列?？蒞使 用對于表達vActRIIB或vActRIIB5多膚有用的任何其他信號膚。
[0093] 在另一個實施方案中，vActRIIB多膚具有與SEQ ID NO:2和18基本上相似的序列。 如本文所使用的，術語"基本上相似的"指與SEQ ID N0:2和18中所示的氨基酸序列具有至 少約80 %同一'性、至少約85 %同一'性、至少約90 %同一'性、至少約95 %同一'性、至少約98 % 同一性或至少約99%同一性的多膚，并且其中在位置28和/或40處的一個或全部兩個氨基 酸由非野生型氨基酸取代，其中多膚保留SEQ ID N0:2和18的多膚的活性，即結合且抑制肌 抑素、激活素 A或GDF-Il的能力。此外，術語vActRIIB多膚包含SEQ ID NO: 2或18的片段，例 如包含本文描述的在位置28和/或40處的取代的N和C末端截短，其中所述多膚能夠結合且 抑制肌抑素、激活素 A或GDF-11。
[0094] 如本文所使用的，術語vActRIIB和vActRIIB5多膚的"衍生物"指至少一種另外的 化學部分、或至少一種另外的多膚的連接，W形成共價或聚集綴合物例如糖基、脂質、乙酷 基、或者C末端或N末端融合多膚、與PEG分子的綴合、和下文更充分地描述的其他修飾。變體 ActRIIB受體多膚(vActRIIB)也可W包括另外的修飾和衍生物，包括對于C和N末端的修飾， 其來源于由于在各種細胞類型中表達的加工，所述細胞類型例如哺乳動物細胞、大腸桿菌、 酵母和其他重組宿主細胞。另外包括的是vActRIIB多膚片段W及包含SEQ ID N0:4、6、8、 10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、 68、70、72、87、88、91、93、95和97中所示多膚序列的滅活的師唐基化位點、滅活的蛋白酶加工 位點、或保守氨基酸取代的多膚。
[00巧]如本文所使用的，術語"vActRIIB或vActRIIB5多膚活性"或"可溶性ActRIIB或 ActRIIBS多膚的生物活性"指vActRIIB和vActRIIB5多膚的一種或多種體外或體內(nèi)活性，其 包括但不限于下文實施例中證實的那些。VActRIIB多膚的活性包括但不限于與肌抑素或激 活素 A或GDF-Il結合的能力，W及減少或中和肌抑素或激活素 A或GDF-Il的活性的能力。如 本文所使用的，術語"能夠與肌抑素、激活素 A或GDF-11結合"指通過本領域已知的方法，例 如下文實施例2中描述的Biacore法測量的結合。此外，在實施例2中，基于pMARE C2C12細胞 的測定方法測量激活素 A中和活性、肌抑素中和活性、和GDF-Il中和活性。體外活性包括但 不限于增加體重、增加無脂肪肌肉量（lean muscle mass)、增加骨骼肌肉量、減少脂肪量， 如下文動物模型中證實的和如本領域已知的。生物活性進一步包括減少或預防由某些類型 的癌癥引起的惡病質、防止某些類型的腫瘤生長、且增加某些動物模型的存活。VActRIIB多 膚活性的進一步討論在下文提供。
[0096] 本發(fā)明的多膚進一步包含直接或通過接頭序列與VActRIIB多膚連接，W形成融合 蛋白的異源多膚。如本文所使用的，術語"融合蛋白"指具有經(jīng)由重組DNA技術連接的異源多 膚的蛋白質。異源多膚包括但不限于化多膚、his標記、和亮氨酸拉鏈結構域，W促進變體 ActRIIB多膚的寡聚化和穩(wěn)定化，如例如引入本文作為參考的WO 00/29581中描述的。在一 個實施方案中，異源多膚是Fc多膚或結構域。在一個實施方案中，F(xiàn)c結構域選自人IgGU IgG2和IgG4化結構域。運些在沈Q ID NO:80、82和84中提供。vActRIIB可W進一步包含與其 各自的IgG化區(qū)域鄰近的IgGl、IgG2或IgG4的較鏈序列的全部或部分。IgGl、IgG2和IgG4的 完整較鏈序列分別在SEQ ID NO:76、77和78中提供。
[0097] VActRIIB多膚可W任選進一步包含"接頭"序列。接頭主要充當多膚和第二種異源 多膚或其他類型的融合物之間或者兩個或更多變體ActRIIB多膚之間的間隔物。在一個實 施方案中，接頭由通過膚鍵連接在一起的氨基酸組成，優(yōu)選通過膚鍵連接的1-20個氨基酸， 其中氨基酸選自20種天然存在的氨基酸。運些氨基酸中的一個或多個可W是糖基化的，如 本領域技術人員了解的。在一個實施方案中，1-20個氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天 冬酷胺、谷氨酷胺和賴氨酸。優(yōu)選地，接頭由非空間位阻的大部分氨基酸例如甘氨酸和丙氨 酸組成。示例性接頭是聚甘氨酸(特別是(Gly)5、(Gly)8、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。如下文實 施例中所示的一種示例性合適的接頭是(Gly)4Se;r(SEQ ID N0:75)。在一個進一步的實施 方案中，vActRIIB可W包含較鏈接頭，運是提供與較鏈區(qū)鄰近的接頭序列，如SEQ ID N0:79 中例示的。
[009引接頭也是非膚接頭。例如，可W使用烷基接頭例如-NH-(C出）S-C(O)-,其中S = 2- 20。運些烷基接頭可W進一步由任何非空間位阻基團取代，所述基團例如低級烷基（例如 Cパ6)、低級酷基、面素(例如C1、化）、CN、N出、苯基等。
[0099] 在一個實施方案中，vActRIIB多膚可W直接或經(jīng)由接頭或經(jīng)由較鏈接頭與化多膚 連接。在一個實施方案中，化是人IgG Fc。與化連接的vActRIIB包括例如vActRIIB-IgGlFc、 E28A(SEQ ID N0:60);vActRIIB-IgGlFc、E28W(SEQ ID N0:62)、vActRIIB-IgGlFc、E28Y (沈Q ID N0:64)、vActRIIB-IgG 化、R40G(SEQ ID N0:66)、vActRIIB5-IgGlFc、E28A(SEQ ID N0:70)和vActRIIB5-IgGl化 E28W(SEQ ID N0:72)，如表1和2中所示，W及在本文實施 例中描述。進一步的實施方案包括vActRIIB-IgG2Fc、E28W(SEQ ID N0:91)、vActRIIB- IgG2Fc、E28Y(沈Q ID N0:93)和vActRIIB-IgG2Fc(沈Q ID N0:95)。如下文實施例中證實 的，與野生型ActRIIB-IgG2IgG化k較，變體已證實產(chǎn)生更少的聚集。
[0100] 本文公開的VActRIIB多膚還可W與非多膚分子連接用于賦予所需性質的目的，所 述性質例如減少降解和/或增加半衰期、減少毒性、減少免疫原性、和/或增加 ActRIIB多膚 的生物活性。示例性分子包括但不限于線性聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚賴氨酸、葡聚糖； 脂質;膽固醇基團（例如類固醇）；碳水化合物、或寡糖分子。
[0101] 在另一個方面，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明的VActRIIB多膚的多核巧酸的分離 核酸分子。如本文所使用的，術語"分離的"指由內(nèi)源材料純化至一定程度的核酸分子。在一 個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含編碼SEQ ID N0:4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和 97的多膚的多核巧酸。由于已知的遺傳密碼簡并性(其中超過一個密碼子可W編碼相同氨 基酸），DNA序列可W與沈Q ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、 39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94和96中所示的那種，或沈Q ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、 65、 67、69、71、92、94和96的互補鏈不同，并且仍編碼具有沈9 10側:4、6、8、10、12、14、16、 20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、 88、91、93、95和97的氨基酸序列的多膚。此種變體DNA序列可W起因于在生產(chǎn)過程中發(fā)生的 沉默突變，或可W是運些序列的有意誘變的產(chǎn)物。
[0102] 在另一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含具有SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、 15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、 92、94和96中所示的多核巧酸序列，或沈Q ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、23、25、27、29、 31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94 和 96 的互補鏈的多核 巧酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了運樣的核酸分子，其在嚴格或中等條件下與SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、 61、63、65、67、69、71、92、94和96的多膚編碼區(qū)雜交，其中所編碼的多膚包含沈Q ID N0:4、 6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、 66、 68、70、72、87、88、91、93、95和97中所示的氨基酸序列，并且其中所編碼的多膚保持 vActRIIB多膚的活性。
[0103] 本發(fā)明的核酸分子包含單鏈和雙鏈形式的DNA，及其RNA互補序列。DNA包括例如 cDNA、基因組DNA、合成DNA、由PCR擴增的DNA、及其組合。基因組DNA可W通過常規(guī)技術進行 分離，例如通過使用SEQ ID NO: 1或17的DNA或其合適的片段作為探針。編碼ActRIIB多膚的 基因組DNA得自對于許多物種可用的基因組文庫。合成DNA可W運樣獲得:重疊寡核巧酸片 段的化學合成，隨后為片段的組裝，W重構編碼區(qū)和側翼序列的部分或全部。RNA可W得自 指導mRNA的高水平合成的原核生物表達載體，例如使用T7啟動子和RNA聚合酶的載體。CDNA 得自由mRNA制備的文庫，所述mRNA從表達ActRIIB的各種組織中分離。本發(fā)明的DNA分子包 括全長基因 W及其多核巧酸和片段。全長基因也可W包括編碼N末端信號序列的序列。
[0104] 在本發(fā)明的另一個方面，還提供了包含核酸序列的表達載體，并且還提供了用此 種載體轉化的宿主細胞和產(chǎn)生VActRIIB多膚的方法。術語"表達載體"指用于由多核巧酸序 列表達多膚的質粒、隧菌體、病毒或載體。用于表達VActRIIB多膚的載體最少包含對于載體 繁殖和克隆的插入片段表達所需的序列。表達載體包含轉錄單位，所述轉錄單位包含（1)在 基因表達中具有調(diào)節(jié)作用的遺傳元件，例如啟動子或增強子，（2)編碼待轉錄成mRNA且翻譯 成蛋白質的VActRIIB多膚的序列，和(3)合適的轉錄起始和終止序列的組裝。運些序列可W 進一步包括選擇標記。適合于在宿主細胞中表達的載體可容易獲得，并且核酸分子使用標 準重組DNA技術插入載體內(nèi)。此種載體可W包括在特定組織中起作用的啟動子，和用于在被 革己定的人或動物細胞中表達vActRIIB的病毒載體。適合于表達vActRIIB的示例性表達載體 是包含vActRIIB多核巧酸的pDSRa(在引入本文作為參考的WO 90/14363中描述)及其衍生 物，W及本領域已知的或下文描述的任何另外合適的載體。
[0105] 本申請進一步提供了制備vActRIIB多膚的方法。可W利用各種其他表達/宿主系 統(tǒng)。運些系統(tǒng)包括但不限于微生物例如用重組隧菌體轉化的細菌、質?；蛘沉NA表達載 體;用酵母表達載體轉化的酵母;用病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)； 用病毒表達載體(例如，花挪菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)轉染的或用細菌表達載 體(例如，Ti或PBR322質粒)轉化的植物細胞系統(tǒng);或動物細胞系統(tǒng)。在重組蛋白質產(chǎn)生中有 用的哺乳動物細胞包括但不限于VERO細胞、化La細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系、或其衍 生物例如在無血清培養(yǎng)基中生長的Veggie C冊和相關細胞系（參見Rasmussen等人，1998， Cytotechnology 28:31)、或DHFR缺陷的CHO株DX-Bll (參見Urlaub等人，1980， Proc.化 tl. Acad. Sci. USA 77:4216-20)，COS 細胞例如猴腎細胞的 C0S-7 系（ATCC (XL 1651)(參見Gluzman等人，1981，Cel 1 23:175)，W138，B皿，胎pG2,3T3(ATCC (XL 163)， RIN，MDCK，A549，PC12，K562，L細胞，C127細胞，BHK(ATCC邸L10)細胞系，衍生自非洲綠猴 腎細胞系CVl的CVl/EBNA細胞系（ATCC (XL 70)(參見McMahan等人，1991，EMB0 J.IO: 2821)，人胚腎細胞例如293、293邸NA或MSR 293,人表皮A431細胞，人C〇1〇205細胞，其他轉 化的靈長類動物細胞系，正常二倍體細胞，衍生自原代組織的體外培養(yǎng)的細胞株，原代外植 體，化-60，U937，化K或化rkat細胞。哺乳動物表達允許產(chǎn)生可W從生長培養(yǎng)基中回收的分 泌的或可溶性多膚。
[0106] 使用合適的宿主-載體系統(tǒng)，vActRIIB多膚通過在允許產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細 胞來重組產(chǎn)生，所述宿主細胞用包含本發(fā)明的核酸分子的表達載體轉化。轉化細胞可W用 于長期、高產(chǎn)率多膚生產(chǎn)。一種此種細胞用包含選擇標記W及所需表達盒的載體轉化，可W 允許該細胞在其轉換到選擇培養(yǎng)基前在富集培養(yǎng)基中生長1-2天。選擇標記設計為允許成 功表達引入序列的細胞的生長和回收。穩(wěn)定轉化細胞的抗性簇可W使用適合于所采用的細 胞系的組織培養(yǎng)技術進行增殖。重組蛋白質表達的概述在Methods of Enzymology，第185 卷，Goeddell，D.V.，編輯，Academic Press(1990)中發(fā)現(xiàn)。
[0107] 在某些情況下，例如在使用原核系統(tǒng)的表達中，本發(fā)明的表達多膚可能需要"重折 疊"且氧化成合適的=級結構并且產(chǎn)生二硫鍵，W便成為生物活性的。重折疊可W使用本領 域眾所周知的許多操作來實現(xiàn)。此種方法包括例如在離液劑的存在下使溶解的多膚暴露于 通常超過7的抑。離液劑的選擇類似于用于包含體溶解的選擇，然而，離液劑一般W較低濃 度使用。示例性離液劑是脈和尿素。在大多數(shù)情況下，重折疊/氧化溶液也將包含特定比例 的還原劑加其氧化形式，W產(chǎn)生允許二硫化物改組發(fā)生的特定氧化還原電位，用于形成半 脫氨酸橋。某些常用的氧化還原偶包括半脫氨酸/脫胺、谷脫甘膚/二硫代雙GSH、氯化銅、二 硫蘇糖醇DTT/二嚷燒DTT、和2-琉基乙醇(bME)/二硫代-bME。在許多情況下，共溶劑可W用 于增加重折疊的效率。常用的共溶劑包括甘油、各種分子量的聚乙二醇和精氨酸。
[0108] 此外，可W根據(jù)常規(guī)技術在溶液中或在固體支持物上合成多膚。各種自動合成儀 是商購可得的，并且可W根據(jù)已知方案進行使用。參見例如，Stewad和化ung，Solid Phase Peptide Synthesis,第2版，Pierce Qiemical Co. (1984) ;Tam等人，J Am Qiem Soc，105: 6442,(1983)；Merrifield,Science 232:341-347(1986);Barany和Merrifield，The Peptides，Gross和Meienhof er，編輯，AcademiC Press ,New York, 1-284 ;Barany等人，Int J Pep Protein Res,30:705-739(1987)。
[0109] 本發(fā)明的多膚和蛋白質可W根據(jù)本領域技術人員眾所周知的蛋白質純化技術進 行純化。運些技術在一個水平上設及蛋白質和非蛋白質級分的粗分級分離。使膚多膚與其 他蛋白質分開后，目的膚或多膚可W使用層析和電泳技術進行進一步純化，W達到部分或 完全純化(或純化至同質性）。如本文所使用的，術語"分離的多膚"或"純化的多膚"意指可 與其他組分分離的組合物，其中多膚純化至相對于其可天然獲得狀態(tài)的任何程度。純化多 膚因此也指離開它可能天然存在的環(huán)境的多膚。一般地，"純化的"將指已實施分級分離W 去除各種其他組分的多膚組合物，并且所述組合物基本上保留其表達的生物活性。當使用 術語"基本上純化的"時，運個命名將指運樣的膚或多膚組合物，即，其中膚或多膚形成組合 物的主要組分，例如構成組合物中約50 %、約60%、約70%、約80 %、約85 %或約90%或更多 的蛋白質。
[0110] 適合于在純化中使用的各種技術將是本領域技術人員眾所周知的。運些包括例如 用硫酸錠、PEG、抗體(免疫沉淀)等或通過熱變性沉淀，隨后離屯、;層析例如親和層析(蛋白 質A柱）、離子交換、凝膠過濾、反相、徑基憐灰石、疏水相互作用層析；等電點聚焦;凝膠電 泳；W及運些技術的組合。如本領域一般已知的，認為執(zhí)行各種純化步驟的順序可W改變， 或某些步驟可W省略，并且仍得到用于制備基本上純化的多膚的合適方法。示例性純化步 驟在下文實施例中提供。
[0111] 用于對多膚純化程度進行定量的各種方法依照本公開內(nèi)容將是本領域技術人員 已知的。運些包括例如測定活性級分的特異性結合活性、或通過SDS/PAGE分析評估級分內(nèi) 的膚或多膚量。用于評估多膚級分的純度的優(yōu)選方法是計算級分的結合活性，使其與起始 提取物的結合活性比較，且因此計算純化程度，在本文中通過"純化倍數(shù)"評估。用于代表結 合活性量的實際單位當然將依賴在純化后所選擇的具體測定技術，W及多膚或膚是否顯示 可檢測的結合活性。
[0112] 變體激活素 IIB型多膚與激活肌肉降解級聯(lián)的配體結合。能夠結合且抑制配體激 活素 A、肌抑素和/或GDF-Il的活性的VActRIIB多膚具有針對設及肌肉萎縮的疾病，W及治 療某些癌癥和如下文實施例中所示的其他疾病的治療潛力。
[0113] 然而，聚集可W在表達或純化野生型ActRIIB或ActRIIBS多膚時發(fā)生。運種聚集包 括在表達過程中有結構的寡聚體形成，W及在表達過程中和多膚純化后無結構的聚集物的 產(chǎn)生。
[0114] 結構分析、分子建模和質譜法的組合方法已表明，多聚化可W經(jīng)由分子間二硫鍵 形成在ActRIIB多膚中出現(xiàn)，所述分子間二硫鍵形成由非糖基化的ActRIIB多膚之間的靜電 和氨鍵合相互作用幫助。顯著的氨鍵存在于兩個ActRIIB分子的界面處；例如在一個 ActRIIB的E28側鏈和另一個ActRIIB的R40側鏈之間。此外，關鍵的靜電相互作用存在于一 個ActRIIB的E28和另一個ActRIIB的R40之間。
[0115] 運些靜電相互作用可W顯著促成增加暫時的ActRIIB二聚體群體，導致促進在 ActRIIB單位之間的非共價和/或共價鍵形成。殘基28和40之間的相互作用是運些相互作用 中最關鍵的，因為運兩個殘基參與雙氨鍵和強靜電相互作用。殘基28和40參與ActRIIB: ActRIIB相互作用而不參與ActRIIB:配體相互作用。因此，殘基28和40根據(jù)本發(fā)明可W由非 天然氨基酸取代，W改善溶解度、且減少受體多膚的聚集。因此，E28和R40可W分別由其他 可能的天然氨基酸取代、表達、且如下所述通過Biacore進行測試。Biacore測定的結合顯示 于下文實施例2中的表1A和IB中。此外，VActRIIB多膚的聚集百分比在下文測定。
[0116] 下文實施例中的結果顯示具有本文描述的氨基酸取代的VActRIIB多膚和蛋白質 的聚集減少，同時保留結合且中和肌抑素、激活素 A或GDF-Il的能力。
[0117] 抗體
[0118] 本發(fā)明進一步包括與變體ActRIIB多膚結合的抗體，包括與本發(fā)明的vActRIIB多 膚特異性結合的那些。如本文所使用的，術語"特異性結合"指對于VActRIIB多膚具有IO6M^i 或更大的結合親和力化a)的抗體。如本文所使用的，術語"抗體"指完整抗體，包括多克隆抗 體（參見例如Antibodies :A LaboratoiT Manual ,Harlow和Lane(編輯），Cold Spring Harbor Press, (1988))，和單克隆抗體（參見例如美國專利號RE 32,011、4,902,614、4， 543,439和4,411,993，W及Monoclonal Antibodies:A New Dimension in Biological Analysis ,Plenum Press ,Kennett ,McKearn和Bechtol (編輯）（1980))。如本文所使用的，術 語"抗體"還指通過重組DNA技術或者通過酶促或化學切割完整抗體產(chǎn)生的抗體片段，例如F (ab)、F(ab'）、F(ab'）2、Fv、Fc和單鏈抗體。術語"抗體"還指雙特異性或雙功能抗體，其是具 有兩個不同重/輕鏈對和兩個不同結合位點的人工雜交抗體。雙特異性抗體可W通過各種 方法產(chǎn)生，包括雜交瘤的融合或Fab'片段的連接（參見Songsivilai等人， Cl in . Exp . Immunol .79:315-321(1990 )，Kostelny等人，J. Immunol .148:1547-1553 (1992))。
[0119] 如本文所使用的，術語"抗體"還指嵌合抗體，即具有與一個或多個非人可變抗體 免疫球蛋白結構域偶聯(lián)的人恒定抗體免疫球蛋白結構域的抗體，或其片段(參見例如，美國 專利號5,595,898和美國專利號5,693,493)?？贵w還指"人源化"抗體(參見例如，美國專利 號4,816,567和WO 94/10332)、微抗體(min化OdiesKwo 94/09817)、大抗體(maxibodies)、 和由轉基因動物產(chǎn)生的抗體，其中包含產(chǎn)生人抗體的基因的一部分但在內(nèi)源抗體產(chǎn)生方面 缺陷的轉基因動物能夠產(chǎn)生人抗體（參見例如，Mendez等人，化ture Genet ics 15:146- 156(1997)和美國專利號6,300,129)。術語"抗體"還包括多聚抗體、或蛋白質的更高級別復 合物例如異二聚抗體和抗獨特型抗體。"抗體"還包括抗獨特型抗體?？筕ActRIIB的抗體可 W例如用于在體外和體內(nèi)鑒定且定量vActRIIB。
[0120] 還包括的是來自任何哺乳動物的多克隆抗體，例如小鼠和大鼠抗體、和兔抗體，其 與本文描述的vActRIIB多膚特異性結合，所述vActRIIB多膚包括SEQ ID N0:4、6、8、10、12、 14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、 72、87、88、91、93、95和97。
[0121] 此種抗體可W用作研究工具并且可W在定量測定中用于檢測且測定本文公開的 多膚。此種抗體使用上文描述的方法和如本領域已知的來制備。
[01。] 藥物組合物
[0123] 還提供了包含本發(fā)明的vActRIIB蛋白質和多膚的藥物組合物。此種組合物包含與 藥學上可接受的材料和生理學上可接受的制劑材料混合的、治療或預防有效量的多膚或蛋 白質。藥物組合物可W包含用于修飾、維持或保留例如組合物的pH、重量摩爾滲透壓濃度、 粘性、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩(wěn)定性、溶解或釋放速度、吸收或滲透的制劑材 料。合適的制劑材料包括但不限于，氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酷胺、天冬酷胺、精氨酸或賴 氨酸）；抗微生物劑;抗氧化劑(例如抗壞血酸、亞硫酸鋼或亞硫酸氨鋼）；緩沖劑(例如棚酸 鹽、碳酸氨鹽、Tris-HCU巧樣酸鹽、憐酸鹽、其他有機酸）；膨脹劑(例如甘露醇或甘氨酸）， 馨合劑(例如乙二胺四乙酸化DTA));絡合劑(例如咖啡因、聚乙締化咯燒酬、0-環(huán)糊精或徑 丙基-e-環(huán)糊精）;填充劑;單糖;二糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精）；蛋白 質（例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白）；著色劑；調(diào)味劑和稀釋劑;乳化劑;親水聚合物 (例如聚乙締化咯燒酬）；低分子量多膚;成鹽抗衡離子(例如鋼）；防腐劑(例如苯扎氯錠、苯 甲酸、水楊酸、硫柳隸、苯乙醇、對徑基苯甲酸甲醋、對徑基苯甲酸丙醋、氯己定、山梨酸或過 氧化氨）；溶劑(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇）；糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇）；懸浮劑;表 面活性劑或濕潤劑(例如普流羅尼(Pluronics)、PEG、脫水山梨糖醇醋、聚氧乙締脫水山梨 糖醇脂肪酸醋例如聚氧乙締脫水山梨糖醇單月桂酸醋、聚氧乙締脫水山梨糖醇單油酸醋、 triton、氨基下S醇、卵憐脂、膽固醇、tyloxapal);穩(wěn)定性增強劑(薦糖或山梨糖醇）；張度 增強劑(例如堿金屬面化物(優(yōu)選氯化鋼或鐘、甘露醇、山梨糖醇）；遞送媒介物;稀釋劑;賦 形劑和/或藥物佐劑（Remington' S Pharmaceutical Sciences，第 18版，A.R.Gennaro,編 輯，Mack Publishing Company, 1990)。
[0124] 最佳藥物組合物將通過本領域技術人員依賴例如預期施用途徑、遞送形式和所需 劑量進行確定。參見例如，Remington'S Pharmaceutical Sciences，同上。此種組合物可W 影響身體狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速度、和多膚的體內(nèi)清除速度。例如，合適的組合物可W是 用于腸胃外施用的注射用水、生理鹽水溶液。
[0125] 藥物組合物中的主要媒介物或載體的性質可W是水性的或非水性的。例如，合適 的媒介物或載體可W是注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊液，可能補充有在用于腸胃外 施用的組合物中常見的其他材料。中性緩沖鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是進一步的示 例性媒介物。其他示例性藥物組合物包含約pH 7.0-8.5的化iS緩沖液、或約pH4.0-5.5的乙 酸鹽緩沖液，其可W進一步包括山梨糖醇或其合適的替代物。在本發(fā)明的一個實施方案中， 組合物可W通過使具有所需純度的所選組合物與任選的配制試劑混合（Remington'S Pharmaceutical Sciences,同上），W凍干團塊或水溶液的形式制備用于膽存。此外，治療 組合物可W使用合適的賦形劑例如薦糖配制為凍干物。
[0126] 制劑可W W各種方法進行遞送，例如通過吸入療法、口服或通過注射。當考慮腸胃 外施用時，用于在本發(fā)明中使用的治療組合物可W是包含藥學上可接受的媒介物中的所需 多膚的無熱原、腸胃外可接受的水溶液的形式。用于腸胃外注射的特別合適的媒介物是無 菌蒸饋水，其中多膚配制為無菌、等滲溶液，適當保存。另外一種制劑可W設及所需分子與 試劑的配制，所述試劑例如可注射微球體、生物可蝕解顆粒、聚合化合物（聚乳酸、聚乙醇 酸）、珠或脂質體，所述試劑提供用于產(chǎn)物的控制或持續(xù)釋放，所述產(chǎn)物隨后可W經(jīng)由儲存 注射進行遞送。還可W使用透明質酸，并且運可W具有促進循環(huán)中的持續(xù)時間的效應。用于 引入所需分子的其他合適的方法包括可植入的藥物遞送裝置。
[0127] 在另一個方面，適合于可注射施用的藥物制劑可W在水溶液中進行配制，優(yōu)選在 生理學上相容的緩沖液中，例如化nks液、林格氏溶液或生理學緩沖鹽水。水性注射懸浮液 可W包含增加懸浮液的粘度的物質，例如簇甲基纖維素鋼、山梨糖醇或右旋糖酢。此外，活 性化合物的懸浮液可W制備為合適的油性注射懸浮液。合適的親脂溶劑或媒介物包括脂肪 油例如芝麻油，或合成脂肪酸醋例如油酸乙醋、甘油=醋或脂質體。非脂質聚陽離子氨基聚 合物也可W用于遞送。任選地，懸浮液還可W包含合適的穩(wěn)定劑或試劑，W增加化合物的溶 解度且允許制備高濃縮溶液。在另一個實施方案中，藥物組合物可W配制用于吸入。吸入溶 液還可W用推進劑進行配制用于氣溶膠遞送。在另外一個實施方案中，溶液可W是霧化的。 肺施用在PCT申請?zhí)朠CT/US94/001875中進一步描述，所述專利申請描述化學修飾的蛋白質 的肺遞送。
[0128] 還考慮某些制劑可W 口服施用。在本發(fā)明的一個實施方案中，W運種方式施用的 分子可W連同或不連同固體劑型例如片劑和膠囊的配制中通常使用的那些載體進行配制。 例如，膠囊可W設計為在胃腸道中的點上當生物利用度達到最大和系統(tǒng)前降解降到最低時 釋放制劑的活性部分?？蒞包括另外的試劑W促進治療分子的吸收。還可W采用稀釋劑、調(diào) 味劑、低烙點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑和粘合劑。用于口服施用的藥物組合 物也可W使用本領域眾所周知的藥學上可接受的載體W適合于口服施用的劑量進行配制。 此種載體使得藥物組合物能夠配制為用于由患者攝入的片劑、丸劑、錠劑、膠囊、液體、凝 膠、糖漿劑、膏劑、懸浮液等。
[0129] 用于口服使用的藥物制劑可W運樣獲得:使活性化合物與固體賦形劑組合，且加 工所產(chǎn)生的顆?；旌衔?任選地，在研磨后），W獲得片劑或錠劑核屯、。需要時，可W加入合 適的助劑。合適的賦形劑包括碳水化合物或蛋白質填充劑，例如糖，包括乳糖、薦糖、甘露糖 醇和山梨糖醇;來自玉米、小麥、稻、馬鈴馨或其他植物的淀粉;纖維素，例如甲基纖維素、徑 丙基甲基纖維素、或簇甲基纖維素鋼;樹膠，包括阿拉伯膠和黃著膠;和蛋白質例如明膠和 膠原。需要時，可W加入崩解劑或增溶劑，例如交聯(lián)聚乙締化咯燒酬、瓊脂和海藻酸或其鹽， 例如海藻酸鋼。
[0130] 錠劑核屯、可W與合適的包衣例如濃縮糖溶液結合使用，所述包衣還可W包含阿拉 伯樹膠、滑石粉、聚乙締化咯燒酬、carbopol凝膠、聚乙二醇、和/或二氧化鐵、漆溶液、和合 適的有機溶劑或溶劑混合物。染料或色素可W加入片劑或錠劑包衣內(nèi)，用于產(chǎn)品鑒定或表 征活性化合物的量，即劑量。
[0131] 可W 口服使用的藥物制劑還包括由明膠制成的推入配合膠囊，W及由明膠制成的 軟的、密封膠囊，和包衣例如甘油或山梨糖醇。推入配合膠囊可W包含與填充劑或粘合劑例 如乳糖或淀粉，潤滑劑例如滑石粉或硬脂酸儀混合，和任選與穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟 膠囊中，活性化合物可W連同或不連同穩(wěn)定劑溶解或懸浮于合適的液體內(nèi)，所述液體例如 脂肪油、液體、或液體聚乙二醇。
[0132] 另外的藥物組合物對于本領域技術人員將是顯而易見的，包括設及在持續(xù)或控制 遞送制劑中的多膚的制劑。用于配制各種其他持續(xù)或控制遞送方式，例如脂質體載體、生物 可蝕解的微?；蚨嗫字楹蛢Υ孀⑸涞募夹g，也是本領域技術人員已知的。參見例如，描述用 于遞送藥物組合物的多孔聚合微粒的控制釋放的PCT/US93/00829。持續(xù)釋放制劑的另外例 子包括成形物品形式的半透聚合物基質，例如膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質可W包括聚醋、水 凝膠、聚交醋（11.5.3,773,919、6? 58,481)^-谷氨酸和丫乙基-1^-谷氨酸鹽的共聚物 (Sidman等人，BiopoIymerS，22:547-556( 1983)、聚（2-徑乙基-甲基丙締酸醋KLanger等 人，J. Biomed .Mater. Res .，15 :167-277 ,(1981); Langer等人，畑em. Tech12 :98-105 (1982))、乙締乙酸乙締醋(Xanger等人，同上）或聚-0(-)-3-?下酸化P 133,988)。持續(xù)釋 放的組合物還包括脂質體，其可W通過本領域已知的幾種方法中的任何一種進行配制。參 見例如，E卵Stein等人，PNAS(USA) ,82:3688(1985) ;EP 36,676;EP 88,046;EP 143,949。
[0133] 待用于體內(nèi)施用的藥物組合物一般必須是無菌的。運可W通過經(jīng)過無菌濾膜過濾 來實現(xiàn)。當組合物凍干時，使用運種方法的滅菌可W在凍干和重配前或后執(zhí)行。用于腸胃外 施用的組合物可WW凍干形式或在溶液中進行膽存。此外，腸胃外組合物一般置于具有無 菌進入口的容器內(nèi)，例如具有可由皮下注射針穿透的塞子的靜脈內(nèi)溶液包或管形瓶。
[0134] 一旦藥物組合物已配制，它就作為溶液、懸浮液、凝膠、乳狀液、固體或脫水或凍干 粉劑膽存于無菌管形瓶內(nèi)。此種制劑可W W立即可用形式或W在施用前需要重配的形式 (例如，凍干的)進行膽存。
[0135] 在一個具體實施方案中，本發(fā)明設及用于產(chǎn)生單劑施用單位的試劑盒。試劑盒可 W各自包含具有干燥蛋白質的第一個容器和具有水制劑的第二個容器。還包括在本發(fā)明的 范圍內(nèi)的是包含單和多室預填充注射器(例如，液體注射器和溶解注射器Qyosyringes)) 的試劑盒。
[0136] 在治療上采用的有效量的藥物組合物將依賴例如治療背景和目的。本領域技術人 員應當理解用于治療的合適劑量水平因此將部分依遞送的分子、多膚用于的適應癥、施用 途徑、W及患者的體型（體重、體表或器官大?。┖蜖顩r(年齡和一般健康）而變化。因此，臨 床醫(yī)生可W逐步滴加劑量且修改施用途徑W獲得最佳療效。一般的劑量可W是約0.1 mg/ kg-最多約lOOmg/kg或更多，依賴上文提及的因素。多膚組合物可W優(yōu)選靜脈內(nèi)注射或施 用。長效藥物組合物可W每3-4天、每周或每2周進行施用，依賴具體制劑的半衰期和清除 率。給藥頻率將依賴使用的制劑中的多膚的藥代動力學參數(shù)。一般地，施用組合物直至達到 實現(xiàn)所需效應的劑量。組合物因此可W作為單劑或多劑（W相同或不同濃度/劑）隨時間施 用，或作為連續(xù)輸注施用。常規(guī)進行合適劑量的進一步改善。合適劑量可W通過使用合適的 劑量-反應數(shù)據(jù)進行確定。
[0137] 藥物組合物的施用途徑依照已知方法，例如口服、通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)（實 質內(nèi)）、腦室內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)、n靜脈內(nèi)、病變內(nèi)途徑、髓內(nèi)、銷內(nèi)、屯、室內(nèi)、經(jīng)皮、皮下 或腹膜內(nèi)注射；W及鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下、尿道、陰道或直腸方法，通過持續(xù)釋放系統(tǒng)或通 過植入裝置施用。需要時，組合物可W通過推注或連續(xù)輸注或通過植入裝置進行施用。可替 代地或另外地，組合物可W經(jīng)由植入已吸附或封裝所需分子的膜、海綿或其它合適材料進 行局部施用。當使用植入裝置時，裝置可W植入任何合適的組織或器官內(nèi)，并且所需分子的 遞送可W經(jīng)由擴散、定時釋放丸或連續(xù)施用。
[0138] 在某些情況下，本發(fā)明的VActRIIB多膚可W通過植入某些細胞進行遞送，所述細 胞已使用例如本文描述的那些方法進行基因工程化，W表達和分泌多膚。此種細胞可W是 動物或人細胞，并且可W是自體的、異體的或異種的。任選地，細胞可W是永生化的。為了減 少免疫應答的機會，細胞可W進行封裝W避免滲入周圍組織。封裝材料一般是生物相容的、 半透的聚合外殼或膜，其允許多膚產(chǎn)品的釋放，但避免細胞被患者的免疫系統(tǒng)或來自周圍 組織的其他有害因子破壞。
[0139] 還考慮了在體內(nèi)的vActRIIB基因療法，其中將編碼vActRIIB或vActRIIB衍生物的 核酸分子直接引入受試者內(nèi)。例如，經(jīng)由核酸構建體連同或不連同合適的遞送載體例如腺 伴隨病毒載體的局部注射，將編碼vActRIIB的核酸序列引入祀細胞內(nèi)?？商娲牟《据d體 包括但不限于逆轉錄病毒、腺病毒、單純瘤疹病毒和乳頭瘤病毒載體?？蒞通過包含所需核 酸序列的所需核酸構建體或其他合適的遞送載體的局部注射、脂質體介導的轉移、直接注 射(裸露DNA)或微粒轟擊(基因槍)在體內(nèi)實現(xiàn)病毒載體的物理轉移。
[0140] vActRIIB組合物的用途
[0141] 本發(fā)明提供了通過使多膚與vActRIIB多膚接觸，用于在體內(nèi)和在體外減少或中和 肌抑素、激活素 A或GDF-Il的量或活性的方法和藥物組合物。vActRIIB多膚對于肌抑素、激 活素 A和GDF-Il具有高親和力，并且能夠減少且抑制肌抑素、激活素 A和GDF-Il中的至少一 種的生物活性。在某些實施方案中，與野生型ActRIIB多膚比較，vActRIIB多膚顯示出改善 的活性。運在下文實施例中證實。
[0142] 在一個方面，本發(fā)明提供了通過給受試者施用有效劑量的vActRIIB組合物，用于 治療需要此種治療的受試者中的肌抑素相關和/或激活素 A相關病癥的方法和試劑。如本文 所使用的，術語"受試者"指任何動物，例如哺乳動物，包括人。
[0143] 本發(fā)明的組合物用于增加作為體重百分比的無脂肪肌肉量且減少作為體重百分 比的脂肪量。
[0144] 可W通過vActRIIB組合物治療的病癥包括但不限于各種形式的肌肉消耗、W及代 謝素亂例如糖尿病和相關病癥、和骨退化性疾病例如骨質疏松癥。vActRIIB組合物已證實 在治療下文實施例3中所示的各種疾病模型的肌肉消耗病癥中有效。運在抑制素-a敲除小 鼠中的肌肉消耗治療、結腸 -26癌癥惡病質模型中的肌肉消耗治療、后肢懸吊模型中的肌肉 萎縮預防、顯示無脂肪肌肉量中的增加的OXV雌性治療、脂肪量的減少和骨礦物質含量的增 加中得到證實。
[0145] 肌肉消耗病癥還包括營養(yǎng)不良，例如杜興氏肌營養(yǎng)不良、進行性肌營養(yǎng)不良、貝克 型肌營養(yǎng)不良、代-蘭二氏肌營養(yǎng)不良、歐勃肌營養(yǎng)不良、和嬰兒神經(jīng)軸突肌營養(yǎng)不良。另外 的肌肉消耗病癥起于慢性疾病或病癥，例如肌萎縮性側索硬化、充血性阻塞性肺疾病、癌 癥、AIDS、腎衰竭、器官萎縮、雄激素剝奪和類風濕性關節(jié)炎。
[0146] 肌抑素和/或激活素的超量表達可W促成惡病質，即一種嚴重的肌肉和脂肪消耗 綜合征。VActRIIB多膚在治療動物模型中的惡病質中的有效性在下文實施例3中顯示。惡病 質也由于類風濕性關節(jié)炎、糖尿病腎病、腎衰竭、化學療法、由于燒傷導致的損傷W及其他 原因而出現(xiàn)。在另一個例子中，發(fā)現(xiàn)肌抑素免疫反應蛋白質的血清和肌內(nèi)濃度在顯示出 AIDS相關肌肉消耗的人中增加，并且與無脂肪量體重相關(Gonzalez-化david等人，PNAS USA 95:14938-14943( 1998))。肌抑素水平還已顯示反應于燒傷而增加，導致分解代謝肌效 應化ang等人，F(xiàn)ASEB J 15,1807-1809(2001))。導致肌肉消耗的另外狀況可能起于由于殘 廢導致的不活動，例如限制在輪椅中、由于中風長期邸床休息、疾病、脊髓損傷、骨折或創(chuàng) 傷、和微重力環(huán)境(太空飛行）中的肌肉萎縮。例如，發(fā)現(xiàn)血漿肌抑素免疫反應蛋白質在長期 邸床休息后增加(Zachwieja等人J Gravit F*hysiol .6(2): 11(1999)。還發(fā)現(xiàn)與未暴露的大 鼠肌肉比較，在航天穿梭飛行過程中暴露于微重力環(huán)境的大鼠肌肉表達增加量的肌抑素 (Lalani等人，J.Endocrin 167(3) :417-28(2000))。
[0147] 此外，脂肪與肌肉比的年齡相關性增加、W及年齡相關的肌肉萎縮看起來與肌抑 素相關。例如，在年輕(19-35歲）、中年(36-75歲）和老年(76-92歲）男性和女性的組中，平均 血清肌抑素-免疫反應性蛋白質伴隨年齡而增加，而在運些組中平均肌肉量和無脂肪體重 伴隨年齡而減少(Yarasheski等人J Nutr Aging 6(5):343-8(2002))。此外，目前已發(fā)現(xiàn)肌 抑素在屯、肌中W低水平表達，并且表達在梗死后的屯、肌細胞中上調(diào)（Sharma等人，J Cell Physiol. 180(1): 1-9(1999))。因此，減少屯、肌中的肌抑素水平可能改善梗死后屯、肌的恢 復。
[0148] 肌抑素看起來還影響代謝素亂，包括2型糖尿病、非膜島素依賴型糖尿病、高血糖 癥和肥胖。例如，肌抑素的缺乏已顯示改善兩個小鼠模型的肥胖和糖尿病表型（Yen等人 FA沈B J. 8:479( 1994)。已在美國申請序列號：11/590，962、美國申請公開號：2007/0117130 中證實，AAV-ActRIIBS載體增加動物中的肌肉與脂肪比，特別是對于肥胖動物模型。本公開 內(nèi)容的vActRIIB多膚例如SEQ ID N0:4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、 38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95適合于此種用途。因 此，通過施用本發(fā)明的組合物減少脂肪組成，將改善動物中的糖尿病、肥胖和高血糖狀況。 此外，包含vActRIIB多膚的組合物可W減少肥胖個體中的食物攝入，如美國申請序列號： 11/590,962、美國申請公開號:2007/0117130中對于vActRIIB多膚證實的。
[0149] 施用本發(fā)明的ActRIIB多膚可W改善骨強度，并且減少骨質疏松癥和其他退化性 骨疾病。運已在下文描述的OVX小鼠模型中得到證實。還已發(fā)現(xiàn)例如肌抑素缺陷小鼠顯示出 增加的小鼠化骨礦物質含量和密度，W及在肌肉附著的區(qū)域處增加的小梁和骨皮質礦物質 含量，W及增加的肌肉量化amrick等人Calcif Tissue Int 71(1) :63-8(2002))。此外，本 發(fā)明的vActRIIB組合物可W用于治療雄激素剝奪的效應，例如用于治療前列腺癌的雄激素 剝奪療法。
[0150] 本發(fā)明還提供了通過給動物施用有效劑量的vActRIIB蛋白質，增加食物動物中的 肌肉量的方法和組合物。因為成熟的C末端肌抑素多膚在所有測試物種中是相同的，所W vActRIIB多膚將預期在農(nóng)業(yè)重要物種(包括牛、雞、火雞和豬）中有效增加肌肉量和減少脂 肪。
[0151] 本發(fā)明的vActRIIB多膚和組合物還括抗激活素 A的活性。激活素 A已知在某些類型 的癌癥特別是性腺腫瘤例如卵巢癌中表達，并且引起幾種惡病質。（Ciprano等人 Endocrinol 141 (7) :2319-27(2000)，化〇11 等人，Endocrinol 138(11):5000-5(1997); Coerver等人，Mol Endocrinol 10(5) :534-43(1996); Ito等人化itish J Cancer82(8): 1415-20(2000)，Lambe;rt-Messe;rIian,等人，Gynecologic Oncology 74:93-7(1999)。在下 文實施例3中，本發(fā)明的vActRI IB多膚已證實有效治療幾種惡病質、減少腫瘤大小、且在抑 制素-Q敲除小鼠模型和結腸-26癌癥惡病質小鼠模型中延長存活。因此，本公開內(nèi)容的組合 物可W用于治療與激活素 A超量表達相關的狀況、W及肌抑素表達，例如來自某些癌癥的惡 病質和治療某些性腺類型的腫瘤。
[0152] 本公開內(nèi)容的組合物可W單獨或與其他治療試劑組合使用，W增強其療效或減少 潛在的副作用。運些性質包括增加的活性、增加的溶解度、減少的降解、增加的半衰期、減少 的毒性、和減少的免疫原性。因此，本公開內(nèi)容的組合物可W用于延長治療方案。此外，本發(fā) 明的化合物的親水性和疏水性性質將良好平衡，從而增強其用于體外和特別是體內(nèi)用途的 功用。特別地，公開內(nèi)容的化合物在水介質中具有合適程度的溶解度，運允許在體內(nèi)的吸收 和生物利用度，同時在脂質中也具有一定程度的溶解度，運允許化合物經(jīng)過細胞膜至假定 作用位點，例如特定肌肉團。
[0153] 此外，本發(fā)明的VActRIIB多膚對于在許多測定中檢測且定量肌抑素、激活素 A或 GDF-Il有用。一般而言，本發(fā)明的ActRIIB多膚在各種測定中用作捕獲試劑，W結合且固定 肌抑素、激活素 A或GDF-11，類似于例如在Asai,編輯，Methods in Cell Biology, 37， Antibodies in Cell Biology ,Academic Press，Inc. ,New 化rk( 1993)中描述的那些。多 膚可W W某些方式進行標記，或可W與第=種分子反應，所述第=種分子例如進行標記W 使得能夠檢測且定量肌抑素的抗體。例如，多膚或第=種分子可W用可檢測部分例如生物 素進行修飾，其隨后可W由第四種分子例如酶標記的鏈霉親和素或其他蛋白質結合。 (AkerstromJ Immunol 135:2589(1985) ;Qiaube;rt，Mod 化tholl0:585(1997))。
[0154] 本發(fā)明已得到描述，下述實施例提供用于舉例說明而不是限制。
[0155] 實施例1
[0156] vActRIIB多膚的表達和純化
[0157] 下述方法用于表達且純化變體ActRIIB多膚。
[0158] 從人睪丸來源的CDNA文庫(0〇11*6油，111(3.)中分離人激活素118型受體的。0臟，且 如美國申請序列號：11/590,962、美國申請公開號:2007/0117130中所述進行克隆。
[0159] 氨基酸取代的測定
[0160] 結構分析、分子建模和質譜法的組合方法表明，聚集(寡聚化)可W通過分子間二 硫鍵形成在ActRIIB中出現(xiàn)，所述分子間二硫鍵形成由在非糖基化的ActRIIB分子之間的靜 電和H鍵合相互作用觸發(fā)。殘基28和40確定為參與ActRIIB: ActRIIB相互作用而不參與 ActRIIB與其配體的相互作用。
[0161] 最初，在ActRIIB-Fc上的E28和R40在每個位置處用A取代。光散射和質譜法分析證 實與野生型蛋白質比較，完全糖基化的vActRIIB-IgGlFc、E28A和VActRIIB-IgGlFc R40A的 級分顯著增加。E28A和R40A VActRIIB-IgGl化在37°C下溫育6天，導致與野生型比較，很少 的聚集或無聚集。進行在位置28和40處(針對具有信號序列的SEQ ID N0:2和18)的氨基酸 取代，W減輕或阻止可W在野生型ActRIIB(SEQ ID N0:2和18)的表達或純化過程中發(fā)生的 聚集。運種聚集已鑒定為在表達過程中的有結構寡聚體形成，W及在表達過程中和蛋白質 純化后的無結構聚集體產(chǎn)生。
[0162] 根據(jù)下文程序，使用大小排阻層析確定在生產(chǎn)和純化過程的不同階段時的聚集。
[0163] 下述示例性方法用于產(chǎn)生變體ActRIIB多膚(vActRIIB和vActRIIB5)。使用包含導 致E28W突變的引物，使用PCR重疊延伸經(jīng)由較鏈接頭序列(編碼SEQ ID NO:79的核巧酸），使 編碼vActRIIB，E28W(SEQ ID N0:23)的多核巧酸與編碼人IgGlFc結構域(SEQ ID N0:82)的 多核巧酸或編碼人IgG2Fc(SEQ ID N0:84)的多核巧酸融合。全長多核巧酸序列是SEQ ID NO: 61。將雙鏈DNA片段亞克隆到pTT5(BiOtechnology Research Institute ,rational Research Council Canada(NRCC)、6100Avenue Royalmount，Montr有al(Qu有bec)Canada H4P 2R2)、pDSR(W0/9014363中描述的）和/或pDSRa的衍生物內(nèi)。在其他實施方案中，使編碼 vActRIIB多膚的多核巧酸與編碼接頭GGGGS(SEQ ID N0:75)的多核巧酸或其多聚體或較鏈 接頭(例如SEQ ID N0:70)連接。
[0164] 如下進行工程化的vActRIIB-Fc和vActRIIB5-Fc的瞬時表達。
[01化]上述兩種分子的工程化的變體在無血清懸浮適應的293-6E細胞（National Research Council of (^inada，Ottawa，(^inada)內(nèi)瞬時表達，所述細胞維持在補充有250]i g/ml遺傳霉素 Invitrogen)和0.1 %Plu;roniC F68( Invitrogen)的Freestyle?培養(yǎng)基 (Invitrogen Coloration，Car 1 sbad，CA)中。轉染作為IL培養(yǎng)物執(zhí)行。簡言之，使細胞接種 物在化fernbach搖瓶(Corning，Inc.)中生長至l.lX106個細胞/ml。搖瓶培養(yǎng)物W65RPM 維持在 Innova 2150 振蕩平臺（News Brunswick Scientific ,Edison, NJ)上，所述振蕩平臺 置于維持在37°C和5%C02下的增濕培養(yǎng)箱中。在轉染時，使293-6E細胞稀釋至1 .OX IO6個細 胞/ml。
[0166] 轉染復合物在100mL Freestyle培養(yǎng)基中形成。首先將Img質粒DNA加入培養(yǎng)基中， 隨后加入3ml FuGene 皿轉染試劑(Roche A卵lied Science,Indianapolis,IN)。轉染復合 物在室溫下溫育約15分鐘，隨后加入搖瓶中的細胞。轉染后24小時，加入20% (w/v)蛋白腺 TNl(OrganoTechnie S.A.，TeknieScience，QC,Canada) W達到0.5% (w/v)的終濃度。轉染/ 表達執(zhí)行4-7天，運之后通過在4，OOORPM下于4°C離屯、60分鐘收獲條件培養(yǎng)基。
[0167] 如下執(zhí)行穩(wěn)定轉染和表達。使用標準電穿孔操作，通過用表達質粒PDC323- vActRIIB 化 28W)-huIgG2Fc 和 pDC324-vActRIIB 巧 28W)-huIgG2Fc 轉染穩(wěn)定的 C 冊宿主細胞 來產(chǎn)生 vActRIIB-human(hu)IgG2-Fc 細胞系（根據(jù)Bianchi 等人，Biotech 和 Bioengineering，84(4) :439-444(2003))。用表達質粒轉染宿主細胞系后，使細胞在不含 GHT的無血清選擇培養(yǎng)基中生長2-3周，W允許質粒的選擇和細胞的回收。直到細胞達到超 過85%的生存力時才選擇細胞。運個轉染細胞合并物隨后在包含150nM甲氨蝶嶺的培養(yǎng)基 中進行培養(yǎng)。
[016引細胞系克隆
[0169] 根據(jù)下述操作由所選擇的克隆制備細胞合并物。將穩(wěn)定轉染的細胞的擴增合并物 種植在96孔板中，并且在小規(guī)模研究中評估候選克隆的生長和生產(chǎn)力性能。由所選擇的克 隆制備約60個管形瓶的前主(Pre-master)細胞庫(PMCB)。所有PMCBs對無菌性、支原體屬和 病毒進行測試。
[0170] 使用典型的分批補料過程按比例增加 vActRIIB-Fc表達細胞系。將細胞接種到 Wave生物反應器(Wave Biotech化C)內(nèi)。培養(yǎng)物用彈丸補料進行3次補料。在第10天時收獲 IOL，其余在第11天時收獲;使兩種種收獲物經(jīng)歷深層過濾，隨后無菌過濾。條件培養(yǎng)基經(jīng)過 10英寸0.45/0.2微米預濾器過濾，隨后通過6英寸0.2微米濾器進行過濾。
[0171] 蛋白質純化
[0172] 使用5ft2 IOK膜切向流濾器（Pall)濃縮包含ActRIIB-Fc(IgGl和IgG2)、 ActRIIB5-Fc(IgGl和IgG2)、和運些的變體的約化條件培養(yǎng)基。將濃縮的材料應用于5mL Protein A High Performance Column?(GE Healthcare),所述柱已用PBS(不含氯化儀或 氯化巧的Du化ecco'S)進行平衡。在用平衡緩沖液洗涂柱直至在280皿(OD280)處的吸光度小 于0.1后，用0.IM甘氨酸-肥1，抑2.7洗脫結合的蛋白質，并且立即用IM Tris-肥1，抑8.5 中和。使中和的洗脫的合并物濃縮至Iml的體積，并且應用于320ml Sephacryl-200柱(GE Heal thcare)，所述柱在PBS(不含氯化儀或氯化巧的Du化ecco ' S)中進行平衡。在4-20 % SDS PAGE凝膠（Invitrogen)中電泳，W測定合并何種級分。如下所示，測試運些多膚的活性和聚 集程度。
[0173] 任選地，多膚可W使用例如使用化P-Se地arose柱進行進一步純化。使用0D280測 定濃度。
[0174] 實施例2
[01巧]體外活性測定
[0176] 如上所述純化的vActRIIB多膚的樣品用憐酸鹽緩沖鹽水（PBS:2.67mM氯化鐘、 138mM氯化鋼、1.47mM憐酸二氨鐘、8. ImM憐酸氨二鋼，pH 7.4)稀釋至0.2mg/ml，在37°C下溫 育6天，隨后應用于MLDI-MS(基質輔助激光解吸/電離質譜法）、SEC和/或SEC-LS分析。在蛋 白質A純化步驟后的野生型和變體多膚的聚集使用SEC或SEC-LS進行測定，并且分子的分子 量使用下文描述的MLDI-MS操作加 W證實。
[0177] 大小排阻層析（SEC)。實驗在具有串聯(lián)的兩個柱（T0S0HAAS G3000swxl, 7.8x 300mm)的Agilent IIOOHPLC系統(tǒng)上執(zhí)行。2x PBSWO.5ml/分鐘用作移動相。
[0178] 大小排阻層析-光散射。實驗在具有Superdex-200凝膠過濾柱（Amersham 化armacia ,Waukesha，WI)的Agi lent 11OOHPLC系統(tǒng)上執(zhí)行。隨后使樣品經(jīng)過Wyatt miniDawn LS激光散射檢測器和Wyatt Optilab DSP折射計(Wyatt Technology Co.,San1:a 8日&日招，〔4)，^測定分子量。？85^0.41111/分鐘用作移動相。
[0179] 基質輔助激光解吸/電離質譜法。使樣品與芥子酸混合（1:1)，并且應用于MALDI- MS(Applied Biosystems Voyager System 2009)。運個操作用于檢查分子的分子量。
[0180] 如下所述獲得關于激活素和肌抑素的結合親和力和ICso值的測定值。
[0181] 定量BIAcore?測定。E28和R40在如上所述與IgGWc的融合物中分別由其他天然 氨基酸取代。如下表中所示，運些連同或不連同接頭產(chǎn)生。在山羊抗人IgGlFc抗體(Jackson Immuno Research,目錄#109-005-098,批次63550)包被的CM5表面上捕獲來自條件培養(yǎng)基 的每個vActRIIB-IgGIFc樣品。使用BIACore2000(BIACore Life Sciences ,Piscataway， New Jersey)將20nM激活素 A注射在捕獲的樣品表面上。所產(chǎn)生的傳感圖對捕獲的化 (500RU)vActRIIB-IgGl化變體進行標準化。某些變體的標準化的結合反應(RU)顯示于表2 中，并且在下文進一步描述。激活素的相對結合親和力也通過Biacore測量進行測定，其中 使用得自哺乳動物細胞表達的條件培養(yǎng)基。激活素 A(20nM)用于捕獲條件培養(yǎng)基中的可溶 性受體多膚，且使測量的sra信號標準化。標準化的SPR+++++: >60，++++: 40-60，+++: 20-40， ++:10-20,+:5-10,-：<5〇
[0182] 表1A和IB概括了相對結合數(shù)據(jù)的結果。下表顯示VActRIIB-IgGlFc的某些實施方 案特別W比野生型高的親和力與激活素 A結合，或保留與野生型相似的親和力。
[0183] 表1A
[0184] 野牛巧巧T賴化的AntR T TR-T祐1 Fn結合（穩(wěn)吿掉泌子）
[0185]
[0186] 表1B
[0187] 野生型和工程化的ActRIIB-IgGlFc結合(瞬時轉染子）
[018 引 [i
[0190] 基于C2C12細胞的活性測定
[0191] 如上所述產(chǎn)生VActRIIBS-IgGl化和VActRIIB-IgGlFc變體。如下所述使用基于細 胞的活性測定來測試運些變體抑制激活素 A或肌抑素與激活素 IIB受體結合的能力。
[0192] 通過用pMRE-luc構建體轉染C2C12成肌細胞(ATCC No:C化-1772)來產(chǎn)生肌抑素/ 激活素/GDF-11反應性報道受體細胞系。pMARE-luc構建體運樣制備:克隆CAGA序列的12個 重復序列，將肌抑素/激活素反應性元件(Dennler等人EMBO 17:3091-3100( 1998))表示到 pLuc-MCS報道載體（Stratagene目錄#219087)內(nèi)TATA盒上游。C2C12細胞在其細胞表面上天 然表達激活素受體IIB。當肌抑素/激活素/GDF-11結合細胞受體時，激活Smad途徑，并且憐 酸化的Smad與反應元件結合(Macias-Silva等人Cell 87:1215(1996))，導致蛋光素酶基因 的表達。蛋光素酶活性隨后使用商業(yè)蛋光素酶報道測定試劑盒（目錄#E4550，Promega， Madison, WI)根據(jù)制造商的方案進行測量。已用pMARE-luc(C2C12/pMRE)轉染的C2C12細胞 的穩(wěn)定系根據(jù)下述操作用于測量活性。將報道細胞鋪平板到96孔培養(yǎng)物內(nèi)。用固定在4nM激 活素的濃度執(zhí)行使用野生型和如上所述構建的變體ActRIIB-IgGl化融合物的稀釋液的篩 選。激活素 AW幾個濃度與受體進行預溫育。激活素活性通過測定處理的培養(yǎng)物中的蛋光素 酶活性進行測量。對于每種多膚測定ICso值。運些顯示于表2中。對于如上所述產(chǎn)生的 ActRIIB-huIgG2化融合物遵循相同操作，用于測定肌抑素。使用相同方法，蛋白質A純化的 野生型和變體用于測定肌抑素的ICso值。對于運種測定，多膚與4nM肌抑素預溫育。此外，聚 集程度使用上文描述的操作進行測定。運些值在下表3中給出。
[0193] 在表1A中列出的ActRIIBS-IgGlFc變體組中，幾種ActRIIB-IgGlFc變體和3種 ActRIIBS-IgGlFc變體連同野生型多膚一起進一步純化，且通過SPR(表面等離子體共振)在 20nM激活素 A的濃度進行分析。表2顯示所選擇的VActRIIB-IgGlFc多膚對于激活素的Sra結 合親和力。激活素 A(20nM)用于捕獲樣品中的vActRIIB多膚，且使測量的Sra信號標準化。 ICso值得自上文所述基于細胞的激活素抑制測定。標準誤對于所有結果小于10%。
[0194] 表2
[0195]
[0196] 如上表2中所示，與野生型比較，VActRIIB-IgGlFc化28W)用于阻斷激活素的ICso值 是 2.0 化M，并且 vActRIIB-IgGlFc 巧 28Y)的 ICsq 值是 2.1nM。此外，vActRIIB-IgGlFc 的 E28W 和 E28Y變體是穩(wěn)定的，并且在純化后不聚集。
[0197]同樣對于另外的變體多膚測定在基于細胞的肌抑素阻斷測定中的ICso值。運些變 體是缺乏信號序列和N末端前6個氨基酸的成熟的截短的VActRIIB多膚。運些序列顯示于表 3中。表3顯示在蛋白質A純化后的蛋白質聚集百分比，W及針對肌抑素的ICso值?？蒞看出與 野生型比較，聚集百分比對于變體多膚小得多。對于不含信號序列和N末端4個氨基酸且具 有如下所示的等同取代的成熟的截短的VActRIIB多膚，獲得類似結果。
[019引表3
[0199]
[020引
[0209] 實施例3
[0210] 使用vActRIIB的體內(nèi)處理
[0211] 根據(jù)下文描述的操作，所有下述動物研究使用成熟的截短的vActRIIB-IgG2Fc 化28W)多膚(SEQ ID N0:91)來進行。
[0212] 在抑制素-a缺陷小鼠中的肌肉消耗的處理
[0213] 抑制素-a是天然存在的激活素 A抑制劑。缺乏抑制素-a的小鼠顯示在循環(huán)中顯著 升高的激活素 A水平，且患有與自發(fā)性腫瘤形成相關的致死性消耗綜合征，所述腫瘤例如卵 巢、睪丸癌和腎上腺癌（Matzuk等人，PNAS 91(19) :8817-21(1994) ,Cipriano等人 化docrinologyl21 (7) :2319-27(2000) ,Matz址等人，NaUire 360(6402) :313-9( 1992))。對 于下述實驗，抑制素-日敲除小鼠（C57I3L/6J)得自QiarIes I^iver Laboratories。在抑制素- 曰敲除小鼠中檢查vActRIIB-IgG2Fc E28W(沈Q ID N0:91)(下文為E28W、或E28W多膚、或可 溶性受體E28W)對體重和肌肉量的影響。執(zhí)行在8周齡的雄性抑制素-a敲除小鼠中的14天單 次注射研究。在8周齡時，與年齡匹配的野生型同窩對照小鼠比較，雄性抑制素-a敲除小鼠 已失去超過25%的體重。在第0天時，5只敲除小鼠給予628胖(3〇111旨/1^)的單次皮下注射，而5 只敲除小鼠皮下施用相同體積的PBS(媒介物）。作為基線對照，在第0天時，5只年齡匹配的 野生型小鼠施用媒介物的單次皮下注射。小鼠在第0天、第7天和第14天時進行稱重。在第14 天結束時，處死所有小鼠，并且經(jīng)由尸檢分析其無脂肪尸體重量和脾腸肌量。在14天的研究 時期，媒介物處理的敲除小鼠的平均體重下降約1. Ig,從第0天時的22.5g到第14天時的 21.4g。相比之下，E28W處理的敲除小鼠的平均體重顯示Ilg的顯著增加，從第0天時的22. Ig 到第14天時的33. Ig。末期尸檢分析掲示在抑制素-a敲除小鼠中，E28W多膚事實上使無脂肪 尸體重量和脾腸肌量加倍，如下所示。與媒介物處理的敲除小鼠的約8.Og和媒介物處理的 野生型對照小鼠的約12. Ig比較，E28W處理的敲除小鼠的平均無脂肪尸體重量是約14.9g。 與媒介物處理的敲除小鼠的約209mg和媒介物處理的野生型對照小鼠的約324mg比較，E28W 處理的敲除小鼠的平均脾腸肌重量(來自兩條腿)是約426mg。運些結果證實E28W多膚用于 處理重量減輕和肌肉消耗的疾病狀態(tài)的有效性，并且概括于下表中。
[0214]
[0215] *:P<〇.05對WT+Veh;#:P<0.05對KO+Veh。
[0216] 在雄性和雌性抑制素-地O小鼠中分別檢查E28W多膚的施用對睪丸和卵巢腫瘤的 形成率的影響。在運個研究中，11只抑制素-a敲除小鼠，包括8周齡的雄性(n = 5)和9周齡的 雌性(n = 6)，用E28W(30mg/kg)的單次皮下注射進行處理，而另外11只抑制素 -a敲除小鼠， 包括年齡匹配的雄性(n = 5)和雌性(n = 6)，接受相同體積的PBS(媒介物）的單次注射。此 夕h 11只野生型同窩對照小鼠，包括年齡匹配的雄性(n = 5)和雌性(n = 6)，施用媒介物的單 次注射。處理后2周，處死小鼠且實施尸檢，W檢查肉眼可鑒定的睪丸和卵巢腫瘤的形成率。 觀察到11只媒介物處理的敲除小鼠中的10只發(fā)展出可鑒定的腫瘤。特別地，分別在檢查的5 只雄性中的5只和6只雌性中的5只中發(fā)現(xiàn)睪丸和卵巢腫瘤形成。發(fā)現(xiàn)運些腫瘤的大小比野 生型對照小鼠中的相應正常睪丸或卵巢大2-3倍。運顯示于圖3中。僅10% (11只中的1只）的 E28W處理的抑制素-a敲除小鼠顯示可見的腫瘤形成。特別地，在雌性中，6只E28W處理的敲 除小鼠中的1只發(fā)展出可鑒定的卵巢腫瘤，而6只未處理的雌性敲除中的5只與年齡匹配的 野生型對照比較，在卵巢的大小或總體形態(tài)學中具有很少的改變或無改變。5只E28W處理的 雄性敲除小鼠中的5只都未顯示出可見腫瘤，與年齡匹配的野生型對照比較，在睪丸的大小 或總體形態(tài)學中具有很少的改變或無改變。運些結果證實E28W施用在減少抑制素 -CiKO小鼠 中的睪丸和卵巢腫瘤形成中有效，提示可溶性受體療法在癌癥治療中的臨床功用。
[0217]在雄性抑制素-a敲除小鼠中檢查E28W多膚在治療厭食癥中的有效性。在運個研究 中，與年齡匹配的野生型小鼠 (n = 10)比較，抑制素-a敲除小鼠 (n = 5)中的食物消耗顯著減 少。觀察到E28W處理的抑制素-a敲除小鼠的食物消耗在檢查的3周時期過程中顯著增加。 E28W處理的敲除小鼠中的平均每周食物攝入增至略微高于年齡匹配的野生型對照小鼠中 的攝入的水平，并且比用媒介物處理的敲除小鼠的平均每周食物攝入高約50%。因此，數(shù)據(jù) 顯示E28W處理在改善抑制素-地0小鼠中的厭食癥中高度有效。
[0218] 在雄性和雌性抑制素-地0小鼠中分別檢查E28W處理對存活的影響。對于雄性，約 50日齡的25只抑制素-地0小鼠施用E28W多膚（10mg/kg/wk，SC)，而26只年齡匹配的抑制素- 地0小鼠接受媒介物(PBS)。19只年齡匹配的野生型雄性小鼠接受媒介物且用作基線對照。 媒介物處理的敲除小鼠在研究的第15天（約65日齡)時開始死亡。到實驗的第34天（約84日 齡)時，50 %媒介物處理的敲除小鼠已死亡，并且到第78天(約128日齡)時，其中100 %已死 亡。相比之下，25只用E28W多膚處理的敲除小鼠或19只用媒介物處理的野生型對照小鼠無 一在研究的第78天（約128日齡)前死亡。在E28W處理的敲除小鼠中，25只中的1只在研究的 第78天(約128日齡)時死亡，并且25只中的24只存活超過第100天(約150日齡）。無媒介物處 理的野生型小鼠在100天的研究階段中死亡。類似存活研究結果在雌性抑制素-地0小鼠中 獲得。約50日齡的22只雌性抑制素-地0小鼠用E28W(10mg/kg/wk，SC)進行處理，而23只相同 年齡的雌性抑制素-地0小鼠用PBS(媒介物)進行處理。同時，17只野生型雌性對照小鼠用媒 介物進行處理。媒介物處理的雌性敲除小鼠在研究的第40天（約90日齡)時開始死亡。到實 驗的第58天(約108日齡)時，50 %媒介物處理的雌性敲除小鼠已死亡，并且到第86天(約136 日齡)時，其中100 %已死亡。相比之下，僅約5 % (22只中的1只化28W處理的雌性敲除小鼠已 死亡，而約90% (22只的20只）存活超過研究的第120天（約170日齡）。無媒介物處理的野生 型小鼠在120天研究階段中死亡。因此，數(shù)據(jù)證實E28W多膚治療在顯著延長雄性和雌性抑制 素-O敲除小鼠的存活中有效。關于雄性和雌性敲除小鼠的存活曲線的示意圖表在圖4中提 供。
[0219] 攜帶結腸-26腫瘤的小鼠中的肌肉消耗的治療
[0220] 攜帶結腸-26腫瘤的小鼠是廣泛使用的用于研究癌癥惡病質的臨床前動物模型 等人，Int J Cancer 68(5) :637-43(1996) ,Kwak等人，Cancer Research 64(22): 8193-8(2004) )dE28W多膚對體重改變、肌肉量和存活率的影響在攜帶腫瘤的小鼠中進行研 究。結腸-26(C-26)腫瘤細胞Wo. 5x IO6個細胞/小鼠皮下植入40只10周齡的、雄性CDFl小 鼠內(nèi)。腫瘤植入在第0天時執(zhí)行。在腫瘤植入后第5天開始，20只C-26小鼠用lOmg/kg vActRIIB IgG2化E28W(SEQ ID N0:91)的皮下注射每周進行處理，而20只C-26小鼠用媒介 物(PBS)進行處理。同時，10只年齡和重量匹配的正常小鼠僅用媒介物(PBS)進行處理。體重 和食物攝入每周測定3次。攜帶腫瘤的小鼠每天2次進行存活檢查。使用與PC計算機連接的 卡尺化Itra-化1 IV IP65電子測徑器，化ed V化wler Co.Boston MA)測量腫瘤大小，并且 數(shù)值自動記錄至Microsoft Excel數(shù)據(jù)文件中的工作表。如圖5中所示，腫瘤植入后2周，攜 帶C-26腫瘤的小鼠發(fā)展出嚴重惡病質，并且急劇喪失其體重。E28W處理有效緩和攜帶腫瘤 的小鼠中的體重減輕。用E28W處理的攜帶腫瘤的小鼠的平均體重顯著高于用媒介物處理的 攜帶腫瘤的小鼠的平均體重(P<〇.001，從腫瘤接種后第7天到第33天，不成對T檢驗，Graph pad Software Inc.San Di ego CA)。
[0221] E28W多膚處理和媒介物處理的組之間的腫瘤大小不存在差異，表明治療對C-26腫 瘤生長無影響。末期尸檢分析顯示E28W處理的攜帶C-26腫瘤的小鼠的平均無脂肪尸體重量 和脾腸肌重量顯著高于用媒介物處理的攜帶腫瘤的小鼠的那些(對于無脂肪尸體和脾腸肌 於0.001)。628胖對攜帶(：-26腫瘤的小鼠的存活的影響顯示于圖6中。媒介物處理的小鼠在腫 瘤植入后約第14天時開始死亡。在腫瘤植入后第35天時，所有20只媒介物處理的攜帶C-26 腫瘤的小鼠死亡；然而，20只用E28W處理的攜帶C-26腫瘤的小鼠中的17只仍存活。因此， E28W處理導致攜帶C-26腫瘤的小鼠的存活的顯著延長(p<0.0001，卡方檢驗）。因此，E28W多 膚不僅在維持體重和肌肉量中有效，而且在延長攜帶C-26腫瘤的小鼠的存活中有效。
[0掛]后肢懸吊小鼠的處理
[0223] 后肢懸吊小鼠模型用于檢查vActRIIB-IgG2Fc E28W(SEQ ID N0:91)對疾病狀態(tài) 中的肌肉量的影響。后肢懸吊操作基本上與先前由化rlson CJ等人(化rlson CJ，Booth FW 和Gordon SE:Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.277:R601-RR606，1999)報告的 相同。9周齡的雌性巧7BL/6小鼠用于研究?？偣?0只小鼠如下分成3組：1.用媒介物(PBS)處 理的未懸吊的基線對照組(20只小鼠），2.用媒介物處理的后肢懸吊組（20只小鼠），和3.用 vActRIIB-IgG2Fc，E28W處理的后肢懸吊小鼠組(20只小鼠）。特別地，在后肢懸吊開始時，分 別對上文描述的組給予30mg/kg VActRIIB-IgG 2Fc E28W或媒介物的單次SC注射。體重改 變每周縱向測量2-3次。來自每個組的5只小鼠在下述4個不同時間點時處死:第1天、第3天、 第7天和第14天。脾腸肌重量經(jīng)由尸檢進行測定。
[0224] 如下表中所示，后肢懸吊導致體重最高達10%的顯著減輕。用vActRIIB-IgG2Fc E28W處理后肢懸吊小鼠導致顯著的體重增加，其水平高于媒介物處理的后肢懸吊組或未懸 吊的基線對照組，運是通過ANOVA測量分析的。在2周研究過程中，分別與媒介物處理的懸吊 組中的0.2%下降和未懸吊基線對照組中的4.8%重量增加比較，vActRIIB-IgG2Fc E28W (SEQ ID N0:91)處理組的平均體重增加是12.6%。時程尸檢結果顯示與體重平行改變的后 肢肌肉量。用vActRIIB-IgG2Fc化28W)處理懸吊小鼠，完全緩解肌肉喪失。因此，運個實驗的 結果顯示E28W在與廢用相關的肌肉萎縮治療中有效。
[02251
[0。6] OVX小鼠的處理
[0227] 切除卵巢的雌性巧7B16小鼠（OVX)考慮作為用于雌性性腺機能減退和骨質疏松癥 的模型。24只雌性巧7B16小鼠在3月齡時切除卵巢，并且允許恢復3個月。在6月齡時，24只 OVX小鼠 W及24只年齡匹配的假手術對照巧7B16小鼠在3個月的處理階段中通過NMR和骨量 (PIXImus-GE LUNAR Co巧oration)測量體重、肌肉和脂肪量的縱向改變。在該階段結束 時，處死動物，并且在末期尸檢過程中收獲骨組織，且實施Faxitron X射線和顯微CT ^axitron X-ray Corporation和GE Medical系統(tǒng)）分析。證實E28W變體受體（SEQ ID NO: 91)在增加體重特別是無脂肪骨骼肌量和骨量方面有效，同時使小鼠的脂肪含量減少至未 切除卵巢的小鼠中可見的水平。特別地，在12周的階段中，與對用E28W處理的假手術小鼠比 較，與對OVX加媒介物或假手術加媒介物的無脂肪肌肉量基本上無增加比較(對于OVX加媒 介物約19克或對于野生型加媒介物約20克），無脂肪肌肉量對于用E28W處理的OVX小鼠從 20g增至27.Og。在相同研究中，到12周研究結束時，用E28W處理的OVX小鼠顯示減少的脂肪 量，從平均Sg/動物到平均約4g/動物，與假手術的動物相似。相比之下，用媒介物處理的OVX 小鼠在研究過程中的任何時間時未喪失脂肪量。最后，與媒介物處理的OVX小鼠比較，骨量 在用E28W處理的OVX小鼠中增加。通過PQCT(外周定量計算機體層攝影)分析測定在末期尸 檢過程中收獲的解剖骨的股骨/腔骨BMC(骨礦物質含量)分析。在12周研究結束時，用E28W 處理的OVX小鼠使BMC從約0.045g/cm增至約0.055g/cm，運與假手術的媒介物處理動物的最 終BMC相似。在12周研究結束時，用媒介物處理的OVX小鼠顯示約相同的0.045g/cm的BMC。在 12周研究結束時，E28W處理的野生型小鼠顯示BMC從約0.054g/cm到約0.065g/cm的增加。運 些研究證實E28W多膚作為老年人中的脆性、骨質疏松癥和肥胖的潛在治療的有效性。
[0228] 本發(fā)明不限于本文描述的具體實施方案的范圍中，所述實施方案預期僅作為本發(fā) 明的個別方面的舉例說明，并且功能上等同的方法和組分在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實上，除本 文顯示和描述的那些外，根據(jù)前述說明書和附圖，本發(fā)明的各種修飾對于本領域技術人員 將是顯而易見的。此種修飾預期包含在所附權利要求的范圍內(nèi)。
【主權項】
1. 包含變體激活素 IIB受體多肽(VActRIIB)的分離的蛋白質，其中所述多肽選自： (a) 包含SEQ ID NO: 18中所示氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含位置28處的氨基 酸取代； (b) 包含SEQ ID NO: 18的氨基酸19-134中所示氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含 位置28處的氨基酸取代； (c) 包含SEQ ID NO: 18的氨基酸23-134中所示氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含 位置28處的氨基酸取代； (d) 包含SEQ ID NO: 18的氨基酸25-134中所示氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含 位置28處的氨基酸取代； (e) 與（a)至(d)中的任何一個具有至少90%同一性的多肽，其中所述多肽包含對應于 SEQ ID NO: 18的位置28的位置處的氨基酸取代，其中所述多肽能夠結合肌抑素、激活素 A或 GDF-Ilo2. 權利要求1的分離的蛋白質，其中所述vActRIIB多肽位置28處的取代選自A、F、Q、V、 I、L、M、K、H、W和Y的氨基酸取代E。3. 權利要求1的分離的蛋白質，其中所述vActRIIB多肽位置28處的取代選自A、W或Y的 氨基酸取代E。4. 權利要求1的分離的蛋白質，其中所述vActRIIB多肽位置28處的取代為W取代E。5. 權利要求1的分離的蛋白質，其中所述分離的蛋白質進一步包含SEQ ID NO: 79中所 示的序列。6. 權利要求1的分離的蛋白質，其中所述分離的蛋白質進一步包含SEQ ID NO:80中所 示的序列。7. 權利要求1的分離的蛋白質，其中所述多肽的序列與SEQ ID NO: 18的氨基酸25-134 中所示氨基酸序列具有至少99%同一性，且其中所述多肽包含位置28處的氨基酸取代，其 中所述位置28處的取代是A、W、Y、F、Q、V、I、L、M、K或H取代E，且其中所述多肽能夠結合肌抑 素、激活素 A或⑶F-11。8. 權利要求1的分離的蛋白質，其中所述多肽的序列與SEQ ID NO: 18的氨基酸25-134 中所示氨基酸序列具有至少99%同一性，且其中所述多肽包含位置28處的氨基酸取代，其 中所述位置28處的取代是A、W、Y、F、Q、V、I、L、M、K或H取代E，且其中所述分離的蛋白質進一 步包含通過接頭與vActRIIB多肽連接的Fc結構域。9. 權利要求1的分離的蛋白質，其中所述多肽的序列與SEQ ID NO: 18的氨基酸25-134 中所示氨基酸序列具有至少99%同一性，且其中所述多肽包含位置28處的氨基酸取代，其 中所述位置28處的取代是W取代E，且其中所述分離的蛋白質進一步包含通過肽接頭（SEQ ID N0:79)與vActRIIB多肽連接的人Fc結構域（SEQ ID N0:80)。10. 權利要求1的分離的蛋白質，其中所述多肽與至少一種異源多肽融合。11. 包含權利要求1的蛋白質的二聚體。12. 藥物組合物，其包含權利要求1的蛋白質與賦形劑。13. 權利要求11的二聚體，其中所述二聚體是同二聚體。14. 藥物組合物，其包含權利要求11的二聚體與賦形劑。15. 藥物組合物，其包含權利要求13的二聚體與賦形劑。16. 包含權利要求9的蛋白質的同二聚體。17. 藥物組合物，其包含權利要求16的同二聚體與賦形劑。18. 藥物組合物，其包含權利要求9的蛋白質與賦形劑。19. 分離的核酸分子，其包含編碼權利要求1-10中任一項的蛋白質的多核苷酸。20. 重組表達載體，其包含權利要求19的核酸。21. 重組宿主細胞，其包含權利要求20的載體。22. 生產(chǎn)權利要求1-10中任一項的蛋白質的方法，其包括培養(yǎng)權利要求21的宿主細胞， 從而表達所述蛋白質。23. 權利要求1 -10中任一項的蛋白質、權利要求11、13和16中任一項的二聚體或權利要 求12、14、15、17和18中任一項的組合物在制備用于抑制需要的受試者中的肌抑素的藥物中 的用途。24. 權利要求1 -10中任一項的蛋白質、權利要求11、13和16中任一項的二聚體或權利要 求12、14、15、17和18中任一項的組合物在制備用于增加需要的受試者中的無脂肪肌肉量或 增加需要的受試者中的無脂肪肌肉量與脂肪量的比例的藥物中的用途。25. 權利要求1 -10中任一項的蛋白質、權利要求11、13和16中任一項的二聚體或權利要 求12、14、15、17和18中任一項的組合物在制備用于治療需要的受試者中肌抑素相關的肌肉 消耗疾病或病癥的藥物中的用途。26. 權利要求25的用途，其中所述肌抑素相關的肌肉消耗疾病或病癥選自肌營養(yǎng)不良、 肌萎縮性側索硬化、充血性阻塞性肺疾病、慢性心力衰竭、癌癥惡病質、老年性骨骼肌減少 癥、器官萎縮、腕管綜合征、雄激素剝奪、由于燒傷導致的惡病質、糖尿病腎病、和由于長期 臥床休息導致的肌肉消耗、脊髓損傷、中風、骨折、衰老或暴露于微重力。27. 權利要求1 -10中任一項的蛋白質、權利要求11、13和16中任一項的二聚體或權利要 求12、14、15、17和18中任一項的組合物在制備用于治療需要的受試者中肌抑素相關的代謝 紊亂的方法。28. 權利要求27的用途，其中所述肌抑素相關的代謝紊亂選自糖尿病、肥胖、高血糖癥 和骨丟失。29. 權利要求1 -10中任一項的蛋白質、權利要求11、13和16中任一項的二聚體或權利要 求12、14、15、17和18中任一項的組合物在制備用于治療需要的受試者中的一種疾病的方 法，激活素在所述疾病中超量表達。30. 權利要求29的用途，其中所述疾病是癌癥。31. 權利要求1 -10中任一項的蛋白質、權利要求11、13和16中任一項的二聚體或權利要 求12、14、15、17和18中任一項的組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。32. 權利要求31的用途，其中所述癌癥是卵巢癌。
【文檔編號】A61P3/04GK105924516SQ201610218042
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2008年3月6日
【發(fā)明人】宣延勛, L·T·譚, 韓匯泉, K·S·郭, 周小嵐
【申請人】安姆根有限公司