Cd30免疫原多肽及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CD30免疫原多肽，屬于抗癌疫苗領域。具體涉及用作抗癌疫苗的CD30免疫原的優(yōu)化多肽，增強T細胞免疫應答。該氨基酸序列為全新的序列，在制備用于治療腫瘤藥物中的應用。尤其在制備用于腫瘤免疫細胞，增強T細胞免疫應答藥物中的應用，以及在制備用于CAR?T細胞免疫治療的應用。本發(fā)明的有益效果在于為全新的序列，可用于腫瘤免疫細胞技術中的免疫原，能（1）促進T細胞增殖，（2）抑制小鼠外周白細胞表面CD30表達，（3）能與T細胞表面的MHC有效的特異性結合，（4）能提高胸腺淋巴瘤小鼠生存率。作為細胞療法的靶標分子，應用于CAR?T等細胞療法。
【專利說明】
CD30免疫原多肽及其用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明是有關抗癌疫苗領域。具體來說，本發(fā)明涉及用作抗癌疫苗的CD30免疫原 的優(yōu)化多肽，增強T細胞免疫應答。
【背景技術】
[0002] CD30(TNFRSF8)是最初發(fā)現(xiàn)于何杰金氏病(Hodgkin's disease)中的里絲氏細胞 (Reed Sternberg cell)上的跨膜糖蛋白。近年發(fā)現(xiàn)活化T細胞高表達該分子。尤其是，⑶30 可表達于多種惡性淋巴系統(tǒng)疾病，如霍奇金淋巴瘤(HL)、間變性大細胞性淋巴瘤(ALCL)、外 周T細胞淋巴瘤(PTCL)、成人T細胞性淋巴瘤(ATL)等，其中以T細胞淋巴瘤占大多數(shù)，如ALCL 腫瘤細胞中⑶30表達可達100%。
[0003] 相對于近年來B細胞淋巴瘤治療領域中的異彩紛呈，如多種化療方案，干細胞移 植，抗CD20單抗、硼替佐米、來那度胺、Ibrutinib等新型藥物不斷優(yōu)化著治療格局，外周T細 胞淋巴瘤的治療則進展不大。主要方案以化療為主要治療手段，輔以放療。目前，靶向治療 復發(fā)/難治性CD30+T細胞淋巴瘤成為熱門話題，已有諸多單藥治療研究見諸報道。有阿侖單 抗、硼替佐米、brentuximab vedotin(sALCL)、環(huán)抱素(AITL)、吉西他濱、普拉曲沙、羅米地 辛。食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的藥物有普拉曲沙、羅米地辛、brentuximabvedotin(對 ALCL)，有效率分別為29%、25%、86%。
[0004] 腫瘤細胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的腫瘤治療模式，是一種自身免 疫抗癌的新型治療方法。它是運用生物技術和生物制劑對從病人體內采集的免疫細胞進行 體外培養(yǎng)和擴增后回輸?shù)讲∪梭w內的方法，來激發(fā)，增強機體自身免疫功能，從而達到治療 腫瘤的目的。腫瘤細胞免疫療法是繼手術、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術。
[0005] ⑶30可以作為腫瘤疫苗的特異性免疫原。然而，CD30由595個氨基酸殘基組成，分 子量較大，較難得到純度高的CD30。這樣，不僅會給后期的特異性T細胞免疫帶來困難，而且 會導致患者的自身免疫。因此，本發(fā)明提供了一種特異性強，純度較高的小分子多肽作為免 疫原。

【發(fā)明內容】

[0006] 發(fā)明目的
[0007] 本發(fā)明提供一種CD30免疫原多肽，可用于腫瘤細胞免疫的免疫原，增強T細胞免疫 應答，具有分子量小、特異性免疫原性強的特點。
[0008] 技術方案
[0009] 本發(fā)明的技術方案在于提供一種C D 3 0免疫原多肽，序列為 PVSPATMPVRYYQCEPQPQYLDEAGRCTACVAQEAARGDR(SEQ ID NO: 1)。該氨基酸序列為全新的序 列，在制備用于治療腫瘤藥物中的應用。尤其在制備用于腫瘤免疫細胞，增強T細胞免疫應 答藥物中的應用，以及在制備用于CAR-T細胞免疫治療的應用。
[0010] 有益效果
[0011] 本發(fā)明的CD30免疫原多肽，為全新的序列，可用于腫瘤免疫細胞技術中的免疫原。 有益效果在于（1)促進T細胞增殖，（2)抑制小鼠外周白細胞表面CD30表達，（3)能與T細胞表 面的MHC有效的特異性結合，（4)能提高胸腺淋巴瘤小鼠生存率。作為細胞療法的靶標分子， 應用于CAR-T等細胞療法。
【具體實施方式】
[0012] 多肽由上海生工吉爾合成。
[0013] 實施例1
[0014] 用小鼠胸腺淋巴瘤模型檢測⑶30免疫原多肽的體內活力。
[0015] 6-8W齡C57BL/6小鼠，小鼠隨機分成4組，雌雄各半，每組10只。⑴空白組；（2)多肽 低劑量組；（3)多肽中劑量組；（4)多肽高劑量組。腹腔注射DNA烷化劑N-甲基-N-亞硝基脲 (MNU)誘導小鼠胸腺淋巴瘤，建立相應動物模型，在造模后的第1、7、14、21天，分別進行免 疫。方案為：空白組加入相同體積的溶劑，實驗組多肽設3個劑量:5、10、20mg/Kg，在腫瘤周 圍多點注射。28天后，觀察小鼠存活數(shù)量，計算存活率。結果顯示，多肽可有效提高荷瘤小鼠 的生存率，其中，劑量為20mg/Kg組的小鼠生存率達到76.12%。
[0016] 實施例2
[0017] 應用競爭性受體-配體親和法測試多肽與MHC的結合能力：
[0018] 將多肽與HLA各型的結合能力由競爭性受體-配體親和法判斷。將固定濃度為50y mo 1 /L的標記1251的多肽以及不同濃度（1-50M101 /L)的多肽加入反應體系（磷酸鹽緩沖液 和MHC，所述的MHC試劑盒購自上海泛柯生物科技有限公司，試劑盒內有HLA-A1、A2、A3、A11 和A24)，在反應體系中形成兩種復合物，即待測多肽MHC復合物和1251標記多肽復合物。待 測多肽與1251標記多肽競爭與MHC的結合。用超過濾(產品型號Microcon 30，Amicon公司） 分離游離多肽和多肽MHC復合物，然后測定多肽MHC復合物的1251放射量，將此放射量與沒 有競爭性抑制的多肽MHC復合物(沒有加待測多肽的樣本）的放射量比較，求待測多肽在抑 制50%標記多肽與腿(：結合時的濃度，8卩1050。由此得到，多肽對111^-六1^2^3^11和八24的 IC50值分別為5.28、4.13、7.58、4.74和6.01_〇1/1，均符合陽性多肽的標準（彡10虛）。因 此，多肽為具有有效結合能力的免疫原多肽。
[0019] 實施例3
[0020] T淋巴細胞的增殖作用:無菌取小鼠脾臟，1640培養(yǎng)基清洗3次，5ml注射器芯研磨， 200目篩網(wǎng)過濾，制成單細胞懸液，離心（1000r/min，5min)，棄上清，TriS-NH4CL破解紅細 胞，冰水浴靜置3_5min，離心（1000r/min，5min)，棄上清，用無菌冷roS洗滌細胞兩次。最后 加入10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(5ml)懸浮細胞，細胞計數(shù)，調整細胞濃度為5 X106 個/ml，于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。
[0021] 實驗設空白對照組、模型組（刀豆蛋白A，sigma公司購買）、多肽各劑量（5、10、 20mg/ml)組。各組分別加入脾臟淋巴細胞懸液100iil/孔后，空白對照組加入1640培養(yǎng)液100 yl，模型組加入ConA(終濃度為5μg/ml)，多肽各劑量組在加入不同濃度的多肽基礎上加 ConA(終濃度為5邱/1111)。37°(：細胞培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結束后每孔加入20yl MTT，繼 續(xù)培養(yǎng)4h，最后棄掉每孔所有溶液，每孔加入100y 1DMS0，震蕩，用酶標儀檢測570nm處0D值， 每孔設5個平行。
[0022]表1多肽對T淋巴細胞的增殖作用
[0024] *P〈〇 ? 05，#P〈0 ? 01 與模型組相比。
[0025]實驗結果見表1，與模型組比較，多肽能促進小鼠脾臟淋巴細胞的增殖，在劑量為5 ~20mg/ml的范圍呈現(xiàn)很好的劑量依賴關系。
[0026] 實施例4
[0027] 采用流式細胞技術測定免疫原多肽對免疫動物體內T細胞表面CD30表達的影響。 6-8w齡C57BL/6小鼠，小鼠隨機分成4組，每組10只。（1)空白組；（2)免疫原多肽低劑量組； (3)免疫原多肽中劑量組；（4)多肽高劑量組。在試驗的第0、7、14天，分別進行免疫。方案為： 空白組加入相同體積的溶劑，實驗組多肽設3個劑量 :5、10、2〇!^/私，在小鼠背部淋巴結附 近多點注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，將血離心后取血細胞層，用紅細胞裂解液 破解紅細胞，洗去裂解的紅細胞，再用熒光標記的⑶30+-FITC(購自北京華泰昕生物醫(yī)療技 術有限公司)孵育、固定后，進行流式細胞技術測定，評價免疫原多肽對CD30+T細胞的影響。 [0028]表2多肽對CD30抗體+T淋巴細胞的作用
[0030] *P〈〇 ? 05，**P〈0 ? 01 與空白組相比。
[0031 ]實驗結果見表2，與空白組比較，多肽能抑制小鼠外周白細胞表面CD30表達，在劑 量為5~20mg/Kg的范圍呈現(xiàn)很好的劑量依賴關系。
【主權項】
1. 一種⑶30免疫原多肽，其特征在于:所述的多肽序列為SEQ ID NO: 1。2. 根據(jù)權利要求1所述的多肽，其特征在于:在制備用于治療腫瘤藥物中的應用。3. 根據(jù)權利要求2所述的多肽，其特征在于:在制備用于腫瘤免疫細胞，增強T細胞免疫 應答藥物中的應用。4. 根據(jù)權利要求2所述的多肽，其特征在于:在制備用于CAR-T細胞免疫治療的應用。
【文檔編號】A61K39/00GK105968190SQ201610438243
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月19日
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司