專利名稱：多肽、其生產(chǎn)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)APJ的新的配體多肽，以及包括編碼該配體多肽之DNA的DNA序列。
背景技術(shù)：
許多激素和神經(jīng)遞質(zhì)通過存在于細胞膜上的特異性受體介導生物學功能。其中許多受體本身是通過激活偶聯(lián)的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(以下有時簡稱為G蛋白)參予細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的，并且這些受體都有包括7個跨膜區(qū)的共同結(jié)構(gòu)。因此，這些受體被統(tǒng)稱為G蛋白偶聯(lián)受體或七跨膜受體。
通過這些激素或神經(jīng)遞質(zhì)與G蛋白偶聯(lián)受體的相互作用而發(fā)揮各種重要的調(diào)節(jié)功能，例如維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、生殖、發(fā)育、代謝和生長，以及調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)。雖然已知存在有各種不同的激素和神經(jīng)遞質(zhì)的受體蛋白，并且也已知它們在控制生命功能中起著重要作用，但還有一些未知活性物質(zhì)(激素或神經(jīng)遞質(zhì))及其受體是否存在等方面的問題尚不清楚。
近年來，利用G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)在部分氨基酸序列上的相似性，已借助聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(簡稱為PCR)搜索了一些編碼新的受體蛋白質(zhì)的DNA，并且迄今也已克隆了許多未知配體的所謂孤獨G蛋白偶聯(lián)受體(Libert，F(xiàn).等人，科學244，569-572，1989；Wetch，S.K.等人，Biochem.Biophys.Res.Communi 209，606-613，1995；Marchese A.等，基因組23，609-618，1994；Marchese，A基因組29，335-344，1995)。此外，由于基因組DNA和cDNA隨機測序工作的開展，也已相繼發(fā)現(xiàn)了一些新的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(Nomura，N.等人，DNA研究，Vol.1，27-35，1994)。迄今為止，用于確定這些孤獨G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)配體的通用方法，仍只是基于這些G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)相似性。然而，許多孤獨G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與已知受體的同源性很低，故很難基于一級結(jié)構(gòu)相似性來估計其配體，除非它們確實是已知配體之受體的亞型。另一方面，由于基因分析工作的開展，已發(fā)現(xiàn)了許多孤獨G蛋白偶聯(lián)受體，故推測它們?nèi)源嬖谠S多未知的相應(yīng)配體。然而，只有很少數(shù)情況下才能真正鑒定出這些孤獨G蛋白偶聯(lián)受體的配體。
最近，已報導了向動物細胞中導入編碼未知配體之受體蛋白質(zhì)(即孤獨G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì))的cDNA，以研究新的阿片樣肽的方法(Reinsheid.R.K.等人，科學270，792-794，1995；Menular，J.-C.等人，自然377，532-535，1995)。然而，鑒于與已知G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的相似性及組織分布，這些情況下很易于預知該配體應(yīng)屬于阿片樣肽家族。有關(guān)通過阿片樣受體作用于活體之物質(zhì)的研究與開發(fā)已有多年的歷史，并已開發(fā)了受體的多種拮抗劑和激動劑。因此，從人工合成的化合物中挑選出了受體的激動劑并以其作為探針，證明了受體在受體cDNA轉(zhuǎn)染的細胞中的表達。然后，搜索與激動劑相似的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導激活劑，純化如此發(fā)現(xiàn)的激活劑，并確定配體的結(jié)構(gòu)。然而，孤獨受體與已知的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的同源性較低時，便很難以推測其配體。
APJ是迄今報導的孤獨G蛋白偶聯(lián)受體之一(O＇Dowd，B.F.等人，Gene 436，355-359，1993)。APJ與血管緊張肽受體(AT1)間的同源性低，而盡管APJ在CHO細胞中有表達，卻完全檢測不到與血管緊張肽II的反應(yīng)，所以其配體仍不清楚。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化器官等系統(tǒng)或器官中表達的孤獨G蛋白偶聯(lián)受體APJ的配體，可望作為藥物使用，但有關(guān)的它們結(jié)構(gòu)和功能目前尚未被闡明。
發(fā)明公開本發(fā)明人借助適當?shù)姆椒ǎ⒗锰禺愋约毎碳せ钚岳缧盘柼禺惢钚詸z測為指標，在細胞中表達了編碼孤獨G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的cDNA，成功地篩選出被所說的受體蛋白質(zhì)識別為配體的多肽。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，可篩選出一種能夠改變該配體之結(jié)合活性的化合物，其為所說的受體蛋白質(zhì)的激活因子。
因此，本發(fā)明涉及(1)能與包括由SEQ ID No3代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的受體蛋白質(zhì)結(jié)合的多肽，其前體多肽、其酰胺或酯，或其鹽。(2)如上文(1)中提到的多肽，其包括由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物，(3)如上文(1)中提到的多肽，其包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的部分序列，(4)如上文(1)中提到的多肽，其包括(a)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第6至77位氨基酸殘基的肽，(b)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第40至77位氨基酸殘基的肽，(c)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第42至77位氨基酸殘基的肽，(d)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第47至77位氨基酸殘基的肽，(e)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第61至77位氨基酸殘基的肽，(f)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至77位氨基酸殘基的肽，或其N末端氨基酸(Gln)轉(zhuǎn)變成焦谷氨酸殘基而產(chǎn)生的衍生物，(g)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第1至25位氨基酸殘基的肽，(h)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第6-25位氨基酸殘基的肽，(i)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第42至64位氨基酸殘基的肽，(j)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第61至64位氨基酸殘基的肽，(k)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第43至77位氨基酸殘基的肽，(l)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第41至77位氨基酸殘基的肽，(m)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第66至77位氨基酸殘基的肽，(n)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第67至77位氨基酸殘基的肽，(o)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第64至77位氨基酸殘基的肽，(p)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第63至77位氨基酸殘基的肽，(q)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至76位氨基酸殘基的肽，(r)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至75位氨基酸殘基的肽，(s)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至75位氨基酸殘基的肽，(5)如上文(1)中提到的多肽，其包括由SEQ ID No15、SEQ ID No38、SEQID No40或SEQ ID No42代表的氨基酸序列中從第65位至第77位氨基酸殘基的氨基酸序列，(6)如上文(1)中提到的多肽，其具有氨基酸序列pGlu Arg Pro Arg LeuSer His Lys Gly Pro Met Pro Phe，(7)如上文(1)中提到的多肽，其包括由SEQ ID No15、SEQ ID No38、SEQID No40或SEQ ID No42代表的氨基酸序列中從第42位至第77位氨基酸殘基的氨基酸序列，(8)如上文(1)中提到的多肽，其為具有SEQ ID No15所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體多肽，(9)如上文(1)中提到的多肽，其為具有由SEQ ID No38所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體多肽，(10)如上文(1)中提到的多肽，其為具有由SEQ ID No40所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體多肽，(11)如上文(1)中提到的多肽，其為具有由SEQ ID No42所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體多肽，(12)DNA，其包括具有編碼能夠與受體蛋白質(zhì)結(jié)合之多肽或其前體多肽的核苷酸序列的DNA，所說的受體蛋白質(zhì)包括由SEQ ID No3所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物，(13)如上文(12)中提到的DNA，其中由之編碼的多肽包括SEQ ID No1所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物，(14)如上文(12)中提到的DNA，其中由之編碼的多肽包括由SEQ IDNo15、SEQ ID No38、SEQ ID No40或SEQ ID No42所代表之氨基酸序列中從第42位氨基酸殘基至第77位氨基酸殘基的氨基酸序列，(15)如上文(12)中提到的DNA，其中由之編碼的多肽包括由SEQ IDNo15、SEQ ID No38、SEQ ID No40或SEQ ID No42所代表的氨基酸序列中第42位氨基酸殘基到第77位氨基酸殘基的氨基酸序列，(16)如上文(12)中提到的DNA，其中由之編碼的前體多肽包括由SEQ IDNo15所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物，(17)如上文(12)中提到的DNA，其中由之編碼的前體多肽包括由SEQ IDNo38所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物，(18)如上文(12)中提到的DNA，其中由之編碼的前體多肽包括由SEQ IDNo40所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物，(19)如上文(12)中提到的DNA，其中由之編碼的前體多肽包括由SEQ IDNo42所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物，(20)包括如上文(12)中記載的DNA的重組載體，(21)攜帶如上文(12)中記載的DNA或上文(20)中記載的重組載體的轉(zhuǎn)化體，(22)生產(chǎn)多肽、其前體多肽或其鹽的方法，其包括培養(yǎng)如上文(21)中記載的轉(zhuǎn)化體，(23)包括如上文(1)中記載的多肽、其前體多肽、其酰胺或酯，或其鹽的藥物組合物，(24)包括如上文(12)中記載的DNA的藥物組合物，(25)如上文(23)或(24)中記載的藥物組合物，其為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)劑、循環(huán)功能調(diào)節(jié)劑、免疫功能調(diào)節(jié)劑、胃腸功能調(diào)節(jié)劑、代謝功能調(diào)節(jié)劑或生殖功能調(diào)節(jié)劑，(26)抗上文(1)中記載的多肽或其前體多肽的抗體，(27)包括上文(26)中記載的抗體的診斷組合物，以及(28)篩選能夠改變上文(1)中記載的多肽與受體蛋白質(zhì)之結(jié)合活性的化合物的方法，其中所述受體蛋白質(zhì)包括由SEQ ID No3代表的氨基酸序列，所說的方法包括使用上文(1)中記載的多肽和所說的受體蛋白質(zhì)，本發(fā)明進一步提供(29)哺乳動物來源的，如上文(1)中記載的多肽，和(30)如上文(23)或(24)中記載的藥物組合物，其可用于治療和/或預防癡呆、抑郁、活動過強性兒童綜合癥(腦過小病)、意識障礙、焦慮癥、精神分裂癥、恐怖癥、生長激素分泌紊亂、飲食過多癥、貪食癥、高膽固醇血癥、高甘油酯血癥、高脂血癥、高催乳素血癥、糖尿病、腫瘤、胰腺炎、腎病、特納氏綜合癥、神經(jīng)官能癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、脊髓損傷、一過性腦局部缺血、肌萎縮性側(cè)索硬化、急性心肌梗塞、脊髓小腦退化、骨折、創(chuàng)傷、特應(yīng)性皮炎、骨質(zhì)疏松、哮喘、癲癇、不育癥、動脈硬化、肺氣腫、肺水腫、乳溢、愛滋病等。
在本發(fā)明的實踐中，配體多肽的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)具體地是(31)特征在于含有由SEQ ID No3代表之氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)，或其鹽，或者，(32)如上文(31)中記載的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)，其包括由SEQ ID No3所代表的氨基酸序列衍生而來，缺失1至30，最好1至10個氨基酸殘基，或加入(或插入)1至30個，最好1至10個氨基酸殘基，或用不同的氨基酸殘基取代1至30個，最好1至10個氨基酸殘基后的氨基酸序列，或其鹽。
本說明書中術(shù)語“實質(zhì)性等同物”是指蛋白質(zhì)的活性，例如配體和受體的結(jié)合活性及物理特征是基本上相同的。氨基酸的取代、缺失或插入常常不會造成多肽的物理和化學性質(zhì)的根本改變，此時包含有取代、缺失或插入的多肽應(yīng)被視為缺少這種取代、缺失或插入的多肽的實質(zhì)性等同物。序列內(nèi)氨基酸的實質(zhì)上等同的取代物可選自于該氨基酸所屬類別內(nèi)的其他成員。非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
附圖簡述

圖1顯示G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)cDNA的核苷酸序列和由之編碼的氨基酸序列。
圖2顯示用Northern印跡法分析G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)mRNA的組織分布的結(jié)果。
圖3顯示全長度受體蛋白質(zhì)在CHO-A10細胞系中，于轉(zhuǎn)錄水平上確定的表達。
泳道1至7是質(zhì)粒DNA(pAKKO-A10)的系列稀釋液(1，1/4，1/16，1/256，1/1024，1/4096)；泳道8至11是從CHO-A10細胞制備的cDNA的系列稀釋液(1，1/10，1/100，1/1000)；泳道12是沒有加反轉(zhuǎn)錄酶時的結(jié)果；泳道13是沒有使用mRNA作為模板時的結(jié)果；泳道14是以同樣方式處理對照CHO細胞所得到的結(jié)果；泳道15是在沒有使用反轉(zhuǎn)錄酶的情況下以同樣方式處理對照CHO細胞時的結(jié)果。M代表DNA大小標志物；左邊一個是入噬茵體DNA的Sty Ⅰ消化產(chǎn)物，右邊一個是φx174DNA的HindⅢ消化產(chǎn)物。
圖4顯示使用細胞傳感器(Cytosensor)檢測包括在豬腦或牛胃提取物中之特異性刺激CHO-A10細胞的活性的結(jié)果。
B1到B4代表用從豬腦制得的樣品進行檢測時得到的結(jié)果，S1至S4是用牛胃衍生的樣品測得的結(jié)果。各數(shù)據(jù)代表作為時間的函數(shù)，CHO-A10細胞(○)和對照細胞(●)之間在各檢測循環(huán)中相對于基礎(chǔ)水平的胞外pH的改變速率(酸化速率)。
在4至7次循環(huán)期間細胞與樣品接觸。
圖5顯示使用細胞傳感器檢測豬小腸提取物中之特異性刺激CHO-A10細胞的活性的結(jié)果(接圖6)。
G1至G8代表用豬小腸制得的樣品獲得的檢測結(jié)果。各數(shù)據(jù)代表各檢測循環(huán)中，作為時間的函數(shù)，CHO-A10細胞(○)和對照細胞(●)之間相對于基礎(chǔ)水平的胞外pH的改變速率(酸化速率)。
在4至7次循環(huán)期間細胞與樣品接觸。
圖6顯示使用細胞傳感器檢測包含在牛下丘腦提取物中之特異性刺激CHO-A10細胞的活性的結(jié)果(接圖7)。
F1至F5代表C18柱上10％乙腈洗脫級分中的樣品，F(xiàn)6至F10樣品得自30％乙腈洗脫級分，F(xiàn)11至F15為50％乙腈洗脫級分。進一步在CM-Sepbarose離子交換柱上將各洗脫級分分級分離成第一洗脫級分(Fr.1、6、11)、100mM乙酸銨洗脫級分(Fr.2、7、12)、250mM乙酸銨洗脫級分(Fr.3、8、13)、500mM乙酸銨洗脫級分(Fr.4、9、14)和1000mM乙酸銨洗脫級分(Fr.5、10、15)，其得到15個級分，然后檢測各樣品中所含有的細胞刺激活性。
各數(shù)據(jù)代表，當4-7次循環(huán)期間CHO-A10細胞(○)和對照細胞(●)與樣品接觸時，作為時間的函數(shù)，胞外pH相對于基礎(chǔ)水平的改變速率。
縱坐標代表酸化速率(％基礎(chǔ)水平)，橫坐標代表循環(huán)。
圖7顯示使用細胞傳感器檢測包含在牛下丘腦提取物中之特異性刺激CHO-A10細胞的活性的結(jié)果(接圖6)。
F1至F5代表C18柱上10％乙腈洗脫級分中的樣品，F(xiàn)6至F10樣品得自30％乙腈洗脫級分，F(xiàn)11至F15為50％乙腈洗脫級分樣品。進一步在CM-Sepharose離子交換柱上將各洗脫級分分級分離成第一洗脫級分(Fr.1、6、11)、100mM乙酸銨洗脫級分(Fr.2、7、12)、250mM乙酸銨洗脫級分(Fr.3、8、13)、500mM乙酸銨洗脫級分(Fr.4、9、14)和1000mM乙酸銨洗脫級分(Fr.5、10、15)，其得到15個級分，然后檢測各樣品中所含有的細胞刺激活性。
各數(shù)據(jù)代表，當?shù)?-7次循環(huán)期間CHO-A10細胞(○)和對照細胞(●)與樣品接觸時，作為時間的函數(shù)，胞外pH相對于基礎(chǔ)水平的改變速率。
縱坐標代表酸化速率(％基礎(chǔ)水平)，橫坐標代表循環(huán)。
圖8顯示以細胞刺激活性作為指征，選擇高水平APJ受體表達細胞。
將從CHO-A10細胞克隆的細胞1至8與同一樣品接觸，然后測定第4次循環(huán)中，相對于基礎(chǔ)水平的細胞外pH改變的速率(％)。
縱坐標代表酸化速率的改變(％基礎(chǔ)水平)，橫坐標代表從CHO-A10細胞克隆的細胞的參考號。
圖9顯示在RESOURCE RPC中粗制牛胃衍生的肽級分的分離，以及CHO-A10細胞特異性活性的檢測。
圖10顯示在Vydac diphenyl 219TP5415上分離RESOURCE RPC中得到的P-2活性，并檢測CHO-A10特異活性。
圖11顯示在Sephasil C8 SC 2．1/10上分離RESOURCE RPC中得到的P-2活性，并檢測CHO-A10特異活性。
圖12顯示在μRPC C2/C18 SC 2．1/10上分離于Vydac diphenyl219TP5415上得到的活性級分，并檢測CHO-A10特異活性。
圖13顯示在μRPC C2/C18 SC 2.1/10上分離于Sephasil C8 SC2．1/10上得到的活性級分，并檢測CHO-A10特異活性。
圖14顯示小鼠衍生的EST(小鼠EST)與SEQ ID No1限定的牛胃衍生的肽片段(牛)之間的同源性。
圖15顯示小鼠型配體多肽cDNA的核苷酸序列和由之編碼的氨基酸序列。
圖16顯示小鼠型配體多肽(小鼠)和SEQ ID No1限定之牛胃衍生的肽片段(牛部分)間的同源性。
圖17顯示大鼠型配體多肽cDNA的核苷酸序列和由之編碼的氨基酸序列。
圖18顯示人型配體多肽cDNA的核苷酸序列和由之編碼的氨基酸序列。
圖19顯示牛型配體多肽cDNA的核苷酸序列和由之編碼的氨基酸序列。
圖20比較顯示由牛、小鼠、大鼠和人型配體多肽cDNA的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
圖21圖解顯示實施例16中得到的肽，和由SEQ ID No42限定的序列中第42位至77位氨基酸殘基之氨基酸序列代表的肽所引起的酸化速率改變。
附圖中，○_○代表由實施例6中得到的肽引起的酸化速率的改變；●_●代表由SEQ ID No42限定的序列中第42至77位氨基酸殘基之氨基酸序列代表的肽所引起的酸化速率改變。
圖22圖解顯示實施例33中檢測對毛喉素刺激的cAMP產(chǎn)生的抑制活性的結(jié)果。
圖中，○_○代表SEQ ID No42中第42至77位氨基酸殘基的氨基酸序列所表示的肽；●_●代表SEQ ID No40中第45至77位氨基酸殘基的氨基酸序列所表示的肽。
本發(fā)明的配體多肽包括能夠與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)結(jié)合的任何蛋白質(zhì)。具體地說，可以提到的多肽包括①含有SEQ ID No1所代表之氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的肽或其部分肽，②由包括SEQ IDNo15所示氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體衍生的部分肽，③由包括SEQ ID No38所代表之氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體衍生的部分肽，④由包括SEQ ID No40所代表之氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體衍生的部分肽，或⑤由包括SEQ ID No42所代表之氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體衍生的部分肽，等等。
現(xiàn)在詳細描述上述配體多肽、其酰胺或酯，或其鹽(以下有時簡稱為多肽)、其生產(chǎn)方法及多肽的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述配體多肽包括由任何組織，例如垂體、胰臟、腦、腎、肝、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、腎上腺、皮膚、肌肉、肺、消化道、血管、心臟等組織；或者由人或其他溫血動物，如豚鼠、大鼠、小鼠、豬、羊、牛、猴等的細胞衍生的任何多肽，并包括①含有SEQ ID No1所代表之氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的肽，或其部分肽，②由包括SEQID No15所示氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體衍生的部分肽，③由包括SEQ ID No38所代表之氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體衍生的部分肽，④由包括SEQ ID No40所代表之氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體衍生的部分肽，⑤由包括SEQ ID No42所代表之氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體衍生的部分肽，等等。例如，除包括SEQ ID No1之氨基酸序列的多肽外，本發(fā)明的配體多肽還包括①包括與SEQ ID No1的氨基酸序列有大約50～99.9％、較好70-99.9％，更好80-99.9％，最好90-99.9％同源性之氨基酸序列，并與包括SEQ ID No73之氨基酸序列的多肽有實質(zhì)上等同的活性的多肽，②與包括SEQ ID No15之氨基酸序列的前體的部分肽有性質(zhì)上實質(zhì)等同活性的多肽，③與包括SEQ IDNo38之氨基酸序列的前體的部分肽有性質(zhì)上實質(zhì)等同的活性的多肽，④與包括SEQ ID No40之氨基酸序列的前體的部分肽有性質(zhì)上實質(zhì)等同的活性的多肽，或⑤與包括SEQ ID No42之氨基酸序列的前體的部分肽有性質(zhì)上實質(zhì)等同的活性的多肽等。術(shù)語“實質(zhì)上等同的”是指受體結(jié)合活性、信號轉(zhuǎn)導活性等性質(zhì)是等同的。因此，既使在受體結(jié)合活性和多肽分子量等方面存在程度上的差異也是允許的。
作為本發(fā)明多肽的特定實例，可以是衍生于小鼠腦、大鼠腦、豬腦、豬小腸、牛下丘腦、牛胃、人下丘腦或人肺的，并含有以下序列所代表的氨基酸序列的多肽①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQ ID No40代表之氨基酸序列的部分序列，⑤由SEQ ID No42代表之氨基酸序列的部分序列等。
此外，作為有上述意義的含氨基酸序列實質(zhì)性等同物的多肽，可提到的有含有經(jīng)取代、缺失、加入或插入一個或多個氨基酸而由含有下述序列或其實質(zhì)性等同物等的多肽衍生的多肽或其部分肽，所說的序列包括①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ IDNo15代表之氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQ ID No40代表的氨基酸序列之部分序列，⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列之部分序列，因此，可以提到的有包括(1)經(jīng)缺失1至7個，較好1至5個，最好1至3個氨基酸而由①SEQ IDNo1代表的氨基酸序列或其部分序列，②SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④SEQID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列衍生之氨基酸序列的多肽；(2)經(jīng)加入(或插入)1至20個，較好1至15個，最好1至10個氨基酸而由①SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④SEQ ID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列衍生之氨基酸序列的多肽；或(3)因用其它氨基酸取代1至7個、優(yōu)選1-5個、更優(yōu)選1-3個氨基酸而由①SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④SEQ ID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列衍生之氨基酸序列的多肽。
再者，本發(fā)明的多肽或部分肽包括在體內(nèi)裂解Gln的N末端，然后將所說的Gln轉(zhuǎn)化成焦谷氨基酸殘基而衍生的氨基酸序列。
本發(fā)明的前體可以是含有作為部分序列的本發(fā)明配體肽的任何蛋白質(zhì)。因此，其包括含有由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的蛋白質(zhì)(這樣的蛋白質(zhì)在下文中有時與上文提到的配體多肽一起稱為本發(fā)明的多肽或配體多肽)。
本發(fā)明的多肽具有約1，000至10，000，較好約1，000至5，000，更好約1，000至3，000道爾頓的分子量。
在本說明書中，(多)肽是根據(jù)已確定的實踐，以N末端(氨基末端)在左側(cè)，C末端(羧基末端)在右側(cè)的方式顯示的。這些包括①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQID No40代表的氨基酸序列的部分序列，⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列等的多肽在C末端一般具有羧基(-COOH)或羧基(-COO-)。但C末端可以是酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)形式的。作為酯的R基團，其可以是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基等C1-6烷基團，環(huán)戊基、環(huán)己基等C3-8環(huán)烷基基團，苯基、α-萘基等C6-12芳基基團，包括例如芐基、苯乙基、二苯甲基等苯基-C1-2烷基基團，及α-萘基甲基等α-萘基-C1-2烷基基團的C7-14芳烷基基團。還可提到新戊酰羥甲酯等，其通常用作口服給藥的酯。當這些包括①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID N038代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQID No40代表的氨基酸序列的部分序列，⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列等的多肽在C末端以外的位置有附加的羧基或羧酸根基因，則其中的這些基團被酰胺化或酯化的多肽也落入本發(fā)明之多肽的范疇內(nèi)。在這種情況下，酯可以是如上文提到的C末端酯的同類酯。
本發(fā)明多肽的鹽是與堿(如堿金屬)或酸(有機酸、無機酸)形成的生理上可接受的鹽，更好是生理上可接受的酸加成鹽。作為這樣的鹽，可以使用與無機酸(如鹽酸、磷酸、硼酸、硫酸)或有機酸(如乙酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽。
可以按照下文提到的肽合成方法，或者從人或溫血動物組織或細胞中純化而制備本發(fā)明的多肽。也可以經(jīng)培養(yǎng)含有該多肽之DNA編碼序列的轉(zhuǎn)化體而生產(chǎn)之，如下文所述。
當從人或溫血動物組織或細胞中生產(chǎn)多肽時，首先制備人或溫血動物組織或細胞的勻漿物，然后用酸提取，并對提取物按適當?shù)慕M合方式進行鹽析、透析、凝膠過濾、反相層析、離子交換層析或親和層析等層析，以純化和分離之。
如上所述，可以用已知的肽合成方法生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。肽合成的方法是任何一種固相合成和液相合成方法。因此，可以將能夠與其殘余部分構(gòu)成該蛋白質(zhì)的部分肽或氨基酸縮合在一起，并且當產(chǎn)物有保護基團時，去掉保護基團以制得所需的肽。已知的縮合和去保護方法包括下列文獻(1)至(5)中所描述的方法。
(1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti，《肽合成》，IntersciencePublishers，New York，1966(2)Schroeder和Luebke，《肽》，Academic Press，New York，1965(3)Nobuo Izumiya等，《肽合成基礎(chǔ)與實驗》，Maruzen，1975(4)Haruaki Yajima和Shumpei Sakakibara，《蛋白質(zhì)化學IV生化實驗》，205，1977(5)Haruaki Yajima(編)，藥物開發(fā)(續(xù))14，Peptide Synthesis，Hirokawa Shoten反應(yīng)后，可聯(lián)合使用溶劑提取、柱層析、液相層析及重結(jié)晶等常規(guī)純化技術(shù)，純化并分離蛋白質(zhì)。上述分離的蛋白質(zhì)是游離化合物時，可用已知方法將其轉(zhuǎn)化成適當?shù)柠}。反之，如分離的產(chǎn)物是鹽時，可使用已知方法將其轉(zhuǎn)化成游離肽。
可使用適于酰胺化的肽合成樹脂制得多肽的酰胺。樹脂包括氯甲基樹脂、羥甲基樹脂、二苯甲基胺樹脂、氨甲基樹脂、4-芐氧基芐醇樹脂、4-甲基二苯甲基胺樹脂、PAM樹脂、4-羥甲基甲基苯基乙酰氨甲基樹酯、聚丙烯酰胺樹脂、4-(2＇，4＇-二甲氧基苯基羥甲基)苯氧基樹脂、4-(2＇，4＇-二甲氧基苯基-Fmoc氨乙基)苯氧基樹脂等。按照各種已知的縮合技術(shù)，使用上述樹脂，將那些α氨基和側(cè)鏈官能團已被適當保護的氨基酸，按目的肽的氨基酸順序縮合到樹脂上。在系列反應(yīng)結(jié)束時，從樹脂上去掉肽或被保護的肽并除去保護基團，必要時形成二硫鍵以得到目的多肽。
為了縮合上述被保護的氨基酸，可使用各種肽合成的活化試劑，但其中特別適用的是碳化二亞胺。碳化二亞胺包括DCC、N，N＇-二異丙基碳化二亞胺和N-乙基-N＇-(3-二甲氨基脯氨酰)碳化二亞胺。為了用這樣的試劑活化，向樹脂內(nèi)直接加入外消旋抑制物添加劑，如HOBt和被保護的氨基酸，或者向樹脂內(nèi)加入預活化為對稱酸酐的被保護的氨基酸，HOBt或HOOBt酯?？梢詮囊阎捎糜陔目s合反應(yīng)的溶劑中適當?shù)剡x擇活化被保護的氨基酸或與樹脂縮合時使用的溶劑。所用溶劑例如可以是N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、氯仿、三氟乙醇、二甲基亞砜、DMF、吡啶、二噁烷、二氯甲烷、四氫呋喃、乙腈、乙酸乙酯或它們的適當混合物?？稍谝阎逆I形成所需溫度范圍內(nèi)選擇反應(yīng)溫度，并且通常選自-20℃～50℃。一般按比例使用1.5至4倍過量的活化的氨基酸衍生物。如果用茚三酮反應(yīng)發(fā)現(xiàn)縮合不足，可以重復進行縮合反應(yīng)以便在不除去保護基團的情況下達到足夠縮合。如果重復進行縮合反應(yīng)仍不能達到足夠程度的縮合，則可用乙酸酐或乙酰咪唑使未反應(yīng)的氨基基團乙酰化。
起始氨基酸材料的氨基保護基團包括Z、Boc、叔戊氧基羰基、異冰片氧基羰基、4-甲氧基芐氧基羰基、Cl-Z、Br-Z、金剛烷氧基羰基、三氟乙酰基、鄰苯二甲酰基、甲?；?、2-硝基苯基亞磺?；?、二苯基硫膦基或Fmoc.可使用的羧基保護基團包括但不只限于上述C1-6烷基、C3-8環(huán)烷基和C7-14芳烷基以及2-金剛烷基、4-硝基芐基、4-甲氧基芐基、4-氯芐基、苯甲酰甲基、芐氧基羰基酰肼基、叔丁氧基基羰基酰肼基和三苯甲游基酰肼基。
可通過酯化或醚化作用保護絲氨酸和蘇氨酸的羥基。適于酯化作用的基團包括乙?；鹊图夋溚轷；愄佳苌幕鶊F，苯甲?；确减；鶊F，芐氧基羰基和乙氧基羰基。適于所說的醚化作用的基團包括芐基、四氫吡喃基和叔丁基。
酪氨酸的酚式羥基的保護基團包括Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基芐基、Br-Z和叔丁基。
組氨酸中咪唑的保護基團包括Tos，4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；?、DNP、芐氧基甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc。
起始氨基酸的活化羧基基團包括相應(yīng)的酸酐、疊氮化物和活性酯，例如與五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基苯酚、氰甲基醇、對硝基苯酚、HONB、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基苯鄰二甲酰亞胺、HOBt等醇形成的酯。起始氨基酸的活化氨基基團包括相應(yīng)的磷酰胺。
除去保護基團的方法包括于鈀黑或Pd/C等催化劑存在下使用氫氣進行催化還原反應(yīng)，用無水氟化氫、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或這些酸的混合物進行酸處理，用二異丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪進行堿處理，在液體氨中用鈉金屬還原。用上述酸處理方法進行去除反應(yīng)一般是在-20℃-40℃的溫度下，并最好加入苯甲醚、苯酚、苯硫基甲烷、間甲酚、對甲酚、甲硫醚、1，4-丁二硫醇、1，2-乙二硫醇等陽離子受體以完成之?？梢杂帽搅蚍犹幚硪猿ビ糜诒Ｗo組氨酸之咪唑基團的2，4-二硝基苯基基團，可用稀氫氧化鈉溶液或稀氨水進行堿處理以及用1，2-乙二硫醇、1，4-丁二硫醇進行上述酸處理，以除去用于保護色氨酸之吲哚基團的甲?；鶊F。
可以從已知基團和方法中判斷選擇保護不參與起始材料反應(yīng)之官能團的方法、可使用的保護基團、除去保護基團的方法，以及活化參與反應(yīng)之官能團的方法。
得到酰胺形式的多肽的另一種方法包括，首先使C末端氨基酸的α羧基酰胺化，然后向N側(cè)延伸肽鏈直到所需的鏈長度，然后使C末端肽的α氨基基團和形成目的多肽之其余部分的氨基酸或肽的α羧基基團選擇性地去保護，并在混合的上述溶劑中，使α氨基基團和側(cè)鏈官能團已用上述適當?shù)谋Ｗo基團保護的兩個片段縮合?？s合反應(yīng)的參數(shù)可以與上述相同。用上述方法從縮合后得到的被保護的肽上去除所有的保護基團，以提供所需的粗肽。可以用已知的純化方法純化該粗肽，并凍干主要部分以提供酰胺化的多肽。
為了得到多肽的酯，將C末端氨基酸的α羧基基團與預期的醇縮合，得到氨基酸酯，然后再按上述生產(chǎn)酰胺的方法進行生產(chǎn)。
本發(fā)明的多肽可以是任何肽，條件是它具有與包括①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列等的多肽實質(zhì)上同樣的活性(如中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)活性、循環(huán)功能調(diào)節(jié)活性、免疫功能調(diào)節(jié)活性、胃腸功能調(diào)節(jié)活性、代謝功能調(diào)節(jié)活性或生殖功能調(diào)節(jié)活性。作為這樣的肽，其可以是包括經(jīng)缺失1個或多個氨基酸而由①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQ ID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列等衍生之氨基酸序列的肽。具體地說，優(yōu)選的是(1)包括由SEQ ID No1代表之氨基酸序列的第1至第12位氨基酸殘基的肽，(2)包括由SEQ IDNo1代表之氨基酸序列的第1至第13位氨基酸殘基的肽，(3)包括由SEQID No1代表之氨基酸序列的第1至第14位氨基酸殘基的肽，(4)包括由SEQ ID No1代表之氨基酸序列的第1至第15位氨基酸殘基的肽，⑤包括由SEQ ID No1代表之氨基酸序列的第1至第16位氨基酸殘基的肽，(6)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的部分序列的肽等。其中，優(yōu)選的是包括由SEQ ID No15、38、40或42代表的氨基酸序列的部分序列的肽。
包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的部分序列的多肽中，可以提到的特定實例有(a)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第6至77位氨基酸殘基的肽，(b)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第40至77位氨基酸殘基的肽，(c)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第42至77位氨基酸殘基的肽，(d)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第47至77位氨基酸殘基的肽，(e)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第61至77位氨基酸殘基的肽，(f)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第66至77位氨基酸殘基的肽，或其因N-末端氨基酸(GLn)變?yōu)榻构劝彼釟埢玫降难苌铮?g)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第1至25位氨基酸殘基的肽，(h)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第6至25位氨基酸殘基的肽，(i)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第42至64位氨基酸殘基的肽，(j)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第61至64位氨基酸殘基的肽，(k)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第43至77位氨基酸殘基的肽，(l)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第41至77位氨基酸殘基的肽，(m)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第66至77位氨基酸殘基的肽，(n)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第67至77位氨基酸殘基的肽，(o)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第64至77位氨基酸殘基的肽，(p)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第63至77位氨基酸殘基的肽，(q)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第65至76位氨基酸殘基的肽，(r)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第65至75位氨基酸殘基的肽，(s)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第65至75位氨基酸殘基的肽，等等。
其中優(yōu)選的是包括包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第65至77位氨基酸殘基的肽、其中N末端氨基酸(Gln)轉(zhuǎn)變成焦谷氨酸殘基而得到的衍生物，或包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第42至77位氨基酸殘基的肽。特別優(yōu)選的是包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第65至77位氨基酸殘基的肽及其N末端氨基酸(Gln)轉(zhuǎn)化成焦谷氨酸殘基所得到的衍生物(pGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe)。此外，由氨基酸序列pGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe所代表之肽的部分肽也可用作本發(fā)明的多肽(肽)。
本發(fā)明的多肽可進一步用作生產(chǎn)抗配體多肽抗體的抗原。除上述本發(fā)明的多肽外，由上述本發(fā)明的多肽衍生的部分肽，如N末端肽、C末端肽和中間肽也可用作抗原。
可使用的部分肽可以是各自只含有一個結(jié)構(gòu)域的肽或各自含有多個結(jié)構(gòu)域的肽。
本說明書中的部分肽可以有一個呈酰胺或(-CONH2)或酯(-COOR)形式的C末端。作為酯基團的例子，可以是如對上述多肽述及的酯基團。當所說的片段肽在C末端以外的位置上具有羧基或羧基時，則這些基團可以被酰胺化或酯化，而且這些酰胺或酯也包括在本發(fā)明之片段肽的概念中。上述酯基團可以是與上述C末端酯基團同樣的。
此外，本發(fā)明的多肽或部分肽可以是與具有已知功能或性質(zhì)的蛋白質(zhì)形成的融合蛋白。
作為本發(fā)明多肽之片段肽的鹽，可以使用如上文對多肽述及的同樣類型的鹽。
可以使用上述合成多肽的同樣合成方法或用適當?shù)碾拿噶呀獗景l(fā)明的多肽，以生產(chǎn)本發(fā)明多肽的部分肽或其酰胺或酯，或其鹽。
編碼本發(fā)明之多肽的DNA可以是任何DNA，條件是其含有對包括SEQ ID No3代表之氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的受體蛋白質(zhì)具有結(jié)合親和性的DNA部分。具體地說，它可以是包括編碼含有下列氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物之多肽的核苷酸序列的任何DNA①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列。其可以是基因組DNA、基因組DNA文庫、衍生于上述組織或細胞的cDNA、衍生于上述組織或細胞的cDNA庫，或合成DNA。用于文庫構(gòu)建的載體可以是噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、噬茵粒等。也可使用由上述組織或細胞制備的RNA部分，以反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(以下簡稱RT-PCR)直接進行擴增。
更具體地說，作為編碼衍生于小鼠全腦、大鼠全腦、牛下丘腦、牛胃、人下丘腦或人肺，并含有①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQ ID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列等的多肽的DNA，其可以是(1)含有下列核苷酸序列的DNA①由SEQID No2代表的核苷酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No16代表之核苷酸序列的部分序列，③由SEQ ID No39代表之核苷酸序列的部分序列，④由SEQ ID No41代表之核苷酸序列的部分序列，或⑤由SEQ IDNo43代表之核苷酸序列的部分序列；(2)能夠在嚴格條件下與(1)中限定的序列之一雜交的哺乳動物DNA；(3)由于遺傳密碼簡并性而不能與(1)和(2)中限定的任何序列雜交，但編碼具有同樣氨基酸序列之多肽的DNA等?？梢园匆阎椒ɑ蚱涓倪M方法進行雜交。上文提到的嚴格條件例如是42℃、50％甲酰胺、4xSSPE(1xSSPE=150mM NaCl、10mMNaH2PO4·H2O、1mM EDTA，pH7.4)，5xDenhardt溶液，0.1％SDS。
在SEQ ID No2中限定的上述核苷酸序列中，Y代表T或C；N代表T、C、A或G；R代表A或G；M代表C或A；W代表T或A；S代表C或G。
在編碼含有①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQ ID No40代表的氨基酸序列的部分序列，⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列等的多肽的DNA中，也可使用含有6至51個(較好9至30個，最好12至30個)核苷酸的部分序列DNA片段作為DNA檢測的探針。
也可用下述基因工程方法生產(chǎn)編碼本發(fā)明的多肽的DNA。
可使用具有多肽的部分核苷酸序列的合成DNA引物進行PCR擴增，或者使用插入到適當載體中、并用含有人衍生之多肽的部分或全部區(qū)域的標記DNA片段，或合成DNA進行雜交，以克隆編碼本發(fā)明之多肽的全長DNA?？砂凑誐olecular Cloning(第二版J.Sambrook等人，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)中所述的方法進行雜交。當使用商業(yè)文庫時，可按照附帶說明書中所說明的方法進行。
可以直接使用，或用限制酶消化或根據(jù)使用目的加入接頭后使用編碼多肽的克隆的DNA。該DNA在5＇端有ATG作為翻譯起始密碼子，并且在3＇端可能有TAA、TGA或TAG作為終止密碼子?？山柚m當?shù)腄NA接頭加入翻譯起始和終止密碼子。
例如可從編碼本發(fā)明多肽或部分肽的DNA中切下靶DNA片段，并在適當?shù)谋磉_載體中與啟動子下游側(cè)連接，以產(chǎn)生用于多肽或部分肽的表達載體。
載體可包括衍生于大腸桿菌的質(zhì)粒如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等；衍生于枯草芽孢桿菌的質(zhì)粒如pUB110，pTP5，pC194等；衍生于酵母的質(zhì)粒如pSH19，pSH15等；噬茵體如p噬菌體及動物病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒和桿狀病毒。
根據(jù)本發(fā)明，只要與用來表達基團的宿主細胞相容，任何啟動子均可使用。當宿主是動物細胞時，啟動子包括SV40衍生的啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、SRα啟動子等。當轉(zhuǎn)化的宿主是大腸桿菌時，啟動子較好是trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、入PL啟動子、lpp啟動子等。當轉(zhuǎn)化的宿主是芽孢桿菌時，啟動子可以是SP01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。當宿主是酵母時，啟動子較好是PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等。當宿主是昆蟲細胞時，啟動子較好是多角體蛋白啟動子、P10啟動子等。
除上述元件外，表達載體還可任選含有增強子、剪接信號、polyA腺苷酸化信號、選擇標志、SV40復制原點(以下有時簡稱為SV40 ori)等。選擇標志的例子包括二氫葉酸還原酶(以下有時簡稱為dhfr)基因[氨甲蝶呤(MTX)抗性]、氨芐青霉素抗性基因(以下有時簡稱為Ampr)、新霉素抗性基因(以下有時簡稱為Neo，G418抗性)等。特別是，當CHO(dhfr-)細胞與作為選擇標志的dhfr基因一起使用時，也可使用無胸苷培養(yǎng)基完成選擇。
必要時，可在本發(fā)明受體蛋白質(zhì)的N末端加上與宿主相匹配的信號序列。作為信號序列，在使用埃希氏桿茵屬細菌作宿主時，可以提到的有PhoA信號序列、Ompa信號序列等；在使用芽孢桿菌屬細菌作宿主時可提到的有α淀粉酶信號序列、枯草桿菌蛋白酶信號序列等；在使用酵母作宿主時，可提到的有MFα信號序列、SUC2信號序列等；在使用動物細胞作宿主時，可提到的信號序列有胰島素信號序列、α干擾素信號序列、抗體分子信號序列等。
可將如此構(gòu)建的編碼本發(fā)明受體蛋白質(zhì)等的DNA導入宿主中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體。
使用如此構(gòu)建的，攜帶本發(fā)明的多肽或部分肽編碼DNA的載體制得轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)染體。例如，宿主可以是埃希氏桿菌屬微生物、芽孢桿菌屬微生物、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等。埃希氏桿菌屬微生物的例子包括大腸桿菌K12.DH1[美國國家科學院院報，Vol.60，160(1968)]、JM103[核酸研究，第9卷，309(1981)]、JA221[分子生物學雜志，Vol.120，517(1978)]、HB101[分子生物學雜志，Vol.41，459(1969)]、C600[遺傳學，Vol.39，440(1954)]等。芽孢桿茵屬微生物的例子包括枯草芽孢桿菌MI114[Gene，Vol.24，255(1983)]、207-21[生物化學雜志，Vol.95，76(1984)]等。酵母細胞例如可以是釀酒酵母AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12等。昆蟲可包括蠶(家蠶幼蟲)[Maeda等人，自然，Vol.315，592(1985)]等。
昆蟲細胞的例子包括草地夜蛾細胞(Sf細胞)、衍生于粉紋夜蛾之中腸的MGl細胞、衍生于粉紋夜蛾卵的High FiveTM細胞、衍生于甘藍夜蛾的細胞、衍生于Estigmena acrea的細胞等(用于病毒AcNPV)；和家蠶N細胞(BmN細胞)等(用于病毒BmNPV)。作為Sf細胞，可使用Sf9細胞(ATCC CRC 1711)和Vaughn，J.L(in Vitro，13，213-217 1977)所述的Sf21細胞。
動物細胞的例子包括猴細胞COS-7、Vero細胞、中國倉鼠細胞CHO(以下簡稱CHO細胞)、dhfr基因缺陷型中國倉鼠細胞CHO(以下簡稱CHO(dhfr-)細胞)、小鼠L細胞、小鼠骨髓瘤細胞、大鼠GH3細胞、人FL細胞、293細胞、C127細胞、小鼠細胞、BALB3T3細胞、Sp-2/0細胞等。
例如可按照美國國家科學院院報，Vol.69，2110(1972)或基因，Vol.17，107(1982)中所述的方法轉(zhuǎn)化埃希氏桿菌屬的微生物?？砂凑辗肿优c普通遺傳學，Vol，168，111(1979)中所述的方法轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬微生物。例如可按照美國國家科學院院報，Vol.75，1929(1978)中所述的方法轉(zhuǎn)化酵母。例如可按照Bio/Technology，6，47-45，1988中所述的方法轉(zhuǎn)化昆蟲細胞或昆蟲。例如可按照病毒學，Vol.52，456，1973中所述的方法轉(zhuǎn)化動物細胞。
例如可用脂轉(zhuǎn)染法(Felgner，P.L.等人，美國國家科學院院報，84，7413(1987))、磷酸鈣法(Graham，I.L.and van der Eb，A.J病毒學52，456-467(1973))、電穿孔法(Nuenann，E.等人，EMBO J1，841-845(1982))將表達載體導入細胞內(nèi)。
因而，可得到用含有編碼本發(fā)明之受體蛋白質(zhì)等的DNA的表達載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
作為適于使用動物細胞穩(wěn)定地表達本發(fā)明的受體蛋白質(zhì)等的方法，可提到克隆選擇法，即選擇那些其中導入的表達載體已整合到其染色體中的動物細胞。更具體地說，即利用上述選擇標志作為指示物來選擇轉(zhuǎn)化體。再者，可以反復使用上述選擇標志對如此得到的動物細胞進行克隆選擇，以得到高表達本發(fā)明之受體蛋白質(zhì)等的穩(wěn)定的動物細胞系。當使用dhfr基因作為選擇標志時，可用漸增MTX濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，以選擇抗性菌株，從而與dhfr基因一起在細胞中擴增編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)等的DNA，以得到更高水平表達受體蛋白質(zhì)的動物細胞系。
可以在適于表達編碼本發(fā)明的受體蛋白質(zhì)等的DNA，以形成和積聚本發(fā)明的多肽的條件下，培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體以產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。
可以在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以埃希氏桿菌或芽孢桿菌屬微生物作為宿主的轉(zhuǎn)化體(轉(zhuǎn)染體)。培養(yǎng)基可含有轉(zhuǎn)化體生長所需的碳源、氮源、礦物質(zhì)等。碳源可包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等。氮源可包括銨鹽、硝酸鹽、玉米浸液、蛋白胨、酪蛋白、肉浸汁、豆餅、馬鈴薯提取物等有機或無機物，礦物質(zhì)可包括氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂等?？蛇M一步加入酵母浸膏、維生素、生長促進因子等。培養(yǎng)基的pH約5至8比較理想。
埃希氏桿菌屬微生物培養(yǎng)基較好是含有例如葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M9培養(yǎng)基(Miller，J.of Experiments in Moledular Genetics，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1972)。必要時，培養(yǎng)基中可添加藥物如3β-吲哚基-丙烯酸，以改善啟動子的效率。在使用埃希氏桿菌宿主的情況下，培養(yǎng)通常是在約15至43℃下進行約3至24小時。必要時，可進行通氣和攪拌。在使用芽孢桿菌宿主的情況下，培養(yǎng)通常是在大約30至40℃下進行約6至24小時。必要時，也可進行通氣和攪拌。在轉(zhuǎn)化體宿主是酵母的情況下，所使用的培養(yǎng)基例如包括Burkholder基本培養(yǎng)基[Bostian，K.L.等人，美國國家科學院院報，77卷，4505(1980)]、含0.5％酪蛋白氨基酸的SD培養(yǎng)基[Bitter G.A.等，美國國家科學院院報，Vol.81，5330(1984)]等。最好將培養(yǎng)基的pH調(diào)到大約5至8。培養(yǎng)通常在約20至35℃下進行約24至72小時。必要時可通氣和攪拌。在轉(zhuǎn)化體宿主是昆蟲的情況下，所使用的培養(yǎng)基可包括向Grace氏昆蟲培養(yǎng)基(Grace，T.C.C，自然，195，788(1962))中適當加入添加劑如鈍化的(或固定化的)10％牛血清等得到的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的pH最好調(diào)到大約6.2至6.4。培養(yǎng)通常是在大約27℃進行約3-5天。必要時，可進行通氣和攪拌。在轉(zhuǎn)化體宿主是動物細胞的情況下，所使用的培養(yǎng)基可包括例如含有約5-20％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基[Science，Vol122，501(1952)]、DMEM培養(yǎng)基(Virology，Vol，8，396(1959))、RPMI1640培養(yǎng)基[Journal of theAmerican Medical Association，Vol.199，519(1967)]、199培養(yǎng)基[Proceedings of the Society of the Biological Medicine，vol.73，1(1950)]等。pH最好是大約6至8。培養(yǎng)通常在大約30至40℃下進行約15至60小時。必要時，可更換培養(yǎng)基、通氣并攪拌。
具體地說，當使用CHO(dhfr-)細胞并以dhfr基因作為選擇標志時，最好使用含有幾乎沒有胸苷的透析胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。
可以按照下述方法從上述培養(yǎng)物中分離并純化多肽或部分肽。
為了從培養(yǎng)的微生物或細胞中提取多肽或部分肽，培養(yǎng)后用已知方法收集微生物或細胞，懸浮于適當?shù)木彌_溶液中，用超聲波、溶茵酶和/或凍融等方法破壞細胞后，離心或過濾得到多肽或部分肽的粗提物。也可使用其他的常規(guī)提取或分離方法。緩沖溶液中可含有蛋白質(zhì)變性劑，如尿素或鹽酸胍或表面活性劑如Triton X-100(注冊商標，下文常稱作“TM”)。
當多肽或部分肽被分泌到培養(yǎng)基中時，在培養(yǎng)結(jié)束后將上清液與微生物分離開，并通過已知方法收集所得上清液?？蛇m當?shù)睾嫌酶鞣N已知的分離和純化方法以純化含有多肽或部分肽的培養(yǎng)物上清液或提取物。各種已知的分離和純化方法包括利用溶解度的方法如鹽析，或主要利用分子大小或重量差異的溶劑沉降方法如透析、超濾、凝膠過濾及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；利用電荷差異的方法如離子交換層析；利用特異親和性的方法如親和層析；利用疏水性質(zhì)差異的方法如反相高效液相層析，以及利用等電點差異的方法如等電電泳或?qū)游鼍劢沟确椒ā?br> 當如此得到的本發(fā)明的多肽為游離形式時，可用已知方法或這些方法的改良法將其轉(zhuǎn)化成鹽。相反，當所得多肽呈鹽形式時，可用已知方法或這些方法的改良法將其轉(zhuǎn)化成游離形式或其他的鹽。
在純化前或純化后，可用適當?shù)牡鞍踪|(zhì)修飾酶處理由轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的本發(fā)明的多肽，以任意地修飾或除去部分多肽?？墒褂玫牡鞍踪|(zhì)修飾酶例如是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酸內(nèi)肽酶、蛋白質(zhì)激酶或糖苷酶。
例如可以使用特異性抗體，以酶免疫檢測法檢測如此得到的本發(fā)明多肽的存在。
編碼本發(fā)明多肽的DNA或本發(fā)明的多肽可用于①合成G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的部分或全長度配體，②檢查本發(fā)明多肽的生理學活性，③制備合成的寡核苷酸探針或PCR引物，④得到編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的配體或前體蛋白質(zhì)的DNA，⑤使用重組受體蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)發(fā)展受體結(jié)合試驗系統(tǒng)，并篩選候選藥物化合物，⑥得到抗體和抗血清，⑦開發(fā)利用DNA、RNA、抗體或抗血清的診斷試劑，⑧開發(fā)例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)劑、循環(huán)功能調(diào)節(jié)劑、免疫功能調(diào)節(jié)劑、胃腸功能調(diào)節(jié)劑、代謝功能調(diào)節(jié)劑或生殖功能調(diào)節(jié)劑，⑨基因治療等。
具體地說，可使用受體結(jié)合試驗系統(tǒng)(其中使用了下文所述的重組G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)表達系統(tǒng))，將所說的DNA或多肽用于篩選人或溫血動物特異性G蛋白偶聯(lián)受體的激動劑或拮抗劑?？墒褂盟f的激動劑或拮抗劑作為預防或治療各種疾病的藥劑。
進一步談到上述應(yīng)用⑧，由于本發(fā)明多肽或其編碼DNA被例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)，循環(huán)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)或生殖系統(tǒng)中表達的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)識別為配體，因此其可用作安全和低毒性的藥物。本發(fā)明的多肽或其編碼DNA與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、循環(huán)系統(tǒng)功能、免疫功能、胃腸功能、代謝功能、生殖功能等有關(guān)，因此可用作各種疾病的治療和/或預防劑，如用于治療和/或預防各種類型的癡呆，如早老性癡呆、腦血管性癡呆、由于系譜變性退化性疾病(如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、皮克病、漢道頓氏病等)引起的癡呆、因感染性疾病(如Creutzfeldt-Jakob病等延遲性病毒感染)導致的癡呆、與內(nèi)分泌疾病、代謝性疾病或中毒(如甲狀腺功能減退、維生素B12缺乏、酒精中毒、各種藥物、金屬或有機化合物引起的中毒)有關(guān)的癡呆，由于腫瘤(如腦腫瘤)引起的癡呆以及由于創(chuàng)傷性疾病(如慢性腦膜下血腫)引起的癡呆、抑郁、活動過強性兒童綜合癥(腦過小病)、意識障礙、焦慮癥、精神分裂癥、恐怖癥、生長激素分泌紊亂(如巨人癥、肢端肥大癥等)、飲食過多癥、貪食癥、高膽固醇血癥、高甘油酯血癥、高脂血癥、高催乳素血癥、糖尿病(如糖尿病性腎病、糖尿病性神經(jīng)病、糖尿病性視網(wǎng)膜病等糖尿病并發(fā)癥)、腫瘤(如乳腺癌、淋巴細胞性白血癥、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌等)、胰腺炎、腎病(如慢性腎衰竭、腎炎等)、特納氏綜合癥、神經(jīng)官能癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、脊髓損傷、一過性腦局部缺血、肌萎縮性側(cè)索硬化、急性心肌梗塞、脊髓小腦退化、骨折、創(chuàng)傷、特應(yīng)性皮炎、骨質(zhì)疏松、哮喘、癲癇、不育癥、動脈硬化、肺氣腫、肺水腫及乳溢。其可進一步用作手術(shù)后營養(yǎng)狀態(tài)改良劑或血管加壓劑。
此外，其可用作治療或預防HIV感染或愛滋病(獲得性免疫缺陷綜合癥)的藥物。
當以本發(fā)明的多肽或其編碼DNA作為藥物組合物時，可按常規(guī)方法使用之。例如，其可以片劑(必要時加有糖衣)、膠囊劑、酏劑、微膠囊等形式口服使用，或以可注射制劑如在水或其他藥用液體中制成的無菌溶液或懸液的形式經(jīng)非口服途徑使用?？梢詫⒍嚯?、其部分肽或編碼它們的DNA與生理可接受的載體、香味劑、賦形劑、載體、抗菌劑、穩(wěn)定劑、粘結(jié)劑等，按一般制藥工業(yè)適用的方式以單位劑量形式混合，從而得到這些制劑。這些制劑中活性成分的含量定在一個特定范圍內(nèi)的適當劑量。
當使用本發(fā)明的DNA時，可以單獨使用DNA或?qū)NA插入到適當?shù)妮d體如反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體或腺病毒相關(guān)病毒載體中使用之。
可在片劑、膠囊劑等中混合的添加劑包括明膠、玉米淀粉、黃蓍膠和阿拉伯膠等粘結(jié)劑，結(jié)晶纖維素等賦形劑，玉米淀粉、明膠和海藻酸等溶脹劑，硬脂酸鎂等潤滑劑，蔗糖、乳糖和糖精等甜味劑，以及薄荷、akamono油和櫻桃等香味劑。當單位劑量形式是膠囊時，上述材料可進一步摻入油和脂等液體載體?？梢园粗扑幑I(yè)的常規(guī)方法，例如將活性成分，天然植物油如芝麻油和椰子油溶解或懸浮于載體如注射用水中，以配制注射用的無菌組合物。
注射用含水液包括生理鹽水和含有葡萄糖及D-山梨醇、D-甘露糖醇及氯化鈉等其他輔助劑的等滲溶液，并可與合適的溶解助劑如醇例如乙醇、丙二醇和聚乙二醇等多元醇，非離子表面活性劑如多乙氧基醚(TM)和HCO-50等合用。油性液體包括芝麻油和大豆油，并可與苯甲酸芐酯和苯甲醇等助溶劑合用。此外，上述材料也可與磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液等緩沖液；潔爾滅、鹽酸普魯卡因等緩解劑；人血清白蛋白、聚乙二醇等穩(wěn)定劑；苯甲醇、苯酚等防腐劑，及抗氧化劑等配制在一起。一般是將如此制備的可注射液體充入適當?shù)陌财恐小Ｒ驗槿绱说玫降闹苿┦前踩偷投拘缘?，所以可用于人或小鼠、大鼠、豚鼠、兔、雞、羊、豬、牛、貓、狗、猴、狒狒、黑猩猩等溫血哺乳動物。
對于一個成年肺氣腫的病人(體重60kg)，根據(jù)病情不同，所說的多肽、其部分肽或其編碼DNA的口服給藥劑量一般為每天約0.1-100mg，較好1.0-50mg，更好約1.0-20mg。在非口服給藥中，最好以可注射制劑的形式給予多肽、其部分肽或其編碼DNA，對于成年肺氣腫病人(體重60kg)，依據(jù)給藥主體、靶器官、癥狀、給藥方法的不同，一般每天靜脈內(nèi)注射約0.01-30mg，較好約0.1-20mg，更好約0.1-10mg。對于其他種動物，則可給予按60kg體重換算出的相應(yīng)劑量。
本發(fā)明多肽的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)可以是任何蛋白質(zhì)，條件是其為衍生于人或溫血動物(如兔、綿羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、牛、馬、豬等溫血哺乳動物)、鳥類(如家禽、鴿、鴨、鵝、鵪鶉)的組織(如垂體、胰、腦、腎、肝、性腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、腎上腺、皮膚、肌肉、肺、消化道、血管、心臟)或細胞，并含有由SEQ ID No3代表之氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)。因此，作為G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)，不僅有含有SEQ ID No3所代表之氨基酸序列的蛋白質(zhì)，而且還包括含有與SEQ ID No3所代表之氨基酸序列具有約90-99.9％同源性的氨基酸序列、并與含有SEQ ID No3所限定之氨基酸序列的蛋白質(zhì)有性質(zhì)上實質(zhì)等同的活性的蛋白質(zhì)，等等。
這些蛋白質(zhì)所表現(xiàn)的活性包括配體結(jié)合活性、信號轉(zhuǎn)導等。術(shù)語“實質(zhì)上等同”是指在配體結(jié)合或其他活性方面性質(zhì)上是等價的。因此，在配體結(jié)合活性強度和受體蛋白的分子量等定量因素上可能是有所變化的。
此外，G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)包括其中N末端Met被保護基團(如甲?；蛞阴５菴1-6?；?保護的蛋白質(zhì)、體內(nèi)裂解N末端的Gln并且所說的Gln被轉(zhuǎn)化成焦谷氨酸殘基所得到的蛋白質(zhì)，其中分子內(nèi)氨基酸的側(cè)鏈被適當?shù)谋Ｗo基團(如甲?；蛞阴５菴1-6?；鶊F)保護的蛋白質(zhì)，以及與糖鏈結(jié)合所得到的稱為糖蛋白的結(jié)合蛋白質(zhì)。
G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的鹽可以是上文對多肽述及的那些鹽。
可以用已知的蛋白質(zhì)純化方法從人或溫血動物組織或細胞中制得G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽，或由之衍生的部分肽。也可按上述包括培養(yǎng)帶有編碼該多肽之DNA的轉(zhuǎn)化體的同樣方法生產(chǎn)之。另外，可以按上述肽合成方法生產(chǎn)之。
關(guān)于由G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)衍生的上述部分肽，例如可使用暴露于細胞膜外的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的外表面區(qū)域。因此，其為含有在親水性分析中確定為細胞外區(qū)域(親水性位點)之G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)部分的肽。也可使用含有疏水位點部分的肽。可以使用各含一個這樣的區(qū)域的肽以及包括多個這樣的區(qū)域的肽。
作為衍生于G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的片段肽的鹽，可使用上述配體多肽的同樣類型的鹽。
編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA可以是任何DNA，條件是它包括編碼含有SEQ ID No3代表之氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的核苷酸序列。其可以是基因組DNA、基因組DNA庫、組織或細胞衍生的cDNA、組織或細胞衍生的cDNA庫、或合成DNA。用于文庫構(gòu)建的載體可以是噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒等。也可以按照已知的RT-PCR技術(shù)，使用由組織或細胞制備的RNA部分直接進行擴增。
具體地說，例如使用包括由SEQ ID No4代表的核苷酸序列的DNA作為編碼含有SEQ ID No3限定之氨基酸序列的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA。
以下舉例說明本發(fā)明的多肽、編碼所說多肽的DNA及抗該多肽的抗體的應(yīng)用(1)作為治療或預防配體多肽缺乏癥的藥物根據(jù)本發(fā)明的多肽具有的與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)有關(guān)的活性，也可使用編碼本發(fā)明多肽的DNA作為配體多肽或G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)缺乏癥的預防或治療劑。
因此，對于本發(fā)明多肽或G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)體內(nèi)水平降低的病人，預計很難有其配體的充分表達的生理活性(中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)活性、循環(huán)功能調(diào)節(jié)活性、免疫功能調(diào)節(jié)活性、胃腸功能調(diào)節(jié)活性、代謝功能調(diào)節(jié)活性、生殖功能調(diào)節(jié)活性等)，故有可能通過(1)施用編碼本發(fā)明之多肽的DNA，或(2)將編碼本發(fā)明多肽的DNA插入到例如腦細胞中，從而引起其表達并在其后將腦細胞植入病人體內(nèi)，以增加所說病人的腦細胞中配體多肽的水平，使配體多肽的所說的活性表達到足夠程度。因此，可使用編碼本發(fā)明多肽的DNA作為預防或治療配體多肽缺乏綜合癥的安全而低毒性的藥劑。
在使用上述DNA作為這樣一種治療劑時，可以利用上述對本發(fā)明的多肽或部分肽的編碼DNA作為藥物提及的同樣方法，所說的DNA可以單獨使用，或者也可將其插入到例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體或腺病毒伴隨病毒載體中使用。
(2)檢測針對配體多肽的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)本發(fā)明的多肽能夠與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)或其鹽，或由之衍生的部分肽或其鹽結(jié)合，因此可以良好的靈敏性用于檢測體內(nèi)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)或其鹽，或由之衍生的片段肽或其鹽的水平。
該檢測方法可以例如與競爭性結(jié)合技術(shù)合用。因此，可以使試驗樣品與本發(fā)明的多肽接觸，以確定試驗樣品中，G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)或其鹽，或由之衍生的部分肽或其鹽的濃度。特別是可以按照下列文獻①或②中描述的已知方法或其改良方法進行檢測。①Hiroshi Irie(ed.)＂Radioimmunoassay＂(Kodansha出版，1974)；②Hiroshi Irie(ed.)＂Radioimmunoassay，A Sequel＂(Kodansha出版，1979)。
(3)篩選能夠改變G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)與本發(fā)明的多肽，其酰胺或其酯或其鹽(以下有時簡稱為配體或配體多肽)之間的結(jié)合的化合物可以使用G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)或其鹽，或由之衍生的部分肽或其鹽，或通過構(gòu)建重組受體蛋白質(zhì)(APJ)表達系統(tǒng)并使用受體結(jié)合試驗系統(tǒng)(其中使用所說的表達系統(tǒng))，篩選能夠改變配體多肽與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)、包括其鹽結(jié)合的化合物(如肽、蛋白質(zhì)、非肽化合物、合成的化合物、發(fā)酵產(chǎn)物等)。這樣的化合物包括能夠通過G蛋白偶聯(lián)受體(APJ)表現(xiàn)細胞刺激活性(例如對花生四烯酸釋放、乙酰膽堿釋放、細胞內(nèi)Ca2+釋放、細胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生、細胞內(nèi)cGMP產(chǎn)生、肌醇磷酸產(chǎn)生、細胞膜電勢改變、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化、c-fos活化、pH抑制的促進劑或抑制劑作用)的化合物(即G蛋白偶聯(lián)受體激動劑)，以及沒有細胞刺激活性的化合物(即G蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑)。術(shù)語“能夠改變與配體的結(jié)合”包括抑制與配體的結(jié)合和促進與配體的結(jié)合兩種情況。
因此，本發(fā)明提供一種篩選能夠改變本發(fā)明的多肽與上述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的結(jié)合的化合物或其鹽的方法，其包括，一方面(ⅰ)使本發(fā)明的配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)或其鹽，或由之衍生的部分肽或其鹽接觸，另一方面(ⅱ)使本發(fā)明的多肽和試驗化合物與上述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)或其鹽，或由之衍生的部分肽或其鹽接觸，并將(ⅰ)和(ⅱ)兩種情況下的結(jié)合相比較。
在本發(fā)明的篩選方法中，(ⅰ)使本發(fā)明的多肽與上述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)或由之衍生的的部分肽接觸，并且(ⅱ)使本發(fā)明的多肽和試驗化合物與上述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)或由之衍生的部分肽接觸，并在(ⅰ)或(ⅱ)的情況下檢測配體與所說的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)或由之衍生的部分肽的結(jié)合水平，或任何所說的細胞刺激活性，并在兩者間進行比較。
篩選方法具體地包括①篩選能夠改變本發(fā)明的多肽與上述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)之結(jié)合的化合物或其鹽的方法，其包括一方面使標記形式的本發(fā)明的多肽與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)或其鹽，或由之衍生的部分肽或其鹽接觸，并且另一方面使標記的本發(fā)明的多肽和試驗化合物與上述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)或其鹽，或由之衍生的部分肽或其鹽接觸，在兩種情況下檢測標記的本發(fā)明的多肽與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)或其鹽，或由之衍生的部分肽或其鹽的結(jié)合水平，并在兩者間進行比較；②篩選能夠改變本發(fā)明的多肽與含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)之結(jié)合的化合物或其鹽的方法，其包括一方面使標記形式的本發(fā)明的多肽與含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的細胞或所說細胞的膜部分接觸，并且另一方面使標記的本發(fā)明的多肽和試驗化合物與含這樣的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的細胞或膜部分接觸，在兩種情況下檢測標記的本發(fā)明的多肽與所說的細胞或膜部分的結(jié)合，并在兩者間進行比較；③篩選能夠改變本發(fā)明的多肽與上述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)之結(jié)合的化合物或其鹽的方法，其包括一方面使標記形式的本發(fā)明的多肽與培養(yǎng)攜帶有編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)之DNA的轉(zhuǎn)化體時于細胞膜上表達的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)接觸，并且另一方面使標記的本發(fā)明的多肽和試驗化合物與培養(yǎng)攜帶有編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)之DNA的轉(zhuǎn)化體時于細胞膜上表達的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)接觸，在兩種情況下檢測標記的本發(fā)明的多肽與所說的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的結(jié)合，并在兩者間進行比較。④篩選能夠改變本發(fā)明的多肽與上述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)之結(jié)合的化合物或其鹽的方法，其包括一方面使能夠活化G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的化合物(如本發(fā)明的多肽)與含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的細胞接觸，另一方面使能夠活化G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的化合物和試驗化合物與這樣的含G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的細胞接觸，在兩種情況下檢測G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)介導的細胞刺激活性(例如對花生四烯酸釋放、乙酰膽堿釋放、細胞內(nèi)Ca2+釋放、細胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生、細胞內(nèi)cGMP產(chǎn)生、肌醇磷酸產(chǎn)生、細胞膜電勢改變、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化、c-fos活化、pH抑制的促進劑和抑制劑作用)，并在兩者間進行比較；⑤篩選能夠改變本發(fā)明的多肽與上述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)之結(jié)合的化合物或其鹽的方法，其包括一方面使能夠活化G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的化合物(例如本發(fā)明的多肽)與培養(yǎng)含有編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)之DNA的轉(zhuǎn)化體時在細胞膜上表達的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)接觸，另一方面使能夠活化G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的化合物和試驗化合物與培養(yǎng)含有編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之DNA的轉(zhuǎn)化體時在細胞膜上表達的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)接觸，在兩種情況下檢測G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)介導的細胞刺激活性(例如對花生四烯酸釋放、乙酰膽堿釋放、細胞內(nèi)Ca2+釋放、細胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生、細胞內(nèi)cGMP產(chǎn)生、肌醇磷酸產(chǎn)生、細胞膜電勢改變、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化作用、c-fos活化、pH抑制的促進劑和抑制劑作用)，并在兩者間進行比較；等等。
對本發(fā)明篩選方法的特別舉例說明如下。
首先，將用于本發(fā)明的篩選方法中的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)可以是任何來源的，條件是它含有上述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或由之衍生的部分肽。人或溫血動物器官衍生的膜部分是適用的。然而，由于人器官的材料很難得到，所以最好使用由重組體以高水平表達產(chǎn)生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)。
例如，可用上述方法生產(chǎn)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)。
在實現(xiàn)本發(fā)明的篩選方法時，如果使用含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細胞或所說細胞的膜部分，可參照下述制備步驟。
當使用含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細胞時，可按照已知方法用戊二醛、福爾馬林等固定細胞。
含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細胞是在其中表達G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的宿主細胞。所說的宿主細胞可以是前述的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等。
膜部分是經(jīng)破碎細胞后按照已知技術(shù)制得的富含細胞膜的部分。破壞細胞的方法可以是使用Potter Elvehjem型勻漿器壓擠細胞、使用Waring Blendor或Polytron(Kinematica)破碎細胞、用超聲波破碎細胞，以及用French Press通過狹小噴嘴施加壓力(進行噴壓)以破壞細胞。為分級分離細胞膜部分，例如可使用分級離心或密度梯度離心法靠離心力分離之。例如，以低轉(zhuǎn)速(500rpm至3，000rpm)短時間(一般約1-10分鐘)離心上清液分離細胞裂解混合物，然后以高速度(15，000rpm至30，000rpm)離心上清液30分鐘至2小時，得到的沉淀作為膜部分。表達的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)及其他膜成分，如細胞衍生的磷脂和膜蛋白均富集在所說的膜部分中。
含G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細胞或膜部分中G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的含量優(yōu)選為每細胞103-108個分子，更好為每細胞105-107個分子。當表達水平高時，膜部分就具有高的配體結(jié)合活性(比活性)，因此不僅有可能構(gòu)建成一個高敏感性的篩選系統(tǒng)，而且還可使用同一批號制劑檢測大量樣品。
在實踐篩選能夠改變本發(fā)明的多肽與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之結(jié)合的化合物的上述①至③的方法中，使用適當?shù)腉蛋白偶聯(lián)受體部分和標記形式的本發(fā)明的多肽。理想的G蛋白偶聯(lián)受體部分是天然G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)、活性上等同于所說的天然部分的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)等。術(shù)語“活性上等同的”是指在例如配體結(jié)合活性上是等同的。標記的配體另外還包括標記的配體類似物等。例如，可使用[3H]、[125I]、 [14C]或[35S]標記的配體。
具體地說，在篩選能夠改變本發(fā)明的多肽與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之結(jié)合的化合物中，首先將含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的細胞或所說細胞的膜部分懸浮于適于篩選的緩沖液中，以制備受體標準品。緩沖液可以是不能抑制配體-受體結(jié)合并且pH為4-10(較好6-8)的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液或任何其他緩沖液。為了減少非特異性結(jié)合，可以向緩沖液中加入CHAPS、TWEEN-80TM(Kao-Atlas)、毛地黃皂苷或脫氧膽酸等表面活性劑。為了防止受體或本發(fā)明的多肽被蛋白酶分解，可進一步加入PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(Peptide Insbitute)或胃酶抑制劑等蛋白酶抑制劑。向0.01ml至10ml所說的受體溶液中加入預定量(5，000cpm至500，000cpm)的標記的本發(fā)明多肽，同時使其中共存有10-4-10-1μm的試驗化合物。為了確定非特異性結(jié)合(NSB)，還制備加有大大過量的未標記的本發(fā)明多肽的反應(yīng)管。反應(yīng)在0℃至50℃，較好在4℃至37℃下進行20分鐘至24小時，較好進行30分鐘至3小時。反應(yīng)后，通過玻璃纖維濾紙等過濾各反應(yīng)混合物，并用適當量的同樣緩沖液洗滌，然后使用液閃計數(shù)器或γ計數(shù)器檢測玻璃纖維濾膜上的放射活性。當將沒有任何拮抗物質(zhì)情況下測得的計數(shù)(Bo)減去非特異性結(jié)合，即計數(shù)(Bo-NSB)取作100％時，則顯示特異性結(jié)合(B-NSB)不超過例如計數(shù)(Bo-NSB)之50％的試驗化合物即可被選作可能具有拮抗或抑制活性的候選物質(zhì)。
在實施上述篩選能夠改變本發(fā)明的多肽與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)之結(jié)合的化合物的方法④或⑤中，可以使用已知方法或市售檢測試劑盒檢測G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)介導的細胞刺激活性(例如對花生四烯酸釋放、乙酰膽堿釋放、細胞內(nèi)Ca2+釋放、細胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生、細胞內(nèi)cGMP產(chǎn)生、肌醇磷酸產(chǎn)生、細胞膜電位改變、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化、c-fos活化、pH抑制的促進劑或抑制劑作用)。具體地說，首先在多孔平板等上培養(yǎng)含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細胞。進行篩選前，更換新鮮培養(yǎng)基或?qū)毎达@示毒性的適當?shù)木彌_液。然后加入試驗化合物時，培養(yǎng)預定時間后，提取細胞并回收上清液，并用相應(yīng)方法檢測所產(chǎn)生的產(chǎn)物。如果由于細胞中含有分解酶，而難以利用某種物質(zhì)(如花生四烯酸)的形成作為檢測細胞刺激活性的指征，則可預先加入抗所說的分解酶的抑制劑，并在抑制劑存在下完成檢測。至于cAMP產(chǎn)生的抑制活性等，可根據(jù)對細胞的cAMP產(chǎn)生抑制活性來檢測所說的活性(所說的細胞中已用毛喉素增加了基礎(chǔ)產(chǎn)生量)。
為了基于檢測細胞刺激活性來進行篩選，需要有其中表達了G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的適當細胞。根據(jù)本發(fā)明使用的其中有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)表達的細胞，最好是上述重組G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)表達細胞系的細胞。
作為試驗化合物，例如可以是肽、蛋白質(zhì)、非肽類化合物、合成的化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細胞提取物、植物提取物、動物組織提取物等。這些化合物可以是新的化合物或已知化合物。
篩選能夠改變本發(fā)明的多肽與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之結(jié)合的化合物或其鹽的試劑盒，包括G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)或其鹽、由G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)衍生的部分肽或其鹽、含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細胞、含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之細胞的膜部分，以及本發(fā)明的多肽。
作為本發(fā)明的篩選試劑盒的實例，可描述如下1．篩選試劑①檢測緩沖液和洗滌緩沖液添加0.05％牛血清白蛋白(Sigma)的Hank＇s平衡鹽溶液。該溶液通過0.45μm孔徑的濾器過濾除菌并于4℃儲存。其可于用前臨時制備。
②G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)標準品將其中有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)表達的CHO細胞傳代培養(yǎng)在12孔平板上(5x105細胞/孔)，在37℃和5％CO2+95％空氣條件下培養(yǎng)2天。
③標記的配體用[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等標記配體。將其溶解于適當?shù)娜軇┗蚓彌_液中并于4℃或-20℃下儲存，使用時臨時用檢測緩沖液稀釋到1μM。
④標準配體溶液將本發(fā)明的多肽溶解于含有0.1％牛血清白蛋白(Sigma)的PBS中，達到1mM濃度并于-20℃保存。2．檢測方法①用兩份1ml檢測緩沖液洗滌培養(yǎng)于12孔組織培養(yǎng)板上的表達G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細胞，然后向各孔內(nèi)加入490μl檢測緩沖液。
②加入5μl 10-3-10-10M試驗化合物溶液，然后加入5μl標記形式的本發(fā)明的多肽，并使反應(yīng)于室溫下進行1小時。為了確定非特異性結(jié)合，加入5μl 10-3M配體溶液以代替試驗化合物。
③除去反應(yīng)溶液并用3份1ml等分的洗滌緩沖液洗各孔。使用0.2NNaOH-1％SDS溶解細胞結(jié)合的標記的配體，并將溶液與4ml液體閃爍液A(Wako Pure Chemical Industries)混合。
④使用液體閃爍計數(shù)器(Beckman)檢測放射活性，并按如下公式以最大結(jié)合百分數(shù)(PMB)表示檢測結(jié)果。
PMB=[(B-NSB)/(Bo-NSB)]×100其中PMB最大結(jié)合百分數(shù)；B加試驗化合物時測得的數(shù)值；NSB非特異性結(jié)合；Bo最大結(jié)合。
使用本發(fā)明的篩選方法或篩選試劑盒得到的化合物(包括其鹽)是能夠改變(抑制或促進)本發(fā)明的多肽與G蛋白偶聯(lián)受體(APJ)之結(jié)合的化合物，更具體地說，是顯示有G蛋白偶聯(lián)受體介導之細胞刺激活性的化合物或其鹽(所謂G蛋白偶聯(lián)受體激動劑)，或是沒有這樣的細胞刺激活性的化合物或其鹽(所謂G蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑)。作為所說的化合物，可提到的有肽、蛋白質(zhì)、非肽類化合物、合成的化合物、發(fā)酵產(chǎn)物化合物等。這些化合物可以是新的或是已知的。
就所研究的化合物是否可判定為上述G蛋白偶聯(lián)受體激動劑或拮抗劑而言，可概括為下述(ⅰ)或(ⅱ)兩種情況。(ⅰ)在完成上文①至③中指出的結(jié)合試驗，以得到能夠改變(特別是抑制)本發(fā)明的多肽與G蛋白偶聯(lián)受體之結(jié)合的化合物后，就其是否具有所說的G蛋白偶聯(lián)受體介導的細胞刺激活性檢驗所說的化合物。具有這樣的細胞刺激活性的化合物或其鹽即為G蛋白偶聯(lián)受體激動劑，而沒有這樣活性的化合物或其鹽則是G蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑。(ⅱ)(a)使試驗化合物與含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細胞接觸，并檢測上述G蛋白偶聯(lián)受體介導的細胞刺激活性。具有這樣的細胞刺激活性的化合物或其鹽就是G蛋白偶聯(lián)受體激動劑。
(b)使能夠活化G蛋白偶聯(lián)受體的化合物(如本發(fā)明的多肽或G蛋白偶聯(lián)受體激動劑)與含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細胞接觸。另一方面，使能夠活化G蛋白偶聯(lián)受體的化合物和試驗化合物與含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細胞接觸。在兩種情況下，檢測G蛋白偶聯(lián)受體介導的細胞刺激活性水平，并彼此比較。降低能夠活化G蛋白偶聯(lián)受體之化合物的細胞刺激活性的化合物或其鹽即為G蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑。
所說的G蛋白偶聯(lián)受體激動劑對G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)來說具有如本發(fā)明的多肽一樣的生理活性，因此其可以如本發(fā)明的多肽一樣的方式被用作安全而低毒性的藥物。
相反，G蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑則抑制本發(fā)明的多肽所具有的針對G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的生理學活性，因此其可作為抑制所說的受體活性的安全而低毒的藥物。
由于本發(fā)明的多肽參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、循環(huán)功能、免疫功能、胃腸功能、代謝功能、生殖功能等，所以可使用上述激動劑或拮抗劑作為治療或預防各種疾病的藥劑，如用于治療和/或預防各種類型的癡呆，如早老性癡呆、腦血管性癡呆、由于系譜變性退化性疾病(如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、皮克病、漢道頓氏病等)引起的癡呆、因感染性疾病(如Creutzfeldt-Jakob病等延遲性病毒感染)導致的癡呆、與內(nèi)分泌疾病、代謝性疾病或中毒(如甲狀腺功能減退、維生素B12缺乏、酒精中毒、各種藥物、金屬或有機化合物引起的中毒)有關(guān)的癡呆，由于腫瘤(如腦腫瘤)引起的癡呆，以及由于創(chuàng)傷性疾病(如慢性硬膜下血腫)引起的癡呆、抑郁、活動過強性兒童綜合癥(腦過小病)、意識障礙、焦慮癥、精神分裂癥、恐怖癥、生長激素分泌紊亂(如巨人癥、肢端肥大癥等)、飲食過多癥、貪食癥、高膽固醇血癥、高甘油酯血癥、高脂血癥、高催乳素血癥、糖尿病(如糖尿病性腎病、糖尿病性神經(jīng)病、糖尿病性視網(wǎng)膜病等糖尿病并發(fā)癥)、腫瘤(如乳腺癌、淋巴細胞性白血癥、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌等)、胰腺炎、腎病(如慢性腎衰竭、腎炎等)、特納氏綜合癥、神經(jīng)官能癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、脊髓損傷、一過性腦局部缺血、肌萎縮性側(cè)索硬化、急性心肌梗塞、脊髓小腦退化、骨折、創(chuàng)傷、特應(yīng)性皮炎、骨質(zhì)疏松、哮喘、癲癇、不育癥、動脈硬化、肺氣腫、肺水腫及乳溢。其可進一步用作安眠藥、鎮(zhèn)靜劑、手術(shù)后營養(yǎng)狀態(tài)改良劑、血管加壓劑、降血壓劑等。
此外，其可用作治療或預防HIV感染或愛滋病(獲得性免疫缺陷綜合癥)的藥物。
使用上述篩選方法或篩選試劑盒得到的適用的化合物的鹽例如是藥學上可接受的鹽。作為實例，可提到的有與無機或有機堿形式的鹽、與無機或有機酸形成的鹽，以及與堿性或酸性氨基酸形成的鹽。
與無機堿形成的鹽的例子有，堿金屬鹽如鈉鹽和鉀鹽，堿土金屬鹽如鈣鹽和鎂鹽，鋁鹽和銨鹽。
與有機堿形成的鹽的例子有與三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2，6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、環(huán)己胺、二環(huán)己胺、N，N’-二芐基乙基二胺等形成的鹽。
與無機酸形成的鹽的例子有，與鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸等形成的鹽。
與無機酸形成的鹽的例子有，與鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸等形成的鹽。
與有機酸形成的鹽的例子有，與甲酸、乙酸、丙酸、富馬酸、草酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲磺酸、苯磺酸、苯甲酸等形成的鹽。
與堿性氨基酸形成的鹽的例子有，與精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸等形成的鹽。與酸性氨基酸形成的鹽的例子有，與天冬氨酸、谷氨酸等形成的鹽。
使用本發(fā)明的篩選方法或篩選試劑盒得到的化合物或其鹽，可以如本發(fā)明的多肽一樣作為用于上述治療和預防目的藥物。
(5)制造抗本發(fā)明多肽的抗體或抗血清可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的抗體或抗血清制造方法或其相似方法，使用本發(fā)明的多肽作為抗原制造抗本發(fā)明多肽的抗體，如多克隆抗體、單克隆抗體和抗血清。
例如，可使用下述方法制造多克隆抗體。[多克隆抗體的制備]可以按照已知方法或其改良方法制備抗本發(fā)明的受體蛋白質(zhì)等的多克隆抗體。例如，制備免疫原(針對受體蛋白質(zhì)等的抗原)本身或其與載體蛋白質(zhì)形成的復合物，并按照生產(chǎn)單克隆抗體的同樣方法免疫哺乳動物。從被免疫動物體內(nèi)回收含有抗本發(fā)明受體蛋白質(zhì)之抗體的材料，并分離和純化抗體。
關(guān)于用于免疫哺乳動物的免疫原與載體蛋白質(zhì)的復合物，就有效地產(chǎn)生抗半抗原(其在載體上交聯(lián)并用于免疫)的抗體而言，可使用任何載體蛋白質(zhì)和載體與半抗原的任何混合比例。例如，可以按大約0.1至20份，較好大約1至5份對1份半抗原的重量比，使牛血清白蛋白、牛環(huán)狀球蛋白(Cycloglobulin)、匙孔血蘭蛋白等偶聯(lián)到半抗原上。
此外，可使用各種縮合劑進行半抗原與載體的偶聯(lián)。例如，縮合劑可以是戊二醛、碳化二亞胺、順丁烯二酰亞胺活化的酯、含有巰基或二硫吡啶基的活化的酯試劑等。
將縮合產(chǎn)物或連同適當?shù)妮d體或稀釋劑一起施用于允許抗體產(chǎn)生的哺乳動物某部位。為了提高抗體產(chǎn)生率，可施用完全或不完全弗氏佐劑。一般情況下，每2-6周施用一次該蛋白質(zhì)等，共施用約3至10次。
從按上述方法免疫的動物的血液、腹水等中，最好從血液中回收多克隆抗體。
可以按照檢測雜交瘤培養(yǎng)物上清的同樣方法檢測抗血清中多克隆抗體的滴度?？砂凑杖鐔慰寺】贵w部分制備免疫球蛋白的方法分離和純化抗體。
可按下述方法生產(chǎn)單克隆抗體。[單克隆抗體的制備](a)制備單克隆抗體產(chǎn)生細胞。
在可能于施用藥后產(chǎn)生抗體的部位，將本發(fā)明的多肽單獨或連同載體或稀釋劑施用于溫血動物。為了增加抗體產(chǎn)生，可施用完全或不完全弗氏佐劑。通常每2-6周給藥一次，共施用2-10次。可利用的溫血動物包括猴、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、綿羊、山羊和雞，并且最好是小鼠和大鼠。
在制備產(chǎn)生單克隆抗體的細胞時，從用抗原免疫的溫血動物(如小鼠)中選擇記錄到抗體滴度的動物，于末次免疫后2-5天收集脾臟和淋巴結(jié)，將其中所含有的抗體生產(chǎn)細胞與骨髓瘤細胞融合，以得到產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。例如可使標記的配體多肽或標記的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(下文中將提到)與抗血清反應(yīng)，然后檢測標記劑與抗體的結(jié)合活性，從而完成對抗血清中抗體滴度的測定。例如可按照Koehler和Milstein(自然256，495，1975)的方法完成融合操作。融合加速劑包括聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒等，但最好使用PEG。
骨髓瘤細胞包括NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等，其中最好是使用P3U1。所使用的抗體產(chǎn)生細胞(脾細胞)數(shù)目對骨髓瘤細胞的優(yōu)選融合比例為約1∶1至20∶1。當以大約10-80％的濃度加入PEG(最好是PEG1000至PEG6000)，于20-40℃(最好30-37℃)下保溫1-10分鐘時，可完成有效的細胞融合。
可用各種方法篩選能產(chǎn)生抗G蛋白偶聯(lián)受體抗體或抗配體多肽抗體的雜交瘤。例如，將骨髓瘤培養(yǎng)物的上清液加到已直接或通過載體吸附了配體多肽抗原或G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)抗原的固相(如微量板)上，然后向其中加入用放射活性物質(zhì)、酶等標記的抗免疫球蛋白抗體(當用于細胞融合的細胞是小鼠細胞時，使用抗小鼠免疫球蛋白抗體)，或蛋白A，然后檢測結(jié)合于固相上的抗配體多肽單克隆抗體或抗G蛋白偶聯(lián)受體單克隆抗體；或者將雜交瘤培養(yǎng)物的上清液加到吸附了抗免疫球蛋白或蛋白A的固相中，然后加入用放射活性物質(zhì)或酶標記的本發(fā)明的多肽，并檢測與固相結(jié)合的抗多肽單克隆抗體。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法或相似方法選擇并克隆產(chǎn)生抗多肽單克隆抗體的雜交瘤。通常在含有HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷)的動物細胞培養(yǎng)基中進行。用于選擇、克隆和細胞生長的培養(yǎng)基可以是雜交瘤能夠在其中生長的任何培養(yǎng)基。例如可以是含有1-20％(優(yōu)選10-20％)胎牛血清(FCS)的RPM11640培養(yǎng)基(Dainippon PharmaceuticalCoLtdJapan)，含有1-20％胎牛血清的GIT培養(yǎng)基(Wako PureChemical，Japan)和用于培養(yǎng)雜交瘤的無血清培養(yǎng)基(SFM-101；NissuiSeiyaku，Japan)。培養(yǎng)溫度通常為20-40℃，最好約37℃。培養(yǎng)時間通常為5天到3周，最好為1-2周。培養(yǎng)通常是在5％二氧化碳氣體中完成?？墒褂蒙鲜鰴z測抗血清中抗多肽抗體滴度的同樣方法檢測雜交瘤培養(yǎng)物上清液的抗體滴度。
(b)純化單克隆抗體。
同分離/純化常規(guī)單克隆抗體一樣，可使用鹽析、乙醇沉淀、等電沉淀、電泳、使用離子交換劑如DEAE吸附/解吸附、超濾、凝膠過濾、特異性純化法(其中用活性吸附劑如抗原結(jié)合固相、蛋白A或蛋白G處理以只收集抗體，解離鍵后得到抗體)等分離/純化免疫球蛋白的方法，分離/純化抗多肽單克隆抗體。
用上述方法(a)或(b)制造的多肽抗體能夠特異性地識別多肽，因此其可用于定量檢測液體試驗樣品中的多肽，特別是用于夾心免疫檢測法進行定量檢測。
因此，本發(fā)明提供例如下列方法(ⅰ)定量檢測液體試驗樣品中的本發(fā)明的多肽，其包括(a)使液體試驗樣品和標記的本發(fā)明多肽與抗體(其可與配體多肽或G蛋白偶聯(lián)受體反應(yīng))競爭性反應(yīng)，并且(b)檢測與所說抗體結(jié)合的標記的本發(fā)明多肽的比例。(ⅱ)定量檢測液體試驗樣品中本發(fā)明的多肽，其包括(a)使液體試驗樣品與固定于不溶性載體上的抗體和標記的抗體同時或相繼反應(yīng)，并且(b)檢測不溶性載體上標記劑的活性，其中一種抗體能夠識別本發(fā)明之多肽的N末端區(qū)域，而另一種抗體能夠識別本發(fā)明之多肽的C末端區(qū)域。
當使用識別本發(fā)明之多肽的本發(fā)明的單克隆抗體時，可檢測本發(fā)明的多肽并可另外借助組織染色法等檢測之。為此目的，可使用抗體分子本身，或者也可使用抗體分子的F(ab＇)2＇，F(xiàn)ab＇或Fab部分。對使用本發(fā)明的抗體的檢測方法沒有特殊限制，任何檢測方法均可使用，只要該方法是通過化學或物理手段檢測，然后使用含有已知量抗原的標準溶液制備的標準曲線計算待檢液體樣品中抗原、抗體或依賴于或相對于抗原量(如本發(fā)明的多肽量)的抗體-抗原復合物量即可。例如，可使用濁度法、競爭法、免疫檢測法和夾心法，但從敏感性和特異性上看，特別優(yōu)選的是下文將描述的夾心法。
在使用標記物質(zhì)的檢測方法中，所使用的標記劑可以是放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、膠體、磁性物質(zhì)等。放射性同位素的例子包括[125I]、[131I]、[3H]和[14C]；優(yōu)選的酶是穩(wěn)定的并且有大的比活性的酶，如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶；熒光物質(zhì)的例子包括熒光胺、異硫氰酸熒光素等；發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、硝酸雙-N-甲基吖啶等。此外，生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)也可用于抗體或抗原與標記劑的結(jié)合。
在固定抗原或抗體中，可使用物理吸附或通常用來固定或固相化處理蛋白質(zhì)或酶的化學結(jié)合方法。載體可以是瓊脂糖、葡聚糖和纖維素等不溶性多糖；聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等合成樹脂，以及硅氧烷、玻璃等。
在夾心(或雙位點)法中，使試驗液體與固定化的抗多肽抗體反應(yīng)(第一反應(yīng))，然后與標記的抗多肽抗體反應(yīng)(第二反應(yīng))，并檢測不溶性載體上標記劑的活性，從而確定試驗液體中本發(fā)明受體多肽的量。第一和第二反應(yīng)可以反過來進行，或同時進行或間隔進行。標記劑和固定化方法可以是與上述相同的方法。在借助夾心法進行的免疫檢測中，用于標記的抗體和用于固相化的抗體并不一定是一種類型或一種，但為了改善檢測敏感性，也可使用二種或多種抗體的混合物。
在以本發(fā)明的夾心法檢測本發(fā)明的多肽時，用于第一和第二反應(yīng)的優(yōu)選抗多肽抗體是其中與本發(fā)明的多肽結(jié)合的位點彼此不同的抗體。因此，用于第一和第二反應(yīng)的抗體是這樣的抗體，即其中當用于第二反應(yīng)的抗體識別本發(fā)明之多肽的C末端區(qū)域時，則在第一反應(yīng)中最好使用識別C末端區(qū)域以外之位點，如識別N末端區(qū)域的抗體。
本發(fā)明的抗多肽抗體也可用于夾心法以外的其他檢測系統(tǒng)中，如用于競爭法、免疫測定法及濁度法中。在競爭法中，使試驗溶液中的抗原和標記的抗原以競爭方式與抗體反應(yīng)，然后分離未反應(yīng)的標記抗原(F)和與抗體結(jié)合的標記抗原(B)(即B/F分離)，并檢測標記的B和F的量，從而確定試驗溶液中抗原的量。就這一反應(yīng)的方法來說，可有液相法和固相法。液相法中以可溶性抗體作為抗體并使用聚乙二醇、抗上述抗體的第二抗體等進行B/F分離，固相法中以固相化抗體作為第一抗體，或以可溶性抗體作為第一抗體，而以固相化抗體作為第二抗體。
在免疫測定法中，使試驗溶液中的抗原和固相化抗原與一定量標記的抗體競爭反應(yīng)，然后分離出液相和固相；或者使試驗溶液中的抗原和過量標記抗體反應(yīng)，然后加入固定化的抗原以用固相結(jié)合未反應(yīng)的標記的抗體，并分離出固相和液相。此后，檢測任何相的標記量并確定試驗溶液中的抗原量。
在濁度法中，檢測凝膠中或溶液中由抗原-抗體反應(yīng)所產(chǎn)生的不溶性沉淀物的量。即使試驗溶液中的抗原量很小并且只得到很小量的沉降物，也可使用其中利用激光散射的激光濁度檢測法。
在將各種免疫學檢測方法用于本發(fā)明的檢測法中，不必設(shè)定任何特殊條件及其操作等。可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員認定的常規(guī)條件和操作方法建立本發(fā)明多肽的檢測系統(tǒng)。有關(guān)常規(guī)技術(shù)手段，可參見多種綜述、教科書等。例如Hiroshi Irie(ed)＂放射免疫測定＂(Kodansha，Japan，1974)；Horoshi Irie(ed)＂放射免疫測定；第二部分＂)Kodansha，Japan，1979)；Eiji Ishikawa等人(ed)＂酶免疫測定＂(Igaku Shoin，Japan，1978)；Eiji Ishikawa等人(ed)s＂酶免疫測定＂(第二版)(IgakuShoin，Japan，1982)；Eiji Ishikawa等(編)“酶免疫測定”(第三版)(Igaku Shoin，Japan，1987)；“酶學方法”，70卷(免疫化學技術(shù)(A部分))；同上，73卷(免疫化學技術(shù)(B部分))；同上，74卷(免疫化學技術(shù)(C部分))；同上，84卷(免疫化學技術(shù)(D部分；篩選免疫測定))；同上，92卷(免疫化學技術(shù)(E部分單克隆抗體與一般免疫測定法))；同上，121卷(免疫化學技術(shù)(I部分雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體))(Academic Press)，等。
這樣，可使用本發(fā)明的抗多肽抗體，以高精確度確定本發(fā)明多肽的量。因此，本發(fā)明的抗體可用于多種疾病的診斷，例如癡呆、抑郁、活動過強性兒童綜合癥(腦過小病)、意識障礙、焦慮癥、精神分裂癥、恐怖癥、生長激素分泌紊亂、飲食過多癥、貪食癥、高膽固醇血癥、高甘油酯血癥、高脂血癥、高催乳素血癥、糖尿病、腫瘤、胰腺炎、腎病、特納氏綜合癥、神經(jīng)官能癥、類風溫性關(guān)節(jié)炎、脊髓損傷、一過性腦局部缺血、肌萎縮性側(cè)索硬化、急性心肌梗塞、脊髓小腦退化、骨折、創(chuàng)傷、特應(yīng)性皮炎、骨質(zhì)疏松、哮喘、癲癇、不育癥、動脈硬化、肺氣腫、肺水腫、乳溢、愛滋病等。
在本說明書和附圖中，所使用的堿基(核苷酸)、氨基酸等的縮寫是由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的或本領(lǐng)域習慣使用的。以下給出這些縮寫的例子?？赡艽嬖诠鈱W異構(gòu)體的氨基酸，除特別指出者外，均為L型。
DNA脫氧核糖核酸cDNA互補脫氧核糖核酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鳥嘌呤C胞嘧啶Y胸腺嘧啶或胞嘧啶N胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤R腺嘌呤或鳥嘌呤M胞嘧啶或腺嘌呤W胸腺嘧啶或腺嘌呤S胞嘧啶或鳥嘌呤RNA核糖核酸mRNA信使核糖核酸dATP脫氧腺苷三磷酸dTTP脫氧胸苷三磷酸dGTP脫氧鳥苷三磷酸dCTP脫氧胞苷三磷酸ATP腺苷三磷酸
EDTA乙二胺四乙酸SDS十二烷基硫酸鈉EIA酶免疫檢測法G，Gly甘氨酸(或甘氨酰)A，Ala丙氨酸(或丙氨酰)V，Val纈氨酸(或纈氨酰)L，Leu亮氨酸(或亮氨酰)I，Ile亮異氨酸(或異亮氨酰)S，Ser絲氨酸(或絲氨酰)T，Thr蘇氨酸(或蘇氨酰)C，Cys半胱氨酸(或半胱氨酰)M，Met蛋氨酸(或蛋氨酰)E，Glu谷氨酸(或谷氨酰)D，Asp天冬氨酸(或天冬氨酰)K，Lys賴氨酸(或賴氨酰)R，Arg精氨酸(或精氨酰)H，His組氨酸(或組氨酰)F，Phe苯丙氨酸(或苯丙氨酰)Y，Tyr酪氨酸(或酪氨酰)W，Trp色氨酸(或色氨酰)P，Pro脯氨酸(或脯氨酰)N，Asn天冬酰胺(或天冬酰胺酰)Q，Gln谷氨酰胺(或谷氨酰胺酰)pGlu焦谷氨酸(或焦谷氨酰)Me甲基Et乙基Bu丁基
Ph苯基TC噻唑烷基-4-(R)-甲酰胺Bom芐氧基甲基NMPN-甲基吡咯烷酮PAM苯基乙酰氨甲基本說明書中，以下列縮寫字指示常用的取代基、保護基團及試劑Tos對甲苯磺?；鵋ONBN-羥基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亞胺OcHex環(huán)己酯Bzl芐基Z芐氧基羰基Br-Z2-溴芐氧基羰基C1-Z2-氯芐氧基羰基Boc叔丁氧基羰基HOBt1-羥基苯并三唑DCCN，N＇-二環(huán)己基羰化二亞胺TFA三氟乙酸FmocN-9-芴甲氧基羰基DNP二硝基苯基Bum叔丁氧基甲基Trt三苯甲游基MeBzl4-甲基芐基本說明書序列表中列出的各個SEQ ID No是指以下序列[SEQ ID No1]是牛配體多肽的氨基酸序列(N末端開始的17個氨基酸)。
是編碼包括SEQ ID No1所代表之氨基酸序列的多肽的完整核苷酸序列。
是由G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的cDNA編碼之G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的完整氨基酸序列。
是G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)cDNA的完整核苷酸序列。
是篩選編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼小鼠配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼小鼠配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼小鼠配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼小鼠配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼小鼠配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼小鼠配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是由小鼠配體多肽的cDNA編碼的氨基酸序列。
是編碼小鼠配體多肽之cDNA的核苷酸序列。
是篩選編碼牛配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼牛配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼大鼠配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼大鼠配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼大鼠配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼大鼠配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼人配體多肽的cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼人配體多肽的cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼人配體多肽的cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼人配體多肽的cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼人配體多肽的cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼人配體多肽的cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼人配體多肽的cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼人配體多肽的cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼牛配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼牛配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼牛配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼牛配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼牛配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼牛配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是篩選編碼牛配體多肽之cDNA的合成DNA引物。
是由大鼠配體多肽的cDNA編碼的氨基酸序列。
是編碼大鼠配體多肽之cDNA的核苷酸序列。
是由人配體多肽的cDNA編碼的氨基酸序列。
是編碼人配體多肽之cDNA的核苷酸序列。
是由牛配體多肽的cDNA編碼的氨基酸序列。
是編碼牛配體多肽之cDNA的核苷酸序列。
下文實施例11中得到的，稱為JM109/pMA10L-13的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌已按照布達佩斯條約的規(guī)定，自1997年12月22日保藏于日本國際貿(mào)易和工業(yè)部，工業(yè)科學和技術(shù)局，國立生命科學與人類技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology(NIBH)，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry，Japan)。指定的保藏登記號為FERMBP-6214。
下文實施例13中得到的，稱為JM109/prSHe-1的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌已按照布達佩斯條約規(guī)定，自1998年1月20日保藏于NIBH，指定的保藏登記號為FERMBP-6228。
下文實施例14中得到的，稱為JM109/phSuN-4的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌，已按照布達佩斯條約的規(guī)定自1998年1月20日保藏于NIBH，指定的保藏登記號為FERMBP-6229。
下文實施例15得到的，稱為JM109/pBovA10prec24的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌，已按照布達佩斯條約的規(guī)定自1998年1月20日保藏于NIBH，指定的保藏登記號為FERMBP-6230。
下文實施例35得到的，稱為BL21(DE3)/pTB960-13的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌，已按照布達佩斯條約的規(guī)定自1998年12月2日保藏于NIBH，指定的保藏登記號為FERMBP-6590，并自1998年11月11日保藏于大版發(fā)酵研究所，保藏登記號為IFO16220。實施本發(fā)明的最好方式下列實施例旨在進一步詳細描述本發(fā)明，而不應(yīng)視為對本發(fā)明范圍的限定。
制備用于擴增編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之DNA的合成DNA引物相互比較各自編碼下列已知受體蛋白質(zhì)之第一跨膜區(qū)附近氨基酸序列的cDNA核苷酸序列，并找出有高度相似的片段人衍生的TRH受體蛋白質(zhì)(HTRHR)、人衍生的RANTES受體蛋白質(zhì)(L10918、HUMRANTES)、人Burkitt氏淋巴瘤衍生的未知配體的受體蛋白質(zhì)(X68149，HSBLRIA)、人衍生的促生長素抑制素受體蛋白質(zhì)(L14856，HUMSOMAT)、大鼠衍生的μ-阿片樣物質(zhì)受體蛋白質(zhì)(U02083，RNU02083)、大鼠衍生的κ-阿片樣物質(zhì)受體蛋白質(zhì)(U00442，U00442)、人衍生的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽B受體蛋白質(zhì)(M73482，HUMNMBR)、人衍生的毒覃堿能乙酰膽堿受體蛋白質(zhì)(X15266，HSHM4)、大鼠衍生的腎上腺素α1B受體蛋白質(zhì)(LO8609，RATAADRE01)、人衍生的促生長素抑制素3受體蛋白質(zhì)(M96738，HUNSSTR3X)、人衍生的C5a受體蛋白質(zhì)(HUMC5AAR)、人衍生的未知配體的受體蛋白質(zhì)(HUMRDC1A)、人衍生的未知配體的受體蛋白質(zhì)(M84605，HUMOPIODRE)以及大鼠衍生的腎上腺素α2B受體蛋白質(zhì)(M91466，RATA2BAR)。
另外，彼此比較各自編碼下列已知受體蛋白質(zhì)之第六跨膜區(qū)附近氨基酸序列的cDNA的核苷酸序列，并找出有高度相似性的片段小鼠衍生的未知配體的受體蛋白質(zhì)(M80481，MUSGIR)、人衍生的的鈴蟾肽受體蛋白質(zhì)(LO8893，HUMBOMB3S)、人衍生的腺苷A2受體蛋白質(zhì)(S46950，S46950)、小鼠衍生的未知配體的受體蛋白質(zhì)(D21061，MUSGPCR)、小鼠衍生的TRH受體蛋白質(zhì)(S43387，S43387)、大鼠衍生的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽K受體蛋白質(zhì)(J05189，RATNEURA)、大鼠衍生的腺苷A1受體蛋白質(zhì)(M69045，RATA1ARA)、人衍生的神經(jīng)激肽A受體蛋白質(zhì)(M57414，HUMNEKAR)、大鼠衍生的腺苷3A受體蛋白質(zhì)(M94152，RATADENREC)、人衍生的促生長素抑制素受體蛋白質(zhì)(M81829，HUMSRI1A)、人衍生的神經(jīng)激肽3受體蛋白質(zhì)(S86390，S86371S4)、大鼠衍生的未知配體的受體蛋白質(zhì)(X61496，RNCGPCR)、人衍生的促生長素抑制素4受體蛋白質(zhì)(L07061，HUMSSTR4Z)、和大鼠衍生的GnRH受體蛋白質(zhì)(M31670，RATGNRHA)。
上文括號中給出的代碼和縮寫字是在使用DNASIS基因/蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)基礎(chǔ)(CD019，Hitachi Software Engineering)檢索GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫后所示出的序號，并且除HTRHR(指日本Kokai Tokryo KohoH07-304797中所述的序列)外，一般分別稱為登記號和命名。
具體地說，使用編碼許多受體蛋白質(zhì)之cDNA所共有的核苷酸序列為基礎(chǔ)，并使這些序列的其余部分中有盡可能多的受體cDNA有漸增的同源性，導入混合的核苷酸。因此，合成兩個具有與共同核苷酸序列互補之序列的合成DNA，即SEQ ID No5和SEQ ID No6所限定的序列。
5＇-CGTGG(G或C)C(A或C)T(G或C)(G或C)TGGGCAAC(A，G，C或T)(C或T)CCTG-3＇(SEQ ID NO5)5＇-GT(A，G，C或T)G(A或T)(A或G)(A或G)GGCA(A，G，C或T)CCAGCAGA(G或T)GGCAAA-3＇(SEQ ID NO6)合成時，在合成的相應(yīng)步驟中混合使用括號內(nèi)給出的多個核苷酸。
使用人扁桃體衍生的cDNA，PCR擴增G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)cDNA使用人扁桃體衍生的cDNA(Quickclone，Clontech)作為模板，并使用參考實施例1中合成DNA引物，以PCR技術(shù)擴增。反應(yīng)混合物的組成如下合成DNA引物(序列5＇引物序列和3＇引物序列)各1μM，模板cDNA lng，0.25mM dNTP、Taq DNA聚合酶1μl及酶附帶的緩沖液，總反應(yīng)混合物體積為100μl。使用熱循環(huán)儀(Terkin Elmer)以30次循環(huán)進行擴增，每次擴增循環(huán)包括96℃，30秒；45℃，1分鐘和60℃，3分鐘。加入Taq DNA聚合酶之前，混合反應(yīng)混合物的其余成分并于95℃加熱5分鐘，再于65℃加熱5分鐘。經(jīng)1．2％瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色證實擴增產(chǎn)物。
PCR后，使用1份(1μl)反應(yīng)產(chǎn)物，按照TA克隆試劑盒(Invitrogen)的使用說明書將擴增的DNA亞克隆到質(zhì)粒載體pCRTMⅡ中(TM是指注冊商標)。將亞克隆產(chǎn)物導入大腸桿菌INVαF＇感受態(tài)細胞(Invitrogen)中以轉(zhuǎn)化之。在含有氨芐青霉素和X-gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上選擇有cDNA插入片段的克隆，用無菌牙簽只分離那些顯示白顏色、以指示為轉(zhuǎn)化體的克隆。得到許多轉(zhuǎn)化體。在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上將各克隆培養(yǎng)過夜，并使用自動質(zhì)粒提取器(Kurabo)制備質(zhì)粒DNA。用EcoRⅠ裂解一部分如此制備的DNA以證實cDNA插入片段的大小。另一部分DNA經(jīng)用RNA酶處理、苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀被進一步濃縮。使用脫氧終止物循環(huán)測序試劑盒(ABI)進行核苷酸測序反應(yīng)，使用自動熒光序列儀分析序列，并使用DNASIS(Hitachi System Engineering)加工所得到的核苷酸序列信息。
基于核苷酸序列分析的結(jié)果，從許多轉(zhuǎn)化體中找出一個其中插入了相當于G蛋白偶聯(lián)受體之一的APJ受體之第1至第6跨膜區(qū)的PCR產(chǎn)物cDNA的克隆，即大腸桿菌INVαF＇/pA10。
O＇Dowd，B.F.等人(Gene，Vol.136，355-360，1993)報導了相當于APJ受體基因核苷酸序列中第318至993位核苷酸之片段的核苷酸序列。然而，因為其為使用修飾的引物得到的PCR產(chǎn)物，所以其引物部分的序列不同于APJ的相應(yīng)序列，而且缺少N和C末端。
從人扁桃體衍生的cDNA庫中克隆含有受體蛋白質(zhì)之全長度編碼區(qū)的cDNA為了得到編碼全長度APJ受體的DNA，使用實施例1中得到的APJ受體cDNA片段作為探針以篩選人扁桃體衍生的cDNA庫。所使用的人扁桃體衍生的cDNA庫是其中利用λgt11噬菌體載體的Clontech cDNA庫(Clontech，CLHL30086)。將相當于2x×06pfu(噬斑形成單位)的人扁桃體cDNA庫與硫酸鎂處理的大腸桿菌Y1090-混合。37℃保溫15分鐘后，加入0.5％瓊脂糖(Pharmacia)LB，并用所得混合物接種1.5％瓊脂(WakoPure Chemical)LB平板(含有50μg/ml氨芐青霉素)。42℃培養(yǎng)過夜后，在上已形成噬斑的各平板上放一硝酸纖維素濾膜，以便將噬斑轉(zhuǎn)移到濾膜上。用堿處理該濾膜使DNA變性，然后于80℃加熱3小時以固定DNA。
在含有50％甲酰胺、4xSSPE、5xDenhardt＇s溶液、0.1％SDS和100μg/ml鮭魚精子DNA的緩沖液中，使該濾膜與下述探針于42℃保溫過夜，以進行雜交。所使用的探針是用EcoRⅠ裂解插入到實施例1中得到的質(zhì)粒pA10中的DNA片段，回收后使用隨機引物DNA標記試劑盒(Amersham)加入[32P]dCTP(duPont)標記制成的。用2xSSC+0.1％SDS于55℃洗1小時，然后于-80℃進行放射自顯影以檢測雜交噬斑。
上述篩選的結(jié)果是，4個獨立的噬菌體克隆顯示了雜交信號。用EcoRI分別消化從這四個克隆制備的DNA，瓊脂糖凝膠電泳后，使用的篩選時所用的同樣探針進行Southern印跡分析。各克隆分別得到相當于約1．2Kb、1．2Kb、1．3Kb和1．6Kb的雜交帶。選擇其中給出約1．6Kb帶的克隆(λ34)。制備λ34的噬菌體DNA，并將其有雜交大小的EcoRⅠ片段在亞克隆到質(zhì)粒pUC118的EcoRⅠ位點。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，以得到轉(zhuǎn)化體大腸桿菌JM109/pUC118-λ34。用實施例1中所述的同樣方法測定質(zhì)粒的核苷酸序列，從而發(fā)現(xiàn)所說的質(zhì)粒含有編碼全長度G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(APJ)的DNA。其所編碼的氨基酸序列與O＇DoWd，B.F.等人(基因，Vol.136，355-360，1993)報導的序列(GenBank登記號U03642)完全相同。DNA序列和氨基酸序列示于圖1中。
用Northern雜交法檢測APJ受體mRNA在人組織中的表達和分布為了在mRNA水平上檢測實施例2中得到的質(zhì)粒pUC118-λ34所編碼的APJ在人組織中的表達，進行Northern印跡分析。用于Northern印跡的濾膜是Human MTNBlot Ⅰ和Ⅱ(CL7760-1；CL7759-1)，并且所使用的探針與實施例1中使用的相同。將上述濾膜和探針在含有50％甲酰胺、5XSSPE、10XDenhardt＇s溶液、2％SDS和100μg/ml鮭魚精子DNA的緩沖液中42℃保溫過夜進行雜交。用0.1XSSC+0.1％SDS于50℃洗濾膜，風干后對X射線膠片(XAR5，Kodak)于-80℃曝光3天。結(jié)果示于圖2中。從圖2可以看出，人心臟、腦、胎盤、肝、骨骼肌、腎、胰、脾、胸腺、前列腺、卵巢、小腸和大腸中表達由pUC118-λ34編碼的受體基因。特別是在脾、心臟和胎盤中有很強的表達。
產(chǎn)生用于APJ受體表達的CHO細胞pUC118-λ34中編碼的cDNA片段具有約0.2Kb的5＇非翻譯區(qū)，因此認為有必要盡可能除去所說的部分以增加表達效率。還有必要在cDNA部分的兩末端加上相當于表達載體克隆位點的限制性酶切位點。因此，分別按下述方法處理兩cDNA片段(5＇側(cè)和3＇側(cè))并插入到動物細胞表達載體pAKKO-111H中SRα啟動子的下游位點，以構(gòu)建pAKKO-A10。這樣，在5＇非翻譯區(qū)和編碼區(qū)中各唯一存在的兩個BstⅪ位點切割pUC118-λ34，使用T4DNA聚合酶修復末端，并經(jīng)連接而加入SalⅠ接頭。經(jīng)SalⅠ-SacⅠ雙消化后，電泳分離約0.6Kb的片段并回收之。然后，經(jīng)EcoRⅠ消化在其兩末端切割插入到pUC118-λ34中的cDNA部分，使用T4DNA聚合酶修復末端，并經(jīng)連接以加入一個ClaⅠ接頭。為了與相當于5＇末端部分的片段區(qū)分開，進行EcoRⅤ消化和進一步的ClaⅠ-SacⅠ雙酶消化，并電泳回收一個約0.8Kb的片段。再者，在多克隆位點SalⅠ和ClaⅠ處消化用于動物細胞的表達載體pAKKO-111H，并電泳回收載體部分。將如上制備的APJ受體cDNA的5＇側(cè)和3＇側(cè)片段與表達載體連接在一起，并用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，以得到大腸桿菌DH5/pAKKO-A10。
培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體大腸桿菌DH5/pAKKO-A10并大量制備質(zhì)粒pAKKO-A10的DNA。
將20μg所說的質(zhì)粒DNA溶解在1ml生理鹽水(PBS)中，將溶液倒入基因轉(zhuǎn)移器(Wako Pure Chemical)瓶中并使用回旋轉(zhuǎn)混合器強烈攪拌，從而形成含有DNA的脂質(zhì)體相。用1-2X106個CHO dhfr-細胞接種直徑35mm的細胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)20小時后，更換新鮮培養(yǎng)基。將相當于0．5μgDNA的脂質(zhì)體相(25μl)滴加到各平皿中，并經(jīng)保溫16小時以導入質(zhì)粒DNA。進一步更換新鮮培養(yǎng)基后培養(yǎng)1天，然后再次換成選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天。最后，經(jīng)胰酶消化分散細胞，并以低密度接種到選擇培養(yǎng)基(無脫氧核糖核苷和核糖核苷的極限必需培養(yǎng)基，添加10％透析的胎牛血清的α培養(yǎng)基)中，進行轉(zhuǎn)化體選擇。轉(zhuǎn)化體可單獨生長于選擇培養(yǎng)基中。經(jīng)反復亞克隆重復選擇，建成細胞系DHO-A10。
在轉(zhuǎn)錄水平上證實全長度受體蛋白質(zhì)在細胞系CHO-A10中的表達使用Fast Track試劑盒(Invitrogen)，按照其使用說明書從CHO-A10細胞及CHO細胞(對照細胞)中制備poly(A)+RNA。使用0.02μg該poly(A)+RNA和RNAPCR試劑盒(Takara Shuzo)進行cDNA合成。所使用的引物是隨機9堿基序列，反應(yīng)混合物的總體積為40μl。作為cDNA合成的陰性對照，還在沒有反轉(zhuǎn)錄酶的情況下制備反應(yīng)混合物。首先，于30℃保溫10分鐘使反應(yīng)進行到引物延伸至一定程度。然后，于42℃保溫30分鐘使反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進行到足夠程度，再于99℃加熱5分鐘以失活酶，進一步將混合物于5℃冷卻5分鐘。
完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，回收一部分反應(yīng)混合物，用蒸餾水稀釋并進行苯酚/氯仿提取和乙醚提取。將經(jīng)過乙醇沉淀后得到的沉淀物溶解在預定量的蒸餾水中，并使用該溶液作為cDNA樣品。制備該cDNA溶液和質(zhì)粒DNA(pAKKO-A10)的系列稀釋液，并使用對全長度受體蛋白質(zhì)特異的引物進行PCR。基于全長度受體蛋白質(zhì)之編碼區(qū)的核苷酸序列制備的引物具有下示序列5＇-CAGACAACCAGTCTGAGTGTGAGT-3＇(SEQ ID No7)5＇-ATGGATTTCTCGTGCATCTGTTCT-3＇(SEQ ID No8)使用1μM各引物、0.5μl Taq DNA聚合酶(Takara shuzo)、酶附帶的反應(yīng)緩沖液和dNTP，以及10μl模板DNA(cDNA或質(zhì)粒溶液)，以100μl總體積進行PCR反應(yīng)。開始時，于94℃加熱處理2分鐘以使模板DNA充分變性，然后以25次循環(huán)完成反應(yīng)，每次循環(huán)包括95℃30秒，65℃30秒和72℃60秒。完成反應(yīng)后，取10μl反應(yīng)混合物進行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測擴增產(chǎn)物并對其進行定量比較。結(jié)果檢測到一個具有由編碼全長度受體蛋白質(zhì)之cDNA序列估計的大小(約1．1rb)的PCR產(chǎn)物(圖3)。在以沒有加反轉(zhuǎn)錄酶得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板的PCR反應(yīng)混合物中，沒有檢測到特異性帶；這一事實排除了所研究的產(chǎn)物是衍生于CHO細胞基因組DNA之PCR產(chǎn)物的可能性。另外，在對照細胞的泳道中沒有顯現(xiàn)特異性帶，從而證實所說的產(chǎn)物并非衍生于最初在CHO細胞中表達的mRNA(圖3)。
借助細胞傳感器檢測組織提取物中含有的活性，特別是刺激CHO-A10細胞的活性基本按下述從牛胃、豬小腸和豬腦中制備提取物，冷凍保存并用作篩選細胞刺激活性的樣品。
各組織煮沸、破壞后用0.5M乙酸提取，過濾提取物并使之吸附于精氨酸上，然后用0.2M鹽酸洗脫。鹽析收集洗脫級分中所含有的物質(zhì)，用甲醇洗并真空干燥。再次溶解于蒸餾水中，調(diào)pH至7.2后加入2倍體積乙醇，并過濾收集所得沉淀物。將此沉淀物再次溶解于蒸餾水中，調(diào)pH至4.2，去除所得沉淀并凍干濾液。將凍干粉溶解于0.2M乙酸中并在SephadexG-25分級分離柱上凝膠過濾。凍干各洗脫級分。
另外將牛下丘腦煮沸并破壞，然后用1M乙酸提取。離心提取物，并向上清中加入0.05％TFA，然后使混合物通過C18柱吸附，用10％、30％和50％乙腈逐步洗脫。將各洗出物調(diào)到20mM乙酸銨-10％乙腈(pH4.5)并上CM Sepharose陽離子交換柱(Hiprep CM Sepharose FF，Pharmacia)以便吸附。濃縮使用100mM、250mM、500mM和1000mM乙酸銨得到的洗脫級分及流出部分，使用Sep-Pak C18柱脫鹽品然后凍干。使用如此得到的凍干物作為細胞刺激活性篩選的樣品。
以細胞外pH改變作為指征，使用細胞傳感器(Molecular Devices)檢測細胞刺激活性。經(jīng)胰酶消化分散CHO-A10細胞或?qū)φ占毎?，并制備?×105細胞/ml的細胞懸液。將這些懸液以每份0.9ml分配于細胞傳感器膠囊中并培養(yǎng)過夜。將各個含細胞的膠囊轉(zhuǎn)移到傳感器小室中，并進一步固定在細胞傳感器的工作站中。使用細胞傳感器的內(nèi)設(shè)泵，交替重復泵開(1分鐘20秒)和泵關(guān)(40秒)狀態(tài)，并檢測泵關(guān)后8秒和泵關(guān)后38秒間(30秒內(nèi))細胞外pH的改變，以計算各循環(huán)間pH改變的速率。細胞適應(yīng)直到pH改變速率穩(wěn)定后(約2小時)，將溶解于細胞傳感器介質(zhì)中的樣品固定在兩通道之一中。通過通道變換，細胞暴露于含樣品的介質(zhì)7分2秒，檢測細胞外pH改變速率的變化。
將蒸餾水(1ml)加到各10mg按上述方法從牛胃、豬小腸和豬腦制備的純化并凍干的組織提取物中。離心去掉不溶性物質(zhì)，以1/40體積比將上清加到添加0.1％牛血清白蛋白(Sigma，A-2153，fractionⅤ)的細胞傳感器低緩沖RPMI 1640培養(yǎng)基中，得到檢測用樣品(終濃度0.25mg/ml)。考慮某些樣品可顯著地改變培養(yǎng)基pH的可能性，用培養(yǎng)基中含有的酚紅顏色作指示劑進行pH調(diào)整。將此樣品加于CHO-A10細胞和對照細胞，以細胞反應(yīng)的差異為指征，篩選含有細胞刺激活性的樣品。至于用層析法分離并純化的樣品，將各樣品溶解于小量DMSO中，然后溶解于添加0.1％牛血清白蛋白(Sigma，A-2153，fractionV)的用于細胞傳感器的低緩沖RPMI1640培養(yǎng)基中，以改善溶解效率。在這種情況下，也預先向無樣品培養(yǎng)基中加入同樣量的DMSO，以使細胞適應(yīng)之。
利用從牛胃、豬小腸和豬腦中按上述方法制備的樣品，以細胞外pH改變速率為指標進行細胞刺激活性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照細胞相比，樣品(B3、B4、S1、S2、S3、S4、G4、G6)能夠特異地激活其中引入了APJ受體的CHO細胞(CHO-A10)(提高細胞外pH改變的速率)，如圖4和5中所示。用從牛下丘腦制備的樣品進行同樣檢測，結(jié)果如圖6和7中所示，在第10管(30％乙腈洗脫物部分吸附于C18柱上，然后用1000mM乙酸銨洗脫得到的部分)中檢測到特異性細胞刺激活性(細胞外pH改變速率增強活性)。
以細胞刺激活性強度作為指征選擇高水平APJ受體表達細胞CHO-A10是經(jīng)導入表達載體pAKKO-A10后，反復在選擇培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化體細胞而確立的細胞系。因此，各細胞中所導入的cDNA的拷貝數(shù)可能有所不同，進而有可能細胞上表達的APJ受體的數(shù)目也不同。如果從這樣一個群體建立能夠高表達功能性受體的細胞系，則將會得到有高敏感性和穩(wěn)定性的檢測結(jié)果。為此，如實施例8中所述的牛胃提取物一樣，于RESOURCE RPC上經(jīng)反相層析后收集從牛下丘腦制備的一部分活性分離物，并將其用作標準樣品。使用該樣品，以細胞傳感器測得的細胞刺激活性作為指征，選擇高APJ受體表達的細胞。如圖8中所示，檢測8個獨立克隆的細胞刺激活性，克隆1、3、4和6測得有顯著的細胞刺激活性。從這些克隆中進一步選擇培養(yǎng)6號克隆(CHO-A10，克隆6)，用于繼后的細胞刺激活性檢測。
從牛胃中純化能夠在細胞系CHO-A10中特異性提高細胞外pH改變速率的活性物質(zhì)(肽)以下具體描述從牛瘤胃和綱胃中純化能夠特異性提高細胞系CHO-A10中的細胞外pH改變速率的活性物質(zhì)。
將牛瘤胃(1．0kg)和綱胃(1．0kg)切成塊，并在4.0L蒸餾水中煮沸20分鐘。在冰上迅速冷卻后，加入280ml乙酸至終濃度為1.0M，用Polytron制備組織勻漿物(12，000rpm，12分鐘)。將勻漿物攪拌過夜并離心(9500rpm，20分鐘)得到上清液。將沉降物懸浮于2.0升1.0M乙酸中，用Polytron勻漿并再次離心得到上清。合并兩份上清液，加入TFA至終濃度為0.05％，將所得到的混合物上反相C18柱(Prep C18 125A，100ml；Millipore)。上樣后，用200ml 0.05％TFA/dH2O(dH2O以下稱為蒸餾水)洗柱，然后用10％、30％和50％CH3CN/0.05％TFA/dH2O分三步洗脫。向30％CH3CN/0.05％TFA/dH2O洗脫級分中加入2體積20mMCH3COONH4/dH2O，并將混合物上陽離子交換柱(Hiprep CM-SepharoseFF，20ml；Pharmacia)。用20mM CH3COONH4/10％CH3CN/dH2O洗柱，然后分四步用100mM、200mM、500mM和1，1，000mMCH3COONH4/10％CH3CN/dH2O洗脫。1，000mM CH3COONH4洗脫級分顯示有特異性提高細胞系CHO-A10中細胞外pH改變之速率的活性，因此向其中加入3體積兩酮，去蛋白并蒸發(fā)濃縮。向濃縮的部分中加入TFA(終濃度0.1％)并將混合物上反相柱(RESORCE RPC，1ml；Pharmacia)。用12.5％-20.0％CH2CN進行濃度梯度洗脫。用15.5％-16．5％和17.0％-17.5％CH3CN洗脫的兩個部分(分別為活性級分P-1和P-2)顯示有特異性提高細胞系CHO-A10中細胞外pH改變速率的活性(圖9)。分離的兩個活性級分中，凍干17.0％-17．5％CH3CN洗脫級分(P-2)，然后溶解于DMSO中并懸浮于0.1％TFA/dH2O中，上反相柱(diphenyl219TP5415，Vydac；或Sephasil C8 SC 2.1/10，Pharmacia)。
在使用diphenyl 219TP5415柱的情況下，用14.0％-20.0％CH3CN濃度梯度洗脫，在17.0％CH3CN部分中檢測到特異性增強細胞系CHO-A10中細胞外pH改變之速率的活性(圖10)。在使用Sephasil C8 SC 2.1/10柱的情況下，用18.0-24.0％CH3CN進行濃度梯度洗脫，在19.5％CH3CN部分中檢測到對細胞系CHO-A10的特異性增加細胞外pH改變速率的活性(圖11)。分別凍干由diphenyl 219TP5415和Sephasil C8 SC 2．1/10柱上洗脫的活性級分，然后溶于DMSO中并懸浮于0．1％TFA/dH2O中，上反相柱(μRPC C2/C18 SC 2.1/10 Pharmacia)。就dihpenyl 219TP5415衍生的活性級分來說，用16.0％CH3CN以均一濃度洗脫時在19.0到20．5分鐘期間洗脫的一個峰；就Sepahsil C8 SC 2.1/10衍生的活性級分來說，用16.0％CH3CN以均一濃度洗脫時在18.0-20.0分鐘期間洗脫的一個峰，均檢測到對CHO-A10細胞系的特異性提高細胞外pH改變速率的活性(圖12和13)。
牛胃衍生的能夠特異性提高細胞系CHO-A10中細胞外pH改變速率之活性物質(zhì)(肽)的氨基酸序列測定確定實施例8中純化的能夠特異地提高細胞系CHO-A10中細胞外pH改變之速率的活性肽(P-2)的氨基酸序列。凍干從反相柱μRPC C2/C18SC2．1/10得到的有相同活性的兩個峰部分，并在肽序列儀(ABI 492型)上進行氨基酸序列分析。結(jié)果，兩峰部分均給出同樣的氨基酸序列(N端17個殘基)(SEQ ID No1)。
鑒定編碼牛胃衍生之肽片段的小鼠對應(yīng)物的基因片段將對實施例9的純化產(chǎn)物進行N末端氨基酸分析得到的，由17個氨基酸殘基組成的牛胃衍生的肽片段翻譯成核苷酸序列(SEQ ID No2)，并使用基因序列分析軟件Gene Bright(Hitachi Software)，在GemBank/EMBL登記的表達序列標簽(Expressed Sequence Tag，EST)數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索。結(jié)果可見，SEQ ID No1中示出的部分序列顯示與以登記號W33327登記的未知功能之小鼠EST翻譯的氨基酸序列高度同源，并且發(fā)現(xiàn)所說的EST編碼牛胃衍生之17氨基酸肽片段的小鼠型下游后半部分對應(yīng)物(圖14)。
編碼實施例9中經(jīng)N末端氨基酸分析得到的牛胃衍生之17氨基酸肽片段的小鼠型對應(yīng)物的配體基因的全長度克隆根據(jù)實施例10中得到的EST的序列，分別合成W33-F1(5＇-CTGGCAGGGAGGCAGGAGGAA-3＇)(SEQ ID No9)、W33-F2(5＇-GCAGGAGGAAATTTCGCAGACAGC-3＇)(SEQ ID No10)、W33-R1(5＇-GAAGAGAATTCATCTGTGGAGTA-3＇)(SEQ ID No11)、和W33-R2(5＇-ACCGGCACCGGGAGGGCACTT-3＇)(SEQ ID No12)。按照相應(yīng)的說明書，使用Isogen(Nippon Gene)從BALB/C小鼠的全腦中制備總RNA，然后使用寡(dT)纖維素柱(mRNA純化試劑盒，PHRMACIA)由之制備poly(A)+)RNA。按照MarathoncDNA擴增試劑盒(Clontech)使用手冊所述方法，從1μg已制備的poly(A)+RNA合成用于迅速擴增cDNA末端(RACE)的雙鏈cDNA，并溶解于10μl蒸餾水中。再用TE緩沖液將其稀釋50倍，并使用稀釋液作為模板進行PCR。使用EXTaq(Takara)作為DNA聚合酶，合并2．5μl10xEXTaq緩沖液、1μldNTP混合物(各2．5mM)和0.5μl與等體積TaqStart抗體(Clontech)混合的ExTaq，加入附帶于Marathon cDNA擴增試劑盒的銜接子引物AP1或AP2(各10μM)0.5μl，基因特異性引物W33-F1、W33-F2、W33-R1或W33-R2(各10μM)0．5μl、及模板cDNA，并用蒸餾水補足25μl體積，以制備反應(yīng)混合物。在第一次RACE中，向反應(yīng)混合物中加入2.5μl模板cDNA溶液，合并W33-F1和AP1用于3＇RACE，合并W33-R1和AP1以進行5＇RACE。94℃加熱處理2分鐘后，按每循環(huán)98℃10秒和72℃2分鐘進行5循環(huán)PCR循環(huán)，然后按每循環(huán)98℃10秒和70℃2分鐘進行5循環(huán)，再按每循環(huán)98℃10秒和68℃2分鐘進行25循環(huán)PCR。用25μl此第一輪PCR產(chǎn)物作第二輪PCR的模板。此時，改變引物組合，即W33-F2與AP2組合用于3＇RACE，W33-R2與AP2組合用于5＇RACE。94℃加熱處理2分鐘后，以每循環(huán)包括98℃10秒鐘和72℃2分鐘進行5次PCR循環(huán)，然后將每循環(huán)包括98℃10秒鐘和70℃2分鐘進行5次循環(huán)，繼之再以每循環(huán)包括98℃10秒鐘和68℃2分鐘進行30次PCR循環(huán)。對PCR產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝電泳和溴化乙啶染色。用剃刀切下約300bp的帶(在3＇RACE的情況下)和約600bp的帶(在5＇RACE的情況下)，使用濾膜(UltraFree；Millipore)進行離心過濾并經(jīng)苯酚提取和乙醇沉淀回收DNA片段。按照使用手冊使如此得到的片段在染料終止物循環(huán)測序試劑盒(ABI)上反應(yīng)，然后在DNA序列儀Prism377(ABI)上進行核苷酸序列分析，從而得到全長度序列.為了得到含有該全長度序列作為一個片段的DNA片段，基于由3＇RACE和5＇RACE得到的序列信息，分別合成兩個引物mF(5＇-GAGAGTCGCGGGCAGAGCAGCGTCAG-3＇)(SEQID No13)和mR(5＇-GAAATCATCCAAGTGAGGGGCGAGAC-3＇)(SEQID No14)。所使用的模板是使用RNA PCR試劑盒(Takara)按下述方法由80ng先前制備的小鼠全腦poly(A)+RNA合成的cDNA。附帶于試劑盒中的隨機引物(9mer)或寡(dT)20-M4銜接子引物使用終濃度為2.5μM，加入MgCl2至終濃度為5mM，加入2μl10xRNA PCR緩沖液，8μl dNTP混合物(各2.5mM)、20單位RNA酶抑制劑和5單位AMV反轉(zhuǎn)錄酶，并用蒸餾水補足20μl總體積。30℃(當只使用隨機引物時)處理10分鐘后，于42℃反應(yīng)30分鐘以進行cDNA合成，將反應(yīng)混合物分別溶解于5μl蒸餾水中，然后混合在一起，并使用混合溶液作為模板。使用EX Taq作為DNA聚合酶，加入2.5μl附帶的10xEX Taq緩沖液、1μl dNTP混合物(各2.5mM)、0.5μl與等體積Taq Start抗體(Clontech)混合的EX Taq，引物mF和mR各0.5μl(各10μM)及1μl模板cDNA溶液，加入蒸餾水使總體積達到25μl。
94℃加熱處理2分鐘后，按每循環(huán)包括98℃10秒鐘和68℃30秒鐘共進行30次PCR循環(huán)。對PCR產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，按前述同樣方法回收約750bp帶，并將其亞克隆到質(zhì)粒載體pCR2.1(Invitrogen)中，然后進一步導入大腸桿菌JM109中，得到E.coli JM109/pmA10L-13。測定插到所得轉(zhuǎn)化體中的cDNA片段的序列，結(jié)果證實該cDNA片段為含有配體多肽cDNA之全編碼區(qū)的片段?；蛐蛄惺居趫D15中。根據(jù)與SEQ ID No1所示牛胃衍生之肽片段的比較(圖16)，認為該小鼠衍生的氨基酸序列應(yīng)為牛型片段的小鼠型對應(yīng)物。
得到編碼牛型肽的cDNA片段按照RNAPCR試劑盒(AMV)版本2(Tarkara Shuzo)的說明書，使用0.35μg牛下丘腦衍生的poly(A)+RNA部分作為模板，并使用隨機9mer和寡dT引物分別制備5管反應(yīng)混合物。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)于30℃進行10分鐘，再于42℃進行30分鐘，最后于99℃加熱5分鐘以終止反應(yīng)。合并反應(yīng)混合物并進行乙醇沉淀。從反應(yīng)混合物中回收合成的cDNA并溶解于40μl蒸餾水中。使用2μl該cDNA溶液作為模板，并使用各0.5μl具有下示序列的合成DNA引物的10μM水溶液5＇-GAATCTGAGTTTCTGCGTGCAGGC-3＇(SEQ ID No17)和5＇-TTAGAAAGGCATGGGGCCCTTATG-3＇)(SEQ ID No18)、1μl dNTP混合物(各2.5mM)、1.25單位Takara ExTaq(Takara Shuzo)和附加試劑盒中的反應(yīng)緩沖液，制備反應(yīng)混合物(25μl)。將此反應(yīng)混合物于95℃加熱2分鐘，將包括98℃10秒、62℃20秒和72℃10秒的反應(yīng)循環(huán)重復40次，于72℃保溫30秒后將反應(yīng)混合物冷卻至4℃。用瓊脂糖凝膠電泳法分析反應(yīng)混合物，經(jīng)溴乙錠染色檢測到約230bp大小的cDNA帶。從凝膠中回收該部分中的DNA，并用上述的同樣引物對其進行PCR(25次循環(huán))擴增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，從凝膠中回收DNA并使用各自的引物，用ABI PRISM Dye Terminator Cycle SequencingReady Reaction試劑盒(Perkin Elmer-Applied Biosystems)進行測序反應(yīng)。使用ABI PRISM 377 DNA序列儀分析該cDNA的序列后，從中找出編碼如實施例9中測得的氨基酸序列LVQPRGPRSGPGPWQGG的部分。
得到編碼大鼠型肽的cDNA按照相應(yīng)的操作手冊，使用Isogen(Nippon Gene)從Wistar大鼠的全腦中制備總RNA，然后使用寡(dT)纖維素柱(mRNA純化試劑盒；Pharmacia)從中制備poly(A)+RNA。按照Marathon cDNA擴增試劑盒(Clontech)的使用手冊從1μg所制備的poly(A)+RNA合成cDNA，并將其溶解于10μl蒸餾水中。進一步用TE緩沖液將其稀釋50倍，并按照實施例11(即小鼠衍生的全長度克隆實施例)中所述的RACE方法，以所得稀釋液為模板，利用不同的引物對進行PCR擴增。在3＇RACE的情況下，第一輪PCR中使用W33-F1和AP1，第二輪PCR中使用W33-F2和AP1，并回收約800bp的帶。在5＇RACE的情況下，第一輪PCR中使用W33-R1和AP1，第二輪PCR中使用W33-R2和AP1，并回收約600bp的帶。按照實施例11中所述的同樣方法測定所回收的片段的序列，發(fā)現(xiàn)有約1，300bp的全長序列。
為了得到只含有認為被翻譯成氨基酸的序列區(qū)域的單一片段形式的DNA片段，基于由3＇RACE和5＇RACE得到的序列信息分別合成引物rFA10(5＇-GTAGTTGGGAGTCGCGGGCAGAGCAC-3＇)(SEQ ID No19)和rRA10(5＇-TAGAACCATGTCAGGATCAGCACTTT-3＇)(SEQ ID No20)。所使用的模板是按下述方法使用RNA PCR試劑盒(Takara)從160g以前制備的大鼠全腦poly(A)+RNA合成的CDNA。因此，以2.5μM的終濃度使用附帶于試劑盒中的隨機引物(9mer)，加入MgCl2至終濃度為5mM，然后加入4μl 10xRNA PCR緩沖液、16μl dNTP混合物(各2.5mM)、40單位RNA酶抑制劑和10單位AMV反轉(zhuǎn)錄酶，并用蒸餾水補足總體積40μl。將混合物于30℃保溫處理10分鐘后，42℃反應(yīng)30分鐘以合成cDNA并將反應(yīng)混合物溶解于40μl蒸餾水中。使用EXTaq作為DNA聚合酶，加入2.5μl附帶的10xEX Taq緩沖液、1μl dNTP混合物(各2．5mM)、0.5μl EX Taq與等體積Taq Start抗體(Clontech)的混合物、各0．5μl的引物rFA10和rRA10(各10μM)及1μl模板cDNA溶液，并用蒸餾水使終體積達到25μl，由此制備PCR反應(yīng)混合物。94℃加熱處理2分鐘后，按98℃10秒和68℃45秒共重復30次循環(huán)以進行PCR。1.2％瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，按上述同樣方法回收電泳帶。將該條帶DNA亞克隆到質(zhì)粒載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中。分析cDNA插入物片段的序列，明確地確定包括引物的約1，270bp核苷酸序列。
此外，合成各自含有起始密碼子和終止密碼子的兩個引物，即引物rFSal(5＇-AGTCGACGCATGAATCTGAGTTTCTG-3＇)(SEQ ID No21)和引物rRNhe(5＇-GAGCCCTTCAAGCTAGCTTTAGAAAG-3＇)(SEQ IDNo22)。劃下線部分是分別被限制性酶SalⅠ和NheⅠ識別的序列。使用這些引物，連同約20ng從含有上述使用rFA10和rRA10擴增得到的片段的轉(zhuǎn)化體中制備的質(zhì)粒(作為模板)，并如上所述使用EXTaq作為DNA聚合酶，經(jīng)94℃加熱處理2分鐘后，將98℃10秒鐘和68℃30秒鐘的熱循環(huán)重復24次，以進行PCR?；厥杖绱说玫降募s260bp的帶，將由其中回收的DNA亞克隆到質(zhì)粒載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中并進一步導入大腸桿菌JM109中，以得到E.coli JM109/prSHe-1。分析插入到所得轉(zhuǎn)化體中的cDNA片段的序列，證實該cDNA片段含有大鼠型肽的全部編碼區(qū)(圖17)。
得到編碼人型肽的cDNA對于在實施例11和13中得到的小鼠和大鼠型序列間充分保守的區(qū)域，合成引物AF2(5＇-GTGCCACTGATGCTGCCTCCAGATGG-3＇)(SEQ ID No23)和AR1(5＇-TTAGAAAGGCATGGGTCCCTTATG-3＇)(SEQ ID No24)。通過加入隨機引物(9mer，GIBCO BRL)并使用莫洛尼鼠類白血病病毒衍生的反轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO BRL)和其附帶的緩沖液，于42℃反應(yīng)1小時，從購自Clontech的5μg人肺poly(A)+RNA合成cDNA。將所合成的cDNA溶解于30μl TE緩沖液中。使用1μl該cDNA溶液作為模板，進行PCR反應(yīng)。使用EX Taq作為DNA聚合酶(參見實施例11)，連同引物AF2和AR1制備PCR反應(yīng)混合物。94℃處理2分鐘后，將包括98℃10秒、62℃20秒、和72℃5秒的循環(huán)重復35次?；厥杖绱说玫降募s150bp的帶并進行核苷酸序列分析。結(jié)果可見該片段編碼人型肽片段。
基于該序列，合成用于3＇RACE的引物h3R1(5＇-ACGGCAATGTCCGCCA CCTGGTGC-3＇)(SEQ ID No25)和h3R2(5＇-CCCTGGCAGGGAGGTCGGAGGAAA-3＇)(SEQ ID No26)，及用于5＇RACE的h5R1(5＇-GGGCGGCTGGCGGCGGAATTTCCT-3＇)(SEQ ID No27)和h5R2(5＇-GCTGCACCAGGTGGCGGACATTGC-3＇)(SEQ ID No28)。按照Marathon cDNA擴增試劑盒(Clontech)的使用說明書，從購自Clontech的人底丘腦核和肺衍生的各1μg poly(A)+RNA(clontech)合成cDNA。將各DNA溶解在10μl蒸餾水中并用TE緩沖液稀釋50倍，以制備用于RACE的模板cDNA溶液。3＇RACE中合用引物h3R1和AP1，5＇RECE中合用h5R1和AP1，按實施例11中所述同樣方法制備反應(yīng)混合物，于94℃加熱處理2分鐘后，將包括98℃10秒和72℃45秒的熱循環(huán)重復5次，然后將包括98℃10秒和70℃45秒的熱循環(huán)重復5次，再將包括98℃10秒和68℃45秒的熱循環(huán)重復25次，以進行PCR。用TE緩沖液將反應(yīng)混合物稀釋50倍，使用各2．5μl稀釋液作為第二輪PCR的模板。改變引物組合，即h3R2和AP1或AP2用于3＇RACE，h5R2和AP1用于5＇RACE。94℃加熱處理2分鐘后，將包括98℃10秒和72℃45秒的循環(huán)重復5次，然后將包括98℃10秒和70℃45秒的循環(huán)重復5次，再將包括98℃10秒和68℃45秒的循環(huán)重復35次，以完成PCR反應(yīng)。結(jié)果，分別回收經(jīng)5＇RACE從底丘腦核衍生之約500bp帶和經(jīng)3＇RACE從肺衍生之約200bp帶，分析約570bp的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)該cDNA編碼人型肽。
另外，為了擴增單一cDNA形式的預期全編碼區(qū)，合成編碼區(qū)的兩末端的引物，hFA10(5＇-TTGGCCTCCGGGCGCCCGACCTCT-3＇)(SEQ IDNo29)和hRA10(5＇-GACATAACCGCAGGGGGTGGGCACTTG-3＇)(SEQ ID No30)。使用RACE中所用的底丘腦核衍生之相同cDNA作為模板。使用Klen Taq(Clontech)作為DNA聚合酶，加入2．5μl附帶的10xKlen Taq緩沖液、1μl dNTP混合物(各2.5mM)、0.5μl Klen Taq、各0.5μl引物hFA10和hRA10(各10μM)及1μl模板cDNA溶液，并用蒸餾水補足25μl總體積以制備PCR反應(yīng)混合物。94℃加熱處理2分鐘后，將包括98℃10秒和68℃30秒的循環(huán)重復30次以完成PCR。對PCR產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，回收所預期的帶，將其亞克隆到質(zhì)粒載體pCR2.1/TOPO(Invitrogen)中并進一步導入大腸桿菌JM109，從而得到E.coli JM109/phSuN-4。對插入到所得轉(zhuǎn)化體中之cDNA片段的序列分析結(jié)果證明，該cDNA片段含有人型肽的全部編碼區(qū)。其基因序列示于圖18中。
得到編碼牛型肽的cDNA基于實施例12中所得PCR產(chǎn)物的核苷酸序列，分別制備用于5＇RACE和3＇RACE的幾種特異性引物。按照Marathon cDNA擴增試劑盒(Clontech)使用手冊所述的方法，從1μg牛肺衍生的Poly(A)+RNA合成cDNA，用蒸餾水將最后步驟中加入銜接子后得到的cDNA溶液稀釋50倍。使用2.5μl該50倍稀釋液、各0．5μl如下列SE Q ID NO31 至34所示的特異性引物(10μM)、0.5μl AP1引物(附加于酶中，10μM)、0.5μl EX Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)與等體積Taq Start抗體(Clontech)的混合物、2.5μl 10X EXTaq緩沖液和1μl dNTP(均為酶附帶的)以制備反應(yīng)混合物(各25μl)，95℃加熱處理2分鐘后，將包括98℃10秒和72℃1分鐘的循環(huán)重復5次，然后將包括98℃10秒和70℃1分鐘的循環(huán)重復5次，再將包括98℃10秒和68℃1分鐘的循環(huán)重復25次，最后于68℃加熱1分鐘以完成PCR。使用1μl該反應(yīng)混合物，改變引物組合以制備反應(yīng)混合物，并在同樣條件(不同的是最后的擴增循環(huán)重復次數(shù)從25次增加到35次)下完成第二輪PCR。
在使用各種引物組合制得的PCR產(chǎn)物中，以瓊脂糖凝膠電泳法分離使用FF1(5＇-CCTGCTGCTCTGGCTCTGCCTGAG-3＇)(SEQ ID NO31)與AP1(5＇-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3＇)(SEQ ID NO32)組合進行第一輪PCR、使用1μl第一輪反應(yīng)混合物及FF2(5＇-GCGGTGTGCGGAGGACCCCTGCTG-3＇)(SEQ ID NO33)與AP2(5＇-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3＇)引物組合進行第二輪PCR得到的那些主要PCR產(chǎn)物，從凝膠中回收之并測定其序列。與實施例11中得到的小鼠cDNA比較后，發(fā)現(xiàn)所分析的3＇RACE產(chǎn)物是具有翻譯終止密碼子之下游序列的cDNA片段?；谟稍?＇RACE示出的牛型肽cDNA的序列，合成相當于3＇非翻譯區(qū)部分的引物。另外，基于已在其他種動物中揭示的5＇非翻譯區(qū)cDNA序列合成一引物。使用相當于150ng牛下丘腦poly(A)+RNA的cDNA作為模板，并加入0．5μl各引物(10μM、0.5μl與等體積Taq Start抗體(Clontech)混合的EX Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)、2.5μl X10 EX Taq緩沖液及1μl dNTP(均為酶附帶的)以制備反應(yīng)混合物(25μl)，95℃加熱處理2分鐘后，將包括98℃10秒、62℃20秒和72℃30秒的循環(huán)重復40次，然后再于72℃保溫30秒。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物。從凝膠中回收主要PCR產(chǎn)物并分析其核苷酸序列。對使用NCR4(5＇-GGCCGCGGCGGCCCAAGGAGCAGC-3＇)(SEQ ID NO35)與RV1(5＇-GCGTGTGGTGGCCCCTTCGGTCCT-3＇)(SEQ ID NO36)或RV2(5＇-AATCACAGGGGGTGGGCGTGTGGT-3＇)(SEQ ID NO37)的引物組合得到的主要PCR產(chǎn)物的核苷酸序列分析揭示，已擴增了含有全長度翻譯區(qū)的cDNA。因此，使用Original TA克隆試劑盒(Invitrogen)將cDNA亞克隆到質(zhì)粒載體pCR2．1中，然后進一步導入大腸桿菌JM109，從而得到E.coli JM109/pBovA10prec24。對插入到所得轉(zhuǎn)化體中之cDNA片段的序列分析結(jié)果證實，該cDNA片段含有牛型肽的全部編碼區(qū)(圖19)。
圖20中比較顯示實施例11、13、14和15中揭示之小鼠、大鼠、人和牛型肽的氨基酸序列。
生產(chǎn)作用于APJ受體的肽，即pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe在ABI 430A型肽合成儀的反應(yīng)容器中充入相當于0.5毫摩爾的商品Boc-Phe-OCH2-PAM樹脂(0.72mmole/克樹脂)，并按照已知的Boc策略(NMP-HOBt)肽合成技術(shù)，依次引入Boc-Pro、Boc-Met、Boc-Pro、Boc-Gly、Boc-Lys(C1-Z)、Boc-His(Bom)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Leu、Boc-Arg(Tos)、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gln，從而得到所需的被保護的肽-樹脂。在5ml無水氟化氫中，將0.22g部分的該樹脂連同0.43g對甲酚0℃攪拌60分鐘，然后于減壓下蒸餾除去氟化氫，向殘留物中加入乙酸-水并用乙酸-水提取肽。將提取物濃縮到足夠程度，加入蒸餾水和二乙醚，提取并進行相分離。凍干所收集的水層，將凍干物溶解在少量50％乙酸-水中并上用同樣溶劑填充的Sephadex(注冊商標)G-25柱(2.0×80cm)。用同樣溶劑展層后，合并主要部分并凍干得到約50mg白色粉末。將其溶解于50ml 50％乙酸-水中，并在60℃水浴上放置1小時。經(jīng)HPLC證實在13.9分鐘時主峰消失，并轉(zhuǎn)化成約15.6分鐘時的一個峰后，將混合物送回室溫并上用LiChroprep(注冊商標)RP-18充填的反相層析柱(2.6×60cm)。用200ml 0.1％TFA-水洗柱，然后使用300ml0.1％TFA-水和300ml含有0.1％TFA的33％乙腈-水進行線性梯度洗脫。合并約20％乙腈濃度的洗脫級分并凍干得到28mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+1533.953(計算值1533.811)HPLC洗脫時間15.7分鐘柱條件柱Wakosil 5C18T，4.6×100mm洗脫液溶劑A-0.1％TFA-水；溶劑B-含0.1％TFA的乙腈；線性濃度梯度洗脫從A/B=95/5到A/B=45/55(25分鐘)流速1.0ml/分。
檢測肽pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe對APJ受體的配體活性將實施例16中得到的肽和包括SEQ IN NO40限定之序列的第42位至77位殘基的氨基酸序列代表的肽溶解在無菌蒸餾水中，至濃度為1×10-3M，并使用含有0.1％BSA的細胞傳感器介質(zhì)將各溶液稀釋到肽濃度為10-8、10-9、10-10和10-11M。將按照實施例6中所述的同樣方法向其中導入了APJ受體cDNA的CHO細胞固定在細胞傳感器的工作臺上，各細胞的酸化速率穩(wěn)定后，將肽稀釋液之一導入細胞傳感器的一個通道中，改變通道使細胞與稀釋液接觸7分2秒鐘。取基礎(chǔ)水平值為100％，計算樣品導入的第3循環(huán)中細胞反應(yīng)達到最大時酸化速率的改變。圖21中示出了所得結(jié)果。
生產(chǎn)Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Ser-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe將商品Boc-Phe-OCH2-PAM樹脂(0.72mmole/g樹脂，0.5mmole)裝入肽合成儀(ABI430A型)的反應(yīng)瓶中，以Boc-策略(NMP-HOBt)方法，按照上述氨基酸的順序依次導入Boc-Pro、Boc-Met、Boc-Gly、Boc-Lys(Cl-Z)、Boc-His(Bom)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Leu、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gln、Boc-Phe、Boc-Trp(CHO)和Boc-Val，以得到所需的被保護的肽樹脂，完成肽合成。將該樹脂(0.17g)與1.0g對甲酚和1.0ml 1，4-丁二硫醇在8ml無水氟化氫中0℃攪拌60分鐘，蒸餾除去氟化氫，向殘留物中加入乙酸-水，并用乙酸-水提取肽。將提取物濃縮到足夠程度，加入蒸餾水和二乙醚以進行提取和相分離，收集并凍干水層，將凍干物溶解在小量50％含水乙酸中，將溶液過已用同樣溶劑充填而制備的SephadexTMG-25柱(2.0×80cm)，用同樣溶劑展層，收集主要部分并凍干得到約70mg白色粉末。將此樣品過LichroprepTMRP-18充填的反相層析柱(2.6×60cm)，用200ml 0.1％TFA-H2O洗柱，并用300ml含0.1％TFA的10％乙腈-水和300ml含0．1％TFA的30％乙腈-水進行線性梯度洗脫。合并主要部分并凍干得到33mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+4064.6(計算值4064.2)HPLC洗脫時間16.0分鐘柱條件柱Wakosil 5C18T，4.6×100mm洗脫液溶液A-0.1％TFA-水，溶液B-含0.1％TFA的乙腈。從A/B=95/5至A/B=45/55的線性濃度梯度(25分鐘)。流速1．0ml/分。
生產(chǎn)Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Ser-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe進一步將Boc-Leu引入實施例18得到的樹脂中，然而按實施例18中所述的方法用氟化氫處理并進行層析純化。合并主要部分并凍干得到23mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+4177.7(計算值4177.3)HPLC洗脫時間16.2分鐘柱條件柱Wakosil 5C18T，4.6×100mm洗脫液溶液A-0.1％TFA-水，溶液B-含0.1％TFA的乙腈。從A/B=95/5至A/B=45/55的線性濃度梯度(25分鐘)。流速1.0ml/分。
生產(chǎn)Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe向市售2-氯三苯甲游基樹脂(Clt樹脂，1.3mmole/g)中引入Fmoc-Phe-OH，用所制得的0.25mmole Fmoc-Phe-O-Clt樹脂(0.32mmole/g)充填肽合成儀(ABI 433A)的反應(yīng)管，并用Fmoc/DCC/HOBt方法進行固相合成。用于Fmoc氨基酸側(cè)鏈的保護基團，對于Arg來說是Pbf，對于Ser來說是tBu，在Trp和Lys的情況下是Boc，并且在His、Asn和Gln的情況下是Trt。使用其他氨基酸則沒有側(cè)鏈保護問題。按照如上顯示的序列所指示的次序，從Phe開始在N末端Leu方向上引入肽鏈，得到所需的被保護的肽樹脂。
將50mg(4.45mmole)該樹脂在1ml由TFA、苯甲硫醚、間甲酚、H2O和乙二硫醇(82.5∶5∶5∶5∶2.5)組成的混合溶液中室溫攪拌2小時，向反應(yīng)混合物中加入醚，并離心回收所得到的沉淀物白色粉末。除去上清的過程重復3次。用水提取殘留物。凍干得到23.1mg白色粉末。使用TSKGELODS120T柱(20×300mm)對如此得到的粗肽進行制備性HPLC。使用溶液A0．1％TFA-水和溶液B含0.1％TFA的乙腈，從A/B=85/15至A/B=75/25進行線性濃度梯度洗脫(60分鐘)。合并含有所需產(chǎn)物的部分，凍干得到10.2mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+4194.8(計算值4194.3)HPLC洗脫時間16．5分鐘洗脫條件柱YMCA-301-3(4.6×100mm)洗脫液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0.1％TFA的乙腈。
從A/B=100/0至A/B=50/50的線性濃度梯度(25分鐘)流速1.0ml/分。
生產(chǎn)His-Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-TlP-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe實施例20中得到的樹脂進一步與Fmoc-His(Trt)縮合，然后進行如實施例20的同樣純化處理，得到10mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+4331.2(計算值4331.4)HPLC洗脫時間16.3分鐘洗脫條件柱YMCA-301-3(4.6×100mm)洗脫液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0．1％TFA的乙腈。
從A/B=100/0至A/B=50/50的線性濃度梯度(25分鐘)流速1.0ml/分。
生產(chǎn)Leu-Val-Lys-Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro-Gly-Ala-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
按照實施例18中所述的同樣方法，基于上述氨基酸序列的次序，向市售Boc-Phe-OCH2-PAM樹脂(0.72mmole/g樹脂)中引入Boc-Pro、Boc-Met、Boc-Gly、Boc-Lys(Cl-Z)、Boc-His(Bom)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Leu、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gln、Boc-Phe、Boc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Thr(Bzl)和Boc-Val，得到所需的被保護的肽樹脂。與實施例18中的同樣方式用氟化氫處理該樹脂，并按同樣方法純化所回收的肽，得到25mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+4199.0(計算值4199.3)[實施例23]生產(chǎn)Tyr-Leu-Val-Lys-Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro-Gly-Ala-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使Boc-Try(Br-Z)進一步與實施例22中得到的樹脂縮合。對所得樹脂進行同樣的處理和純化，得到12mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+4362.7(計算值4362.4)[實施例24]生產(chǎn)Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使市售Boc-Phe-OCH2-PAM樹脂(0.72mmole/g樹脂)按次序與Boc-Pro、Boc-Met、Boc-Pro、Boc-Gly、Boc-Lys(C1-2)、Boc-His(Bom)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Leu、Boc-Arg(Tos)和Boc-Pro縮合。于對甲酚存在下用氟化氫處理樹脂，并按實施例18中的同樣方式純化肽，得到54mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+1266.4(計算值1266.7)[實施例25]生產(chǎn)Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使實施例24的樹脂進一步與Boc-Arg(Tos)縮合，然后進行同樣的處理和純化，得到30mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+1422.6(計算值1422.8)[實施例26]生產(chǎn)Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
使實施例25的樹脂進一步與Boc-Gln縮合，然后進行同樣處理和純化，并從稀釋的鹽酸中凍干得到21mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+1551.1(計算值1550.8)[實施例27]生產(chǎn)Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Set-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使實施例26的樹脂與Boc-Arg(Tos)進一步縮合2次，然后經(jīng)同樣處理和純化得到17mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+1862.8(計算值1863.0)[實施例28]生產(chǎn)Cys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使實施例27的樹脂進一步與Boc-Phe，再與Boc-Cys(MeBzl)縮合，然后進行同樣處理和純化，得到30mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+2113.2(計算值2113.1)HPLC洗脫時間16.0分鐘洗脫條件柱YMCA-301-3(4.6×100mm)洗脫液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0.1％TFA的乙腈。
從A/B=100/0至A/B=50/50的線性濃度梯度(25分鐘)流速1.0ml/分。
生產(chǎn)Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使實施例27的樹脂進一步按次序與Boc-Phe、Boc-Lys(C1-Z)、Boc-Arg(Tos)和Boc-Arg(Tos)縮合，然后進行同樣處理和純化得到13mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+2450.4(計算值2450.4)HPLC洗脫時間15.7分鐘洗脫條件柱YMC A-301-3(4.6×100mm)洗脫液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0.1％TFA的乙腈。
從A/B=100/0至A/B=50/50的線性濃度梯度(25分鐘)流速1．0ml/分。
生產(chǎn)pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Giy-Pro-Met-Pro使市售Boc-Pro-OCH2-PAM樹脂(0.63mmole/g樹脂)按次序與Boc-Met、Boc-Pro、Boc-Gly、Boc-Lys(C1-Z)、Boc-His(Bom)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Leu、Boc-Arg(Tos)、Boc-Pro、Boc-Ary(Tos)、Z-Gln縮合。于對甲酚存在下用氟化氫處理所得樹脂，并按實施例18中所述同樣方式純化肽，得到56mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+1386.4(計算值1386.7)HPLC洗脫時間12.7分鐘洗脫條件柱Wakosil 5C18T(4.6×100mm)洗脫液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0.1％TFA的乙腈。
從A/B=95/5至A/B=45/55的線性濃度梯度(25分鐘)流速1.0ml/分。
生產(chǎn)pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Giy-Pro-Met使市售Boc-Met-OCH2-PAM樹脂(0.66mmole/g樹脂)依次與Boc-Pro、Boc-Gly、Boc-Lys(C1-Z)、Boc-His(Bom)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Leu、Boc-Arg(Tos)、Boc-Pro、Boc-Ary(Tos)和Z-Glu縮合。于對甲酚存在下用氟化氫處理所得到的樹脂，按實施例18中所述同樣方式純化肽，得到29mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+1289.9(計算值1289.7)HPLC洗脫時間11.8分鐘洗脫條件柱Wakosil 5C18T(4.6×100mm)洗脫液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0.1％TFA的乙腈。
從A/B=95/5至A/B=45/55的線性濃度梯度(25分鐘)流速1.0ml/分。
生產(chǎn)Met-Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使實施例20的樹脂進一步與Fmoc-Met縮合，然后進行同樣的純化，得到5mg白色粉末。質(zhì)量分析(M+H)+4324.9(計算值4325.3)HPLC洗脫時間16.8分鐘洗脫條件柱YMCA-301-3(4.6×100mm)洗脫液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0.1％TFA的乙腈。
從A/B=100/0至A/B=50/50的線性濃度梯度(25分鐘)流速1.0ml/分。
檢測對毛喉素刺激的cAMP產(chǎn)生的抑制活性將CH0-A10克隆6細胞接種于24孔組織培養(yǎng)板上(3×105細胞/孔)并培養(yǎng)過夜。制備含有0.2mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和0.05％牛血清白蛋白的Hanks＇平衡鹽溶液(HBSS)，作為檢測緩沖液。用2×500μl檢測緩沖液洗各孔，然后于37℃預保溫30分鐘。進一步用500μl檢測緩沖液洗后，向各孔內(nèi)加入在添加1μM毛喉素的檢測緩沖液中制成的樣品溶液500μl，并于37℃保溫30分鐘。為了了解細胞產(chǎn)生cAMP的基礎(chǔ)水平，各孔與未加毛喉素的檢測緩沖液保溫；為了了解因毛喉素刺激而導致的cAMP產(chǎn)生的最大水平，進一步制備與添加毛喉素的檢測緩沖液保溫的孔。保溫完成后，用500μl檢測緩沖液洗各孔，并向各孔中加入Amersham cAMP EIA試劑盒附帶的500μl溶解緩沖液1B，以提取cAMP。按照試劑盒使用說明書，對100μl等分的各提取物進行cAMP檢測試驗。將最大水平和加樣品孔的水平間的cAMP產(chǎn)生量之差值作為相對于毛喉素刺激的cAMP產(chǎn)生量增加(最大水平和基礎(chǔ)水平間的差值)的百分比，計算對cAMP產(chǎn)生的抑制活性(cAMP產(chǎn)生的抑制百分率)。結(jié)果示于圖22中。
中，于37℃反應(yīng)1小時以完成4個寡聚體(各1μg)(除形成5＇末端的#1和#6外)的5＇末端磷酸化。苯酚處理后，回收水層，加入2體積乙醇，將混合物冷卻至-70℃并離心沉淀DNA。b)DNA片段的連接將如上得到的磷酸化的DNA片段和各1μg#1和#2合并成120μl總體積。該混合物于80℃保持10分鐘，然后逐步冷卻到室溫以退火。使用Takara DNA連接試劑盒ver.2(Takara Shuzo)完成連接反應(yīng)。為此，向30μl退火混合物中加入30μl溶液Ⅱ，徹底混合后加入60μl溶液Ⅰ，并于37℃進行連接反應(yīng)1小時。苯酚處理后，回收水層，加入2體積乙醇，將混合物冷卻至-70℃，并離心沉淀DNA。c)5＇末端磷酸化將沉淀物溶解于10μl TE緩沖液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA)中，并在100μl磷酸化反應(yīng)介質(zhì)[50mM Tris-HCl(pH7.6)、10mMMgCl2、1mM亞精胺、10mM二巰基乙醇、0.1mg/ml牛血清白蛋白、1mMATP、10單位T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)]中37℃反應(yīng)1小時，以進行5＇末端磷酸化。苯酚處理后，回收水層，加入2體積乙醇，將混合物冷卻到-70℃，離心沉淀DNA并溶解于20μlTE緩沖液中。
制備人apelin-36表達質(zhì)粒用XbaⅠ和AvaⅠ消化pTB960-2(EP-A499990；Koyama等人，Journal of Biotechnology，Vol.32，273)，并對消化混合物進行1％瓊脂糖電泳。使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取約4.4Kb的DNA片段，并溶解于25μl TE緩沖液中。使用Takara DNA連接試劑盒ver.2(Takara Shuzo)對pTB960-2的該XbaⅠ-AvaⅠ片段和如上制備的人apelin-36結(jié)構(gòu)基因進行連接反應(yīng)。為此，將pTB960-2的該XbaⅠ-AvaⅠ片段溶液1μl和人apelin-36結(jié)構(gòu)基因溶液4μl混合在一起，加入5μl溶液Ⅰ并于16℃進行連接反應(yīng)30分鐘。使用10μl連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Toyobo)的感受態(tài)細胞，然后涂布于含有10μg/ml四環(huán)素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，并于37℃培養(yǎng)1天。選擇如此形成的四環(huán)素抗性菌落。將此轉(zhuǎn)化體在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并使用QIAprep8 Miniprep試劑盒(Qiagen)制備質(zhì)粒pTB960-13。使用Applied Biosystems 377型DNA序列儀證實所說質(zhì)粒中人apelin-36結(jié)構(gòu)基因部分的核苷酸序列。使用質(zhì)粒pTB960-13轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株(Novagen)，將轉(zhuǎn)化的細胞涂布于含有10μg/ml四環(huán)素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，并于37℃培養(yǎng)1天，從而得到人apelin-36-CS23融合蛋白質(zhì)表達菌株BL21(DE3)/pTB960-13。
使用1L含有5.0mg/l四環(huán)素的LB培養(yǎng)基(1％蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.5％氯化鈉)，將實施例35中得到的轉(zhuǎn)化體在2升培養(yǎng)瓶中37℃振蕩培養(yǎng)8小時。將所得到的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到裝有19升主發(fā)酵培養(yǎng)基(1.68％磷酸氫二鈉、0.3％磷酸二氫鉀、0.1％氯化銨、0.05％氯化鈉、0.05％硫酸鎂、0.02％消泡劑、0.00025％硫酸亞鐵、0.00025％鹽酸硫胺素、1.5％葡萄糖、1.5％酪蛋白氨基酸)的50l發(fā)酵罐中，并于通氣和攪拌下30℃開始發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)物的濁度達到500Klett單位時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度12mg/l，并繼續(xù)培養(yǎng)4小時。完成培養(yǎng)后，離心培養(yǎng)液得到約66g濕細菌細胞，將其置于-80℃凍存。
得到人apelin-36向550g實施例35中制得的細菌細胞中加入1，500ml含有10mMEDTA+1mM(對脒基苯基)甲磺酰氟鹽酸化物的溶液(pH6.0)，超聲(Branson Sonifier model 450)處理混合物并離心(10，000rpm，60分鐘)。收集上清，并再次按同樣方式處理沉降物。將合并的上清調(diào)到pH6.0并上已用50mM磷酸鹽緩沖液(pH6.0)平衡過的AF-Heparin Toyopearl650M柱(30mm ID×500mm L，Tosoh)，以吸附之。洗柱后，用0-100％B(B=50mM磷酸鹽緩沖液+2M NaCl，pH6.0)逐步梯度洗脫，得到530ml含人apelin-36-CS23融合蛋白質(zhì)的級分。使用Pericon Minicassette(Millipore)同時加入0.1M乙酸濃縮該洗脫物。如此得到人apelin-36-CS23融合蛋白質(zhì)的0.1M乙酸溶液。向該溶液中加入尿素至6M的終濃度，然后加入35mg 1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓鹽(DMAP-CN)，并使反應(yīng)在室溫下進行15分鐘。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物上已用10％乙酸平衡過的Sephadex G-25柱(46mm ID×600mm L，Pharmacia)，并使用與平衡同樣的10％乙酸以6ml/分的流速展層，以得到含有S-氰化的人apelin-36-CS23融合蛋白質(zhì)的級分。濃縮該洗脫物，并用Pericon Minicassete(Millipore)脫鹽，得到人apelin-36-CS23融合蛋白的脫鹽溶液。向該脫鹽溶液中加入尿素至6M終濃度，再加入1N氫氧化鈉至0.06N終濃度，使反應(yīng)于0℃進行15分鐘。此后，用乙酸調(diào)整反應(yīng)混合物至pH6.0，得到人apelin-36。將此反應(yīng)混合物上已用含有3M尿素的50mM磷酸鹽緩沖液(pH6.5)平衡的SP-5PW柱(21.5mm ID×150mm L，Tosoh)，以吸附之。洗柱后，用0至40％B(B=50mM磷酸鹽緩沖液+1M NaCl+3M尿素，pH6.5)進行逐步梯度洗脫，得到人apelin-36部分。將該人apelin-36部分進一步過0.1％三氟乙酸平衡的C4P-50柱(21.5mm ID×300mm L，ShowaDenko)。洗柱后，用15-30％B(B=80％乙腈/0．1％三氟乙酸)進行逐步梯度洗脫。合并所得到的人apelin-36部分，凍干得到人apelin-36的凍干粉末。a)氨基酸組成分析使用氨基酸分析儀(Hitachi L-8500A型氨基酸分析儀)確定氨基酸組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與根據(jù)人apelin-36的核苷酸序列推測的氨基酸組成一致，并證明N末端加有蛋氨酸(表1)表1 氨基酸組成分析氨基酸 每摩爾的殘基數(shù) 由人apelin-36的核苷酸序列推測的值A(chǔ)sx 1．01Thr1)0Ser1)1．92Glx 3．03Pro 5．76Gly 5．76Ala 0 0CyS2)0Val 1．01Met 2．01Ile 0 0Leu 2．02Tyr 0 0Phe 1．92His 1．01Lys 1．82Arg 7．38Trp 0．91酸水解(6N鹽酸-4％巰基乙酸，110℃，水解24或48小時)1)外推到0小時得到的值2)未測b)N末端氨基酸序列分析使用氣相蛋白序列儀(Applied Biosystems model 477A)測定N末端氨基酸序列。結(jié)果，除N末端加有蛋氨酸外，N末端氨基酸序列與從人apelin-36的核苷酸編碼序列推測的序列一致(表2)。表2 N-末端氨基酸序列殘基號 測得的PTH1)氨基酸 由人apelin-36的核苷酸(pmole)序列推測的氨基酸1 Met(526)2 Leu(648)Leu3 Val(513)Val4 Gln(437)Gln5 Pro(463)Pro6 Arg(216)Arg7 Gly(232)Gly8 Ser(129)Ser9 Arg(129)Arg10Asn(142)Ash11Gly(185)Gly12Pro(219)Pro13Gly(202)Gly14Pro(188)Pro15Trp(88) Trp16Gln(116)Gln17Gly(120)Gly18Gly(72) Gly19Arg(56) Arg20Arg(40) Arg使用1nmole進行分析。
1)乙內(nèi)酰苯硫脲c)C末端氨基酸分析使用氨基酸分析儀(Hitachi Model L-8500A氨基酸分析儀)分析C末端氨基酸。表3C末端氨基酸分析人apelin-36C末端氨基酸回收率(％)Phe 38.6氣相聯(lián)氨分解(100℃，6小時)。
從上示結(jié)果看出，實施例37中得到的人apelin-36是N末端帶有蛋氨酸的分子(Met-人 apelin-36)。
(生物學活性試驗)使用實施例33中所述的方法檢測實施例37中得到的人apelin-36的活性，證實其活性等同于合成產(chǎn)物。
去除N末端蛋氨酸將40mg實施例37中得到的Met-人 apelin-36溶解在0.8ml 3M尿素溶液中。然后，加入由0.05ml 80mM硫酸銅、0.046g乙醛酸和0.1ml吡啶組成的混合物，使反應(yīng)于25℃進行1小時。此后，將反應(yīng)混合物上已用2.5M尿素+10mM磷酸鹽緩沖液(pH5.5)平衡過的Sephadex G-25柱(10mm ID×250mmL)，并以0.5ml/分的流速，用平衡緩沖溶液展層。合并含有二酮形式的Met-人 apelin-36的級分。向合并級分中加入4M乙酸，4M乙酸鈉和3M尿素，然后再加入鄰苯二胺至40mM濃度。將混合物脫氣和用氮氣封閉后，使反應(yīng)于25℃進行5天。此后，將反應(yīng)混合物上已用50mM磷酸鹽緩沖液(pH6.0)平衡過的Sephadex G-25柱(25mm ID×600mmL)，并以4ml/分的流速用此平衡溶液展層。合并現(xiàn)已沒有N末端蛋氨酸的人apelin-36的洗脫物。將其調(diào)至pH6.0并使之吸附于已用50mM磷酸鹽緩沖液+0.1M NaCl+2.5M尿素(pH5.0)平衡過的CM-5PW柱(7.5mm ID×75mm L，Tosoh)上，用0-100％B(B=50mM硼酸鹽緩沖液+0.1M NaCl+2.5M尿素，pH9.0)，以0.8ml/分的流速，經(jīng)40分鐘完成梯度洗脫。合并含人apelin-36的洗脫物，并再次過已用0.1％TFA平衡的C4P-50柱(10mm ID×250mmL，Showa Denko)以進行吸附，用15-30％B(B=80％乙腈/0.1％TFA)以2ml/分的流速經(jīng)40分鐘完成梯度洗脫。合并人apelin-36部分并凍干得到人apelin-36。a)氨基酸組成分析使用氨基酸分析儀(Hitachi L-8500A型氨基酸分析儀)確定氨基酸組成。結(jié)果顯示，氨基酸組成與根據(jù)人apelin-36 DNA的核苷酸序列推斷的氨基酸組成相符(表4)。
表4 氨基酸組成分析氨基酸 每摩爾的殘基數(shù) 由人apelin-36的核苷酸序列推測的值A(chǔ)sx 1．0 1Thr1) 0 0Ser1) 1．8 2Glx 3．0 3Pro 5．7 6Gly 5．6 6Ala 0 0Cys2) 0Val 1．0 1Met 1．0 1Iie 0 0Leu 2．0 2Tyr 0 0Phe 1．8 2His 1．0 1Lys 1．8 2Arg 7．2 8Trp 0．9 1酸水解(6N鹽酸-4％巰基乙酸，110℃，水解24或48小時)1)外推到0小時得到的值2)未測b)N-末端氨基酸序列分析使用氣相蛋白質(zhì)序列儀(Applied Biosystems 477A型)確定N末端氨基酸序列。結(jié)果可見，N末端氨基酸序列與根據(jù)人apelin-36DNA的核苷酸序列推斷的序列相一致(表5)。表5 N末端氨基酸序列殘基序號 檢測的PTH1)-氨基酸 由人apelin-36的核苷酸(pmole) 序列推測的氨基酸1Leu(570) Leu2Val(611) Val3Gln(594) Gln4Pro(587) Pro5Arg(332) Arg6Gly(552) Gly7Ser(255) Ser8Arg(277) Arg9Asn(345) Asn10 Gly(383) Gly11 Pro(383) Pro12 Gly(366) Gly13 Pro(318) Pro14 Trp(131) Trp15 Gln(210) Gln16 Gly(218) Gly17 Gly(281) Gly18 Arg(130) Arg19 Arg(190) Arg20 Lys(144) Lys使用1mmole進行分析1)乙內(nèi)酰苯硫脲c)C-末端氨基酸分析使用氨基酸分析儀(Hitachi L-8500A型氨基酸分析儀)分析C末端氨基酸表6 C末端氨基酸分析人apelin-36 C末端氨基酸 回收率(％)Phe 66.3氣相聯(lián)氨分解(100℃，6小時)[實施例40](生物學活性試驗)以實施例33中所述的方法對實施例39中制得的人apelin-36進行活性試驗，證實其活性等同于合成產(chǎn)物的活性。
工業(yè)實用性本發(fā)明的多肽參予調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、循環(huán)功能、免疫功能、胃腸功能、代謝功能、生殖功能等，其可用作治療或預防HIV感染或愛滋病(獲得性免疫缺陷綜合癥)等各種疾病的藥物。
序列表〈110〉Takeda Chemical Industries，Ltd.〈120〉多肽，其生產(chǎn)方法及應(yīng)用〈130〉2496WOOP〈150〉JP9-353955〈151〉1998-12-24〈150〉JP10-032577〈151〉1998-02-16〈150〉JP10-220853〈151〉1998-08-04〈150〉JP10-271645〈151〉1998-09-25〈160〉43〈210〉1〈211〉17〈212〉PRT〈213〉?！?00〉1Leu Val Gln Pro Arg Gly Pro Arg Ser Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly1 5 10 15Gly17〈210〉2〈211〉51〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉2YTNGTNCARC CNMGNGGNCC NMGNWSNGGN CCMGGNCCNT GGCARGGNGG N 51〈210〉3〈211〉380〈212〉PRT〈213〉未知〈220〉〈223〉〈400〉3Met Glu Glu Gly Gly Asp Phe Asp Asn Tyr Tyr Gly Ala Asp Asn Gln1 5 10 15Ser Glu Cys Glu Tyr Thr Asp Trp Lys Ser Ser Gly Ala Leu Ile Pro20 25 30Ala Ile Tyr Met Leu Val Phe Leu Leu Gly Thr Thr Gly Asn Gly Leu35 40 45Val Leu Trp Thr Val Phe Arg Ser Ser Arg Glu Lys Arg Arg Ser Ala50 55 60Asp Ile Phe Ile Ala Ser Leu Ala Val Ala Asp Leu Thr Phe Val Val65 70 75 80Thr Leu Pro Leu Trp Ala Thr Tyr Thr Tyr Arg Asp Tyr Asp Trp Pro85 90 95Phe Gly Thr Phe Phe Cys Lys Leu Ser Ser Tyr Leu lle Phe Val Asn100 105 110Met Tyr Ala Ser Val Phe Cys Leu Thr Gly Leu Ser Phe Asp Arg Tyr115 120 125Leu Ala Ile Val Arg Pro Val Ala Asn Ala Arg Leu Arg Leu Arg Val130 135 140Ser Gly Ala Val Ala Thr Ala Val Leu Trp Val Leu Ala Ala Leu Leu145 150 155 160Ala Met Pro Val Met Val Leu Arg Thr Thr Gly Asp Leu Glu Ash Thr165 170 175Thr Lys Val Gln Cys Tyr Met Asp Tyr Ser Met Val Ala Thr Val Ser180 185 190Ser Glu Trp Ala Trp Glu Val Gly Leu Gly Val Ser Ser Thr Thr Val195 200 205Gly Phe Val Val Pro Phe Thr Ile Met Leu Thr Cys Tyr Phe Phe Ile210 215 220Ala Gln Thr Ile Ala Gly His Phe Arg Lys Glu Arg Ile Glu Gly Leu225 230 235 240Arg Lys Arg Arg Arg Leu Leu Ser Ile Ile Val Val Leu Val Val Thr245 250 255Phe Ala Leu Cys Trp Met Pro Tyr His Leu Val Lys Thr Leu Tyr Met260 265 270Leu Gly Ser Leu Leu His Trp Pro Cys Asp Phe Asp Leu Phe Leu Met275 280 285Ash Ile Phe Pro Tyr Cys Thr Cys Ile Ser Tyr Val Ash Ser Cys Leu290 295 300Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Phe Phe Asp Pro Arg Phe Arg Gln Ala Cys305 310 315 320Thr Ser Met Leu Cys Cys Gly Gln Ser Arg Cys Ala Gly Thr Ser His325 330 335Ser Ser Ser Gly Glu Lys Ser Ala Ser Tyr Ser Ser Gly His Ser Gln340 345 350Gly Pro Gly Pro Ash Met Gly Lys Gly Gly Glu Gln Met His Glu Lys355 360 365Ser Ile Pro Tyr Ser Gln Glu Thr Leu Val Val Asp370 375 380〈210〉4〈211〉1140〈212〉DNA〈213〉未知〈220〉〈223〉〈400〉4ATGGAGGAAG GTGGTGATTT TGACAACTAC TATGGGGCAG ACAACCAGTC TGAGTGTGAG 60TACACAGACT GGAAATCCTC GGGGGCCCTC ATCCCTGCCA TCTACATGTT GGTCTTCCTC 120CTGGGCACCA CGGGAAACGG TCTGGTGCTC TGGACCGTGT TTCGGAGCAG CCGGGAGAAG 180AGGCGCTCAG CTGATATCTT CATTGCTAGC CTGGCGGTGG CTGACCTGAC CTTCGTGGTG 240ACGCTGCCCC TGTGGGCTAC CTACACGTAC CGGGACTATG ACTGGCCCTT TGGGACCTTC 300TTCTGCAAGC TCAGCAGCTA CCTCATCTTC GTCAACATGT ACGCCAGCGT CTTCTGCCTC 360ACCGGCCTCA GCTTCGACCG CTACCTGGCC ATCGTGAGGC CAGTGGCCAA TGCTCGGCTG 420AGGCTGCGGG TCAGCGGGGC CGTGGCCACG GCAGTTCTTT GGGTGCTGGC CGCCCTCCTG 480GCCATGCCTG TCATGGTGTT ACGCACCACC GGGGACTTGG AGAACACCAC TAAGGTGCAG 540TGCTACATGG ACTACTCCAT GGTGGCCACT GTGAGCTCAG AGTGGGCCTG GGAGGTGGGC 600CTTGGGGTCT CGTCCACCAC CGTGGGCTTT GTGGTGCCCT TCACCATCAT GCTGACCTGT 660TACTTCTTCA TCGCCCAAAC CATCGCTGGC CACTTCCGCA AGGAACGCAT CGAGGGCCTG 720CGGAAGCGGC GCCGGCTGCT CAGCATCATC GTGGTGCTGG TGGTGACCTT TGCCCTGTGC 780TGGATGCCCT ACCACCTGGT GAAGACGCTG TACATGCTGG GCAGCCTGCT GCACTGGCCC 840TGTGACTTTG ACCTCTTCCT CATGAACATC TTCCCCTACT GCACCTGCAT CAGCTACGTC 900AACAGCTGCC TCAACCCCTT CCTCTATGCC TTTTTCGACC CCCGCTTCCG CCAGGCCTGC 960ACCTCCATGC TCTGCTGTGG CCAGAGCAGG TGCGCAGGCA CCTCCCACAG CAGCAGTGGG 1020GAGAAGTCAG CCAGCTACTC TTCGGGGCAC AGCCAGGGGC CCGGCCCCAA CATGGGCAAG 1080GGTGGAGAAC AGATGCACGA GAAATCCATC CCCTACAGCC AGGAGACCCT TGTGGTTGAC 1140〈210〉5〈211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉5CGTGGSCMTS STGGGCAACN YCCTG25〈210〉6〈211〉27〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉6GTNGWRRGGC ANCCAGCAGA KGGCAAA 27〈210〉7〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉7CAGACAACCA GTCTGAGTGT GAGT 24〈210〉8〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉8ATGGATTTCT CGTGCATCTG TTCT 24〈210〉9〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉9CTGGCAGGGA GGCAGGAGGAA 21〈210〉10〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉10GCAGGAGGAA ATTTCGCAGA CAGC 24〈210〉11〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉11GAAGAGAATT CATCTGTGGA GTA23〈210〉12〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉12ACCGGCACCG GGAGGGCACT T21〈210〉13〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉13GAGAGTCGCG GGCAGAGCAG CGTCAG 26〈210〉14〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉14GAAATCATCC AAGTGAGGGG CGAGAC 26〈210〉15〈211〉77〈212〉PRT〈213〉小鼠〈400〉15Met Asn Leu Arg Leu Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ser1 5 10 15Leu Thr Ala Val Cys Gly Val Pro Leu Met Leu Pro Pro Asp Gly Thr20 25 30Gly Leu Glu Glu Gly Ser Met Arg Tyr Leu Val Lys Pro Arg Thr Ser35 40 45Arg Thr Gly Pro Gly Ala Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg50 55 60Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe65 70 75 77〈210〉16〈211〉231〈212〉DNA〈213〉小鼠〈400〉16ATGAATCTGA GGCTCTGCGT GCAGGCGCTG CTGCTGCTCT GGCTCTCCTT GACTGCAGTT 60TGTGGAGTGC CACTGATGTT GCCTCCAGAT GGAACAGGAC TAGAAGAAGG AAGCATGCGC 120TACCTGGTGA AGCCCAGAAC TTCGAGGACT GGACCAGGAG CCTGGCAGGG AGGCAGGAGG 180AAATTTCGCA GACAGCGCCC CCGGCTCTCC CATAAGGGCC CCATGCCTTT C 231〈210〉17〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉17GAATCTGAGT TTCTGCGTGC AGGC 24〈210〉18〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉18TTAGAAAGGC ATGGGGCCCT TATG 24〈210〉19〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉19GTAGTTGGGA GTCGCGGGCA GAGCAC 26〈210〉20〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉20TAGAACCATG TCAGGATCAG CACTTT 26〈210〉21〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉21AGTCGACGCA TGAATCTGAG TTTCTG 26〈210〉22〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉22GAGCCCTTCA AGCTAGCTTT AGAAAG 26〈210〉23〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉23GTGCCACTGA TGCTGCCTCC AGATGG 26〈210〉24〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉24TTAGAAAGGC ATGGGTCCCT TATG 24〈210〉25〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉25ACGGCAATGT CCGCCACCTG GTGC 24〈210〉26〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉26CCCTGGCAGG GAGGTCGGAG GAAA 24〈210〉27〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉27GGGCCGCTGG CGGCGGAATT TCCT 24〈210〉28〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉28GCTGCACCAG GTGGCGGACA TTGC 24〈210〉29〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉29TTGGCCTCCG GGCGCCCGAC CTCT 24〈210〉30〈211〉27〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉30GACATAACCG CAGGGGGTGG GCACTTG 30〈210〉31〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉31CCTGCTGCTC TGGCTCTGCC TGAG 24〈210〉32〈211〉27〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉32CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27〈210〉33〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉33GCGGTGTGCG GAGGACCCCT GCTG 24〈210〉34〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉34ACTCCTATA GGGCTCGAGC GGC 23〈210〉35〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉35GGCCGCGGCG GCCCAAGGAG CAGC 24〈210〉36〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉36GCGTGTGGTG GCCCCTTCGG TCCT 24〈210〉37〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉37AATCACAGGG GGTGGGCGTG TGGT 24〈210〉38〈211〉77〈212〉PRT〈213〉大鼠〈400〉38Met Asn Leu Ser Phe Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ser1 5 10 15Leu Thr Ala Val Cys Gly Val Pro Leu Met Leu Pro Pro Asp Gly Lys20 25 30Gly Leu Glu Glu Gly Asn Met Arg Tyr Leu Val Lys Pro Arg Thr Ser35 40 45Arg Thr Gly Pro Gly Ala Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg50 55 60Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe65 70 75 77〈210〉39〈211〉231〈212〉DNA〈213〉大鼠〈400〉39ATGAATCTGA GTTTCTGCGT GCAGGCGCTG CTGCTGCTCT GGCTCTCCTT GACTGCCGTG 60TGTGGAGTGC CACTGATGCT GCCTCCAGAT GGGAAAGGGC TAGAAGAAGG CAACATGCGC 120TACCTGGTGA AGCCCAGAAC TTCGAGGACT GGACCAGGGG CCTGGCAGGG AGGCAGGAGG 180AAATTTCGCA GACAGCGGCC CCGTCTCTCC CATAAGGGAC CCATGCCTTT C 231〈210〉40〈211〉77〈212〉PRT〈213〉人〈400〉40Met Asn Leu Arg Leu Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ser1 5 10 15Leu Thr Ala Val Cys Gly Gly Ser Leu Met Pro Leu Pro Asp Gly Asn20 25 30Gly Leu Glu Asp Gly Asn Val Arg His Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser35 40 45Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg50 55 60Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe65 70 75 77〈210〉41〈211〉231〈212〉DNA〈213〉人〈400〉41ATGAATCTGC GGCTCTGCGT GCAGGCGCTC CTGCTGCTCT GGCTCTCCTT GACCGCGGTG 60TGTGGAGGGT CCCTGATGCC GCTTCCCGAT GGGAATGGGC TGGAAGACGG CAATGTCCGC 120CACCTGGTGC AGCCCAGAGG GTCAAGGAAT GGGCCAGGGC CCTGGCAGGG AGGTCGGAGG 180AAATTCCGCC GCCAGCGGCC CCGCCTCTCC CATAAGGGAC CCATGCCTTT C 231〈210〉42〈211〉77〈212〉PRT〈213〉?！?00〉35Met Asn Leu Arg Arg Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Cys1 5 10 15Leu Ser Ala Val Cys Gly Gly Pro Leu Leu Gln Thr Ser Asp Gly Lys20 25 30Glu Met Glu Glu Gly Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln Pro Arg Gly Pro35 40 45Arg Ser Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg50 55 60Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe65 70 75 77〈210〉43〈211〉231〈212〉DNA〈213〉?！?00〉43ATGAATCTGC GGCGCTGCGT GCAGGCGCTC CTGCTGCTCT GGCTCTGCCT GAGCGCGGTG 60TGCGGAGGAC CCCTGCTGCA GACTTCTGAC GGGAAGGAGA TGGAAGAAGG CACCATCCGA 120TACCTGGTGC AGCCCAGGGG GCCGAGGAGC GGCCCAGGCC CCTGGCAGGG AGGTCGGAGG 180AAGTTCCGGC GCCAGCGGCC ACGCCTCTCC CACAAGGGTC CCATGCCTTT C 23權(quán)利要求
1．能夠與包括由SEQ ID No3代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的受體蛋白質(zhì)結(jié)合的多肽、其前體多肽、其酰胺或酯，或其鹽。
2．權(quán)利要求1的多肽，其包括由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物。
3．權(quán)利要求1的多肽，其包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的部分序列。
4．權(quán)利要求1的多肽，其包括(a)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第6至77位氨基酸殘基的肽，(b)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第40至77位氨基酸殘基的肽，(c)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第42至77位氨基酸殘基的肽，(d)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第47至77位氨基酸殘基的肽，(e)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第61至77位氨基酸殘基的肽，(f)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至77位氨基酸殘基的肽，或因其N末端氨基酸(Gln)轉(zhuǎn)變成焦谷氨酸殘基而產(chǎn)生的衍生物，(g)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第1至25位氨基酸殘基的肽，(h)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第6至25位氨基酸殘基的肽，(i)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第42至64位氨基酸殘基的肽，(j)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第61至64位氨基酸殘基的肽，(k)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第43至77位氨基酸殘基的肽，(l)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第41至77位氨基酸殘基的肽，(m)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第66至77位氨基酸殘基的肽，(n)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第67至77位氨基酸殘基的肽，(o)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第64至77位氨基酸殘基的肽，(p)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第63至77位氨基酸殘基的肽，(q)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至76位氨基酸殘基的肽，(r)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至75位氨基酸殘基的肽，或(s)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至75位氨基酸殘基的肽。
5．權(quán)利要求1的多肽，其包括由SEQ ID No15、SEQ ID No38、SEQID No40或SEQ ID No42代表的氨基酸序列中從第65位至第77位氨基酸殘基的氨基酸序列。
6．權(quán)利要求1的多肽，其具有氨基酸序列pGlu Arg Pro Arg Leu SerHis Lys Gly Pro Met Pro Phe。
7．權(quán)利要求1的多肽，其包括由SEQ ID No15、SEQ ID No38、SEQID No40或SEQ ID No42代表的氨基酸序列中從第42位至第77位氨基酸殘基的氨基酸序列。
8．權(quán)利要求1的多肽，其為具有SEQ ID No15所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體多肽。
9．權(quán)利要求1的多肽，其為具有由SEQ ID No38所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體多肽。
10．權(quán)利要求1的多肽，其為具有由SEQ ID No40所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體多肽。
11．權(quán)利要求1的多肽，其為具有由SEQ ID No42所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物的前體多肽。
12．一種DNA，其包括具有編碼能夠與受體蛋白質(zhì)結(jié)合之多肽或其前體多肽的核苷酸序列的DNA，所說的受體蛋白質(zhì)包括由SEQ ID No3所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物。
13．權(quán)利要求12的DNA，其中由之編碼的多肽包括SEQ ID No1所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物。
14．權(quán)利要求12的DNA，其中由之編碼的多肽包括由SEQ IDNo15、SEQ ID No38、SEQ ID No40或SEQ ID No42所代表之氨基酸序列中從第65位至第77位氨基酸殘基的氨基酸序列。
15．權(quán)利要求12的DNA，其中由之編碼的多肽包括由SEQ IDNo15、SEQ ID No38、SEQ ID No40或SEQ ID No42所代表的氨基酸序列中第42位至第77位氨基酸殘基的氨基酸序列。
16．權(quán)利要求12的DNA，其中由之編碼的前體多肽包括由SEQ IDNo15所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物。
17．權(quán)利要求12的DNA，其中由之編碼的前體多肽包括由SEQ IDNo38所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物。
18．權(quán)利要求12的DNA，其中由之編碼的前體多肽包括由SEQ IDNo40所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物。
19．權(quán)利要求12的DNA，其中由之編碼的前體多肽包括由SEQ IDNo42所代表的氨基酸序列或其實質(zhì)性等同物。
20．包括權(quán)利要求12的DNA的重組載體。
21．攜帶權(quán)利要求12的DNA或權(quán)利要求20的重組載體的轉(zhuǎn)化體。
22．生產(chǎn)多肽、其前體多肽或其鹽的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)化體。
23．一種藥物組合物，其中包括如權(quán)利要求1的多肽、其前體多肽，其酰胺或酯，或其鹽。
24．一種藥物組合物，其中包括權(quán)利要求12的DNA。
25．權(quán)利要求23或24的藥物組合物，其為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)劑、循環(huán)功能調(diào)節(jié)劑、免疫功能調(diào)節(jié)劑、胃腸功能調(diào)節(jié)劑、代謝功能調(diào)節(jié)劑或生殖功能調(diào)節(jié)劑。
26．抗權(quán)利要求1的多肽或其前體多肽的抗體。
27．包括權(quán)利要求26的抗體的診斷組合物。
28．篩選能改變權(quán)利要求1的多肽與包括SEQ ID No3氨基酸序列之受體蛋白質(zhì)的結(jié)合活性的化合物的方法，其包括使用權(quán)利要求1的多肽和所說的受體蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種參予調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、循環(huán)功能、免疫功能、胃腸功能、代謝功能、生殖功能等的多肽,其可用作治療或預防HIV或愛滋病(獲得性免疫缺陷綜合癥)等各種疾病的藥物。
文檔編號C07K14/705GK1283228SQ98812634
公開日2001年2月7日 申請日期1998年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月24日
發(fā)明者日沼州司, 立元一彥, 細谷昌樹, 羽畑祐吾, 藤井亮, 北田千惠子 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社