專利名稱：北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的北冬蟲夏草菌株已在《楊宣華；不同氮源對(duì)北冬蟲夏草生長(zhǎng)影響 的研究，佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008， 26(3): 52-54》文獻(xiàn)中公開，可 購(gòu)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院菌種保藏中心。 本發(fā)明涉及的大腸桿菌DH5a菌株已在《劉靜華，包英華，陳燕飛；大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的改進(jìn)，韶關(guān)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008， 29(03): 87-90》文獻(xiàn)中公開。 大腸桿菌DH5a菌株的感受態(tài)細(xì)胞可通過(guò)供應(yīng)商寶生物工程(大連)有限公司購(gòu)買，貨號(hào) D9027。 本發(fā)明涉及的根癌農(nóng)桿菌EHA105已在《黃亞麗，蔣細(xì)良，田云龍，郭萍， 朱昌雄；根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的哈茨木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究，中國(guó)生物工程雜志，2008， 28(3): 38-43》文獻(xiàn)中公開。根癌農(nóng)桿菌EHA105可通過(guò)公開市售的商業(yè)渠道取得，如 可以從澳大利亞CAMBIA公司購(gòu)得，菌株編號(hào)為Gambarl。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些 實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件 的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條 件。 實(shí)施例1 步驟一，北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子的克隆
1、北冬蟲夏草的培養(yǎng)將保藏在試管斜面上的北冬蟲夏草菌株(Cordycepsmilitaris編號(hào)51534，來(lái)源 于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院菌種保藏中心)放至2『C活化24h，挑取試管斜面菌株的菌絲接至含有 馬鈴薯綜合培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar, PDA)平板上，28"恒溫培養(yǎng)7天。將lcm2左 右的生長(zhǎng)在PDA平板上的菌種接至PDA液體培養(yǎng)基，在2『C、 120rpm條件下培養(yǎng)5天。
2、北冬蟲夏草DNA的分離 采用高鹽低pH法提取基因組DNA，包括以下步驟 (1)將lg左右經(jīng)液氮研磨的樣品放入65t:預(yù)熱的提取緩沖液，放入65t:水浴保 溫30min，緩慢振搖，25。C下10,000 Xg離心10min ; (2)吸取上清液，并在試管中加入約為上清液體積2/3毫升的2.5mol/L的KAc高 鹽溶液，混勻后置于0t:保持30min沉淀蛋白質(zhì)； (3)在4。C下10,000Xg離心10min，棄蛋白質(zhì)沉淀。上清液加入由氯仿和異戊 醇按照24 : 1的體積比配成的等體積的氯仿和異戊醇的混合物抽提，在6,000Xg離心 10min，取出水相轉(zhuǎn)入另一離心管，如果中間層仍有白色沉淀，則再用由氯仿和異戊醇按 照24 : 1的體積比配成的氯仿和異戊醇的混合物抽提一次； (4)在上清液中加入約為上清液體積2/3毫升的預(yù)冷異丙醇，混勻后置于-20°C 靜置30min，以沉淀核酸，重復(fù)一次，用體積比為70%乙醇清洗沉淀，在空氣中干燥 50min，將DNA沉淀溶解在TE緩沖液中，分裝存放于-20°?；?t:冰箱中保存。
54/11頁(yè) 3、北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因核心片斷的克隆在分析已報(bào)道的肉座菌目(hypocreales)絲狀真菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的 氨基酸序列(已公開GenBank : XP_386433 ; AAT80324 ; ABQ42571 ; AAR22391 ; Q00584)的基礎(chǔ)上，根據(jù)保守的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物
gpd-F : 5-ATCAACGGNTTCGGNCGNATTGG-3為正向引物
和gpd-R: 5-CATNACGTACATGGGNGCATC-3為反向引物，以北冬蟲夏草基因 組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94t:5min，循環(huán)設(shè)定94°C 變性30s， 45。C退火30s， 72。C延伸lmin， 30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為657bp。然后按常規(guī)方法對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè) 序。測(cè)序結(jié)果使用NCBI的BLAST軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)，知其核 酸序列與已知的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)(已公開GenBank : AY679162)等的甘油 醛-3-磷酸脫氫酶基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)gpd基因。
4、北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子的克隆 采用熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR， TAIL-PCR)反應(yīng)技術(shù) 擴(kuò)增甘油醛-3-磷酸脫氫酶核心片段的啟動(dòng)子序列。即從前人的研究中選取6個(gè)隨機(jī)簡(jiǎn)并 引物，再根據(jù)核心片斷序列末端邊界200-300區(qū)間內(nèi)分別向外依次設(shè)計(jì)TAIL-PCR所需的 3條特異性巢式引物。6個(gè)隨機(jī)簡(jiǎn)并引物與已設(shè)計(jì)的TAIL-PCR的3條特異性巢式引物配 對(duì)進(jìn)行三輪TAIL-PCR反應(yīng)，同時(shí)電泳檢測(cè)三輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。理想的結(jié)果是第二輪中 存在目的條帶，第三輪中會(huì)出現(xiàn)略小于它的特異條帶，第三輪中這條略小的條帶即為目 的條帶。挑選TAIL-PCR第三輪中的特異條帶進(jìn)行克隆、測(cè)序。 將所得的北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶的啟動(dòng)子序列和核心片段序列比對(duì)后 進(jìn)行拼接，得到全長(zhǎng)序列3193bp，生物信息學(xué)分析表明甘油醛-3-磷酸脫氫酶編碼框的 第一個(gè)起始密碼子在(2516-2518bp)處，第一個(gè)起始密碼子ATG前的2515個(gè)堿基為甘油 醛-3-磷酸脫氫酶基因的5'側(cè)翼序列，命名為CmGDPlP，另外的677bp序列為CmGDP 基因序列。將3193bp的序列提交GenBank中進(jìn)行比對(duì)，其中3'端的300bp(2894-3193bp) 序列與球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因編碼區(qū)(已公開 GenBank: AY679162)的同源性為91%。 在5'端的序列中只有三段序列與球孢白 僵菌(Beauveria bassiana)甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子區(qū)有一定的同源性，一段 在414-797bp處，同源性為78%， 一段在1692-1775bp處，同源性為85%，另一段在 2185-2669bp處，同源性為81%，其余區(qū)段未發(fā)現(xiàn)任何同源序列。說(shuō)明所得到的2515bp 序列確定為CmGDP基因的5'側(cè)翼序列，并且是新發(fā)現(xiàn)的序列。 步驟二，北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子的gusA基因的煙草轉(zhuǎn)化
1、北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子的克隆 根據(jù)北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)能擴(kuò)增出到起始密 碼子ATG(SEQ ID NO.l中第2516-2518位核苷酸)為止的5'側(cè)翼序列的引物，在保證雙 元表達(dá)載體(如pCAMBIA 1301)中g(shù)usA報(bào)告基因閱讀框架正確的前提下，在上游和下游 引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定，如選用載體pCAMBIA 1301 則上游可用BamH I和下游可用Bgl 11)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以北冬蟲夏草基因組DNA 為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因5'側(cè)翼序列克隆至中間載體(如pMD 18-Tvector)，測(cè)序結(jié)果與所得的2515bp CmGDPlP的5'側(cè)翼序列比較， 一致性為100%，表明擴(kuò)增沒(méi)有出現(xiàn)錯(cuò)配。
2、真核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)引物兩端設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，用雙酶切(pCAMBIA 1301載體則可用BamH I和 Bgl II)將CmGDPlP片斷從pMD 18-T vector上切下，把酶切后回收的CmGDPlP片斷與 經(jīng)同樣的酶(pCAMBIA 1301載體則可用BamH I和Bgl II)酶切的載體片斷相連。將連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株中，提取質(zhì)粒DNA，用雙酶切鑒定。將構(gòu)建好的載體命 名為P1301-CmGDPlP。 大量提取構(gòu)建的表達(dá)載體(pl301-CmGDPlP)的質(zhì)粒DNA，取 20uL(約lug)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，在28°C 、 YEB培養(yǎng)基(含卡那霉素lOOug/ ml，鏈霉素125ug/ml)上培養(yǎng)兩天。各挑選兩個(gè)克隆做菌液PCR鑒定，均擴(kuò)增出目標(biāo)條 帶。 3、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草葉片 (1)挑取LB選擇平板(40mg/L利福平，25mg/L鏈霉素，75mg/L卡那霉素)上的 陽(yáng)性單菌落，接種于2mlLB液體培養(yǎng)基(40mg/L利福平，25mg/L鏈霉素，75mg/L卡那 霉素)，28°C ， 200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)；(2)取lml以上培養(yǎng)物，加入50mlLB液體培養(yǎng)基(40mg/L利福平，25mg/L鏈霉 素，75mg/L卡那霉素)中，28°C， 200rpm振蕩培養(yǎng)至OD260 = 0.6-1.0 ;
(3)將培養(yǎng)物5000rpm離心10分鐘，收集菌體； (4)用MMA培養(yǎng)基(MS， 30g/L蔗糖，200uM乙酰丁香酮，10mMMES， pH = 5.8)重懸，使OD26。 = 2.4， 28°C 180rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)； (5)取生長(zhǎng)兩周左右的煙草的無(wú)菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約l平方厘米 見方的小葉片； (6)將大約200片葉盤放入兩瓶200ml農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中，28°C， 190rpm振蕩培養(yǎng) 10分鐘；(7)將葉片平鋪在MS(MS粉，30g/L蔗糖，2.5mg/L植物凝膠)培養(yǎng)基平板上， 28t:暗培養(yǎng)3天； (8)三天后轉(zhuǎn)入MS篩選培養(yǎng)基(含3mg/L6-BA， 0.2mg/L NAA，含卡那霉素 100iig/L，噻孢霉素250iig/L， pH5.8)中，28。C光照培養(yǎng)，每日光照12-16小時(shí)。每2 周繼代一次，每次將變黃的葉片或愈傷組織丟掉，大的愈傷組織切割成小塊，經(jīng)2-3次繼 代后，培養(yǎng)的愈傷組織陸續(xù)分化出苗。將幼苗轉(zhuǎn)移入罐頭瓶裝的MS固體培養(yǎng)基(含卡那 霉素100iig/L，鏈霉素125iig/L， pH5.8)中，28。C光照培養(yǎng)，待其根系發(fā)育完全后，移 栽到溫室中。 步驟三，煙草轉(zhuǎn)基因后代的分子檢測(cè)及CmGDPlP啟動(dòng)子活性的檢測(cè)
1、煙草轉(zhuǎn)基因后代的分子檢測(cè) (l)煙草總DNA小量提取取煙草幼嫩葉片150mg左右于1.5ml離心管中，研成粉 末。加800iU65t:預(yù)熱的SDS裂解緩沖液(0.1MTris-HCI， 0.05M EDTA， 0.5MNaCl， 1%SDS)，振蕩混勻。65t:水浴20分鐘，加入250 iU 5M KAc，冰浴5分鐘，4°C、 12000rpm離心10分鐘。取上清于另一 1.5ml離心管中，4°C、 12000rpm再離心5分鐘。將 上清轉(zhuǎn)入另一干凈離心管，加入600iU異丙醇，充分混勻，4°C 12000rpm離心15分鐘。最后用體積比為70%乙醇清洗沉淀2次，真空干燥后，加80iU滅菌重蒸水溶解DNA;
(2)PCR檢測(cè)根據(jù)gusA基因的序列設(shè)計(jì) 一 對(duì)引物GuS-F和GuS-R，用這對(duì)引 物檢測(cè)用SDS法提取的轉(zhuǎn)基因煙草DNA。其中，PCR反應(yīng)體系組成如下10X緩沖 液2.5 ii 1， dNTP混合物(每種10mM)0.5 y 1， GUSF(濃度為10 y M)0.5 y 1， GUSR(濃 度為10iiM)0.5iiL， Taq酶(濃度為5U/lyL)0.5iiL，轉(zhuǎn)基因煙草總DNA(濃度為20ng/ y L)l y L，滅菌水定容至25 ii L。 PCR檢測(cè)結(jié)果表明陽(yáng)性煙草植株與待檢測(cè)煙草植株的 株數(shù)比為80%。 2、 CmGDPlP啟動(dòng)子活性的檢測(cè) 將PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的煙草植株，提取其6-8片葉小苗的根，莖、莖基 和葉，花的萼片、花瓣、花柄、雌蕊和雄蕊，完全伸張開的成熟葉片，開花后20天 的未成熟種子和成熟種子的總蛋白，定量檢測(cè)gusA基因編碼蛋白P-葡萄糖苷酸酶 (13 -Glucuronidase)的活性，分析CmGDPlP的組織特異性驅(qū)動(dòng)活性。
具體步驟如下 (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用反應(yīng)終止液(0.2M Na2C03)將4-MU(4-甲基傘形酮)配制 成O.OO、 6.25、 12.50、 50.00、 100.00、 250.00、 500.00、 lOOO.OOpM的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，通
過(guò)測(cè)定它們的熒光強(qiáng)度，作出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 [OO53] (2)總蛋白提取與蛋白濃度的測(cè)定 ①取O.lg材料于1.5ml離心管中，加入液氮，研成粉末；②力Q 600uL酶提取液(0.05M pH7.0磷酸緩沖液，0.1 % SDS， 0.01M
pH8.0EDTA， 20 %甲醇，0.1 % Triton X-IOO， 0.1 %巰基乙醇)，在13000rpm 4 °C離心
10min，取上清于新的離心管中，-201:保存?zhèn)溆茫?③取上清，用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白的含量。 (3) 13 -葡萄糖苷酸酶的酶促反應(yīng)及其熒光定量 ①取50uL含GUS的上清，加入到450uL37。C預(yù)熱的檢測(cè)液(2mM4-MUG溶液) 中，迅速充分混勻； ②立刻取出50uL加入到950uL反應(yīng)終止液(0.2M Na2C03)，將該管作為酶促反應(yīng) 的0點(diǎn)； ③分別在10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘和60分鐘從反應(yīng)液中取出50uL， 轉(zhuǎn)入950uL的反應(yīng)終止液中； ④酶促反應(yīng)結(jié)束后，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)365nm、發(fā)射波長(zhǎng)455nm 下，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的熒光值； ⑤根據(jù)測(cè)定的熒光值以及參與反應(yīng)的總蛋白，求出GUS活性。GUS活性二單位 時(shí)間內(nèi)反應(yīng)生成的MU/蛋白量(單位nM A-MU.mii^.mg-1蛋白)。 |3 -葡萄糖苷酸酶基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的13 -葡萄糖苷酸酶(|3 -Glucuronidase)活性測(cè) 定結(jié)果表明CmGDP基因起始密碼子ATG上游2515bp的序列(CmGDPlP)足以啟動(dòng)報(bào) 告基因gusA在煙草的不同組織中表達(dá)。 步驟四，北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gusA在北冬蟲夏 草中的表達(dá)將北冬蟲夏草CmGDPlP中5'端側(cè)翼序列(位于SEQ ID NO.l中第l-2515bp)
8構(gòu)建入雙元載體(如pCAMBIA 1300)之中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化北冬蟲夏草菌絲體，最后得到具有抗性的菌株。 1、北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子的克隆 根據(jù)北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出5'端側(cè)翼序列的引物，在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定，如選用載體pCAMBIA 1300則上游可用Xma I和下游可用Pst 1)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以北冬蟲夏草基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因5'端側(cè)翼序列克隆至中間載體(如pMD 18-Tvector)，測(cè)序結(jié)果與所得的2515bpCmGDPlP的5'側(cè)翼序列比較， 一致性為100%，表明擴(kuò)增沒(méi)有出現(xiàn)錯(cuò)配。
2、真核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)引物兩端設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，用雙酶切(pCAMBIA 1300載體則可用Xma I和Pst I)將CmGDPlP片斷從pMD 18-T vector上切下，把酶切后回收的CmGDPlP片斷與經(jīng)同樣的酶(pCAMBIA 1300載體則可用Xma I和Pst I)酶切的載體片斷相連。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a菌株中，提取質(zhì)粒DNA，用雙酶切鑒定。將構(gòu)建好的載體命名為P1301-CmGDPlP。 大量提取構(gòu)建的表達(dá)載體(pl300-CmGDPlP)的質(zhì)粒DNA，取20uL(約lug)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，在28t:、 YEB培養(yǎng)基(含卡那霉素100ug/ml，鏈霉素125ug/ml)上培養(yǎng)兩天。各挑選兩個(gè)克隆做菌液PCR鑒定，均擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。
3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的北冬蟲夏草轉(zhuǎn)化 (1)挑取LB選擇平板(40mg/L利福平，25mg/L鏈霉素，75mg/L卡那霉素)上的陽(yáng)性農(nóng)桿菌單菌落，接種于2mlLB液體培養(yǎng)基(40mg/L利福平，25mg/L鏈霉素，75mg/L卡那霉素)，28°C ， 200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)；(2)取lml以上培養(yǎng)物，加入50mlLB液體培養(yǎng)基(40mg/L利福平，25mg/L鏈霉素，75mg/L卡那霉素)中，28°C， 200rpm振蕩培養(yǎng)至OD260 = 0.6-1.0 ;
(3)將培養(yǎng)物5000rpm離心10分鐘，收集菌體；(4)用IM培養(yǎng)液(10mM磷酸緩沖液(pH 7.0)， 2.5mM NaCl， 2mM MgS04，0.45mM CaCl2， 9uM FeS04， 4mM(NH4)2S04， 10mM葡萄糖，40mM 2-嗎啉乙磺酸，0.5%甘油，200iiM乙酰丁香酮)重懸，使0026。 = 0.15， 28°C 200rpm振蕩培養(yǎng)3-6小時(shí)； (5)5000rpm離心收集北冬蟲夏草菌絲，用研磨杵磨碎，用10倍體積的PDA培養(yǎng)液懸浮備用； (6)將剛在IM培養(yǎng)液中培養(yǎng)完的農(nóng)桿菌菌液與北冬蟲夏草菌絲PDA懸浮液按1 : 1(v/v)混勻，圖布于上層鋪有濾紙(Whatman 3MM)的CM培養(yǎng)基(與IM培養(yǎng)基相同，除10mM葡萄糖改為5mM葡萄糖，加1.5%凝膠)平板上，23。C共培養(yǎng)3天。
(7)揭下CM平板上的濾紙，將濾紙反鋪到PDA篩選培養(yǎng)基(潮霉素，500 y g/mL頭孢霉素)平板上，28t:暗培養(yǎng)2天； (8)揭去PDA篩選平板上的濾紙，2『C再暗培養(yǎng)5天，每天檢查新的單菌落，挑出單菌落接種于新的篩選PDA培養(yǎng)基。
4、北冬蟲夏草轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證
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(l)PCR檢測(cè)陽(yáng)性北冬蟲夏草轉(zhuǎn)化子 ①采用高鹽低pH法提取5個(gè)北冬蟲夏草轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，同步驟一 ；
②在北冬蟲夏草gpd啟動(dòng)子和雙元載體中抗性基因(如pCAMBIA 1300的潮霉素抗性基因)序列中，分別設(shè)計(jì)一個(gè)上游引物和一個(gè)下游引物，以此達(dá)到能同時(shí)擴(kuò)增兩者部分序列的目的； ③以北冬蟲夏草轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，以設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。
結(jié)果表明所選5個(gè)轉(zhuǎn)化子皆能擴(kuò)增出包含抗性基因和北冬蟲夏草啟動(dòng)子的片斷，從而證明以北冬蟲夏草gpd啟動(dòng)子構(gòu)建的雙元載體可以通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化北冬蟲
夏草菌絲體。(2)Southem blot檢測(cè)陽(yáng)性北冬蟲夏草轉(zhuǎn)化子 ①采用高鹽低pH法提取5個(gè)北冬蟲夏草轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，同步驟一 ；
②選取CmGpdlp啟動(dòng)子和載體上抗性基因中不具有識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)北冬蟲夏草轉(zhuǎn)化子基因組DNA進(jìn)行37t:酶切24小時(shí)以上，酶切后進(jìn)行電泳驗(yàn)證，直至確認(rèn)酶切已徹底； 配置0.8%瓊脂糖凝膠，向每管DNA酶切產(chǎn)物中加入6Xloading buffer,點(diǎn)樣，常溫下于lV/cm電泳12小時(shí)左右，至溴酚藍(lán)遷移至凝膠的3/5距離處；
Southern凝膠轉(zhuǎn)膜和固定，按照Amershan Biosciences公司的Hybond-N+中的說(shuō)明書進(jìn)行； ⑤以載體上包含抗性基因和北冬蟲夏草gpd啟動(dòng)子的片段設(shè)計(jì)一對(duì)探針引物；
⑥探針的標(biāo)記，雜交，用1XSSC、 0.1% SDS的溶液在65t:下進(jìn)行雜交后的洗膜，操作步馬聚按照Amershan Biosciences公司的ALkphos Direct labeling and DetectionSystem試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，其中1 X SSC和0.1 % SDS溶液的配置可參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行； ⑦使用CDP-Star Detection Kit(Amershan Biosciences公司)檢測(cè)雜交信號(hào)，然后進(jìn)行放射自顯影，操作過(guò)程都按照使用說(shuō)明書進(jìn)行。 結(jié)果表明5個(gè)轉(zhuǎn)化子都產(chǎn)生單一的清晰條帶，表明帶有北冬蟲夏草gpd啟動(dòng)子的抗性基因已經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入北冬蟲夏草。再次證明以北冬蟲夏草gpd啟動(dòng)子構(gòu)建的雙元載體可以通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化北冬蟲夏草菌絲體。
5、北冬蟲夏草中g(shù)usA活性的驗(yàn)證 選PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的北冬蟲夏草菌絲提取其總蛋白，定量檢測(cè)gusA基因編碼蛋白P -葡萄糖苷酸酶(P -Glucuronidase)的活性，分析CmGDPIP的在北冬蟲夏草菌絲中的活性。具體步驟如下[OO97](1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(同步驟三)；
OO98] (2)總蛋白提取與蛋白濃度的測(cè)定(同步驟三)； (3) |3 -葡萄糖苷酸酶的酶促反應(yīng)及其熒光定量(同步驟三)； |3 -葡萄糖苷酸酶基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的13 -葡萄糖苷酸酶(|3 -Glucuronidase)活性測(cè)定結(jié)果表明CmGDP基因起始密碼子ATG上游2515bp的序列(CmGDPIP)足以啟動(dòng)報(bào)告基因gusA在北冬蟲夏草的菌絲中表達(dá)。
實(shí)施例2
步驟一，缺失啟動(dòng)子片斷的PCR擴(kuò)增
(l)引物的合成 根據(jù)北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)能擴(kuò)增出2000bp長(zhǎng) 短的啟動(dòng)子區(qū)的一段序列(SEQ ID NO.l中第501-2515位核苷酸)。引物序列為上游引 物5' -AGACGGCTTTGGGCGGCTGCTTGC-3';下游弓l物為5' -TGTTCTTGATTA GAAAAGTGAGGTG-3';
(2)PCR擴(kuò)增 以北冬蟲夏草基因組DNA為模板，使用步驟(l)中所述的引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增 后，將北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因5'側(cè)翼的部分序列(約2000bp)克隆至中間 載體(如pMD 18-T vector),測(cè)序結(jié)果與所得的2515bp CmGDPlP的5'側(cè)翼序列比較， 與SEQIDNO.l中第501-2515位核苷酸一致性為100%，表明擴(kuò)增沒(méi)有出現(xiàn)錯(cuò)配。
步驟二，探針的制備 以SEQIDNO.l中第1-2515位核苷酸為探針，探針標(biāo)記的操作步驟按照 Amershan Biosciences公司的ALkphos Direct labeling and Detection System試齊ll盒說(shuō)明書進(jìn) 行。 步驟三，Southern blot (1)缺失的啟動(dòng)子的序列的擴(kuò)增 按步驟一的方法擴(kuò)增出有缺失的啟動(dòng)子的序列(SEQIDNO.l中第501-2515位核 苷酸)； (2)電泳 配置0.8%瓊脂糖凝膠，向每管DNA片斷中加入6Xloading buffer,點(diǎn)樣，常溫 下于1V/cm電泳12小時(shí)左右，至溴酚藍(lán)遷移至凝膠的3/5距離處；
(3)轉(zhuǎn)膜和固定Southern凝膠轉(zhuǎn)膜和固定，按照Amershan Biosciences公司的Hybond-N+中的說(shuō) 明書進(jìn)行；
(4)雜交用1XSSC、 0.1% SDS的溶液在65t:下進(jìn)行雜交后的洗膜，操作步驟按照 Amershan Biosciences公司的ALkphos Direct labeling and Detection System試齊ll盒說(shuō)明書進(jìn) 行，其中1XSSC和0.1% SDS溶液的配置可參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行；
(5)檢測(cè) 使用CDP-Star Detection Kit(Amershan Biosciences公司)檢測(cè)雜交信號(hào)，然后進(jìn) 行放射自顯影，操作過(guò)程都按照使用說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果表明缺失的啟動(dòng)子與探針雜交后能產(chǎn)生單一的清晰條帶，即得到在高嚴(yán)謹(jǐn)
條件下可與序列表中SEQ ID NO.l中限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。 序列表 <110>上海交通大學(xué) <120>北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子
<160>1<170>PatentIn version 3.1
<210>1 <211>3193 <212>DNA <213>北冬蟲夏草(Cordyceps militaris) <220> <221>Promoter <222>(1)"'(2515) <400>1 agtgtagtat cataggccaa ggacgtagag ttgaggctct tcagatcaat ggagacgccc 60 ttgtcgatgt tattgaaccc aggattggga ttatggcctc cagatttgac tgagaactgg 120 cagtaattgg ttgtgagaag ctcgacaatg acagacatgt ctcgggacga tgagggcgtc 180 actacacatc cgggatgctg catggaagtg gtggccgcgg atctcggagc tcgggttcac 240 ggcg昭racg ccg昭g^ac ^c昭^ctc ttg鄉(xiāng)啤3 gg昭礎(chǔ)cga gc昭gg鄉(xiāng)g 300 gccra昭cra ttcractc^ raracg昭ct tgtgcc^ct昭昭cgg^c昭gatccttg 360 ccacgactgc attctagaat gccgaattgg agccctgggg tagttagtgg gaatcgagac 420 cgttgtctac gccccgggtt cttcccccag gaaagcggct cgcttgctgg tccaatcttc 480 tgccgagcag ggccggggcc agacggcttt gggcggctgc ttgctctggg ccggacaagg固 aaggaggaca agccaaagca acgcacccgt tctgctccgg ccctggggcg gaagaagtgg 600 aacaagacgg gcagcgcagc cctgcggtta tcgtgatgcg cccgaacttt gccgcgtcta 660 敏gggac昭昭cgtgccat t她t敏^ c昭g^3cca ^ggacg^3啤c昭racc 720 tggttccgat gcttgtgtaa agagcaaaat catagaggtt tgcgcacgac gccgtgctgg 780 cctccccaca cctgcgatgg ttatgcaatt acaagagatt tgatccctct ccccctcttc 840 taccggaatt tgctatgagt gatttttcca ttggcagcgc gctgttttca ctgacctggt 900 tcttatcggc ggctgcgcag cggagtgcac tgtactggcc tagcgctgtt gcagatacag 960 gatgaacagg gacgacgggg gtacttgagg agtactgagc ttggtgtgca acaaaggcag 1020 gcaaccgggt cgaatcggag ggcagatgct ggtacctcag aggttcccca caccggaccg 1080 gcctcagaaa gcgatttaat tttagcattt tcgcagggcg tcaaacagtg aagggcaaag 1140
3敏ggcg3t她cgt昭gt ^totttra昭a(bǔ)cccgctc cca^^鄉(xiāng)1200 cgcagtgcag tgccaacagg gtgcgttgac gctgccgcat gctgaggctg gtgaatatga 1260 ctagccggag acattgctat tcgggccttg tctgttatcg attcggtgcc caggcgcata 1320 ttacggcgtg agtgtgtaat gggaatggag tcagccggcg ccagatcgga ggacgctgaa 1380 tgaggaccaa gagtgtactt ttcccggcgc ggccggacta agacggtttc actaatacgc 1440 catggaatca tggatgggag ccttgtcgtg tcatcttggt ggccaatttg tctattctgg 1500 tagttccgcc gtggccaact tgacggttca ctggttttgt gtcttgatga ctgacaaaga 1560 gggccagaga tgagacgacg agctgccggt tgcaccatca gccaaccgtt cgcagaaatc 1620 atcagttgcg ctacagtcaa catagcgggt ggtcaaagtt tgcgtgggca cgggttgccg 1680 cacgagttgg aacgtcagta aagtggggga ggggaagcaa ccagaacgag gccaattgaa 1740 tgggatgaag gcgtctggga gggaagcacg agcgtgaatg aatggacggt tgcgtgactc 1800 tggtctcgcg atttcgatcg agtcaaggaa cccgtatggt tgcctcttgt cttggagagc 1860
1211/11頁(yè) tcgtcgaggc ccaagctgcg agtatatggt tggtgatgcg ctgggcattt gcccctctct 1920 gcccctccat ggacggacct gcagctcttg ggctggcaag gtgttgcgct acgtcgagat 1980 gcggttaggt aagctggcat aagctggcat aaggttggct gttcttgaga aatcaggcca 2040 gc敏cttgc acctctctgg clac昭gctc tcc昭cggtc昭ccaccgcc actcc昭cgc 2100 ctgtttttca ctgacgatgg ccttgttttt ttgttgctct ggcagctggc aagctgggtc 2160 ccggragctg ccacggcc^ gcraccc昭g aclac^^c ratttgccra cccctcctct 2220 tcgccgtgcg tctcttcttt ttctcccctc ratoracct cattcttc昭ttc^昭g^ 2280 caaaagtgag ttttccatcc gtcccacacc tggctccatc atctcgagct tcattgcttc 2340 ttgaccatct accacgctct accctccaac agcttcgctc acccaagagc tgcctgcttt 2400 tcccctcctc tcracgaccc cgcratcrac cacttocct a^gtoccc ctcgctocc 2460 gcra^cgtc cc^c昭gtt tttcttctct racctcactt ttctotc^ g^c礎(chǔ)ggc 2520 tcccgtcaag gttggcatca acggcttcgg ccgcattggc cgcattgtct tccgcaacgc 2580 cgtcgagcac aacgacatcg acgttgttgc cgtcaacgac ccctttgttg aggtcaagta 2640 cgccgtg敏ttracraccc graccg3她^gct她cc cttgcctgca ccccgarac3 2700 gccttgctgt tatggctgtg gctgtggctg tggctgtgac gtggtaggat tgtcaatttt 2760 ggc^cccgc tra^c昭ct atc昭gcrac gctgccgctg cttgtgacra ggtt噸gtt 2820 tggttggtaa agcgaaccaa acctcataat cgctctacta gtgccaaagg cgaacactcg 2880 tcaacctcat ttgccaataa gctgctaacc attcatcgcg caggcctaca tgctcaagta 2940 tgactcctcc cacggtgttt tcaagggcga gattgccatt gacggcaacg atctcgtcgt 3000 c^cggc鄉(xiāng)鄉(xiāng)3ttcgct tclacggcga gcgcgacccc gccgcrattc cctgg^gga 3060 gaccgccgcc g敏acgttg tcg敏ccac tggtgtcttc 3cracratcg 3ra昭gcc^ 3120 ggctracttg c昭ggtggtg cc鄉(xiāng)^ggt ratcatctcg gccccctctg ccgacgcccc 3180 tatgtacgtg atg 319權(quán)利要求
一種北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子，其特征在于，具有SEQ ID NO.1中第1-2515位所示的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO.1中第1-2515位所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子，其特征是， 所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為用1XSSC、 0.1% SDS溶液在65t:下洗膜。
全文摘要
一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的北冬蟲夏草甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子具有SEQ ID NO.1中第1-2515位所示的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO.1中第1-2515位所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子可啟動(dòng)報(bào)告基因gusA基因在真菌的菌絲體和子實(shí)體中高效表達(dá)，特別是在北冬蟲夏草的菌絲體和子實(shí)體中有較高的活性。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101691570SQ20091004669
公開日2010年4月7日 申請(qǐng)日期2009年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月26日
發(fā)明者周選圍, 唐克軒, 龔振華 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)