專利名稱：一類茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)序列標(biāo)簽及其生物芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一類茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)序列標(biāo)簽及其生物芯片。呼吸代謝糖酵解中催化甘油醛-3-磷酸脫氫為1，3-二磷酸甘油酸的關(guān)鍵酶類。
背景技術(shù)：
生物體基因組中可轉(zhuǎn)錄表達(dá)的序列(即基因)僅占總序列的2％左右，對這部分序列進(jìn)行測定，將直接導(dǎo)致新基因的發(fā)現(xiàn)，并獲取基因組中與產(chǎn)業(yè)化關(guān)系最為密切的信息。20世紀(jì)80年代，高通量的自動測序的出現(xiàn)，使從質(zhì)?；パa(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary DNA，簡稱cDNA，下同)文庫隨機(jī)選取許多cDNA克隆和測定來自非載體兩端的幾百個堿基(Base Pair，簡稱bp，下同)的脫氧核糖核酸(簡稱DNA，下同)序列成為可能。這些短的DNA序列叫作“表達(dá)序列標(biāo)簽”(Expressed Sequence Tags，簡稱ESTs)。表達(dá)序列標(biāo)簽的概念最早是由Adams等在1991年提出來的(Science，252(5013)1651-1656)。隨后Venter等(1991)(Science，252(5013)1651-1656)創(chuàng)立了大規(guī)模表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)，其基本特征就是從以質(zhì)粒為載體，構(gòu)建完成的目的組織cDNA文庫中，隨機(jī)選擇許多cDNA克隆，利用質(zhì)粒上攜帶的通用引物對cDNA兩端進(jìn)行一輪脫氧核糖核酸序列測定，所獲得的來自3′端或5′端的幾百個堿基的非載體短脫氧核糖核酸序列。1992年Sikela和Matsubara(Sikela，et al.Nucleic Acids Research 19，1837-1843；Matsubara，et al.Nature Genetics，2，173-179)針對獲得大量信使核糖核酸(mRNA，下同)序列的迫切需要，提出大規(guī)模cDNA測序的研究戰(zhàn)略。簡而言之，表達(dá)序列標(biāo)簽是來自表達(dá)基因片段3′端或5′端的短脫氧核糖核酸序列(通常為300-500bp)，代表一個特定組織或發(fā)育階段的表達(dá)基因部分轉(zhuǎn)錄片段。表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)對于基因組研究缺乏的物種，如茶樹，具有特別重要的意義和價值。
根據(jù)表達(dá)標(biāo)簽序列提供的序列信息設(shè)計(jì)合成基因特異引物(Gene specific primer，GSP)在使用Oligo(dT)對mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的同時加上錨定引物(Anchored primer)，然后在總RNA中，采用cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid amplification cDNA ends)技術(shù)，獲得目的基因的全長序列。也可以用該標(biāo)簽序列提供的信息設(shè)計(jì)引物，合成探針對cDNA文庫進(jìn)行篩選，挑取最長的陽性克隆進(jìn)行測序，以期獲得目的基因。邢桂春等(中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2001，17(2)203-208)用電子延伸結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆出了腫瘤相關(guān)MAGE基因家族的一個新基因MAGE-D1；羅瑛等(生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2001，28(2)188-191)據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)巢式PCR引物，成功分離了RIG1基因的全序列；Qian J等(Acta Biochem Biophys Scnica，2001，33(2)147-152)用一個與泛蛋白途徑相關(guān)的表達(dá)序列標(biāo)簽序列，結(jié)合RACE-PCR技術(shù)分離了UBAP1基因全長。
隨著生物技術(shù)和生命科學(xué)發(fā)展的需要以及表達(dá)序列標(biāo)簽固有的特點(diǎn)，近幾年，人們發(fā)明了生物芯片。生物芯片(Biochips)的實(shí)質(zhì)就是在面積不大的基片上有序地點(diǎn)陣排列了一系列固定于一定位置地可尋址的生物識別分子(Lipshutz，RJ et al.Bio Techniques 19(1995)，442-447；Fodor，SP et al.Nature 364(1993)，555-556；Fodor，SP et al.Science 251(1991)，767-773；Pease，AC et al.Proceedings of National Academy of Science，USA 91(1994)，5022-5026)。由于最初的生物芯片主要是用于DNA序列測定、基因表達(dá)譜鑒定(Lockhart，DJ et al.Nature Biotechnology14(1996)，1675-1680)、基因突變體的檢測和分析(Feriotto，G et al.，Human Mutation 13(1999)，390-400；Hacia，JG et al.Nature Genetics 21(suppl 1)(1999)，42-47；Hacia，JG et al.NatureGenetics 22(1999)，164-167；Nilsson，P et al.Bio Techniques 26(1999)，308-316)，所以又稱為DNA芯片或生物芯片。目前，這一技術(shù)已擴(kuò)展至免疫反應(yīng)、受體結(jié)合等非核酸領(lǐng)域，因此生物芯片已超出了原來的范圍。如今生物芯片主要包括cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列、動電微陣列、蛋白質(zhì)芯片和免疫芯片等，還出現(xiàn)了組織芯片、細(xì)胞芯片、多肽芯片、質(zhì)譜芯片和電芯片等新的品種和技術(shù)。
1995年10月P.Brown和他的同事(Bio Techniques，19(1995)，442-447)提出了cDNA微陣列技術(shù)，M.Schena(Science 270(1995)，467-470)和D.Shalon(Genome Research 6(1996)，639-645)等首次制造了cDNA陣列，隨后這項(xiàng)技術(shù)得到了飛速的發(fā)展。運(yùn)用生物芯片技術(shù)，將獲得的芯片運(yùn)用雜交技術(shù)和掃描技術(shù)對生物芯片進(jìn)行芯片處理、有效數(shù)據(jù)提取、分析和報(bào)告，可獲得相應(yīng)的基因表達(dá)譜(Gene expression profiling)。目前DNA芯片因具有強(qiáng)有力性、靈活性、敏感性和相對簡單等特點(diǎn)而被應(yīng)用在許多領(lǐng)域，如DNA序列測定、基因多態(tài)性檢測(Wang，et al.Science 280(1998)，1077-1082；Nalushka，et al.Nature Genetics 22(1999)，239-247)、新基因的發(fā)現(xiàn)、疫苗和藥物研究、植物的抗逆性研究(Schenk，PM et al.Proceedingsof National Academy of Science，USA，97(2000)，11655-11660)、有機(jī)體的發(fā)育、調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的基因的協(xié)調(diào)性研究、檢測不同發(fā)育時期不同組織中基因的波動性活動等。分析基因組規(guī)?；幕虮磉_(dá)數(shù)據(jù)，將最終導(dǎo)致對細(xì)胞分化的整體性觀察，涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、能量代謝、胞間和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、免疫反應(yīng)的產(chǎn)生、細(xì)胞遷移的基因組分子圖譜等。表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片用于生物功能的研究和檢測平臺。生物包括動物、植物以及它們的器官、植物的種子、動植物細(xì)胞和它們的產(chǎn)物；所說的生物功能的研究包括基因藥物、疫苗、植物的抗逆性、動植物育種和植物新品種的產(chǎn)生、動植物生長和發(fā)育的機(jī)理和藥物的毒理學(xué)；生物功能的檢測包括轉(zhuǎn)基因植物的安全性檢測、食物成分的功能性評估、病原體的檢測和診斷、生物物種的鑒定，包括動植物和微生物?？鼓嫘园垢珊怠⒖共『?、抗蟲害、抗低溫和抗鹽堿的特性。
通過對茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)序列標(biāo)簽及其構(gòu)成的生物芯片進(jìn)行基因表達(dá)分析，有助于發(fā)現(xiàn)并克隆基因家族新成員、基因定位克隆、作為序列標(biāo)簽位點(diǎn)(Sequence-Tagged Sites，簡稱STSs)進(jìn)行染色體的基因定位和基因圖譜制作、遺傳突變位點(diǎn)的鑒定、分析基因在不同組織中的表達(dá)特異性和建立DNA物理圖譜和對細(xì)胞和有機(jī)體的整體研究等。正因?yàn)楸磉_(dá)序列標(biāo)簽具有如此的優(yōu)越性，因此表達(dá)序列標(biāo)簽測序已經(jīng)成為許多基因組研究機(jī)構(gòu)的工作重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一個目的是提供一類茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)序列標(biāo)簽及其生物芯片。
本發(fā)明另一個目的是提供一種茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因表達(dá)的分析檢測。
本發(fā)明另一個目的是提供一種茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的克隆。
一類分離出的茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)序列標(biāo)簽的序列表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ IDNo.1～SEQ ID No.3所示的序列；所示3條序列中的一條或數(shù)條的組合；每條序列的互補(bǔ)序列或同源序列；每條序列中8～100個連續(xù)核苷酸為探針的序列或其互補(bǔ)序列。
它的制備方法為1)茶樹總核糖核酸(RNA)提?。?)信使核糖核酸(mRNA)分離與純化；3)采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)第一鏈和第二鏈；4)cDNA酶切、純化，并與載體連接；5)產(chǎn)生噬菌體文庫與質(zhì)粒cDNA文庫轉(zhuǎn)化；6)重組質(zhì)粒的培養(yǎng)和提取；7)表達(dá)序列標(biāo)簽序列的測定；8)剔除載體序列、冗余序列，互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索、分類，獲得SEQ ID No.1～SEQ IDNo.3表達(dá)序列標(biāo)簽序列。
一種由權(quán)利要求1所述表達(dá)序列標(biāo)簽所組成的生物芯片在載體上結(jié)合有SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的序列；同源序列或其互補(bǔ)序列的核酸分子；所說的核酸分子是脫氧核糖核酸；核糖核酸和多聚寡核苷酸。
所說的芯片制備方法為1)對SEQ ID No.1～SEQ ID No.3表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增；2)PCR產(chǎn)物純化處理后用于芯片制作；3)芯片由芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)制。
所說的載體為固相載體或液相載體；固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維素膜、凝膠。
一種茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因表達(dá)的分析檢測利用表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的序列；所示的序列中的一條或數(shù)條的組合；每條序列的互補(bǔ)序列或同源序列；每條序列中的8～100個連續(xù)核苷酸序列或其互補(bǔ)序列作為基因表達(dá)分析檢測的探針。
茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因表達(dá)的分析檢測方法的步驟為1)靶基因組織總RNA或mRNA的提取；2)甲醛凝膠變性電泳分離RNA；3)將變性電泳后的RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜或硝酸纖維素膜；4)利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的序列、同源序列、互補(bǔ)序列、8-100個核苷酸序列為探針，采用同位素法制備探針；5)探針與靶基因雜交、放射自顯影，通過定性、定量比較雜交圖譜，可以明確基因是否表達(dá)、表達(dá)的活性是上調(diào)還是下調(diào)。
一種茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的克隆利用表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ ID No.1～SEQID No.3所示的序列、所示的序列中的一條或數(shù)條的組合、每條序列的互補(bǔ)序列或同源序列、每條序列中的30～100個連續(xù)核苷酸為探針的序列或其互補(bǔ)序列來合成PCR擴(kuò)增的基因特異引物、擴(kuò)增微管蛋白基因全長的5’或3’引物。
茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的克隆方法的步驟為1)總RNA的提取和mRNA的分離；2)PCR法合成5’或3’cDNA；3)利用表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的序列、同源序列、互補(bǔ)序列或30～100個連續(xù)核苷酸來合成基因特異引物，PCR快速擴(kuò)增末端cDNA；4)Southern雜交或克隆測序鑒定PCR產(chǎn)物的特性；5)當(dāng)PCR產(chǎn)物被部分或全部測序所鑒定后，以5′cDNA為模板，用表達(dá)序列標(biāo)簽5’或3’設(shè)計(jì)的引物，采用長距離PCR擴(kuò)增獲得基因全長。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.用獲得的表達(dá)序列標(biāo)簽制成表達(dá)序列標(biāo)簽芯片具有許多商用價值和科研價值(1)應(yīng)用該表達(dá)序列標(biāo)簽芯片可用于作物種質(zhì)資源的鑒定評價。(2)應(yīng)用該生物芯片也可用于對農(nóng)作物的雜種優(yōu)勢進(jìn)行早期預(yù)測，篩選出最佳的優(yōu)勢雜交種。(3)應(yīng)用該生物芯片也能用于對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行商品檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)可食轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性。(4)應(yīng)用該生物芯片還可用于查找藥物的毒性和副作用，進(jìn)行毒理學(xué)研究，利于對新型除草劑和新型農(nóng)藥的篩選。(5)該生物芯片可用于植物的育種和植物新品種的產(chǎn)生。(6)該生物芯片還可用于從整體上研究整個信使核糖核酸(mRNA)的表達(dá)，這對生物體基因調(diào)節(jié)的整體性研究具有重要的科研和實(shí)踐指導(dǎo)價值。(7)應(yīng)用該生物芯片還可以運(yùn)用突變體研究植物中胞間和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，為發(fā)現(xiàn)植物中的基因功能和生理代謝途徑提供重要的理論依據(jù)。(8)該生物芯片能夠作為一種商品，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)科學(xué)研究和實(shí)際生產(chǎn)中。
2.應(yīng)用這些表達(dá)序列標(biāo)簽可進(jìn)行茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的表達(dá)分析檢測。通過對茶樹基因的分析，經(jīng)過與這些表達(dá)序列標(biāo)簽的比較，可以判定茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因是否表達(dá)以及表達(dá)的強(qiáng)弱，表達(dá)是上調(diào)，還是下調(diào)。
3.應(yīng)用這些表達(dá)序列標(biāo)簽可進(jìn)行茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的克隆。采用PCR技術(shù)，根據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽所提供的序列信息來合成茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因PCR反應(yīng)的基因特異引物以及PCR擴(kuò)增基因全長的5’和3’引物，非常容易獲得茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶的全長基因。
4.還可以利用這些表達(dá)序列標(biāo)簽繪制基因圖譜。如果一個表達(dá)序列標(biāo)簽在基因組中只出現(xiàn)一次，那么它可以做為序列標(biāo)簽位點(diǎn)。由表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)建的物理圖譜叫表達(dá)圖或轉(zhuǎn)錄圖(expression or transcript maps)。利用表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行基因圖制作，可以加快序列標(biāo)簽位點(diǎn)的制作和新基因的染色體定位。
5.表達(dá)序列標(biāo)簽序列可以作為基因特異性探針，對組織特異性基因表達(dá)的研究具有重要的作用。
6.這些新的表達(dá)序列標(biāo)簽豐富了表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫，并可以最大限度地利用公開的表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫信息，大大縮短克隆新的全長互補(bǔ)脫氧核糖核酸的周期并可減少克隆的成本，加快生物信息積累較薄弱的茶樹基因克隆進(jìn)度。
7.表達(dá)序列標(biāo)簽還可進(jìn)行新基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。表達(dá)序列標(biāo)簽可以對所有動植物的基因作為一種標(biāo)簽庫，通過不同的序列比較可以獲得保守序列片段，從而獲得基因的遺傳進(jìn)化圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1，cDNA文庫的構(gòu)建一、茶樹總RNA的提取春天取生長健壯的茶樹嫩葉100mg，迅速加液氮冷凍研磨成細(xì)粉末狀，加入1000μLTrizol試劑(購自Gibco BRL)繼續(xù)研磨后，又再加入1000μL Trizol試劑，混勻分裝到兩個經(jīng)焦炭酸二乙酯處理的1.5mL離心管中，冰上放置5分鐘，各加入200μL的氯仿，顛倒混勻，4℃ 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取500μL上清液，加入等體積的異丙醇，上下輕輕顛倒10次，室溫放置10分鐘，4℃12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去上清，沉淀中加入1mL 75％乙醇輕輕清洗，倒去乙醇，干燥后加入20μL經(jīng)焦炭酸二乙酯處理過的雙蒸水溶解沉淀。甲醛凝膠變性電泳檢測RNA質(zhì)量，RNA 3.5μL中加入上樣緩沖液(1mL由45％甲酰胺545μL、37％甲醛196μL、10×3-(N-瑪林代)丙磺酸121μL、80％甘油76μL和10％溴酚蘭62μL配制)16.5μL，混勻后在95℃變性2分鐘后，迅速放入冰浴中，防止退火。電泳時，電泳槽置于冰上，保證低溫，電壓不超過5v/cm。RNA可放于-70℃冰箱中長期保存，備用。
二、mRNA的分離和純化1.生物素標(biāo)記的Oligo(dT)探針與mRNA的退火在經(jīng)焦炭酸二乙酯處理不含RNA酶的1.5mL離心管中加入0.5mg總RNA，溶解于500μL焦炭酸二乙酯處理水中，65℃水浴保溫10分鐘，加入3μL的Oligo(dT)探針，13μL的20×SSC(1L 20×SSC含175.3g氯化鈉和88.2g檸檬酸鈉，pH7.0)輕輕混勻，室溫放置約10-20分鐘至冷卻。
2.親和素順磁磁珠的沖洗將一管親和素順磁磁珠(購自Promega Corporation)輕輕懸浮后放入磁性分離架中，使親和素順磁磁珠集中到管的一側(cè)，小心除去上清，用300μL 0.5×SSC清洗親和素順磁磁珠三次，每次用磁性分離架集中磁珠，去除上清液，將清洗過的親和素順磁磁珠溶于100μL的0.5×SSC中備用。
3.雜交體的生成和漂洗將已退火的生物素標(biāo)記探針，加入到溶于100μL的0.5×SSC的親和素順磁磁珠中，輕輕混勻，室溫放置10分鐘，每隔1-2分鐘輕混勻一次，用磁性分離架捕獲磁珠親和素順磁磁珠，小心去除上清，用300μL的0.1×SSC洗滌親和素順磁磁珠，磁性分離架集中后去除上清液，共重復(fù)4次。
4.洗脫mRNA
將漂洗過的親和素順磁磁珠重新懸浮于100μL的焦炭酸二乙酯水中，用磁性分離架捕獲磁珠，將洗脫的水相吸至一新管中，重復(fù)清洗親和素順磁磁珠，共得到250μL的mRNA。
5.mRNA的沉淀和溶解加入0.1×體積的醋酸鈉(pH5.2)和1×體積的異丙醇沉淀mRNA，-20℃過夜。12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去上清。加入1mL的75％的乙醇懸浮后，離心片刻，去上清，干燥，復(fù)溶于30μL的焦炭酸二乙酯處理的水中。3.5μLmRNA加入16.5μL上樣緩沖液(按7∶33配)混勻后在95℃變性2分鐘，拿出后立即放入冰上，防止退火，甲醛凝膠變性電泳時，電泳槽置于冰上，保證低溫。電壓不超過5v/cm。
三、cDNA文庫的構(gòu)建(一)cDNA第一鏈合成在0.5mL的離心管中，分別加入3μL的茶樹mRNA，1μL 10μM5’PCR第一鏈合成引物(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGG CCGGG-3’)，1μL 10μM3’PCR引物(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGC CGACATG-d(T)30N-1N-3’)(N＝A，G，C或者T；N-1＝A，G，C)?；靹颍噪x心，72℃溫育2分鐘，冰上冷卻2分鐘，離心把組分收集到底部，每管中加入2μL 5×第一鏈合成緩沖液(250mM Tris，pH8.3，30mM氯化鎂，375mM氯化鉀)，1μL二硫蘇糖醇(20mM)，1μL dNTP混合物(10mM)，1μL反轉(zhuǎn)錄酶，至總體積為10μL。經(jīng)渦旋、瞬間離心混勻，在PTC-220 PCR儀(MJ Research，Inc.)中42℃溫育1小時后，取出放于冰上，終止第一鏈的合成。放于-20℃冰箱中可保存3個月，備用。
(二)cDNA第二鏈的合成先把PCR儀加熱到95℃。在一個0.5mL的離心管中加入2μL第一鏈cDNA，80μL無離子水，10μL 10×PCR緩沖液，2μL 50×dNTP mix，2μL 10μM5’PCR第二鏈合成引物(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGT-3’)，2μL 3’PCR引物(5’-ATTCT AGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-d(T)30N-1N-3’)(N＝A，G，C或者T；N-1＝A，G，C)，2μL 50×聚合酶混合物至總體積為100μL，輕輕振動混勻，稍離心，將物質(zhì)收集到底部，必要時加2滴礦物油以覆蓋液面。放進(jìn)經(jīng)預(yù)熱到95℃的PCR儀中，PCR反應(yīng)程序如下95℃變性20秒，接著95℃5秒，68℃6分鐘共24個循環(huán)，PCR結(jié)束后，取5μL用1.1％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE(45mM Tris-硼酸，1mM乙二胺四乙酸，pH8.0)中電泳。其余放于-20℃冰箱可保存3個月。
(三)蛋白消化及cDNA純化1.取75μL cDNA加到一個0.5mL的管中，加2μL的蛋白酶K(20μg/μL)。
2.45℃溫育20分鐘3.取出后，離心一下，將組分收集到管底4.加入23μL的無離子水，保證總體積為100μL5.加入等體積充分混勻的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，v/v/v)，來回混勻1-2分鐘6. 14000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘7.離心后有三層，取上層到一個新的0.5mL的管中8.加入100μL的氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)來回混勻1-2分鐘9. 14000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘10.取上清液11.加入10μL的醋酸鈉(3M，pH4.8)、1.3μL糖原(20μg/μL)，260μL 95％乙醇。迅速以14000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心20分鐘12.小心除去上清13.用100μL 80％的乙醇洗滌沉淀14.干燥約10分鐘去除殘留的乙醇15.加入79μL的無離子水，懸浮沉淀(四)Sfi I酶切獲得可連接的cDNA1.在一個0.5mL的離心管中加入，79μL cDNA(經(jīng)蛋白酶K消化)，10μL 10×Sfi I緩沖液，10μL Sfi I內(nèi)切酶(20單位/μL)，1μL 100×牛血清白蛋白充分混勻2. 50℃水浴保溫2小時，取出后放于-20℃冰箱中3.分離時再加入2μL 1％二甲苯青，充分混勻(五)建庫用cDNA分離1.準(zhǔn)備16個1.5mL離心管2.準(zhǔn)備CHROMA SPIN-400柱(購自Clontech Laboratories，Inc.)1)將CHROMA SPIN-400從4℃中取出，在室溫下放置1小時，顛倒數(shù)次徹底懸浮膠體；2)從柱中除去氣泡，用1000μL的移液器輕輕懸浮膠體，避免產(chǎn)生氣泡。拿走底部的蓋，讓柱體自然流下。(如3分鐘之后不流了，蓋上上面的蓋，會使柱體繼續(xù)流下)；3)鐵夾夾住柱子；4)貯存緩沖液通過柱子自然流下，直至能看到柱體中膠的表面，膠的高度應(yīng)在1mL標(biāo)記處。如果少的話，可以用其它柱中的膠來調(diào)整；5)流速大約為1滴/40-60秒，1滴約為40μL。(如果流速太低，＜1滴/100秒，或者每滴的體積＜25μL必須重新懸浮，重復(fù)上述步驟)
3.貯存緩沖液流完后，靠柱內(nèi)邊緣小心加入700μL的柱子緩沖液，直到流光。
4.當(dāng)柱子緩沖液流完后(約15-20分鐘)，小心將約100μL經(jīng)Sfi I酶切的cDNA和二甲苯青的混合物加到膠頂部中心部位的表面，不光滑的膠表面不會影響下面的分離。
5.進(jìn)行下一步之前，讓樣品充分進(jìn)入膠內(nèi)(在膠表面沒有殘留的液體)。
6.用100μL的柱子緩沖液清洗含有cDNA的管，再輕倒入膠表面。
7.讓緩沖液流光，當(dāng)停止時，繼續(xù)下一步，讓染料層進(jìn)入膠內(nèi)幾毫米。
8.將放有16個管子的架子放在柱子下面，第一個管子正在柱子下的出口。
9.加600μL的柱子緩沖液，立即開始收集，每管35μL(約1滴)，收集后的管子立即加蓋，當(dāng)都收集完后，蓋上柱子的蓋子。
10.在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，檢查每個管子的組分，在1.1％的瓊脂糖/EB膠上電泳，每管用3μL連續(xù)在點(diǎn)樣孔加樣，用1kb DNA Marker作分子量標(biāo)記，150V電泳10分鐘。收集最亮的3-4個組分到一個新1.5mL的管中。
11.將1/10體積醋酸鈉(3M；pH4.8)，1.3μL糖原(20mg/mL)，2.5體積95％乙醇(-20℃)混勻，-20℃過夜。
12.室溫14000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘。
13.小心去上清。
14.輕離心，去剩余的上清，干燥約10分鐘。
15.溶于7μL的無離子水，輕輕混勻。這些Sfi I酶切的cDNA現(xiàn)在已經(jīng)可以與經(jīng)Sfi I酶切的λTripIEx2載體(購自Clontech Laboratories，Inc.)連接。
(六)cDNA與載體連接1.按下列組分準(zhǔn)備一個連接反應(yīng)對照(μL)樣品(μL)cDNA01.0λTripIEx2載體(500ng/μL) 1.0 1.010×連接酶緩沖液0.5 0.5ATP(10mM) 0.5 0.5T4DNA連接酶(400單位/μL) 0.5 0.5無離子水2.5 1.5總體積 5.0 5.0其中10×連接酶緩沖液由500mM Tris-鹽酸，pH7.8，100mM氯化鎂，100mM二硫蘇糖醇，0.5mg/mL牛血清白蛋白組成。
2.輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，瞬間離心使組分沉到底部，16℃連接過夜
3.對于每一個連接，做一個包裝反應(yīng)。
(七)包裝反應(yīng)1.在每一個連接產(chǎn)物中加入25μL的包裝蛋白。
2. 30℃溫育90分鐘。
3.取出放于4℃冰箱中可保存2周。經(jīng)過擴(kuò)增的文庫可以在4℃穩(wěn)定保存6-7個月，或在7％二甲基亞砜中-70℃至少保存1年以上。
(八)測定滴度1.原始和工作平板的制備為復(fù)蘇冰凍細(xì)胞，取5μL冰凍的大腸桿菌細(xì)胞XL1-Blue在含氨卞青霉素的LB平板(1LLB蛋白胨10g，酵母5g，氯化鈉5g，瓊脂糖15g，pH7.0高壓滅菌20分鐘)上劃板，37℃培養(yǎng)過夜后，作為原始平板，置于4℃可保存2周。從原始平板中挑取單克隆在另一個含氨卞青霉素的LB/硫酸鎂(1L LB/硫酸鎂含蛋白胨10g，酵母5g，氯化鈉5g，10mM硫酸鎂，瓊脂15g，pH7.0，高壓滅菌20分鐘)平板上涂板，37℃培養(yǎng)過夜后，作為工作平板。
2.未擴(kuò)增文庫的滴度測定從工作平板中挑取分離良好的單克隆接種到含15mL LB/硫酸鎂/麥芽糖培養(yǎng)基(1L含蛋白胨10g，酵母5g，氯化鈉5g，10mM硫酸鎂，瓊脂15g，0.2％麥芽糖，pH7.0，高壓滅菌20分鐘)的50mL試管中，140轉(zhuǎn)/分鐘震蕩37℃培養(yǎng)過夜直至OD值達(dá)到2.0，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去上清液，用7.5mL 10mM硫酸鎂重新懸浮沉淀。將包裝產(chǎn)物用噬菌體緩沖液稀釋5-20倍，在200μL過夜培養(yǎng)的XL-1Blue受體菌中加入1μL稀釋的噬菌體，讓噬菌體在37℃吸收10-15分鐘，再加入2mL溶解的LB/硫酸鎂頂層瓊脂?？焖兕嵉够靹虿⒌谷虢?jīng)37℃預(yù)熱的LB/硫酸鎂平板，快速搖動平板使均勻分布，室溫冷卻10分鐘讓頂層瓊脂變硬，倒置平板在37℃培養(yǎng)6-17小時，統(tǒng)計(jì)菌斑并根據(jù)公式文庫滴度(pfu/mL)＝(噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù))/受體菌的體積，計(jì)算未擴(kuò)增文庫滴度6.8×105pfu/mL，總克隆數(shù)為3.5×105個。
(九)文庫重組率的測定本文庫可以利用X-Gal顯色原理測定重組率，在測定滴度時加入100mM的IPTG及100mM的X-Gal，過夜培養(yǎng)后，通過藍(lán)斑(未重組克隆)、白斑(重組克隆)的數(shù)量計(jì)算重組率為98.05％。
(十)cDNA插入片段的PCR鑒定從LB平板上隨機(jī)挑取15-20個獨(dú)立的噬菌斑，分別加到含有200μL噬菌體緩沖液的離心管中，37℃放置1小時后，保存于4℃，利用λTripEX2噬菌體5’PCR引物(5’-CTCCGAGATCTGGACGAGCT-3’)和3’PCR引物(5’-GGGATATCACTCAG CATAAT-3’)對構(gòu)建的文庫進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體積為20μL，其中的組成為含單克隆噬菌斑的稀釋液2μL，25mM鎂離子1.4μL，10μM核苷酸0.4μL，10×PCR緩沖液2μL，10μM5’及3’引物分別0.1μL，Taq DNA聚合酶0.1μL，去離子水13.9μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4分鐘，95℃變性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，36個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。反應(yīng)在PCR儀(PTC-225型，MJ Research，Inc.)上進(jìn)行。PCR結(jié)果表明插入片段大多分布在0.5-2.0kb之間，絕大部分在1.0-1.5kb左右。
(十一)cDNA文庫的擴(kuò)增、滴度測定從工作平板中挑取分離良好的XL1-Blue單克隆接種到含15mL的LB/硫酸鎂/麥芽糖培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，37℃ 140轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)過夜至OD值達(dá)到2.0。5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去上清液，用7.5mL 10mM硫酸鎂重新懸浮沉淀。在7mL試管中加入500μL細(xì)菌培養(yǎng)液和足夠稀釋過的溶菌物，在37℃水浴溫育15分鐘，加4.5mL熔化的LB/硫酸鎂軟頂層瓊脂(1L含蛋白胨10g，酵母5g，氯化鈉5g，10mM硫酸鎂，瓊脂7.2g，pH7.0，高壓滅菌20分鐘)，快速混合并傾倒細(xì)菌/噬菌體混合物到LB/硫酸鎂平板上，使瓊脂均勻鋪于平板上。室溫冷卻10分鐘，使頂層瓊脂變硬，倒置平板于37℃培養(yǎng)6-18小時直至菌落長至相互接觸。加入12mL 1×Lambda稀釋緩沖液(0.1M氯化鈉，10mM硫酸鎂·7H2O，35mMTris-鹽酸，0.01％明膠)于每個平板，4℃過夜，一個平板可以成為一個擴(kuò)增文庫的溶菌物。平板在室溫50轉(zhuǎn)/分鐘震蕩1小時后倒入一個已滅菌的廣口瓶。為去除細(xì)胞碎片和裂解剩余的完整細(xì)胞，充分混合噬菌體裂解物并倒入一個50mL聚丙烯帶蓋的滅菌離心管中，加入10mL氯仿蓋緊蓋子，渦旋2分鐘后，7000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至另一個滅菌的50mL離心管中，4℃保存，并按前述方法測定擴(kuò)增后文庫的滴度為7.2×109pfu/mL。
把經(jīng)擴(kuò)增的文庫分裝成1mL，加入終濃度7％的二甲基亞砜于-70℃可長期保存，盡量避免多次凍融過程。
(十二)cDNA質(zhì)粒文庫的產(chǎn)生在LB固體培養(yǎng)基上加入5μL DH12S菌液，涂板，37℃過夜。取其單克隆到含有10mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 140轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)至OD值為1.2。取出后加入氯化鎂至終濃度為10mM，混勻，取1μL噬菌體cDNA文庫與100μL的DH12S菌液混勻，37℃培養(yǎng)15分鐘，然后加入700μL SOC培養(yǎng)基(1L SOC含細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨20g，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5g，氯化鈉0.5g，2.5mM氯化鉀，10mM氯化鎂，20mM葡萄糖，pH7.0，高壓滅菌20分鐘)37℃搖床培養(yǎng)45分鐘，獲得質(zhì)粒文庫，取出放于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2，表達(dá)序列標(biāo)簽測序和獲得(一)質(zhì)粒的培養(yǎng)和提取1.將獲得的cDNA質(zhì)粒文庫稀釋，進(jìn)行梯度試驗(yàn)，選出最佳稀釋濃度。
2.在LB固體培養(yǎng)基(1L LB含蛋白胨10g，酵母5g，氯化鈉5g，瓊脂糖15g，pH7.0，高壓滅菌20分鐘)上涂板。
3. 37℃培養(yǎng)12-16小時左右，直至長出菌落。
4.將菌落接種在96孔板上，每孔加入1mL LB(含氨卞青霉素)(1L蛋白胨10g，酵母5g，氯化鈉5g，氨卞青霉素終濃度為50μg/mL)接種單細(xì)菌克隆。37℃培養(yǎng)16-18小時左右。
5.保存菌種，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞。
6.加入200μL溶液I(50mM Tris-鹽酸，pH8.0，10mM乙二胺四乙酸，0.1mg/mL RNA酶，4℃)，用膠帶封口，振蕩混勻。
7.加入200μL溶液II(0.2N氫氧化鈉，1％十二烷基硫酸鈉，室溫)，用新膠帶封口，翻轉(zhuǎn)混合10次。此時裂解液應(yīng)該透明、粘稠，不含細(xì)菌碎片。
8.加入200μL溶液III(3 M醋酸鉀，冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.5，4℃)，用新膠帶封口，翻轉(zhuǎn)混合10次。
9.沸水浴5分鐘。
10.冰浴10分鐘。
11. 4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，上清液全部轉(zhuǎn)入下面的深孔板中。
12.取下深孔板，加入300μL異丙醇溶液，用膠帶封口，立即翻轉(zhuǎn)混合3次。離心15分鐘(4000轉(zhuǎn)/分鐘)，沉淀DNA。
13.去掉上清，加入300μL 70％乙醇，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。
14.用水重新溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (二)測序PCR反應(yīng)和序列測定1.用水稀釋5’測序引物(5’-CTCCGAGATCT GGACGAGC T-3’)。注意加到每個反應(yīng)的DNA和引物的體積要依賴于他們的濃度。調(diào)整加入的無菌水的量，反應(yīng)混合物的終體積是20μL。
2.在96孔板上，將要測序的每個模板加入下列試劑DYEnamic ET終止子試劑預(yù)先混合物8μL，引物(5μM)1μL，DNA模板0.2-2μg，使總體積為20μL。
3.將混合物輕輕震蕩充分混合。
4.將96孔板封口并放到預(yù)先設(shè)計(jì)好程序的PCR熱循環(huán)儀上。
5.按照下列條件進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，95℃，20秒，50℃，15秒，60℃，1分鐘，共32個循環(huán)。
6.循環(huán)完成后，簡單離心收集管子底部的溶液。
7.每個反應(yīng)管中加1μL 7.5M乙酸銨，27.5μL無水乙醇，5μL去離子水。
8. 4000轉(zhuǎn)/分鐘離心40分鐘。
9.除掉上清液。
10.每個反應(yīng)管中加50μL 70％的乙醇，并混合好。
11.4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘。
12.除去上清夜，真空干燥或空氣干燥沉淀。不要過分干燥。
13.將沉淀重新懸浮在5μL的點(diǎn)樣溶液中，用力震蕩10-20秒，確保完全懸浮，簡單離心收集樣品。
14.將樣品放入DNA測序儀(型號為MegabaceTM1000，Amershan Pharmacia Biotech Inc.)中進(jìn)行測序。
(三)表達(dá)序列標(biāo)簽的獲得1.將序列測定結(jié)果輸出。
2.剔除載體序列和冗余序列獲得表達(dá)序列標(biāo)簽的序列。
3.用非冗余序列對公共表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，按功能將其分類。表達(dá)序列標(biāo)簽對應(yīng)的克隆進(jìn)行保存、備用。
實(shí)施例3，生物芯片的制備一、對表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增茶樹cDNA質(zhì)粒插入片段PCR擴(kuò)增，反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行(PTC-225型，MJ Research，Inc.)，引物為M13通用引物(正向?yàn)?’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’，反向?yàn)?’-AGCGGATAATTT CACACAGG-3’)，每100μL的反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液10μL；25mM氯化鎂7μL；100ng/μL的正反向引物各1μL，20mM dNTPs 1μL，3單位的Taq DNA聚合酶(購自Promega Corporation)和15ng的質(zhì)粒模板。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4分鐘，每個循環(huán)于94℃變性30秒，58℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘；共36-40個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。
二、PCR產(chǎn)物處理加入100μL異丙醇和10μL 3M的醋酸鈉(pH5.2)于-20℃沉淀8小時，4000轉(zhuǎn)/分鐘4℃離心40分鐘，棄上清，沉淀用70％的乙醇洗滌，干燥后溶解于20μL DNA變性液(0.4M氫氧化鈉，10mM乙二胺四乙酸)。
三、芯片制備變性液溶解后的表達(dá)序列標(biāo)簽用于茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)序列標(biāo)簽芯片的點(diǎn)制，芯片由芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)制，芯片的載體為玻片，所有的點(diǎn)點(diǎn)制為36×24一級陣，每一個點(diǎn)在8個基因構(gòu)成的4×4的二級陣中平行兩次以驗(yàn)證試驗(yàn)的重復(fù)性。
實(shí)施例4，茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因表達(dá)的分析檢測一、茶樹總RNA的提取和mRNA純化取待分析的不同生長發(fā)育階段或不同器官的茶樹幼嫩材料100-500mg(材料多少視RNA含量而定)，采用實(shí)施例1，“cDNA文庫的構(gòu)建”中的“RNA的提取”、“mRNA的分離和純化”所描述的流程、方法提取總RNA，分離和純化mRNA用于以下的步驟。
二、甲醛凝膠變性電泳1.配制5×甲醛凝膠電泳緩沖液0.1M 3-(N-瑪林代)丙磺酸(pH7.0)，40mM醋酸鈉，5mM乙二胺四乙酸(pH8.0)。
2.凝膠制備將適量的瓊脂糖熔于水，冷卻至60℃，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液至終濃度為1×和2.2M。在通風(fēng)櫥內(nèi)灌制凝膠，在室溫放置30分鐘以上，使凝膠凝固。
3.在一滅菌的離心管中混合下列液體，以制備樣品總RNA或mRNA 4.5μL，5×甲醛凝膠電泳緩沖液2.0μL，甲醛3.5μL，甲酰胺10μL于65℃溫育15分鐘，冰浴冷卻，離心5秒使管內(nèi)液體集中于管底。
4.加2μL滅菌并經(jīng)焦炭酸二乙酯處理的甲醛凝膠加樣緩沖液(50％甘油，1mM 乙二胺四乙酸，pH8.0，0.25％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯青FF)。
5.加樣前將凝膠預(yù)電泳5分鐘，電壓為5V/cm，隨后將樣品加至凝膠樣孔。以已知大小的RNA混合物作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。
6.將凝膠浸入1×甲醛凝膠加樣緩沖液中，3-4 V/cm電壓降進(jìn)行電泳。
7.電泳結(jié)束后，溴化乙錠染色，在紫外燈下照相(分子量標(biāo)記旁放一把透明直尺以距離計(jì)算RNA分子的大小)后將RNA轉(zhuǎn)移至膜上。
三、轉(zhuǎn)膜1.將凝膠移至一個玻璃干烤皿內(nèi)，用鋒利刀片修去凝膠的無用部分，并在其右上角(加樣孔一端為上)切去凝膠一小角作為以下操作的記號。
2.用長和寬均大于凝膠的一塊有機(jī)玻璃作為平臺，將其放入大干烤皿內(nèi)，上面放一張濾紙作為紙橋，倒入20×SSC使液面略低于平臺，當(dāng)平臺上的濾紙濕透后，用玻璃棒趕出所有的氣泡。
3.用一把鋒利的裁紙刀裁一張硝酸纖維素膜或者尼龍膜，其長度和寬度應(yīng)各比凝膠大2mm，并切去一角使之與凝膠對應(yīng)。
4.將濾膜浸入去離子水表面，直至濕透為止，隨后用20×SSC浸泡濾膜至少5分鐘。
5.將凝膠翻轉(zhuǎn)后置于平臺上濕潤的濾紙中央，兩者之間不留任何氣泡。
6.用雙層保鮮膜包裹凝膠四周。
7.在凝膠上方放置濕潤的濾膜，并使兩者的切角重疊。
8.用2×SSC溶液浸濕2張與凝膠同樣大小的濾紙，并放置在濾膜上方，趕出所有氣泡。
9.切一疊與濾紙同樣大小的紙巾，放于濾紙上方，并在紙巾上方壓一塊玻璃板，然后用約500g重物壓實(shí)。目的是建立自液池經(jīng)凝膠流向?yàn)V膜的上行流路，使RNA在毛細(xì)管的作用下從凝膠流向并聚集在濾膜上。
10.使上述RNA轉(zhuǎn)膜12-18小時，當(dāng)中更換濕紙巾一次。
11.轉(zhuǎn)移結(jié)束后，揭去凝膠上方的紙巾和濾紙，從凝膠上剝離濾膜。以5×SSC溶液浸泡濾膜5分鐘，于室溫干燥30分鐘以上。
12.將晾干的濾膜放在兩張濾紙之間，在80℃烤箱中干烤2-3小時。
四、探針的制備采用實(shí)施例3，“生物芯片的制備”中“對表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增”所描述的方法和流程，對特定的表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得15ng/μL的PCR產(chǎn)物作探針，用同位素標(biāo)記法制備探針。
1.混合PCR產(chǎn)物5μL，合成的寡核苷酸引物5μL。
2.于60℃加熱5分鐘，然后冷卻至4℃。
3.加入100mM二硫蘇糖醇 5μL10×RP緩沖液(900mM HEPES，pH6.0，100mM氯化鎂)5μL各5mM的dCTP、dGTP、dTTP混合液5μL[α-32P]dATP(比活度＞3000Ci/mM，10μCi/μL) 25μLDNA聚合酶I(Klenow)(12.5單位) 2.5μL于室溫反應(yīng)5-6小時。
4.加入0.5M乙二胺四乙酸(pH8.0)1.0μL，20％十二烷基硫酸鈉2.5μL。
5.利用Sephadex G-50小柱進(jìn)行柱層析或離心柱層析，使標(biāo)記的表達(dá)序列標(biāo)簽與未摻入的dNTP分開。
五、預(yù)雜交、雜交和放射自顯影1.在含50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt試劑，0.1％十二烷基硫酸鈉溶液中預(yù)雜交1-2個小時。
2.在預(yù)雜交液中加入變性的已標(biāo)記的探針，在適宜溫度下繼續(xù)溫育12-24小時。
3.用1×SSC，0.1％十二烷基硫酸鈉于室溫洗膜20分鐘，隨后用0.2×SSC、0.1％十二烷基硫酸鈉洗膜3次，每次20分鐘。
4.用醫(yī)用X光片進(jìn)行放射自顯影，可于-70℃曝光24-72小時。
六、基因表達(dá)的分析檢測觀察X光片，進(jìn)行茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因表達(dá)分析檢測，通過定性、定量比較雜交圖譜，可以明確該基因是否表達(dá)、表達(dá)的活性是上調(diào)還是下調(diào)。
實(shí)施例5，茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的克隆一、總RNA的提取和mRNA的分離采用實(shí)施例1，“cDNA文庫的構(gòu)建”中的“RNA的提取”、“mRNA的分離和純化”所描述的流程、方法提取總RNA，分離和純化mRNA用于以下的步驟。
二、5’或3’cDNA的合成1.在0.5mL滅菌離心管中混合(1)進(jìn)行5′cDNA合成1-3μL RNA樣品，1μL 5′引物[5′-(T)25V N-3′(N＝A，C，G，or T；V＝A，G，or C)]，1μL Oligo(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCG GG-3′)，(2)進(jìn)行3′cDNA合成1-3μL RNA樣品，1μL 3′引物A(5′-AAGCAGTGGTA TCAACGCAGAG TAC(T)30VN-3′，(N＝A，C，G，or T；V＝A，G或C)2.加入滅菌水至每個反應(yīng)的總體積為5μL3.混合樣品并瞬間離心4.離心管在70℃溫育2分鐘5.冰上冷卻2分鐘6.瞬間離心收集樣品到管底7.加入下列成分到每個離心管(已含5μL)2μL 5×第1鏈合成緩沖液(250mM Tris-鹽酸(pH8.3)，375mM KCl，30mM MgCl2)，1μL二硫蘇糖醇(20mM)，1μL dNTP混合物(10mM)，1μL逆轉(zhuǎn)錄酶，總體積為10μL8.用移液器輕輕混合反應(yīng)成分9.瞬間離心收集成分到管底
10.在42℃有熱蓋的PCR儀保溫1.5小時11.用Tricine-乙二胺四乙酸緩沖液稀釋第一鏈合成反應(yīng)產(chǎn)物從＜200ng總RNA開始加20μL，從＞200ng總RNA開始加100μL，從mRNA開始加250μL12.在72℃加熱離心管7分鐘13.樣品能在-20℃保存3個月三、對照PCR反應(yīng)1.按每管50-μL PCR反應(yīng)體積混合下列試劑34.5μL PCR-級水，5μL 10×PCR緩沖液，1μLdNTP混合物(10mM)，1μL 50×聚合酶混合物，總體積41.5μL2.渦旋混勻并瞬間離心3.按下表準(zhǔn)備PCR反應(yīng)，順序加入各成分到PCR管中，輕輕混勻

*10×通用引物混合物長引物(0.4μM)5′-CTAATACGACTCACTATA GGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，短引物(2μM)，5′-CTAA TACGACTCACTATAGGGC-3′4.在PCR管中加入2滴礦物油，蓋緊蓋子。如果用有熱蓋的PCR儀，可以不加礦物油。
5.采用如下的程序，進(jìn)行熱啟動PCR，94℃ 30秒，72℃ 3分鐘，5個循環(huán)，94℃ 30秒，70℃30秒，72℃ 3分鐘，5個循環(huán)，94℃ 30秒，68℃ 30秒，72℃ 3分鐘，27個循環(huán)6.取5μL在1.2％瓊脂糖/溴化乙錠電泳分析，直到對照試驗(yàn)?zāi)芄ぷ鳌?br> 四、cDNA末端快速PCR擴(kuò)增1.按每管50-μL PCR反應(yīng)體積混合下列試劑34.5μL PCR-級水，5μL 10×PCR緩沖液，1μLdNTP混合物(10mM)，1μL 50×聚合酶混合物，總體積41.5μL
2.渦旋充分混勻(避免產(chǎn)生氣泡)，瞬間離心3.進(jìn)行5′-PCR擴(kuò)增時，按下表準(zhǔn)備PCR反應(yīng)，順序加入各成分到PCR管中，輕輕混勻5′cDNA2.5μL，10×通用引物混合物5μL，§基因特異引物1(10μM)1μL，PCR混合物41.5μL，總體積為50μL。
末端快速擴(kuò)增PCR必須根據(jù)已知的表達(dá)序列標(biāo)簽合成2個基因特異引物，5’PCR需要一個反義引物，3’PCR需要一個正義引物，它們必須滿足下列條件23-28bp，50-70％GC含量，Tm≥65℃可獲得最佳結(jié)果，如果Tm＞70℃可采用熱啟動PCR。
4.進(jìn)行3′-PCR時，按下表準(zhǔn)備PCR反應(yīng)，順序加入各成分到PCR管中，輕輕混勻3′cDNA 2.5μL，10×通用引物混合物5μL，基因特異引物2(10μM)1μL，PCR混合物41.5μL，總體積達(dá)到50μL。
5.在PCR管中加2滴礦物油，蓋緊蓋子。如果用有熱蓋的PCR儀，可以不加礦物油。
6.根據(jù)最初從總RNA或mRNA開始，正確選擇如下程序的一個，進(jìn)行熱啟動PCR。
程序1(如果基因特異引物Tm＞70℃)，94℃ 30秒，72℃ 3分鐘，5個循環(huán)，94℃ 30秒，70℃ 30秒，72℃ 3分鐘，5個循環(huán)，94℃ 30秒，68℃ 30秒，72℃ 3分鐘，20個循環(huán)(如果用mRNA)或25個循環(huán)(如果用總RNA)程序2(如果基因特異引物Tm＝60-70℃)94℃ 30秒，68℃ 30秒，72℃ 3分鐘，20個循環(huán)(如果用mRNA)或25個循環(huán)(如果用總RNA)七、PCR產(chǎn)物的特性鑒定(一)Southern雜交1.先進(jìn)行1.2％瓊脂糖/溴化乙錠電泳，紫外燈下拍照。
2.按照實(shí)施例4，“茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因表達(dá)的分析檢測”的“轉(zhuǎn)膜”程序把DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。
3.可采用末端標(biāo)記的巢式基因特異引物1或2為探針。另外，如果合成的基因特異引物具有5’和3’重疊區(qū)，基因特異引物2可作為鑒定5′-PCR的探針，基因特異引物1可作為鑒定3′-PCR的探針。
4.預(yù)雜交、雜交，并在中等嚴(yán)謹(jǐn)度下洗膜，放射自顯影。
(1)把含有靶DNA的濾膜漂浮于一盤6×SSC液面上，上下濕潤后在液體內(nèi)浸泡2分鐘。(2)將濾膜裝入塑料袋中，按0.2mL/cm2濾膜加入預(yù)雜交液(6×SSC，0.05×Blotto，50％甲酰胺)，擠出袋內(nèi)的空氣，在42℃水浴中溫育1-2小時。(3)100℃加熱5分鐘使探針變性，迅速在冰水浴中使探針驟冷。(4)快速從水浴中取出雜交袋，剪去袋的一角，向預(yù)雜交液中加入已變性的探針，盡量去除袋中的空氣，重新封口。(5)將雜交袋放入42℃水浴中，雜交2-3小時。(6)取出雜交袋迅速剪去一角，將雜交液倒入安全容器內(nèi)，沿3邊剪開袋子，將濾膜取出放到一個盛有足夠的2×SSC和0.5％十二烷基硫酸鈉塑料盒中，室溫浸泡。(7)5分鐘后濾膜轉(zhuǎn)移至另一個2×SSC和0.1％十二烷基硫酸鈉的塑料盒中，于室溫輕搖浸泡15分鐘。(8)濾膜轉(zhuǎn)移至另一個0.1×SSC和0.5％十二烷基硫酸鈉的塑料盒中，于37℃輕搖浸泡1小時。(9)將溶液換為新配的0.1×SSC和0.5％十二烷基硫酸鈉，并把塑料盒轉(zhuǎn)移至68℃溫育1小時。(10)用0.1×SSC于室溫暫短漂洗濾膜，用紙吸去大部分液體。(11)包裝膜包被濾膜，將濾膜對X光片爆光24-72小時以獲得放射自顯影影象。
5.比較雜交帶型與瓊脂糖凝膠照片。
6.當(dāng)獲得與預(yù)期大小一致的條帶后，從凝膠中回收DNA，繼續(xù)下面的試驗(yàn)。
(二)PCR產(chǎn)物的克隆和測序1.糖凝膠中回收可能的目的條帶(1)加入3-4倍體積的10M碘化鈉。(2)50℃溶解凝膠。(3)加入40％的氧化硅。(4)混勻，37℃水浴保溫5分鐘。(5)離心，加入2倍體積的清洗緩沖液(50％酒精，0.1M氯化鈉，0.1M Tris-鹽酸，pH7.5)。(6)離心，去上清。(7)室溫干燥3分鐘。(8)加入10μL滅菌的雙蒸水。(9)離心，把上清液轉(zhuǎn)移至新離心管，即可將回收片段克隆到載體上。
2.回收條帶克隆到T/A類型或T類型載體上(可從Promega Corporation和Invitrogen Corporation購買)。
(1)瞬時離心T載體和對照插入DNA管子，使組分集中于管底。(2)按下表設(shè)置回收DNA與T載體的連接反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)連接陽性對照背景對照T載體(50ng) 1μL1μL1μL回收的DNA 3-5μL - -對照插入DNA - 1μL-5×T4DNA連接酶緩沖液 2μL2μL2μLT4DNA連接酶(3單位/μL) 1μL1μL1μL去離子水至總體積 10μL 10μL 10μL(3)移液器混勻，瞬間離心。室溫連接1小時或4℃連接過夜。(4)轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物混合5μL連接產(chǎn)物與50μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；于冰上放置30分鐘；42℃熱激2分鐘后立即于冰上放置2分鐘；加入600μL 2×YT(1L含蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，pH7.0，高壓面菌20分鐘)肉湯培養(yǎng)基；37℃搖動培養(yǎng)1小時；加入100μL X-Gal(30mg/mL)，10μLIPTG(30mg/mL)；分別取10μL、50μL、100μL、200μL在含氨卞青霉素的LB平板上涂板，37℃倒置培養(yǎng)過夜；挑取3-5個白色單克隆在含氨卞青霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；(5)以T載體的通用引物，采用“實(shí)施例2，表達(dá)序列標(biāo)簽測序和獲得”類似的方法測定插入的目的DNA片段序列。
3.采用32P標(biāo)記的巢式基因特異引物為探針雜交或者用基因特異引物為測序引物測定8-10個克隆的序列，鑒別出含特定基因插入的陽性克隆。
(八)全長基因的獲得當(dāng)PCR產(chǎn)物被部分或全部測序所鑒定后，可以用下列方法的獲得全長基因1.以5′cDNA為模板，用表達(dá)序列標(biāo)簽5’或3’設(shè)計(jì)的引物，采用長距離PCR擴(kuò)增獲得基因全長。
2.用基因重疊區(qū)的限制性酶切位點(diǎn)，克隆5’或3’的重疊區(qū)，再獲得基因全長。
表達(dá)序列標(biāo)簽的序列表(1)SEQ ID No.1的信息(a)序列特征長度441個堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源茶樹(d)序列描述SEQ ID No.1GGGGGGTGTCAATGAGGAGGATTACAAGCCAGATCTTCACATTGTTTCCAATGCTAGCTGCACTACCAACTGTCTTGCCCCCCTTGCTAAGGTTATCAATGACGAAGTTTGGCATCGTTGAGGGTCTCATGACTACCGTGCACTCCATCACAGCCACACAAAAAACTGTTGATGGACCATCAAGCAAGGACTGGAGAGGTGGAAGAGCTGCTTCATTCAATATCATTCCTAGCAGCACTGGAGCTGCCAAGGCTGTTGGTAAGGTGCTGCCTGCACTTAATGGGAAATTGACTGGAATGGCTTTCCGTGTTCCCACTGTCGATGTCTCAGTGGTTGACCTCACTGTGAGGCTGGAAAAGAAGGCTACTTATGATGAAATCAAAGCTGCTATCAAGGCAGCGTCTGAGGGAAACATGAAGGGGATCTTGGGTTACACCGAGG(2)SEQ ID No.2的信息(a)序列特征
長度355個堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源茶樹(d)序列描述SEQ ID No.2GGGTGAGGGTAGTTTGAAGGGAATCCTTGGTTACACTGAGGATGATGTAGTGTCAACCGACTTTATTGGTGATTGCAGGTCCAGCATTTTTGATGCCAAGGCTGGTATTGCATTGAATGAGAACTTTGTGAAGTTTGTCTCTTGGTATGACAACGAATGGGGTTACAGCAACCGGGTGATTGACTTGATTCGACACATGGCCTCTGCTTAATGAGCTTCTTTGGCGCTGATTCCGAGCATACCATGAAGATTAGTACTGTTCCATGGTTAGGGAGTTCAGTTTGGAATAATTTGCTGTTCAAACACTATACCAATTTTGACAGAGAAGTTAAAGAGCGATGTCTTCTTGCGTT(3)SEQ ID No.3的信息(a)序列特征長度596個堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源茶樹(d)序列描述SEQ ID No.3GGGGTCCGCAGCTCTCTCTCTCCCTCTCTCCCTTTATCACTCACTCTCTACAGTCTGTTCCCTCTCCTACGCTTAAGATCATGGGCAAGATCAAGATCGGAATCAATGGCTTTGGAAGGATGGCCGGTGTGGGTGGCCAGAGGTGGCTCTGCAAAGAGACGATGTTGAGCTCGTCGCTGCTCAACGATCCCTTCATCACCACTGAGTTACATGACTTACATGTTCAAGTATGATAGTGTTCACGGTCAAGTGGAAGCATCATGAACTCAAAGGTGAAGGATTCCAAGACCCTTCTCTTGTGGAGAGAAAGCAGTAGCTGTTTTAGGGCCTTAGGAACCCAGAGGAGATCCCATGGGCTGAGACTGGAGCCGAATTCATTGTGGAGTCCACTGGAGTCTTCACTGATAAGGATAAGGCCGCTGCCCACTTAAAGGGTGGTGCAAAGAAGGTTATCATTTCAGCCCCTAGTAAGGATGCTCCCATGTGGTACATGGGTGTCAATGAGAAGGATTACAAGCCAGATCTTCACATTGTTTCCAATGCTAAGCTGCACTACCAACTGTCTTGCCCCCTTGCTAGGTCACCACTGAACAAGT
權(quán)利要求
1.一類分離出的茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)序列標(biāo)簽的序列，其特征在于表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的序列；所示3條序列中的一條或數(shù)條的組合；每條序列的互補(bǔ)序列或同源序列；每條序列中8～100個連續(xù)核苷酸為探針的序列或其互補(bǔ)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類分離出的茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)序列標(biāo)簽的序列，其特征在于，它的制備方法為1)茶樹總RNA提??；2)mRNA分離與純化；3)采用PCR法合成cDNA第一鏈和第二鏈；4)cDNA酶切、純化，并與載體連接；5)產(chǎn)生噬菌體文庫與質(zhì)粒cDNA文庫轉(zhuǎn)化；6)重組質(zhì)粒的培養(yǎng)和提??；7)表達(dá)序列標(biāo)簽序列的測定；8)剔除載體序列、冗余序列，互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索、分類，獲得SEQ ID No.1～SEQID No.3表達(dá)序列標(biāo)簽序列。
3.一種由權(quán)利要求1所述表達(dá)序列標(biāo)簽所組成的生物芯片，其特征在于在載體上結(jié)合有SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的序列；同源序列或其互補(bǔ)序列的核酸分子；所說的核酸分子是脫氧核糖核酸；核糖核酸和多聚寡核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片，其特征在于，所說的芯片制備方法為1)對SEQ ID No.1～SEQ ID No.3表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增；2)PCR產(chǎn)物純化處理后用于芯片制作；3)芯片由芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)制。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片，其特征在于所說的載體為固相載體或液相載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片，其特征在于所說的固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維素膜、凝膠。
7.一種茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因表達(dá)的分析檢測，其特征在于利用表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的序列；所示的序列中的一條或數(shù)條的組合；每條序列的互補(bǔ)序列或同源序列；每條序列中的8～100個連續(xù)核苷酸序列或其互補(bǔ)序列作為基因表達(dá)分析檢測的探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因表達(dá)的分析檢測，其特征在于所說的茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因表達(dá)的分析檢測方法，它的步驟為1)靶基因組織總RNA或mRNA的提??；2)甲醛凝膠變性電泳分離RNA；3)將變性電泳后的RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜或硝酸纖維素膜；4)利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的序列、同源序列、互補(bǔ)序列、8-100個核苷酸序列為探針，采用同位素法制備探針；5)探針與靶基因雜交、放射自顯影，通過定性、定量比較雜交圖譜，可以明確基因是否表達(dá)、表達(dá)的活性是上調(diào)還是下調(diào)。
9.一種茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的克隆，其特征在于利用表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQID No.1～SEQ ID No.3所示的序列、所示的序列中的一條或數(shù)條的組合、每條序列的互補(bǔ)序列或同源序列、每條序列中的30～100個連續(xù)核苷酸為探針的序列或其互補(bǔ)序列來合成PCR擴(kuò)增的基因特異引物、擴(kuò)增甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因全長的5’或3’引物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的克隆，其特征在于所說的茶樹甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的克隆方法，它的步驟為1)總RNA的提取和mRNA的分離；2)PCR法合成5’或3’cDNA；3)利用表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的序列、同源序列、互補(bǔ)序列或30～100個連續(xù)核苷酸來合成基因特異引物，PCR快速擴(kuò)增末端cDNA；4)Southern雜交或克隆測序鑒定PCR產(chǎn)物的特性；5)當(dāng)PCR產(chǎn)物被部分或全部測序所鑒定后，以5′cDNA為模板，用表達(dá)序列標(biāo)簽5’或3’設(shè)計(jì)的引物，采用長距離PCR擴(kuò)增獲得基因全長。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類茶樹甘油醛－3－磷酸脫氫酶表達(dá)序列標(biāo)簽及其生物芯片。表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ IDNo.1～SEQ ID No.3所示的序列；所示3條序列中的一條或數(shù)條的組合；每條序列的互補(bǔ)序列或同源序列；每條序列中8～100個連續(xù)核苷酸為探針的序列或其互補(bǔ)序列。運(yùn)用表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)對構(gòu)建的茶樹互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)文庫進(jìn)行脫氧核糖核酸序列測定，獲得的表達(dá)序列標(biāo)簽通過剔除冗余序列、互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索、分類，富積非冗余序列，獲得了3條茶樹甘油醛－3－磷酸脫氫酶表達(dá)序列標(biāo)簽，本發(fā)明應(yīng)用于作物種質(zhì)資源的鑒定評價、作物雜種優(yōu)勢的早期預(yù)測、作物育種和新品種的產(chǎn)生與鑒定、植物抗逆性的研究、植物單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢定、轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的安全性檢測、新型除草劑和新型農(nóng)藥的篩選等。
文檔編號C12P19/34GK1552906SQ20031010957
公開日2004年12月8日 申請日期2003年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月18日
發(fā)明者高其康, 陳亮, 趙麗萍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所