一種基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器的癌胚抗原免疫分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器的癌胚抗原免疫分析方法,具體為將量子點納米水溶膠與待測癌胚抗原的單克隆抗體1偶聯(lián),功能化感光微球與鏈霉親和素偶聯(lián),待測癌胚抗原的單克隆抗體2進行生物素標記,利用雙抗體夾心法,通過680nm的近紅外激光照射后,采集605nm處熒光信號,熒光信號強度與體系當中癌胚抗原的含量成正比關(guān)系,從而實現(xiàn)癌胚抗原均相熒光免疫分析。本發(fā)明免疫分析癌胚抗原的方法是基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器而建立的,從而避免使用有機染料作為熒光受體,而且,本發(fā)明的檢測方法靈敏度高、穩(wěn)定性好、使用簡單、方便。
【專利說明】
一種基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器的癌胚抗原免疫分 析方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域,具體地,涉及一種基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點 傳感器的癌胚抗原免疫分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)是一種糖蛋白復合物,分子量約為 220KDa左右,它是由加拿大科學家Samuel 0. Freedman和Phil Go Id于1965年在結(jié)腸癌組織 提取物當中首次發(fā)現(xiàn)。通常而言,癌胚抗原是在胎兒時期,由胃腸道組織、胰和肝臟細胞合 成,并在出生后基本停止合成。因此正常健康個體的血清當中癌胚抗原的含量維持在很低 的水平,約為2.5yg/mL。通常認為,血清中CEA水平的升高在胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、甲 狀腺髓樣癌患者當中較為常見,也常見于一些非腫瘤性疾病當中,比如潰瘍性結(jié)腸炎、胰腺 炎、肝硬化、慢性阻塞性肺病、克羅恩病等。因此,血清當中CEA含量的檢測對上述疾病的診 斷與治療具有重要的價值。
[0003] 目前國內(nèi)對癌胚抗原的檢測主要采用傳統(tǒng)的非均相分析(如ELISA,DIPSTICK等) 以及新型的高端定量免疫學檢測技術(shù)(如時間分辨熒光免疫分析TRFIA,微陣列等)。許多相 關(guān)技術(shù)都用到微球,也能做到很高靈敏度的定性定量分析,但大多數(shù)微球使用的是有機染 料,而且多為固相的或非均相分析,整個操作過程步驟多,需要洗滌來分離結(jié)合標記與游離 標記,耗費時間長,不易自動化等缺點。而均相熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析就可以克服這些缺 點,分析操作簡單,不需要洗滌分離游離標記物,分析速度快,易實現(xiàn)自動化等優(yōu)點,在生物 分析領(lǐng)域其應(yīng)用越來越廣泛。
[0004] 現(xiàn)有的均相時間分辨熒光能量共振轉(zhuǎn)移分析(HTRFA)技術(shù)體系中,能量供體與受 體是一對一的分子相互作用形成能量轉(zhuǎn)移,從而實現(xiàn)定性定量分析。其技術(shù)瓶頸在于:一對 一的分子能量共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效率很低,供體的能量不能充分利用,其靈敏度受到一 定的限制;其次,目前這些分析方法用到的能量受體是熒光素(fluorescein)、青色素 (cyanine,cy),亞歷克撒染料(Alexa),藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)或別藻紅蛋白 (al lophycocyanin,APC)等有機染料。盡管有機染料已使用數(shù)十載,然而,眾所周知,有機染 料致命的的缺點就是光譜的Stock位移比較短,熒光發(fā)射峰不對稱且有明顯拖尾,抗光漂白 性極差,使得基于熒光值分析測試方法的生物分析,尤其是HTRFA很不穩(wěn)定,效率低下,間內(nèi) 和間外分析偏差較大。因此,有機染料并非HTRFA能量受體的最佳選擇。而且,F(xiàn)RET傳遞距離 限制較大,一般不能超過l〇nm的空間距離。另一方面,由于大多數(shù)有機染料熒光發(fā)射光譜寬 而且有明顯拖尾,現(xiàn)有HTRFA技術(shù)僅適合在長波長或近紅外波段進行分析,對昂貴的近紅外 敏感檢測器要求依然存在。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足,提供了一種基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點 傳感器的癌胚抗原免疫分析方法。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明是通過以下方案予以實現(xiàn)的:
[0007] -種基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器的癌胚抗原免疫分析方法,包括如下步 驟:將量子點納米水溶膠與待測癌胚抗原的單克隆抗體1偶聯(lián),功能化感光微球與鏈霉親和 素偶聯(lián),待測癌胚抗原的單克隆抗體2進行生物素標記,利用雙抗體夾心法,通過680nm的近 紅外激光照射后,采集605nm處熒光信號,熒光信號強度與體系當中癌胚抗原的含量成正比 關(guān)系,從而實現(xiàn)癌胚抗原均相熒光免疫分析;
[0008] 所述量子點納米水溶膠的制備步驟如下:將發(fā)射波長在520~620nm之間的脂溶性 量子點改性成水溶性量子點;將制備的水溶性量子點、噻嗪化合物包被入羧基、氨基、羥基、 醛基或磺酸基修飾的納米乳膠球中制備出量子點納米乳膠球;對量子點納米乳膠球進行水 溶膠非特異性處理,將量子點納米乳膠球表面修飾葡聚糖凝膠得到量子點納米水溶膠;所 述功能化感光微球的制備方法為:將感光材料酞菁化合物包被入羧基、氨基、羥基、醛基或 磺酸基修飾的納米乳膠球中,得到功能化感光微球。
[0009] 解釋說明:待測癌胚抗原的單克隆抗體1和待測癌胚抗原的單克隆抗體2僅僅是為 了表述兩個抗體能組成夾心法檢測,優(yōu)選地,所述待測癌胚抗原的單克隆抗體1為癌胚抗原 單克隆抗體S001,待測癌胚抗原的單克隆抗體2為癌胚抗原單克隆抗體6F11。
[0010] 本發(fā)明的傳感器不同于傳統(tǒng)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移而發(fā)光,主要是基于單線態(tài)活性 氧而發(fā)光。本發(fā)明的傳感器是基于單線態(tài)氧通道能量傳遞技術(shù)與量子點納米水溶膠(TQPS) 內(nèi)部的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的聯(lián)合應(yīng)用。
[0011]優(yōu)選地,制備量子點納米水溶膠時用的納米乳膠球為聚苯乙烯-二乙烯基苯羧酸 改性膠乳,制備功能化感光微球時用的納米乳膠球為表面羧基化的聚苯乙烯微球。納米乳 膠球具有以下特性:表面具有多孔性、表面含有羧基化合物、光學通透性、粒徑分布均勻。
[0012] 脂溶性量子點是指量子點能溶解于癸烷、己烷、三氯甲烷等有機溶劑內(nèi)。優(yōu)選地, 所述脂溶性量子點為硒化鎘、硫化鎘或碲化鎘為核的各種半導體納米晶體。根據(jù)具體情況 選擇所需波長的量子點,只要其發(fā)射波長在520~620nm之間,均適合本發(fā)明。量子點的生物 應(yīng)用層出不窮,因其抗光漂白性極強,亮度高,一束激光光源可同時激發(fā)不同顏色的量子 點,而且能經(jīng)受激光的多次激發(fā)照射而熒光強度無明顯變化;此外,量子點的光譜Stock位 移比較寬,熒光發(fā)射峰窄而對稱,無拖尾,該特性使得量子點納米乳膠球能滿足該免疫分析 方法靈敏度和精密度要求,不需要昂貴的紅敏檢測器件。量子點熒光發(fā)射波譜最大半峰寬 窄,不同波長的量子點可以使用同一激發(fā)光激發(fā)等特性,因此,具有發(fā)射峰在525、565或 605nm的其熒光發(fā)射波譜與噻嗪化合物熒光發(fā)射重疊較少,而這些量子點的摩爾激發(fā)光譜 與噻嗪化合物熒光發(fā)射重疊較多,最適合與噻嗪化物之間實現(xiàn)均相熒光共振能量轉(zhuǎn)移分 析。
[0013] 由于直接從水溶液制備的量子點的最大半峰寬一般較大,接近60nm,不適合本發(fā) 明CEA分析。因此,本發(fā)明采用脂溶性量子點,然后改性成為水溶性量子點。由于只是進行量 子點表面改性,不存在對發(fā)光核心材料的影響,改性后得到的熒光發(fā)射峰位置和粒徑等與 油溶性相比無明顯差異;改性方法簡單易行,可操作性強;
[0014] 優(yōu)選地,所述脂溶性量子點改性成水溶性量子點的方法為:將穩(wěn)定劑加入到溶解 于三氯甲烷的脂溶性量子點中,混合均勻;加入0.1M的氫氧化鈉溶液振蕩孵育,室溫下保存 1~3小時;加入去離子水和丙酮,沉淀、離心、溶解即可得到水溶性量子點。
[0015] 優(yōu)選地,所述穩(wěn)定劑為巰基丁二酸、谷胱甘肽或巰基乙酸。
[0016] 更優(yōu)選地,所述脂溶性量子點改性成水溶性量子點的方法為:將25mg巰基丁二酸 穩(wěn)定劑加入到溶解于三氯甲燒中硒化鎘量子點(1~5μΜ)500μL,混合均勻,加入0.1M的氫氧 化鈉溶液10~1 〇〇yL,振蕩孵育,室溫下保存1~3小時。加入400yL去離子水,和1.8mL丙酮, 沉淀,離心,溶解于0.5mL的去離子水中,即可得到水溶性量子點。
[0017] 優(yōu)選地,使用水溶性量子點制備量子點納米乳膠球之前,可以使用三辛基氧膦、正 十六胺或其他碳鏈大于五的正烷烴修飾水溶性量子點表面,使其表面具有疏水和親水的雙 能性基團。預處理的方法為:將三辛基氧膦加入到水溶性量子點中;加熱到60°c,劇烈攪拌, 使之完全溶解,冷卻至室溫;先后加入苯甲醇、乙二醇和濃度為0.1M的氫氧化鈉溶液攪拌混 合均勻。
[0018] 傳感器中量子點納米水溶膠是能量受體,功能化感光微球是能量供體。供體與受 體之間可實現(xiàn)長達200nm的遠距離能量轉(zhuǎn)移。
[0019] 量子點納米乳膠球內(nèi)包含具有與單線態(tài)氧反應(yīng)的化學試劑、量子點。化學試劑指 的是能量受體,其包含噻嗪化合物或其他具有能與單線態(tài)氧反應(yīng)時釋放200~400nm熒光的 化學試劑,噻嗪化合物等化學試劑與單線態(tài)氧發(fā)生化學反應(yīng)后,釋放出的熒光能與量子點 能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
[0020] 優(yōu)選地,所述量子點納米乳膠球的制備方法具體為:向水溶性量子點中加入三辛 基膦,加熱,攪拌均勻,然后與溶脹劑、噻嗪化合物和羧基、氨基、羥基、醛基或磺酸基修飾的 納米乳膠球混合均勻,在110~120°C高溫熱溶脹5~30min,冷卻到室溫,高速離心沉淀洗 滌,得到量子點納米乳膠球。
[0021] 更優(yōu)選地,所述溶脹劑是苯甲醇(或三氯甲烷、丙酮、乙氧基乙醇等其他溶劑)、去 離子水與乙二醇的混合物,三者的體積比為1:(0.8~1):(8~8.2)。在熱溶脹劑保護下,羧 基、氨基、羥基、醛基或磺酸基修飾的納米乳膠球表面在高溫下膨脹,不會被過度撕裂而造 成表面官能團分布不均,克服量子點熒光淬滅的問題,保持其包被前應(yīng)有的量子產(chǎn)率,并有 效防止沉淀聚集,大大提高量子點納米乳膠球的穩(wěn)定性。
[0022]優(yōu)選地,所述水溶性量子點的濃度一般為0.1~1 ΟμΜ/mL。羧基、氨基、羥基、醛基或 磺酸基修飾的納米乳膠球一般為1~200mg/mL,粒徑一般為20nm~3μηι,更優(yōu)選,粒徑為20nm ~300nm。另外,作為優(yōu)選實施方式,制備功能化感光微球時用的納米乳膠球的粒徑<制備 量子點納米水溶膠時用的納米乳膠球的粒徑。乳膠球表面含有大量羧基化合物,其羧基密 度為每平方納米含有5~12個,該規(guī)格的乳膠球是經(jīng)過了特殊處理,不同于一般的羧基化聚 苯乙烯微球,表面有微孔能通過熱溶脹包容具有雙功能團的納米顆粒,該乳膠球親水性較 強,具有很強的光學通透性,可以直接用于偶聯(lián)生物分子或表面處理,適合做臨床診斷分 析。本發(fā)明所述方法,推薦直接使用CPS乳膠球,不必使用表面附有一層羧基的聚苯乙烯微 球,也不必將非水溶性聚苯乙烯微球進行羧基化或其他基團的接枝。本發(fā)明采用溫和的雙 功能有機試劑,在高于大多數(shù)生物分析所要求的溫度下,即在110~120°C溶脹乳膠球包埋 水溶性量子點。大多數(shù)生物分析所要求的溫度均低于熱溶脹溫度,可以避免使用中產(chǎn)生的 泄漏問題。雖然包被量子點后納米乳膠球的尺寸分布稍微變化,但不會影響量子點納米乳 膠球的生物應(yīng)用。
[0023] 優(yōu)選地,所述量子點納米水溶膠的具體制備方法為:將氨基葡聚糖溶解于MES緩沖 液中,調(diào)節(jié)pH為6.0后逐滴加入量子點納米乳膠球中;攪拌加入EDAC溶液和MES緩沖液,室溫 下持續(xù)攪拌2小時;加入乙醇胺孵育30min,17000rmp離心棄掉上清液;將沉淀物溶于去離子 水中,超聲處理,重復該步驟三次,即得。
[0024] 葡聚糖是生物領(lǐng)域廣泛使用到一種水溶膠。購置的氨基化葡聚糖分子量為 lOOKDa,每7個葡聚糖單元含有1~2個氨基;偶聯(lián)劑是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞 胺鹽酸鹽(EDAC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS),也可以使用其他能將羧基與氨基 偶聯(lián)的偶聯(lián)劑,對應(yīng)的緩沖溶液等反應(yīng)條件也相應(yīng)變化;通過偶聯(lián)后,量子點納米乳膠球所 剩羧基或氨基可繼續(xù)偶聯(lián)生物分子;此外,TQPS表層的葡聚糖極大地防止量子點的泄漏,增 強其自身的穩(wěn)定性和生物兼容性。按本發(fā)明制得的TQPS作為檢測CEA抗原傳感器的重要組 成部分,其表面含有大量的羥基、羧基和氨基官能團,能單分散于生物用緩沖液中,克服了 自身因為羧基的負電荷密度高所導致的沉淀問題,也解決了對生物分子的非特異性吸附問 題。
[0025]所述傳感器的TQPS與偶聯(lián)抗體,是通過共價鍵作用,在偶聯(lián)劑EDAC和Sulfo-NHS的 作用下,將癌胚抗原CEA的單克隆抗體S001與TQPS表面羧基相偶聯(lián),制備出用于均相免疫分 析的功能性TQPS。根據(jù)待分析物的不同,與TQPS偶聯(lián)的抗體也可以使用別的蛋白,或者末端 帶有氨基或者羧基的核酸或者肽鏈。
[0026]所述的605nm處熒光信號來自于TQPS。當近紅外激光激發(fā)檢測樣品時,SA-PS內(nèi)的 BTHS因吸收感光能量釋放出單線態(tài)活性氧。該活性氧即可擴散并滲透到200nm范圍內(nèi)的 TQPS,于是與TQPS所含噻嗪化合物反應(yīng)釋放短波長熒光(320~400nm),并與周圍的量子點 發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,從而使得TQPS釋放出605nm的熒光檢測信號。
[0027] 本發(fā)明所述傳感器還需要制備能被近紅外光激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧的功能化感光微 球,其制備方法為:將羧基、氨基、羥基、醛基或磺酸基修飾的納米乳膠球加入到乙二醇中, 取酞菁化合物溶于苯甲醇中,二者混合后加入去離子水,混勻后110°c反應(yīng)10分鐘,冷卻至 室溫后添加乙醇,尺寸選擇性離心。
[0028] 所述感光材料酞菁化合物為本領(lǐng)域常用的酞菁化合物,如二氫氧化硅2,9,16,23-四叔丁基-29H,31H-酞菁,CAS 號:85214-70-6。
[0029]感光材料酞菁化合物(BTHS)受到近紅外激光照射,釋放出大量的單線態(tài)活性氧。 有文獻報道(Macromolecules 25,3399-3405),這些單線態(tài)活性氧可以在一般水溶性介質(zhì) 中擴散,其距離大約200nm,并能滲透入其周圍的聚苯乙烯微球,其效率達到20%。新型傳感 器基于該單線態(tài)氧通道傳遞技術(shù),結(jié)合量子點的抗光漂白性及其特異性光學性質(zhì),大大提 高了能轉(zhuǎn)移效率,克服了水溶膠表面基團對能量轉(zhuǎn)移的空間障礙;同時,因為表面有多個結(jié) 合位點可以同時向光激化學發(fā)光量子點進行單線態(tài)氧傳遞,大大提高了檢測的靈敏度。 [0030]所述的基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器的均相熒光分析應(yīng)用,指的是利用單 線態(tài)氧接收端噻嗪化合物與量子點之間熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理進行的免疫分析血清中的 癌胚抗原含量。在該分析方法中,采用雙抗體夾心一步法,將能量受體與供體偶聯(lián)到抗原的 兩個單克隆抗體上,借助抗體與抗原的免疫反應(yīng),將能量受體TQPS與供體SA-PS靠近,當感 光微球SA-PS和量子點納米水溶膠TQPS距離小于200nm時,即可發(fā)生氧信號傳遞,繼而激發(fā) TQPS內(nèi)QDS和噻嗪化合物之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(如圖2所示)。
[0031]在TQPS內(nèi),根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理,需要實現(xiàn)發(fā)光天線材料噻嗪化合物與量 子點之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移,而要實現(xiàn)共振能量轉(zhuǎn)移需要天線材料的發(fā)射波譜與量子點 的激發(fā)波長匹配(如圖3所示)。根據(jù)選用的發(fā)光材料噻嗪化合物發(fā)光光譜及量子點的摩爾 消光光譜,理論計算光譜重疊為:
[0033] 這里A表示量子點能量受體,D表示發(fā)光天線材料。εΑ為量子點的激發(fā)光譜函數(shù),λ 為波長,Id為能量供體的熒光發(fā)射光譜函數(shù)。計算得J(A) = 2.86 X 1016。
[0034] 發(fā)光天線材料與量子點相接近需要F&ter距離理論公式:
[0035] R〇=(8.79X10-5 · κ2 · Φ〇 · η-4 · J(A))1/6
[0036] 其中,Φ?為發(fā)光天線材料的量子產(chǎn)率(2.5%),κ2為動力學參數(shù)一般為2/3,n為溶 液折射率。由該公式計算得到發(fā)光天線材料與量子點發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的Fdster距離 為2.3nm,此距離是發(fā)光天線材料與量子點之間發(fā)生50%能量轉(zhuǎn)移效率的平均距離。 「00371 而帯I#垢能畺拄軟溈鑾.
[0039]其中r為能量供體與受體的空間距離;實際應(yīng)用中,能量轉(zhuǎn)移效率E-般為1.5%-98.5%為有效轉(zhuǎn)移范圍,即可得到發(fā)光天線材料與量子點距離為1.611 111〈1?〈4.611111。因此,在 空間結(jié)構(gòu)上,本發(fā)明所用到的噻嗪化合物與量子點通過簡單包埋在聚苯乙烯微球,在理論 上滿足熒光能量轉(zhuǎn)移的條件。
[0040]因為紅色量子點(熒光發(fā)射峰605nm,量子產(chǎn)率為48% )的摩爾激發(fā)光譜與噻嗪化 合物的發(fā)射光譜有較大重疊,感光微球與TQPS分別標記上鏈霉親和素和CEA的單克隆抗體 S001組成基于單線態(tài)氧通道發(fā)光的量子點傳感器,并且CEA的另一株單克隆抗體6F11進行 了生物素標記。因此,當基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器、生物素化6F11與CEA抗原發(fā) 生免疫反應(yīng)后,感光微球與TQPS被拉近,此時在激發(fā)光源的照射下,感光微球使周邊的氧變 成高能態(tài)的單線態(tài)氧,單線態(tài)氧傳遞到量子點納米水溶膠內(nèi)部,繼而激發(fā)噻嗪化合物與量 子點之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移,量子點發(fā)出信號熒光(如圖3所示)。當兩單克隆抗體較抗原 CEA大大過量時,檢測到的熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號將與抗原的量成比例關(guān)系(如圖4所示)。 [0041 ]與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下有益效果:
[0042] 本發(fā)明免疫分析癌胚抗原的方法是基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器而建立 的,從而避免使用有機染料作為熒光受體,而且,本發(fā)明的檢測方法靈敏度高、穩(wěn)定性好、使 用簡單、方便。
[0043] 本發(fā)明涉及的傳感器是基于單線態(tài)氧傳遞的新型均相熒光免疫分析傳感器,該傳 感器改變了現(xiàn)有技術(shù)能量配體一對一的方式,并且突破20nm的空間檢測距離。另外,單線態(tài) 氧通道發(fā)光量子點是一種具有新奇的光學特性的能量受體:其光譜的Stock位移比較寬,熒 光發(fā)射峰對稱且無明顯拖尾,更重要的是抗光漂白性極強,而且該能量受體不依賴于昂貴 的紅敏檢測器。這類傳感器,無需沖洗過量標記物,在均相中反應(yīng)和檢測,適合大分子免疫 球蛋白或小分子半抗原等生物分子的檢測,在體外免疫診斷領(lǐng)域具有潛在的巨大優(yōu)勢。
[0044] 本發(fā)明獨創(chuàng)性地制備多功能基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器。該傳感器用到 TQPS具有水溶性好、尺寸分布均勻、量子產(chǎn)率高等優(yōu)點,提高了分析的穩(wěn)定性和靈敏度,也 克服了非特異性吸附等問題,創(chuàng)新性地在將量子點與氧傳遞技術(shù)相結(jié)合。使用多功能基于 單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器的新型均相氧傳遞熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析方法,不僅可提 高能量轉(zhuǎn)移效率從而提高了分析靈敏度,還可以減少對昂貴紅敏光子探測器的依賴,在臨 床分子診斷和食品檢測等生物化學分析中具有非常重要的意義。
【附圖說明】
[0045] 圖1為納米水溶膠功能化前(CPS)后(QPS)的粒徑分布圖。
[0046] 圖2為基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器均相分析原理圖。
[0047] 圖3為水溶性量子點的摩爾激發(fā)光譜與噻嗪化合物熒光發(fā)射波譜圖。
[0048] 圖4為基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器均相免疫夾心法分析CEA的初步應(yīng)用。
【具體實施方式】
[0049] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步地詳細闡述,所述實施例只 用于解釋本發(fā)明,并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的聚苯乙烯-二乙烯基 苯羧酸改性膠乳購自Thermo Fisher Scientific公司(貨號8300-0520100390),脂溶性量 子點(貨號Q21701MP)購自Invitrogen公司,偶聯(lián)劑EDAC、Sulf〇-NHS以及三辛基氧膦等化學 試劑均購自美國Sigma-Aldrich公司,所用到的癌胚抗原單克隆抗體S001及6F11和癌胚抗 原抗原標準品購自中山大學達安基因公司,其他化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司
[0050] 實施例1
[0051] 該步驟的核心技術(shù)是,得到量子產(chǎn)率高、熒光發(fā)射峰最大半峰寬窄而對稱的水溶 性量子點。本發(fā)明具體實施用到的是從美國Invitrogen公司購得的核/殼型硒化鎘/硫化鋅 量子點,其溶劑為癸烷,其波譜Stock位移長度從592nm往短波長之間的較寬范圍內(nèi),因此波 長短于592nm均可激發(fā)該量子點;熒光發(fā)射峰為605 ±0.5nm,最大半峰寬為27 ± 1.5nm,量子 產(chǎn)率76 %;這樣的光學特性的量子點,與單線態(tài)氧接收"天線"噻嗪化合物熒光發(fā)射譜較匹 配,從各方面均克服了有機染料的不足,適合取代之,以減少測量誤差,提高熒光能量共振 轉(zhuǎn)移(FRET)效率,從而提高分析靈敏度。
[0052] -種基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器的癌胚抗原免疫分析方法,包括量子點 納米水溶膠與功能化感光微球;量子點納米水溶膠與功能化感光微球的制備方法如下: [0053] 一、高性能水溶性量子點的制備:將50yL購得的脂溶性量子點置于離心管中,加入 200yL的無水甲醇;混合均勻,密封離心管,在3000rpm、4°C離心5min;棄掉上清液,加入50yL 三氯甲烷,充分溶解;加入25mg巰基丁二酸穩(wěn)定劑和0.1M的氫氧化鈉水溶液20yL,混合均 勻,在搖床上振蕩孵育,室溫下保存3小時;加入100yL去離子水和1.8mL丙酮,沉淀,6000rpm 離心5min;溶解于0.2mL的去離子水中,得到水溶性量子點待用。得到的水溶性量子點使用 熒光分光光度計分析其發(fā)射波譜,其熒光發(fā)射峰605nm。
[0054]二、基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點納米乳膠球(TQPS)的制備:
[0055] 1、納米乳膠球(CPS)的預處理:將100yL聚苯乙烯-二乙烯基苯羧酸改性膠乳(粒徑 205 ± 3nm,質(zhì)量濃度為100mg/mL,固體濃度為10 % )于14000rmp,4°C離心;棄去上清液,并重 懸于100yL去離子水中;
[0056] 2、水溶性量子點的預處理:將2mg的三辛基氧膦加入到上述步驟一制得的水溶性 量子點中;加熱到60°C,劇烈攪拌,使之完全溶解,冷卻至室溫;先后加入2mL苯甲醇、2.8mL 乙二醇和l〇〇yL濃度為0.1M的氫氧化鈉溶液攪拌混合均勻;
[0057] 3、然后將步驟2中的量子點水溶液和噻嗪化合物(4mg溶解于100yL的苯甲醇中)滴 加入步驟1的納米乳膠球中,在105 °C下劇烈攪拌15分鐘;冷卻至室溫,以12000rpm的速度沉 淀離心25分鐘;溶解于200yL的2-(N-啉)乙磺酸緩沖液(MES,50mM,pH6);得到的高性能水溶 性量子點納米乳膠球(QPS),其尺寸分布如圖1所示,四方形和三角形實線分別表示包被量 子點前后的納米乳膠球尺寸分布情況。所述噻嗪化合物的制備方法如下:將10~15g對溴苯 胺溶解于l〇〇mL二甲基亞砜溶液中,分別加入40mL的1-溴正十四烷和30mL N,N'_二異丙基 乙胺。在氮氣保護下,反應(yīng)液持續(xù)加熱到90°C,反應(yīng)16小時后冷卻至室溫。往反應(yīng)液再次加 入20mL 1 -溴正十四烷和15mL N,N' -二異丙基乙胺。反應(yīng)混合液再次加熱到90 °C反應(yīng)15小 時。反應(yīng)液冷卻至室溫,真空干燥并將殘留液用200mL二氯甲烷稀釋.分別使用1N的Na0H(2 X )水溶液,水和鹽水萃取洗滌,最后使用Na2S〇4干燥。反應(yīng)液濃縮得到棕黑色油約為55g。使 用Agilent 1200HPLC制備液相分離,流動相為正己烷,得到黃色油,其中大多數(shù)為產(chǎn)品4_ 溴-N,N'_二甲基-對苯胺以及少量的1-溴甲烷.后者通過減壓蒸餾(bp 105~110°C, 0.6mmH)即可除去,最終得到目標產(chǎn)物棕色油。
[0058]三、TQPS的制備:TQPS可以通過量子點納米水溶膠表面修飾而制得,其步驟如下: 稱取l〇mg氨基葡聚糖溶解于100yL的MES緩沖液中,用1M鹽酸將pH再次調(diào)到6.0;逐滴加入到 上述步驟二中的量子點納米乳膠球(QPS)中,以300rmp速度攪拌;加入300yL的EDAC溶液 (80mg/mL)和1.4mL的MES緩沖液,室溫下持續(xù)攪拌2小時;加 ImM的乙醇胺700yL,孵育30min; 在17000rmp轉(zhuǎn)速下離心,棄掉上清液,將沉淀物溶解于20yL去離子水中,超聲處理;重復以 上步驟三次,最后得到量子點納米水溶膠感光乳膠球(TQPS)。
[0059] 四、功能性感光微球的制備:
[0060] 將O.lmL表面羧基化的聚苯乙烯微球加入到0.7mL乙二醇中,取5mg BTHS酞菁化合 物溶于0. lmL苯甲醇中,兩者混合后再加入0. lmL去離子水,充分混勻后升溫到110°C,反應(yīng) 10分鐘,冷卻到室溫后添加乙醇,尺寸選擇性離心。將收集到的感光性供體微球(0.1 g)以 10%乙醇保存待用。
[0061 ] 實施例2
[0062] -種基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器的癌胚抗原免疫分析方法,包括量子點 納米水溶膠與功能化感光微球;量子點納米水溶膠與功能化感光微球的制備方法如下: [0063] 一、高性能水溶性量子點的制備:將50yL脂溶性量子點量置于離心管中,加入200μ L的無水甲醇;混合均勾,密封離心管,在3000rpm、4°C離心5min;棄掉上清液,加入40yL三氯 甲烷,充分溶解;加入21mg谷胱甘肽穩(wěn)定劑和0.1M的氫氧化鈉水溶液10yL,混合均勻,在搖 床上振蕩孵育,室溫下保存2小時;加入100yL去離子水和1.8mL丙酮,沉淀,6000rpm離心 5min;溶解于0.5mL的去離子水中,得到水溶性量子點。制得的水溶性量子點用熒光分光光 度計分析其發(fā)射波譜,其熒光發(fā)射峰605nm。
[0064] 二、基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點納米乳膠球(TQPS)的制備:
[0065] 三、TQPS的制備:
[0066]四、功能性感光微球的制備:
[0067] 實施例3
[0068] 基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器在均相氧傳遞熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析中的 應(yīng)用,單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器均相分析原理如圖3所示,應(yīng)用的步驟如下:
[0069] 一、TQPS與抗癌胚抗原單克隆抗體偶聯(lián),步驟如下:配制0.5M的MES緩沖液,pH調(diào)制 6.1,取100yL待用;用去離子水配制50mg/mL的Sulf o-NHS溶液,取230yL待用;用去離子水配 制50mg/mL的EDAC溶液,取240yL待用;將以上待用溶液混合,用去離子水定容至lmL,加入上 述步驟三制備的TQPS中,重懸;混合物室溫下震蕩反應(yīng)30分鐘;16000rmp轉(zhuǎn)速離心,除去未 反應(yīng)的Sulfo-NHS和EDAC,使用去離子水洗滌,重懸,離心,重復三次;去離子水重懸活化后 的TQPS,最終質(zhì)量濃度為1%,體積為lmL;取500yL加入500yL的單克隆抗體S001(lmg/mL); 輕輕震蕩孵育2小時,加入1.5yL乙胺醇,室溫震蕩孵育30分鐘;離心洗滌除去未偶聯(lián)的蛋白 質(zhì)和乙胺醇;加入lmL的50mM的磷酸緩沖液(其中含有0.05%Proclin-300),得到偶聯(lián)有單 克隆抗體S001的量子點納米水溶膠感光乳膠球,并將其濃度調(diào)整為100yg/mL,其摩爾激發(fā) 光譜如圖2左側(cè)紅曲線所示。
[0070]二、感光微球與鏈霉親和素的偶聯(lián),通過EDAC和Sulfo-NHS,把制備得的供體微球 表面偶聯(lián)上鏈霉親和素,并將其濃度調(diào)整至16yg/mL。
[0071 ]三、抗癌胚抗原單克隆抗體6F11的生物素化標記:按照s igma公司說明書將抗體溶 液與生物素溶液體積比為10:1充分混勻,室溫振動孵育4小時后,采用美國Mi 11 ipore公司 的帶有濾膜的離心管去除多余的生物素,并將抗體濃度調(diào)整為Syg/mL。
[0072] 四、將CEA抗原配制成0即/1111^、21^/1]11^、51^/1111^、2〇1^/1111^、10〇1^/1111^、50〇1^/1111^系列 濃度;微孔條中依次加入25yL待測樣品,25μμL生物素化抗體、25yL量子點納米水溶膠,加貝占 封片;微孔反應(yīng)條在37°C恒溫振蕩儀內(nèi)振動孵育15分鐘;在避光條件下加入鏈霉親和素化 的供體微球175yL;微孔反應(yīng)條在37°C恒溫振蕩儀內(nèi)振動孵育15分鐘;在PerkinElmer公司 2300EnSpireTM檢測儀上檢測信號值。參考標準品濃度的對數(shù)為橫坐標,信號值計數(shù)的對數(shù) 為縱坐標,由雙對數(shù)數(shù)學模型Log-Log函數(shù)處理,測得CEA試劑盒劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系 數(shù)為r = 0.9918,如圖3所示。
[0073] 在進彳丁以上檢測之后的兩小時內(nèi),每隔10分鐘進彳丁相同的灰光檢測。所有樣品的 結(jié)果顯示,使用的TQPS抗光漂白性極強,標準品濃度與熒光值雙對數(shù)關(guān)系圖幾乎重疊。 [0074]以零參考標準品(A點)作為標本重復測量20次,計算其熒光均值X及標準差SD,X+ 2SD所得的熒光值代入標準曲線方程計算得出其靈敏度,即檢測CEA的最低檢測下限為 0·7ng/mL〇
[0075]用血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素做CEA樣品交叉反應(yīng)測,結(jié)果均無交叉反應(yīng)。
【主權(quán)項】
1. 一種基于單線態(tài)氧通道發(fā)光量子點傳感器的癌胚抗原免疫分析方法,其特征在于, 包括如下步驟:將量子點納米水溶膠與待測癌胚抗原的單克隆抗體1偶聯(lián),功能化感光微球 與鏈霉親和素偶聯(lián),待測癌胚抗原的單克隆抗體2進行生物素標記,利用雙抗體夾心法,通 過680nm的近紅外激光照射后,采集605nm處熒光信號,熒光信號強度與體系當中癌胚抗原 的含量成正比關(guān)系,從而實現(xiàn)癌胚抗原均相熒光免疫分析; 所述量子點納米水溶膠的制備步驟如下:將發(fā)射波長在520~620 nm之間的脂溶性量 子點改性成水溶性量子點;將制備的水溶性量子點、噻嗪化合物包被入羧基、氨基、羥基、醛 基或磺酸基修飾的納米乳膠球中制備出量子點納米乳膠球;對量子點納米乳膠球進行水溶 膠非特異性處理,將量子點納米乳膠球表面修飾葡聚糖凝膠得到量子點納米水溶膠;所述 功能化感光微球的制備方法為:將感光材料酞菁化合物包被入羧基、氨基、羥基、醛基或磺 酸基修飾的納米乳膠球中,得到功能化感光微球。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌胚抗原免疫分析方法,其特征在于,所述脂溶性量子點為硒 化鎘、硫化鎘或碲化鎘為核的各種半導體納米晶體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌胚抗原免疫分析方法,其特征在于,所述脂溶性量子點改性 成水溶性量子點的方法為:將穩(wěn)定劑加入到溶解于三氯甲烷的脂溶性量子點中,混合均勻; 加入0.1M的氫氧化鈉溶液振蕩孵育,室溫下保存1~3小時;加入去離子水和丙酮,沉淀、離 心、溶解即可得到水溶性量子點。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的癌胚抗原免疫分析方法,其特征在于,所述穩(wěn)定劑為巰基丁二 酸、谷胱甘肽或巰基乙酸。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌胚抗原免疫分析方法,其特征在于,所述量子點納米乳膠球 的制備方法具體為:向水溶性量子點中加入三辛基膦,加熱,攪拌均勻,然后與溶脹劑、噻嗪 化合物和羧基、氨基、羥基、醛基或磺酸基修飾的納米乳膠球混合均勻,在11 〇~120 °C高溫 熱溶脹5~30min,冷卻到室溫,高速離心沉淀洗滌,得到量子點納米乳膠球。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的癌胚抗原免疫分析方法,其特征在于,所述噻嗪化合物的 制備方法為:將對溴苯胺溶解于二甲基亞砜溶液中,分別加入1-溴正十四烷和N,N'_二異丙 基乙胺,在氮氣保護下,加熱到90°C,反應(yīng)16小時后冷卻至室溫;往反應(yīng)液再次加入1-溴正 十四烷和N,N二異丙基乙胺,再次加熱到90°C反應(yīng)15小時;反應(yīng)液冷卻至室溫,真空干燥 并將殘留液用二氯甲烷稀釋,分別使用NaOH (2X)水溶液,水和鹽水萃取洗滌,最后使用 Na2S04干燥;反應(yīng)液濃縮得到棕黑色油,使用HPLC制備液相分離,流動相為正己烷,得到黃色 油,減壓蒸餾除去雜質(zhì),即得棕色油狀產(chǎn)物。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌胚抗原免疫分析方法,其特征在于,所述量子點納米水溶膠 的具體制備方法為:將氨基葡聚糖溶解于MES緩沖液中,調(diào)節(jié)pH為6.0后逐滴加入量子點納 米乳膠球中;攪拌加入EDAC溶液和MES緩沖液,室溫下持續(xù)攪拌2小時;加入乙醇胺孵育 30min,17000rmp離心棄掉上清液;將沉淀物溶于去離子水中,超聲處理,重復該步驟三次, 即得。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌胚抗原免疫分析方法,其特征在于,所述功能化感光微球的 制備方法為:將羧基、氨基、羥基、醛基或磺酸基修飾的納米乳膠球加入到乙二醇中,取酞菁 化合物溶于苯甲醇中,二者混合后加入去離子水,混勻后ll〇°C反應(yīng)10分鐘,冷卻至室溫后 添加乙醇,尺寸選擇性離心。
【文檔編號】G01N21/64GK106093408SQ201610383258
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月31日 公開號201610383258.3, CN 106093408 A, CN 106093408A, CN 201610383258, CN-A-106093408, CN106093408 A, CN106093408A, CN201610383258, CN201610383258.3
【發(fā)明人】劉天才, 陳振華
【申請人】南方醫(yī)科大學