本發(fā)明涉及醫(yī)藥診斷技術(shù)領(lǐng)域，更具體的是涉及一種新型的基于量子點(diǎn)的CA 15-3免疫層析試紙條的制備方法。

背景技術(shù)：

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升并有年輕化趨勢(shì)。最新調(diào)查顯示，乳腺癌已位居全球女性惡性腫瘤死亡率首位，嚴(yán)重威脅女性生命健康安全。女性乳腺癌發(fā)病率(粗率)全國(guó)合計(jì)為42.55/10萬(wàn)，城市為51.91/10萬(wàn)，農(nóng)村為23.12/10萬(wàn)。乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷，是提高療效的關(guān)鍵。因此研究乳腺癌早期診斷方法有重大意義。

血清糖類抗原(Carbohydrate antigen，CA)15-3是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的乳腺癌診斷和病情監(jiān)測(cè)指標(biāo)，乳腺癌患者通常伴隨著該物質(zhì)的血清含量升高，正常人血清中CA 15-3的含量尚不到28U/mL。因此CA 15-3血清水平是乳腺癌患者檢測(cè)的一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)。對(duì)乳腺癌的早期診斷，術(shù)后監(jiān)測(cè)有重大作用。

免疫層析技術(shù)是將免疫標(biāo)記技術(shù)與層析技術(shù)結(jié)合的一種新型檢測(cè)技術(shù)，它既有免疫標(biāo)記的特異性又有層析技術(shù)快速、便捷等優(yōu)勢(shì)。其中膠體金免疫層析試紙條已廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。但膠體金作為標(biāo)記物，抗原濃度低的樣本檢測(cè)條帶顏色太淺無(wú)法用肉眼識(shí)別，限制了其在檢測(cè)血清腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用。量子點(diǎn)(QDs)是一種半導(dǎo)體納米晶，它具有寬激發(fā)譜、窄發(fā)射譜、熒光效率高、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種備受關(guān)注的新型熒光探針。用量子點(diǎn)取代傳統(tǒng)的膠體金作為標(biāo)記物可以彌補(bǔ)膠體金標(biāo)記的不足。所以本文擬研制基于量子點(diǎn)的CA 15-3免疫熒光試紙條，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行快速、方便、靈敏檢測(cè)，建立乳腺癌檢測(cè)的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于腫瘤標(biāo)志物在腫瘤檢測(cè)中的重要地位、量子點(diǎn)納米粒子獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)以及層析技術(shù)簡(jiǎn)便和價(jià)格方面的優(yōu)勢(shì)。我們將結(jié)合量子點(diǎn)和免疫層析試紙條兩種技術(shù)，利用量子點(diǎn)羧基和CA 15-3單克隆抗體(Ab1)的氨基反應(yīng)，制得量子點(diǎn)熒光探針QDs@Ab1。探針、CA15-3和包埋在試紙條的另一種CA 15-3抗體(Ab1’)通過(guò)抗體抗原之間的作用，形成一種類似夾心的結(jié)構(gòu)QDs@Ab1-CA 15-3-Ab1’。對(duì)CA 15-3——乳腺癌腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行定性定量的檢測(cè)，建立腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的新方法，致力于簡(jiǎn)單迅速、價(jià)格低廉、定性定量、操作簡(jiǎn)便的乳腺癌診斷方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

基于量子點(diǎn)的CA 15-3免疫層析試紙條的制備方法；其步驟如下：

(1)將水溶性量子點(diǎn)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽加入到反應(yīng)器，然后向反應(yīng)器中加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到活化的量子點(diǎn)；

(2)將活化的量子點(diǎn)、CA 15-3單克隆抗體按照摩爾比為1:20～100比例混合于PBS緩沖液中，將混合溶液置于旋轉(zhuǎn)混合架上，室溫下反應(yīng)2～3小時(shí)；

(3)反應(yīng)結(jié)束后，采用離心分離進(jìn)行純化，用PBS緩沖液清洗除去游離的抗體和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，得到熒光探針QDs@Ab1，然后將產(chǎn)物分散在含有1～5％牛血清白蛋白的PBS緩沖液中，4℃靜置過(guò)夜；

(4)將另一種CA 15-3抗體以及羊抗鼠IgG用PBS緩沖液稀釋到1～2mg/mL，用點(diǎn)樣儀噴于硝酸纖維素膜上以形成T線和C線；

(5)將樣品墊，結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序固定于單面塑膠板上，各個(gè)墊和膜之間相互重疊1～3mm，完成試紙條的組裝。

所述量子點(diǎn)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1：4000～10000。

所述原料摩爾比量子點(diǎn)：CA 15-3單克隆抗體＝1：10～100。

所述樣品墊處理方法如下，樣品墊浸入含Tween-20 0.1％～2％的Tris-HCl緩沖液中靜置5-10min，然后放入37℃恒溫干燥箱中干燥2～4小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所述結(jié)合墊處理方法如下，結(jié)合墊浸入含BSA、親水聚合物、表面活性劑、蔗糖的PBS緩沖液的處理液中，靜置5～10min，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥2～4小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所述處理液配方如下：中BSA濃度為1％～4％，親水聚合物濃度為0.5％～5％，表面活性劑濃度為0.1％～2％，蔗糖濃度為1％～10％。

所述步驟1)中在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基30min，離心得到活化的量子點(diǎn)；

本發(fā)明制備的新型基于量子點(diǎn)的CA 15-3免疫層析試紙條優(yōu)勢(shì)在于：

1.采用量子點(diǎn)這種具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于示蹤、成像以及標(biāo)記等方面的納米材料作為探針熒光來(lái)源，將納米技術(shù)應(yīng)用到腫瘤檢測(cè)領(lǐng)域。

2.采用免疫層析技術(shù)作為檢測(cè)用的基材，免疫層析技術(shù)因其簡(jiǎn)單迅速、價(jià)格低廉、可以隨時(shí)隨地等優(yōu)點(diǎn)在檢測(cè)領(lǐng)域處于特殊重要的地位。

3.采用量子點(diǎn)的羧基和抗體的氨基之間的反應(yīng)形成的牢固的化學(xué)鍵，而非傳統(tǒng)的靜電吸附作用，提高了試紙條抵抗非特異性吸附的能力，量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度和CA 15-3濃度之間正相關(guān)關(guān)系可同時(shí)實(shí)現(xiàn)定性和定量檢測(cè)，且靈敏度高，最低可檢測(cè)出0.16U/mL。

附圖說(shuō)明

圖1：本發(fā)明制備的基于量子點(diǎn)的CA 15-3試紙條陰性樣品的檢測(cè)圖片。

圖2：本發(fā)明制備的基于量子點(diǎn)的CA 15-3試紙條陽(yáng)性樣品的檢測(cè)圖片。

圖3：實(shí)施案例1制備的基于量子點(diǎn)的CA 15-3試紙條樣品定量檢測(cè)擬合曲線。

圖4：實(shí)施案例2制備的基于量子點(diǎn)的CA 15-3試紙條樣品定量檢測(cè)擬合曲線。

圖5：實(shí)施案例3制備的基于量子點(diǎn)的CA 15-3試紙條樣品定量檢測(cè)擬合曲線。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施案例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。

具體步驟說(shuō)明如下：

1.量子點(diǎn)偶聯(lián)CA 15-3抗體(QDs@Ab1)

(1)將水溶性量子點(diǎn)(QDs)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)加入到反應(yīng)器，然后向反應(yīng)器中加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基30min，離心得到活化的量子點(diǎn)。

(2)將活化的量子點(diǎn)、CA 15-3單克隆抗體Ab1按照摩爾比為1:20～100比例混合于PBS緩沖液中，將混合溶液置于旋轉(zhuǎn)混合架上，室溫下反應(yīng)2～3小時(shí)；

(3)反應(yīng)結(jié)束后，采用離心分離進(jìn)行純化，用PBS緩沖液清洗三次以除去游離的抗體和EDC，得到熒光探針QDs@Ab1，最后將產(chǎn)物分散在含有1～5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液中，4℃靜置過(guò)夜。

2.抗體的固定

將另一種CA 15-3抗體(Ab1’)以及羊抗鼠IgG(二抗，Ab2)用PBS緩沖液稀釋到1～2mg/mL，用點(diǎn)樣儀噴于硝酸纖維素膜上以形成T線和C線，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥2～4小時(shí)。

3.樣品墊、結(jié)合物釋放墊的預(yù)處理以及熒光探針的固化

(1)將樣品墊浸入含Tween-20 0.1％～2％的Tris-HCl緩沖液中靜置5-10min，然后放入37℃恒溫干燥箱中干燥2～4小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)結(jié)合墊浸入含BSA、親水聚合物、表面活性劑、蔗糖的PBS緩沖液的處理液中，靜置5～10min，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥2～4小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)將所得熒光探針QDs@Ab1用含BSA、親水聚合物、表面活性劑、蔗糖的PBS緩沖液的處理液稀釋5～20倍，均勻涂覆在上述已處理的結(jié)合物釋放墊上，靜置5～10min后于37℃恒溫干燥箱中干燥2～4小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.試紙條的組裝

(1)將所得樣品墊，結(jié)合物釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序固定于單面塑膠板上，各個(gè)墊和膜之間相互重疊1～3mm，完成試紙條的組裝。

(2)用自動(dòng)切膜機(jī)將組裝好的試紙條進(jìn)行切割，寬度約為3mm，并將其裝入塑料板中，最后將其與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封儲(chǔ)存。

5.樣品的測(cè)試和結(jié)果判讀

(1)定性和半定量檢測(cè)：用于激發(fā)量子點(diǎn)的紫外燈波長(zhǎng)范圍為320nm～420nm的普通紫外燈即可；根據(jù)夾心免疫的原理，當(dāng)待測(cè)樣本中含有CA 15-3(CA 15-3)時(shí)，復(fù)合物將同時(shí)被T線和C線捕獲，紫外燈照射下出現(xiàn)兩條熒光條帶，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；反之，檢測(cè)樣本中不含CA 15-3時(shí)，則只在C線位置出現(xiàn)熒光條帶，檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果T線和C線都不出熒光現(xiàn)條帶則說(shuō)明檢測(cè)無(wú)效。(如圖1，圖2所示)

(2)定量檢測(cè)：定量檢測(cè)時(shí)，配置一系列濃度梯度的CA 15-3標(biāo)準(zhǔn)液，如：15U/mL，50U/mL，100U/mL，250U/mL，500U/mL，取50uL滴加到免疫層析試紙條上，10～30min后用檢測(cè)儀讀取T線和C線的熒光強(qiáng)度，分別將T/C的熒光強(qiáng)度及對(duì)應(yīng)的抗原濃度做擬合曲線，得到熒光強(qiáng)度與濃度對(duì)應(yīng)的公式。

所述的制備方法，其特征在于所述量子點(diǎn)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1：4000～10000。

所述的制備方法，其特征在于所述原料摩爾比量子點(diǎn)：CA 15-3單克隆抗體Ab1＝1：10～100。

所述的制備方法，其特征在于處理液配方中親水聚合物為PEG-4000，PVP-10000，PVP-40000的一種。

所述的制備方法，其特征在于處理液配方中表面活性劑為T(mén)ritonX-100，Tween-20的一種。

所述的制備方法，其特征在于處理液配方中BSA濃度為1％～4％，親水聚合物濃度為0.5％～5％，表面活性劑濃度為0.1％～2％，蔗糖濃度為1％～10％。

實(shí)施案例1：

1.量子點(diǎn)偶聯(lián)CA 15-3抗體(QDs@Ab1)

(1)將水溶性量子點(diǎn)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)水溶液按照原料質(zhì)量比為1:4000比例混合于磷酸緩沖液(PBS緩沖液)中，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基30min，離心得到活化的量子點(diǎn)。

(2)將活化的量子點(diǎn)、CA 15-3抗體Ab1按照摩爾比為1:20比例混合于PBS緩沖液中，將混合溶液置于旋轉(zhuǎn)混合架上，室溫下反應(yīng)2小時(shí)；

(3)反應(yīng)結(jié)束后，采用離心分離進(jìn)行純化，用PBS緩沖液清洗三次以除去游離的抗體和EDC，得到熒光探針QDs@Ab1，最后將產(chǎn)物分散在含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液中，4℃靜置過(guò)夜。

2.抗體的固定

將CA 15-3另一位點(diǎn)的抗體(Ab1’)以及羊抗鼠IgG(二抗，Ab2)用PBS緩沖液稀釋到1mg/mL，用點(diǎn)樣儀噴于硝酸纖維素膜上以形成T線和C線，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥2小時(shí)。

3.樣品墊、結(jié)合物釋放墊的預(yù)處理以及熒光探針的固化

(1)將樣品墊浸入含0.1％Tween-20的Tris-HCl緩沖液中靜置5min，然后放入37℃恒溫干燥箱中干燥2小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)結(jié)合墊浸入含1％的BSA、0.5％的PEG-4000、0.1％的TritonX-100、1％的蔗糖的PBS緩沖液中，靜置5min，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥2小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)將所得熒光探針QDs@Ab1用含1％的BSA、0.5％的PEG-4000、0.1％的TritonX-100、1％的蔗糖的PBS緩沖液稀釋5倍，均勻涂覆在上述已處理的結(jié)合物釋放墊上，靜置5min后于37℃恒溫干燥箱中干燥2小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.試紙條的組裝

(1)將所得樣品墊，結(jié)合物釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序固定于單面塑膠板上，各個(gè)墊和膜之間相互重疊1mm，完成試紙條的組裝。

(2)用自動(dòng)切膜機(jī)將組裝好的試紙條進(jìn)行切割，寬度約為3mm，并將其裝入塑料板中，最后將其與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封儲(chǔ)存。

5.樣品的測(cè)試和結(jié)果判讀

(1)定性和半定量檢測(cè)：用于激發(fā)量子點(diǎn)的紫外燈波長(zhǎng)范圍為320nm～420nm的普通紫外燈即可；根據(jù)夾心免疫的原理，當(dāng)待測(cè)樣本中含有CA 15-3時(shí)，復(fù)合物將同時(shí)被T線和C線捕獲，T線生成復(fù)合物QDs@Ab1-CA 15-3-Ab1’，C線生成復(fù)合物QDs@Ab1-Ab2。紫外燈照射下出現(xiàn)兩條熒光條帶，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；反之，檢測(cè)樣本中不含CA 15-3時(shí)，則只在C線位置 出現(xiàn)熒光條帶，檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果T線和C線都不出熒光現(xiàn)條帶則說(shuō)明檢測(cè)無(wú)效。條帶顏色越深說(shuō)明待測(cè)樣本中含有的CA 15-3含量越高。

(2)定量檢測(cè)：配置一系列濃度梯度的CA 15-3標(biāo)準(zhǔn)液，如：15U/mL，50U/mL，100U/mL，250U/mL，500U/mL，取50uL滴加到免疫層析試紙條上，10min后用檢測(cè)儀讀取T線和C線的熒光強(qiáng)度，分別將T/C的熒光強(qiáng)度及對(duì)應(yīng)的抗原濃度做擬合曲線，得到熒光強(qiáng)度與濃度對(duì)應(yīng)的公式。擬合曲線見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖3。

實(shí)施案例2：

1.量子點(diǎn)偶聯(lián)CA 15-3抗體(QDs@Ab1)

(1)將水溶性量子點(diǎn)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)水溶液按照原料質(zhì)量比為1:6000比例混合于磷酸緩沖液(PBS緩沖液)中，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基30min，離心得到活化的量子點(diǎn)。

(2)將活化的量子點(diǎn)、CA 15-3抗體Ab1按照摩爾比為1:60比例混合于PBS緩沖液中，將混合溶液置于旋轉(zhuǎn)混合架上，室溫下反應(yīng)2.5小時(shí)；

(3)反應(yīng)結(jié)束后，采用離心分離進(jìn)行純化，用PBS緩沖液清洗三次以除去游離的抗體和EDC，得到熒光探針QDs@Ab1，最后將產(chǎn)物分散在含有2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液中，4℃靜置過(guò)夜。

2.抗體的固定

將CA 15-3另一位點(diǎn)的抗體(Ab1’)以及羊抗鼠IgG(二抗，Ab2)用PBS緩沖液稀釋到2mg/mL，用點(diǎn)樣儀噴于硝酸纖維素膜上以形成T線和C線，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥3小時(shí)。

3.樣品墊、結(jié)合物釋放墊的預(yù)處理以及熒光探針的固化

(1)將樣品墊浸入含1％Tween-20的Tris-HCl緩沖液中靜置5min，然后放入37℃恒溫干燥箱中干燥2小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)結(jié)合墊浸入含2％的BSA、3％的PVP-10000、1％的Tween-20、7％的蔗糖的PBS緩沖液中，靜置5min，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥3小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)將所得熒光探針QDs@Ab1用含2％的BSA、3％的PVP-10000、1％的Tween-20、7％的蔗糖的PBS緩沖液稀釋10倍，均勻涂覆在上述已處理的結(jié)合物釋放墊上，靜置5min后于37℃恒溫干燥箱中干燥3小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.試紙條的組裝

(1)將所得樣品墊，結(jié)合物釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序固定于單面塑膠板上，各個(gè)墊和膜之間相互重疊2mm，完成試紙條的組裝。

(2)用自動(dòng)切膜機(jī)將組裝好的試紙條進(jìn)行切割，寬度約為3mm，并將其裝入塑料板中，最后將其與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封儲(chǔ)存。

5.樣品的測(cè)試和結(jié)果判讀

(1)定性和半定量檢測(cè)：用于激發(fā)量子點(diǎn)的紫外燈波長(zhǎng)范圍為320nm～420nm的普通紫外燈即可；根據(jù)夾心免疫的原理，當(dāng)待測(cè)樣本中含有CA 15-3時(shí)，復(fù)合物將同時(shí)被T線和C線捕獲，T線生成復(fù)合物QDs@Ab1-CA 15-3-Ab1’，C線生成復(fù)合物QDs@Ab1-Ab2。紫外燈照射下出現(xiàn)兩條熒光條帶，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；反之，檢測(cè)樣本中不含CA 15-3時(shí)，則只在C線位置出現(xiàn)熒光條帶，檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果T線和C線都不出熒光現(xiàn)條帶則說(shuō)明檢測(cè)無(wú)效。條帶顏色越深說(shuō)明待測(cè)樣本中含有的CA 15-3含量越高。

(2)定量檢測(cè)：配置一系列濃度梯度的CA 15-3標(biāo)準(zhǔn)液，如：15U/mL，50U/mL，100U/mL，250U/mL，500U/mL，取50uL滴加到免疫層析試紙條上，20min后用檢測(cè)儀讀取T線和C線的熒光強(qiáng)度，分別將T/C的熒光強(qiáng)度及對(duì)應(yīng)的抗原濃度做擬合曲線，得到熒光強(qiáng)度與濃度對(duì)應(yīng)的公式。擬合曲線見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖4。

實(shí)施案例3：

1.量子點(diǎn)偶聯(lián)CA 15-3抗體(QDs@Ab1)

(1)將水溶性量子點(diǎn)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)水溶液按照原料質(zhì)量比為1:10000比例混合于磷酸緩沖液(PBS緩沖液)中，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基30min，離心得到活化的量子點(diǎn)。

(2)將活化的量子點(diǎn)、CA 15-3抗體Ab1按照摩爾比為1:100比例混合于PBS緩沖液中，將混合溶液置于旋轉(zhuǎn)混合架上，室溫下反應(yīng)3小時(shí)；

(3)反應(yīng)結(jié)束后，采用離心分離進(jìn)行純化，用PBS緩沖液清洗三次以除去游離的抗體和EDC，得到熒光探針QDs@Ab1，最后將產(chǎn)物分散在含有5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液中，4℃靜置過(guò)夜。

2.抗體的固定

將CA 15-3另一位點(diǎn)的抗體(Ab1’)以及羊抗鼠IgG(二抗，Ab2)用PBS緩沖液稀釋到2mg/mL，用點(diǎn)樣儀噴于硝酸纖維素膜上以形成T線和C線，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥4小時(shí)。

3.樣品墊、結(jié)合物釋放墊的預(yù)處理以及熒光探針的固化

(1)將樣品墊浸入含2％Tween-20的Tris-HCl緩沖液中靜置10min，然后放入37℃恒溫干燥箱中干燥4小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)結(jié)合墊浸入含4％的BSA、5％的PVP-40000、2％的Tween-20、10％的蔗糖的PBS緩沖液中，靜置10min，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥4小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)將所得熒光探針QDs@Ab1用含4％的BSA、5％的PVP-40000、2％的Tween-20、10％的蔗糖的PBS緩沖液稀釋20倍，均勻涂覆在上述已處理的結(jié)合物釋放墊上，靜置10min后于37℃恒溫干燥箱中干燥4小時(shí)，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.試紙條的組裝

(1)將所得樣品墊，結(jié)合物釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序固定于單面塑膠板上，各個(gè)墊和膜之間相互重疊3mm，完成試紙條的組裝。

(2)用自動(dòng)切膜機(jī)將組裝好的試紙條進(jìn)行切割，寬度約為3mm，并將其裝入塑料板中，最后將其與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封儲(chǔ)存。

5.樣品的測(cè)試和結(jié)果判讀

(1)定性和半定量檢測(cè)：用于激發(fā)量子點(diǎn)的紫外燈波長(zhǎng)范圍為320nm～420nm的普通紫外燈即可；根據(jù)夾心免疫的原理，當(dāng)待測(cè)樣本中含有CA 15-3時(shí)，復(fù)合物將同時(shí)被T線和C線捕獲，T線生成復(fù)合物QDs@Ab1-CA 15-3-Ab1’，C線生成復(fù)合物QDs@Ab1-Ab2。紫外燈照射下出現(xiàn)兩條熒光條帶，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；反之，檢測(cè)樣本中不含CA 15-3時(shí)，則只在C線位置出現(xiàn)熒光條帶，檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果T線和C線都不出熒光現(xiàn)條帶則說(shuō)明檢測(cè)無(wú)效。條帶顏色越深說(shuō)明待測(cè)樣本中含有的CA 15-3含量越高。

(2)定量檢測(cè)：配置一系列濃度梯度的CA 15-3標(biāo)準(zhǔn)液，如：15U/mL，50U/mL，100U/mL，250U/mL，500U/mL，取50uL滴加到免疫層析試紙條上，30min后用檢測(cè)儀讀取T線和C線的熒光強(qiáng)度，分別將T/C的熒光強(qiáng)度及對(duì)應(yīng)的抗原濃度做擬合曲線，得到熒光強(qiáng)度與濃度對(duì)應(yīng)的公式。擬合曲線見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖5。