一種檢測hiv抗體的免疫層析測試條及檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測HIV病毒的免疫層析測試條及其檢測試劑盒，該免疫層析測試條及其檢測試劑盒應用熒光免疫層析技術和雙抗原夾心法檢測人血清中的HIV?1和HIV?2抗體，特異性好，操作便捷，可以在加樣后的15min內快速得到檢測結果，適于臨床和現(xiàn)場使用。
【專利說明】
一種檢測HIV抗體的免疫層析測試條及檢測試劑盒
[0001]技術領域本發(fā)明涉及疾病檢測領域，具體涉及一種檢測HIV抗體的免疫層析測試條及檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]
艾滋病，既獲得性免疫缺陷綜合癥，是由人類免疫缺陷病毒感染所引起的一種具有嚴重傳染性的免疫
缺陷性疾病。HIV在病毒分類中屬逆轉錄病毒科慢病毒屬的人類免疫缺陷病毒組。鑒于對HIV感染還沒有安全有效的治療方法，因而對HIV感染的診斷則是艾滋病預防控制工作顯得尤其重要，診斷發(fā)現(xiàn)傳染源才能更有效地控制艾滋病傳播。
[0003]HIV抗體檢測是AIDS檢測中最常用的方法，目前根據(jù)血清學反應和病毒核酸序列測定，全球流行的HIV可分為2型:HIV-1型和HIV-2型，對應地HIV抗體產生的抗體主要有HIV-1和HIV-2兩種抗體。傳統(tǒng)HIV抗體檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)以及免疫印記實驗(WB)。臨床常用ELISA法及免疫層析/滲濾法作為初篩實驗，而免疫印記(WB)則是確認實驗的唯一方法。酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)是國際上檢測HIV抗體最早、使用最廣泛的檢測方法。但存在的缺點是操作復雜，檢測時間較長，因而在臨床或研究中尚未大規(guī)模使用。
[0004]WB是將HIV抗體蛋白用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，把分子量大小不等的蛋白帶分離開來(這些蛋白分為HIV-1和HIV-2) AIV-1的抗原為核心蛋白pl7(或？18)、？24、？55，多聚酶?31(或？32)、？51、？66，外殼蛋白8?41、8?160、8?120等;!11￥-2的抗原蛋白為8口36、8口140、8口105、口53、口68、口56、口34、口26、口16等)，然后把這些分離開的蛋白帶帶電轉移到硝酸纖維素膜上，與樣本中的抗體反應，即會出現(xiàn)相應的膜帶。WB是我國衛(wèi)生部頒布的“艾滋病檢測技術規(guī)范”中規(guī)定的唯一HIV抗體確認方法，其靈敏度和特異性都很高。不過這種方法技術要求高，影響因素多，操作復雜，價格昂貴，因此，WB僅用作權威部門作為確認實驗而在臨床上絕少使用。
[0005]為解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種檢測HIV抗體的免疫層析測試條及其檢測試劑盒，應用熒光免疫層析技術，采用雙抗原夾心法檢測人血清中的HIV-1和HI V-2抗體，同時，通過在試劑盒上設置高分子過濾膜，可以直接對全血樣品進行分離檢測，操作便捷，特異性好，可以在加樣后的15min內快速得到檢測結果。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測HIV抗體的免疫層析測試條，包括底板和依次搭接并粘貼在底板上
的樣品墊、結合墊、反應膜和吸水墊，所述反應膜上遠離結合墊的一端設置有質控線，在質控線和結合墊之間還設置有檢測線，所述的結合墊上包被有熒光膠乳標記的HIV1/2重組蛋白抗原和抗兔IgG多克隆抗體，所述的檢測線上包被有HIV1/2重組蛋白抗原，所述質控線上包被有兔IgG。
[0007]所述的底板是PVC底板，厚0.2?0.4mm，長7.0cm，寬4mm。
[0008]所述的樣品墊是玻璃纖維膜。所述樣品墊上還涂布有樣品墊處理液，所述的樣品墊處理液包括0.5質量體積％卵清蛋白，0.01質量體積°/^￥6611-20，？!1值為7.0的0.0lM PBS和0.02質量體積%疊氮鈉。
[0009]所述的結合墊是玻璃纖維膜。所述的結合墊上包被的熒光膠乳標記的HIV1/2重組蛋白抗原是gp41和
gp36，均從Meridian life science , Inc.米購，gp41 濃度為0.4?0.8mg/ml，gp36濃度為0.4?0.8mg/ml，所述的結合墊上包被的熒光膠乳標記的抗兔IgG多克隆抗體的濃度是0.2~0.4mg/ml。
[0010]所述的反應膜是硝酸纖維素膜。所述反應膜的檢測線上包被的HIV1/2重組蛋白抗原的濃度為0.5-0.75mg/ml。所述反應膜的檢測線上包被的HIV1/2重組蛋白抗原是GR-HIV109和p53 J^UMeridian life science，Inc.采購，其中GR-HIV109為P17、P24、gpl20和gp41的混合物。所述反應膜的質控線上包被的兔IgG濃度為0.5?1.0mg/ml。
[0011]所述的結合墊上包被的熒光膠乳標記的HIV1/2重組蛋白抗原和抗兔IgG多克隆抗體通過以下方法制備得到:
(1)標記洗滌液的制備:將20gBSA加入100mlpH值為7.0的0.0lMPBS溶液混合均勻；
(2)膠乳交聯(lián)劑的制備:將50mg/mlEDC(碳二亞胺)溶解在pH為7.0的0.05MPBS溶液緩沖液；
(3)熒光膠乳的活化:按每10毫升熒光膠乳加入I毫升膠乳交聯(lián)劑，室溫反應I小時后，1000rpm?15000 rpm離心 15min，用0.05M PBS反復離心3次；
(4)gp41重組蛋白抗原熒光標記結合物配制:將活化的熒光膠乳恢復原始體積，加入gp41重組蛋白抗原，使得gp41重組蛋白抗原在熒光膠乳溶液中的濃度為0.4-0.8mg/ml，旋渦混合后，室溫攪拌反應2?4h，離心30分鐘，棄上清，沉淀用標記洗滌液洗滌兩次，棄去上清。
[0012](5)gp36重組蛋白抗原熒光標記結合物配制:將活化的熒光膠乳恢復原始體積，加入gp36重組蛋白抗原，使得gp36重組蛋白抗原在焚光膠乳溶液中的濃度為0.4?0.8mg/ml，旋渦混合后，室溫攪拌反應2?4h，離心30分鐘，棄上清，沉淀用標記洗滌液洗滌兩次，棄去上清。
[0013](6)抗兔IgG多克隆抗體熒光標記結合物配制:將活化的熒光膠乳恢復原始體積，加入抗兔IgG多克隆抗體，使得抗兔IgG多克隆抗體在熒光膠乳溶液中的濃度為0.2-0.4mg/ml，旋渦混合后，室溫攪拌反應2?4h，離心30分鐘，棄上清，沉淀用標記洗滌液洗滌兩次，棄去上清O
[0014]所述反應膜上的檢測線和質控線通過以下方法制備得到:
將0.49g Na2CO3.10H20、2.94g NaHC03、8.5g NaCl，加入純化水至100ml制得緩沖液，分別加入一定量的GR-HIV109與p53，使緩沖液中GR-HIV109與p53的濃度均為0.5-0.75mg/ml，將所得溶液通過噴膜機噴到檢測線上。
[0015]將0.49g Na2CO3 ,1H2O ^ 2.94g NaHCO3,8.5g NaCl，加入純化水至 100ml 制得緩沖液，加入一定量的兔IgG，使得緩沖液中兔IgG濃度為0.5-1.0mg/ml，將所得溶液通過噴膜機噴到質控線上。
[0016]本發(fā)明的另一個目的是提供一種包含了上述檢測HIV抗體的免疫層析測試條的檢測試劑盒，其包括底座和上蓋，所述底座上設置有定位槽，所述的免疫層析測試條置于定位槽內，所述上蓋在對應于所述免疫層析測試條樣品墊的位置設置有一個加樣口，用于滴加全血樣品，所述的加樣口上設置有一個可濾除全血樣品中的紅細胞的高分子過濾膜，優(yōu)選聚四氟乙烯多孔膜。所述上蓋在對應于所述的檢測線和質控線的位置設置有一個長方形的觀測窗口，如果全血樣品中含帶有HIV抗體，在加樣后15min左右，透過觀測窗口可看到在檢測線上顯示一條紅色條帶，同時質控線上也顯示一條紅色條帶，如果質控線上未顯示紅色條帶，說明樣品在硝酸纖維素反應膜上未能順利層析，則拋棄檢測結果。
[0017]全血樣品在硝酸纖維素反應膜上層析的過程中，血液中的各組分擴散速度不一，當血清中的HIV抗體到達檢測線，并使檢測線顯紅色時，血漿中的血紅蛋白還沒有到達檢測線，但加樣后超過30分鐘，本身帶紅色的血紅蛋白也到達檢測線，對非專業(yè)人士來說，將會對結果判定帶來混淆，因而通過在加樣口上設置一個高分子過濾膜，可以有效濾除紅細胞，提高檢測結果的準確性。所述的高分子過濾膜優(yōu)選聚四氟乙烯多孔膜，所述的聚四氟乙烯多孔膜可以通過W095/02447或US8153041所記載的方法制備得到。
[0018]所述的加樣口的一端，還包括一個可覆蓋加樣口的可插拔的蓋子，檢測前拔除蓋子在加樣口加入全血樣品，加樣完成后可以插上蓋子，以免樣品暴露，降低操作人員的感染風險。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明的檢測HIV抗體的免疫層析測試條的結構示意圖。
[0020]圖2為本發(fā)明的檢測HIV抗體的檢測試劑盒的結構示意圖。
[0021 ]附圖標記說明:1.樣品塾;2.結合塾;3.、檢測線;4.反應I旲；5.質控線;6.吸水塾；
7.底板;8、底座;9、上蓋;10、加樣口； 11、過濾膜;12、觀測窗口； 13、可插拔的蓋子。
[0022]實施例1
一種檢測HIV抗體的免疫層析測試條，由玻璃纖維樣品墊I，玻璃纖維結合墊2，硝酸纖維素反應膜4和吸水紙6依次搭接并粘貼固定在PVC底板7上組成，所述PVC底板7裁切平整，厚0.2 1111]1，長7.0 cm，寬4mm，在所述硝酸纖維素反應膜4上臨接結合墊2的一端的距離1.75cm處設置有檢測線3，并在距離檢測線3的0.65cm處設置有質控線5，所述結合墊2上涂覆有焚光膠乳標記的gp41和gp36重組蛋白抗原，濃度均為0.4mg/ml，所述結合墊還涂覆有熒光膠乳標記的抗兔IgG，濃度為0.2mg/ml，所述檢測線3包被有GR-HIV109與p53，濃度均為
0.5 mg/ml，所述質控線5包被有抗兔IgG多克隆抗體，濃度0.5mg/ml。
[0023]實施例2
一種檢測HIV抗體的免疫層析測試條，由玻璃纖維樣品墊I，玻璃纖維結合墊2，硝酸纖維素反應膜4和吸水紙6依次搭接并粘貼固定在PVC底板7上組成，所述PVC底板7裁切平整，厚0.2 1111]1，長7.0 cm，寬4mm，在所述硝酸纖維素反應膜4上臨接結合墊2的一端的距離1.75cm處設置有檢測線3，并在距離檢測線3的0.65cm處設置有質控線5，所述結合墊2上涂覆有焚光膠乳標記的gp41和gp36重組蛋白抗原，濃度均為0.8mg/ml，所述結合墊還涂覆有熒光膠乳標記的抗兔IgG，濃度為0.4mg/ml，所述檢測線3包被有GR-HIV109與p53，濃度均為
0.75 mg/ml，所述質控線5包被有抗兔IgG多克隆抗體，濃度1.0mg/ml。
[0024] 實施例3
一種包含了實施例1或實施例2的檢測HIV抗體的免疫層析測試條的檢測試劑盒，其包括底座8和上蓋9，所述底座(8)上設置有定位槽，所述的免疫層析測試條置于定位槽內，所述上蓋9在對應于所述免疫層析測試條樣品墊I的位置設置有一個加樣口 10，所述的加樣口10上設置有一個聚四氟乙烯多孔膜11，所述上蓋9在對應于所述的檢測線3和質控線5的位置設置有一個長方形的觀測窗口 12，所述的加樣口 10的一端，還包括一個可插拔的蓋子13。
【主權項】
1.一種檢測HIV抗體的免疫層析測試條，包括底板(7)和依次搭接并粘貼在底板(7)上的樣品墊(1)、結合墊(2)、反應膜(4)和吸水墊(6)，所述反應膜(4)上遠離結合墊(2)的一端設置有質控線(5)，在質控線(5)和結合墊(2)之間還設置有檢測線(3)，所述的結合墊(2)上包被有熒光膠乳標記的HIV1/2重組蛋白抗原和抗兔IgG多克隆抗體，所述的檢測線(3)上包被有HIV1/2重組蛋白抗原，所述質控線(5)上包被有兔IgG。2.如權利要求1所述的一種檢測HIV病毒的免疫層析測試條，其特征在于，所述的結合墊(2)上包被的熒光膠乳標記的HIV1/2重組蛋白抗原是gp41和gp36。3.如權利要求2所述的一種檢測HIV病毒的免疫層析測試條，其特征在于，所述的gp41濃度為0.4?0.8mg/ml，所述的gp36濃度為0.4?0.8mg/ml。4.如權利要求1所述的一種檢測HIV病毒的免疫層析測試條，其特征在于，所述的結合墊(2)上包被的熒光膠乳標記的抗兔IgG多克隆抗體的濃度是0.2-0.4mg/ml。5.如權利要求1所述的一種檢測HIV病毒的免疫層析測試條，其特征在于，所述的檢測線(3)上包被的HIV1/2重組蛋白抗原的濃度為0.5-0.75mg/ml。6.如權利要求1所述的一種檢測HIV病毒的免疫層析測試條，其特征在于，所述的檢測線(3)上包被的HIV1/2重組蛋白抗原是P17、P24、gpl20、gp41的混合物和p53。7.如權利要求1所述的一種檢測HIV病毒的免疫層析測試條，其特征在于，所述的質控線(5)上包被的兔IgG濃度為0.5?1.0mg/ml。8.—種包含了權利要求1所述的檢測HIV抗體的免疫層析測試條的檢測試劑盒，其包括底座(8)和上蓋(9)，所述底座(8)上設置有定位槽，所述的免疫層析測試條置于定位槽內，所述上蓋(9)在對應于所述免疫層析測試條樣品墊(I)的位置設置有一個加樣口(10)，所述的加樣口(10)上設置有一個高分子過濾膜(11)，所述上蓋(9)在對應于所述的檢測線(3)和質控線(5)的位置設置有一個長方形的觀測窗口( 12)。9.如權利要求8所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的高分子過濾膜(11)為聚四氟乙烯多孔膜。10.如權利要求8或權利要求9所述的檢測試劑盒，其特征在于，在所述的加樣口(10)的一端，還包括一個可插拔的蓋子(13)。
【文檔編號】G01N33/569GK105842462SQ201610311016
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】陳飛, 康可人, 王繼華
【申請人】廣州萬孚生物技術股份有限公司