一種檢測(cè)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的試劑盒及檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種基于銅離子催化性質(zhì)的檢測(cè)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican?3，GPC3)的試劑盒及檢測(cè)方法，所述試劑盒主要包括抗體功能化的氧化銅納米探針和檢測(cè)用試劑，所述抗體功能化的氧化銅納米探針由氧化銅納米顆粒表面修飾GPC3抗體并用BSA(牛血清白蛋白)封閉制得，氧化銅納米顆粒與抗體的質(zhì)量用量比為1：0.0015～0.03；所述檢測(cè)用試劑由包被液、洗滌液、封閉液、顯色液和終止液組成；本發(fā)明的有益效果主要體在：本發(fā)明是利用銅離子的催化性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)，方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、效果良好，不需要用到成本高、對(duì)環(huán)境條件敏感的生物酶。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種檢測(cè)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的試劑盒及檢測(cè)方法
(一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種基于銅離子催化性質(zhì)的檢測(cè)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)的試劑盒及檢測(cè)方法。
(二)
【背景技術(shù)】
[0002]生物酶是一種高效的生物催化劑，由于其高底物特異性和高催化活性，生物酶已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、化學(xué)工業(yè)、環(huán)境科學(xué)以及其他領(lǐng)域。過(guò)氧化物酶是生物酶其中的一類(lèi)，能夠活化過(guò)氧化氫(H2O2)發(fā)生許多化學(xué)反應(yīng)并應(yīng)用于分析診斷等領(lǐng)域，例如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)。然而這些生物酶穩(wěn)定性較差，容易受到pH和溫度等環(huán)境條件的影響，從而引發(fā)酶的變性或失活。而且生物酶還具有制備麻煩、提純和儲(chǔ)存成本高等問(wèn)題。近年來(lái)有許多研究工作致力于構(gòu)建過(guò)氧化物模擬酶，包括氯化血紅素、撲啉、納米材料模擬酶等。與生物酶相比，這些過(guò)氧化物模擬酶具有合成簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、價(jià)格便宜、容易儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)。GPC3是一種存在于細(xì)胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白，在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中特異性高表達(dá)，而在肝硬化、肝炎組織、癌旁組織、正常肝組織中低表達(dá)或不表達(dá)。GPC3被認(rèn)為是肝細(xì)胞癌新的癌癥標(biāo)志物。實(shí)現(xiàn)對(duì)GPC3的特異性、高靈敏檢測(cè)具有重要的意義。
(三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的是提供一種可實(shí)現(xiàn)對(duì)特異性蛋白的高靈敏檢測(cè)的檢測(cè)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的試劑盒及檢測(cè)方法。
[0004]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0005]—種檢測(cè)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的試劑盒，主要包括抗體功能化的氧化銅納米探針和檢測(cè)用試劑；
[0006]所述抗體功能化的氧化銅納米探針由氧化銅納米顆粒表面修飾GPC3抗體并用BSA(牛血清白蛋白)封閉制得，氧化銅納米顆粒與抗體的質(zhì)量用量比為1:0.0015?0.03;
[0007]所述檢測(cè)用試劑由包被液、洗滌液、封閉液、顯色液和終止液組成，所述包被液為的pH7.4,6.7mM磷酸緩沖液;所述洗滌液組成如下:135mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，0.05 %吐溫-20，溶劑為pH7.4、50mM磷酸緩沖液;所述封閉液為I %BSA溶液;所述顯色液組成如下:1.33mM ΤΜΒ,1.33M過(guò)氧化氫，溶劑為0.2M、pH4.0的醋酸緩沖液;所述終止液為2M硫酸溶液。
[0008]本發(fā)明中，銅離子也具有類(lèi)似過(guò)氧化物酶的催化活性，而且其催化活性不受底物濃度的影響，可通過(guò)提高H2O2的濃度來(lái)提高銅離子的催化效率。由于氧化銅納米顆粒溶解可產(chǎn)生銅離子，所以利用抗體功能化的氧化銅納米顆?？蓪?shí)現(xiàn)對(duì)特異性蛋白的高靈敏檢測(cè)。這種基于銅離子催化的方法與基于生物酶的方法相比，更簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效。
[0009]具體的，所述抗體功能化的氧化銅納米探針由如下方法制備得到:納米氧化銅顆粒加入濃度10mM、pH7.4的磷酸緩沖液中超聲分散均勻，再緩慢加入濃度為150ug/mL的GPC3抗體，震蕩反應(yīng)2?4小時(shí)，氧化銅納米顆粒與GPC3抗體的質(zhì)量比為1:0.0015?0.03，加入BSA至其終濃度為I %，封閉I?2h，保存于40C冰箱備用。
[0010]本發(fā)明還涉及一種利用所述試劑盒檢測(cè)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的方法，所述方法如下:
[0011](I)包被:將待測(cè)蛋白樣品用包被稀釋液稀釋?zhuān)謩e取50yL加入96孔板中，37°C靜置2h，棄去孔中液體，用洗滌液洗3遍；
[0012](2)封閉:將200yL封閉液加至各反應(yīng)孔并置于37 °C 2h，封閉結(jié)束后用洗滌液洗3遍；
[0013](3)孵育納米生物探針:各反應(yīng)孔加入50yL抗體功能化的氧化銅納米顆粒稀釋液，37 °C靜置Ih后，棄去孔中液體，用洗滌液洗5遍；
[0014](4)氧化銅溶解:各反應(yīng)孔加入50yL 50mM鹽酸，37°C反應(yīng)半小時(shí)；
[0015](5)顯色反應(yīng):各反應(yīng)孔加入顯色緩沖液150yL，37°C反應(yīng)lOmin，然后加50yL終止液終止反應(yīng)；
[0016](6)檢測(cè):測(cè)量各孔溶液在450nm波長(zhǎng)處的吸收值或者測(cè)量其在350?600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光光譜；
[0017](7)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取梯度濃度的GPC3標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照前述步驟(I)?(6)方法進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0018](8)結(jié)果判定:根據(jù)待測(cè)蛋白樣品的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測(cè)蛋白樣品的濃度數(shù)據(jù)。
[0019]本發(fā)明方法是利用抗體功能化的氧化銅納米探針來(lái)識(shí)別目標(biāo)蛋白，然后利用鹽酸溶解氧化銅納米探針并產(chǎn)生銅離子，通過(guò)銅離子的催化顯色反應(yīng)來(lái)間接檢測(cè)目標(biāo)蛋白。
[0020]本發(fā)明的有益效果主要體在:本發(fā)明是利用銅離子的催化性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)，方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、效果良好，不需要用到成本高、對(duì)環(huán)境條件敏感的生物酶。
(四)
【附圖說(shuō)明】
[0021 ]圖1為銅離子催化活性驗(yàn)證圖，a*TMB溶液，b為T(mén)MB加H2O2的溶液，c為T(mén)MB加銅離子的溶液，d為T(mén)MB加H2O2與銅離子的溶液；圖2為不同濃度銅離子催化TMB與H2O2反應(yīng)后用!^04終止后的溶液吸收光譜圖；
[0022]圖3為銅離子的催化性質(zhì)用于GPC3檢測(cè)的原理示意圖；
[0023]圖4為抗體功能化氧化銅納米探針用于GPC3檢測(cè)的可行性考察；圖中，a為CuONPs-BSA，b為CuO NPs_BSA+GPC3，c為CuO NPs-Ab，d為CuO NPs_Ab+GPC3;
[0024]圖5為分別對(duì)6?03、85六、肥4』六以及冊(cè)進(jìn)行檢測(cè)并考察對(duì)應(yīng)的信號(hào)增強(qiáng)情況；
[0025]圖6為檢測(cè)不同濃度GPC3時(shí)，溶液在350?600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜圖；
[0026]圖7為檢測(cè)不同濃度GPC3時(shí)，溶液在450nm波長(zhǎng)處的吸收變化情況以及標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(五)
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0028]實(shí)施例1:銅離子的催化性質(zhì)及其應(yīng)用
[0029]抗體功能化氧化銅納米探針的制備:
[°03°] 111^氧化銅(粒徑小于5011111)加入11]11^磷酸緩沖液(101111、卩!17.4)超聲分散均勾。緩慢加入50yL 150yg/mL的GPC3抗體(1G12，Santa Cruz B1technology，Inc.)，震蕩反應(yīng)3小時(shí)。加入BSA至其終濃度為I %，封閉Ih，得到抗體功能化的氧化銅納米探針(CuO NPs-Ab)。
[0031]同時(shí)按照上述方法，省去抗體修飾的步驟得到僅封閉BSA的氧化銅納米探針(CuONPs-BSA)作為參照。
[0032]銅離子的催化性質(zhì):
[0033]圖1為銅離子催化活性驗(yàn)證圖，a*TMB溶液，b為T(mén)MB加H2O2的溶液，c為T(mén)MB加銅離子的溶液，d為T(mén)MB加H2O2與銅離子的溶液。由圖可見(jiàn)，TMB與H2O2的反應(yīng)速率很低，只有加入類(lèi)似催化劑的銅離子時(shí)，反應(yīng)速率才得到很大提高，所以銅離子具有類(lèi)似過(guò)氧化物酶的催化活性。從圖2結(jié)果可以看出，隨著銅離子濃度的增大，TMB與H2O2的反應(yīng)速率也會(huì)隨著增大，從而溶液的吸收和顏色變化越明顯。
[0034]蛋白檢測(cè)原理驗(yàn)證:
[0035]圖3為銅離子的催化性質(zhì)用于GPC3檢測(cè)的原理示意圖。利用抗體功能化的氧化銅納米探針來(lái)識(shí)別目標(biāo)蛋白，然后通過(guò)鹽酸溶解氧化銅產(chǎn)生銅離子，通過(guò)銅離子的催化顯色反應(yīng)來(lái)間接檢測(cè)目標(biāo)蛋白。由于一個(gè)氧化銅納米探針能夠產(chǎn)生許多的銅離子，從而達(dá)到了信號(hào)放大的效果。
[0036]分別用CuO NPs-Ab與CuO NPs-BSA作為納米生物探針來(lái)進(jìn)行GPC3的檢測(cè)(5ng/mL)，對(duì)方法的可行性進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，目標(biāo)蛋白是通過(guò)抗體進(jìn)行識(shí)別，也只有目標(biāo)蛋白存在時(shí)，檢測(cè)信號(hào)才會(huì)顯著增大。
[0037]特異性實(shí)驗(yàn):
[0038]分別用BSA(牛血清白蛋白)、HSA(人血清白蛋白)、EA(卵白蛋白)與Hb(血紅蛋白)代替GPC3進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)量對(duì)應(yīng)的信號(hào)增強(qiáng)情況，結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，由于GPC3抗體對(duì)其對(duì)應(yīng)的目標(biāo)蛋白的特異性識(shí)別，該方法對(duì)GPC3的檢測(cè)具有較好的特異性。
[0039]實(shí)施例2:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的檢測(cè)
[0040](I)溶液配制
[0041 ] 蛋白包被稀釋液:6.7mM的磷酸緩沖液(pH7.4);
[0042] 洗滌液:50mM的磷酸緩沖液(pH7.4) + 135mM氯化鈉+2.7mM氯化鉀+0.05% (w/w)吐溫-20;
[0043 ]封閉液:I % (w/w) BSA溶液；
[0044]顯色液:0.2M的醋酸緩沖液(pH4.0)+1.33mM TMB+1.33M H2O2;
[0045 ] 終止液:2M硫酸溶液。
[0046](2)檢測(cè)方法
[0047]包被:將50yg待測(cè)蛋白樣品用200yL包被稀釋液溶解稀釋?zhuān)謩e取50yL加入96孔板中并置于37 °C下2h，棄去孔中液體，用洗滌液洗3遍；
[0048]封閉:將200yL封閉液加至各反應(yīng)孔并置于37 °C2h，封閉結(jié)束后用洗滌液洗3遍；
[0049]孵育納米生物探針:將制備好的抗體功能化的氧化銅納米顆粒溶液稀釋后每孔加50yL，置于37 °C Ih;棄去孔中液體，用洗滌液洗5遍；
[0050]氧化銅溶解:各反應(yīng)孔加入50yL 50mM鹽酸反應(yīng)半小時(shí)，使氧化銅溶解成銅離子；[0051 ] 顯色反應(yīng):各反應(yīng)孔加入顯色緩沖液150yL，37°C反應(yīng)lOmin，然后加50yL終止液終止反應(yīng)；
[0052]檢測(cè):測(cè)量各孔溶液在450nm波長(zhǎng)處的吸收值或者測(cè)量其在350?600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光光譜；
[0053]標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取梯度濃度的GPC3標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照前述步驟進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0054]結(jié)果判定:根據(jù)待測(cè)蛋白樣品的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測(cè)蛋白樣品的濃度數(shù)據(jù)。
[0055]檢測(cè)不同濃度目標(biāo)蛋白(GPC3)時(shí)，溶液在350?600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜圖參見(jiàn)圖6，溶液在450nm波長(zhǎng)處的吸收變化情況以及標(biāo)準(zhǔn)曲線參見(jiàn)圖7，結(jié)果顯示可檢出0.2pg/mL的GPC3。
[0056]結(jié)論:
[0057]基于生物酶檢測(cè)方法的缺點(diǎn):生物酶穩(wěn)定性較差，容易受到pH和溫度等環(huán)境條件的影響，從而引發(fā)酶的變性或失活。而且生物酶還具有制備麻煩、提純和儲(chǔ)存成本高等問(wèn)題。
[0058]本發(fā)明方法優(yōu)點(diǎn):(I)基于銅離子的類(lèi)似于過(guò)氧化物酶的催化性質(zhì)，其催化活性不受底物濃度的影響，可通過(guò)提高H2O2的濃度來(lái)提高銅離子的催化效率，從而提高檢測(cè)靈敏度。(2)利用抗體功能化的氧化銅納米探針來(lái)識(shí)別目標(biāo)蛋白，然后通過(guò)鹽酸溶解氧化銅產(chǎn)生銅離子，通過(guò)銅離子的催化顯色反應(yīng)來(lái)間接檢測(cè)目標(biāo)蛋白。由于一個(gè)氧化銅納米探針能夠產(chǎn)生許多的銅離子，從而達(dá)到了信號(hào)放大的效果。與基于生物酶的檢測(cè)方法相比，該檢測(cè)方法更簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測(cè)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的試劑盒，主要包括抗體功能化的氧化銅納米探針和檢測(cè)用試劑； 所述抗體功能化的氧化銅納米探針由氧化銅納米顆粒表面修飾GPC3抗體并用BSA封閉制得，氧化銅納米顆粒與抗體的質(zhì)量用量比為1:0.0015?0.03; 所述檢測(cè)用試劑由包被液、洗滌液、封閉液、顯色液和終止液組成，所述包被液為的pH7.4、6.7mM磷酸緩沖液;所述洗滌液組成如下:135mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，0.05%吐溫-20，溶劑為pH7.4、50mM磷酸緩沖液；所述封閉液為I % BSA溶液；所述顯色液組成如下:1.33mMTMB，1.33M過(guò)氧化氫，溶劑為0.2M、pH4.0的醋酸緩沖液;所述終止液為2M硫酸溶液。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述抗體功能化的氧化銅納米探針由如下方法制備得到:納米氧化銅顆粒加入濃度10mM、pH7.4的磷酸緩沖液中超聲分散均勻，再緩慢加入濃度為150ug/mL的GPC3抗體，震蕩反應(yīng)2?4小時(shí)，氧化銅納米顆粒與GPC3抗體的質(zhì)量比為1: 0.0015?0.03，加入BSA至其終濃度為I %，封閉I?2h，保存于4°C冰箱備用。3.—種利用權(quán)利要求1所述試劑盒檢測(cè)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的方法，所述方法如下: (1)包被:將待測(cè)蛋白樣品用包被稀釋液稀釋?zhuān)謩e取50yL加入96孔板中，37°C靜置2h，棄去孔中液體，用洗滌液洗3遍； (2)封閉:將200yL封閉液加至各反應(yīng)孔并置于37°C2h，封閉結(jié)束后用洗滌液洗3遍； (3)孵育納米生物探針:各反應(yīng)孔加入50yL抗體功能化的氧化銅納米顆粒稀釋液，37°C靜置Ih后，棄去孔中液體，用洗滌液洗5遍； (4)氧化銅溶解:各反應(yīng)孔加入50yL50mM鹽酸，37°C反應(yīng)半小時(shí)； (5)顯色反應(yīng):各反應(yīng)孔加入顯色緩沖液150yL，37°C反應(yīng)1min，然后加50yL終止液終止反應(yīng)； (6)檢測(cè):測(cè)量各孔溶液在450nm波長(zhǎng)處的吸收值或者測(cè)量其在350?600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光光譜； (7)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取梯度濃度的GPC3標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照前述步驟(I)?(6)方法進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (8)結(jié)果判定:根據(jù)待測(cè)蛋白樣品的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測(cè)蛋白樣品的濃度數(shù)據(jù)。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105842457SQ201610168697
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月23日
【發(fā)明人】劉景豐, 劉小龍, 鄭愛(ài)仙, 黃愛(ài)民, 曾永毅
【申請(qǐng)人】福州市傳染病醫(yī)院