抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3全人源抗體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及了一株高親和性結(jié)合磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3(glypican-3，GPC3)的全人源抗體的篩選、制備方法及其潛在的用于肝癌和黑色素瘤治療 中的應用。
【背景技術】
[0002] 肝癌是危害很廣泛的一種惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)肝癌位居全部惡性腫瘤發(fā)病男 性第5位、女性第7位，為惡性腫瘤死亡男性第2位，女性第6位。在發(fā)展中國家，其居男性 惡性腫瘤發(fā)病第3位，女性第6位，居男性惡性腫瘤死亡第2位，居女性第5位。我國的乙型 肝炎病人位居世界第一，這也直接導致我國肝癌病人高居全球榜首。調(diào)查顯示，1973-1975 年、1990-1992年及2004-2005年我國肝癌死亡分別位居全部惡性腫瘤死因順位的第3、2、 和2位（張思維等：中國肝癌發(fā)病的趨勢分析和預測.《中華預防醫(yī)學雜志》，2012,46(7): 588-592)。未來很長一段時間肝癌仍將是危害國內(nèi)各大群眾主要惡性腫瘤。阿霉素是傳統(tǒng) 的用于肝癌治療的藥物，但緩解率僅為10-15%且不能延長患者的生存時間。近年來，隨著 分子生物學、基因組學及蛋白質(zhì)組學的進展，陸續(xù)問世了一系列的分子靶向藥物可以用于 肝癌的救治。分子靶向治療是以腫瘤細胞過度表達的某些標志性分子為靶點，選擇針對性 的阻斷劑，可有效地干預該標志性分子調(diào)控和密切相關的信號傳導通路，從而達到抑制腫 瘤生長、進展及轉(zhuǎn)移的效果。相對于手術、放療、化療三大傳統(tǒng)治療手段，其具有較好的分子 選擇性，能高效并選擇性地殺傷腫瘤細胞，減少對正常組織的損傷。分子靶向藥物的選擇性 高，廣譜有效，不易發(fā)生耐藥，同時安全性優(yōu)于細胞毒性化療藥物，是目前腫瘤治療領域發(fā) 展的新方向。目前，針對肝癌靶向治療的主要研究有：以表皮生長因子受體（EGFR)為靶點 的肝癌治療研究，目前主要包括大分子的單克隆抗體（如西妥昔單抗、尼妥珠單抗）和小分 子的化合物如吉非替尼、厄羅替尼等藥物；以抗血管生成為靶點的肝癌治療研究，VEGF單 克隆抗體Becacizumab ;多激酶抑制劑索拉非尼對原發(fā)性肝癌的治療研究；以肝細胞生長 因子及其受體為靶點的肝癌治療研究等。
[0003] 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican_3, GPC3)是一種膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白。 glypican-3蛋白通過硫酸乙酰肝素葡萄糖胺聚糖鏈連接于核心蛋白，核心蛋白羧基末端 通過GPI錨定于細胞膜表面。glypican-3與肝癌、黑素瘤及卵巢透明細胞癌的發(fā)生和發(fā) 展密切相關。GPC3表達具有較高的特異性，在肝癌中高表達，在黑素瘤、卵巢透明細胞癌、 卵黃囊瘤、成神經(jīng)細胞瘤、肝母細胞瘤和Wilm肉瘤細胞等腫瘤中少量表達，而在乳腺癌、 間皮瘤、卵巢上皮癌和肺癌中則不表達表達，在正常人組織中幾乎不表達，因此其有望成 為肝癌免疫治療的理想靶點之一（阮健等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在惡性腫瘤中的表達 及其臨床應用?腫瘤，2011，31(9) :863-866)。目前，共有4個glypican-3抗體進入不 同的研究階段。GC33(Ishiguro T，et al.Anti-glypican 3 antibody as a potential antitumor agent for human liver cancer. Cancer Res. 2008 ；68 (23) ：9832-9838. Nakano K，et al. Generation of a humanized anti-glypican 3 antibody by CDR grafting and stability optimization. Anticancer Drugs. 2010 ；21 (10) :907_916)為 第一個進入臨床研究的人源化抗體。GC33為對鼠源性母本抗體進行人源化改造后得到 的抗體，GC33識別glypican-3的羧基端（542-563)的多肽表位，主要通過抗體依賴的細 胞毒作用（ADCC)以及募集腫瘤腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL)發(fā)揮抗腫瘤作用。目前完成與 索拉非尼（sorafenib)聯(lián)合用藥的I期臨床研究（NCT00976170)，II期臨床研究患者正 在招募中（NCT01507168)。YP7為高親和力人源化抗體（Phung Y，Gao W，Man YG，Nagata S，Ho M. High-affinity monoclonal antibodies to cell surface tumor antigen glypican-3 generated through a combination of peptide immunization and flow cytometry screening. MAbs. 2012Sep_0ct ;4 (5) :592_9)，YP7 與 glypican-3 的親和力的 KD為0.3nM，識別glypican-3的羧基端（510-560)的多肽表位。具有較強的腫瘤抑制活 性。HN3 為人源單域抗體（Feng M，et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A.2013;110(12) :E1083-1091.)。該抗體可直接抑制 HCC 細胞的增殖。 該抗體是通過菌體抗體庫技術篩選得到。HN3高親和性結(jié)合glypican-3的核心蛋白部 位。在體內(nèi)、體外均對glypican-3陽性肝癌細胞有很好的抑制作用。HN3的獨特性在于它 可直接抑制腫瘤細胞的增殖，參與YAP信號通路，使細胞周期阻滯。MDX-1414為全人源抗體 (Feng M, Ho M. Glypican-3 antibodies ：a new therapeutic target for liver cancer. FEBS Lett.2014 Jan 21 ;588(2) :377-82.)。MDX-1414 由 Medarex 公司從多株全人源抗體 中篩選得到，具有親和力高，特異性強，有內(nèi)在化特性，體內(nèi)外研究顯示有較好的抑制腫瘤 細胞生長的作用，且無明顯的毒副作用。目前還處于臨床前研究階段。
[0004] 檢索國內(nèi)專利數(shù)據(jù)庫與磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican_3)治療抗體相關專利 共12件，為中外制藥株式會社（【申請?zhí)枴?38210576、2012101528190、2012101548137授權(quán) 公告號：CN102046200B、授權(quán)公告號：CN102850455B、授權(quán)公告號：CN101287492B、授權(quán)公告 號：CN101809162B、授權(quán)公告號：CN101186650B、授權(quán)公告號：CN101014367B、授權(quán)公告號： CN1842540B、授權(quán)公告號：CN1314803C)，其中授權(quán)公告號：CN102850455B與贊科股份有限 公司共有；米德列斯公司（授權(quán)公告號：CN101815726B)等3家國外公司所有，尚未見國內(nèi) 由關單位和個人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的專利申報。在glypican-3抗體研究方面 有王玉亮等所做的一個glypican-3鼠源性單克隆的報道（王玉亮，劉濤，穆紅.癌胚抗原 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3單克隆抗體的制備及應用。天津醫(yī)藥，2014,42(3) :235-238.)。本 發(fā)明所公布的是一株高親和性結(jié)合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3, GPC3)的全人源抗 體的篩選、制備方法及其潛在的用于肝癌和黑色素瘤治療中的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明首先人工合成了一段位于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (glypican-3) C末端40個 氨基酸的（524A-563K)多肽。利用該多肽經(jīng)多輪篩選，從已構(gòu)建的人源大容量Fab噬菌體 抗體庫中篩選到的與該多肽結(jié)合的Fab抗體。經(jīng)ELISA和分子相互作用儀Biacore 3000 檢測，在大腸桿菌表達的Fab抗體與該glypican-3多肽有較好的結(jié)合活性，Biacore 3000 檢測二者親和常數(shù)為6. 54X 10 SM。在此基礎上，利用分子生物學的方法構(gòu)建完整的抗體， 并在真核細胞中實現(xiàn)表達，所表達的抗體經(jīng)純化后證實與肝癌細胞株膜表面的磷脂酰肌醇 蛋白聚糖3具有很好的結(jié)合活性。構(gòu)建的全抗體為一種全人源抗體，用于人體治療具有免 疫原性低、毒副作用小的特性，具有用于肝癌和黑色素瘤治療的潛在價值。
[0006] 本發(fā)明的技術方案如下：
[0007] 本發(fā)明提供了一種可與磷脂酰肌醇蛋白聚糖3結(jié)合的全人源單克隆抗體，由可變 區(qū)和恒定區(qū)構(gòu)成，可變區(qū)包含CDR和框架區(qū)，所述抗體的重鏈CDR區(qū)氨基酸序列為：
[0008] CDR1 ：GESISSGYY ；
[0009] CDR2 :MWHNGTT ;
[0010] CDR3 ：ATRGMFSPLPff ；
[0011] 所述抗體的輕鏈⑶R區(qū)氨基酸序列為：
[0012] CDR1:HDIRNY;
[0013] CDR2 :AESTLQN ;
[0014] CDR3 :QQLNSYPLT〇
[0015] 本發(fā)明同時提供了所述抗體的重鏈DNA序列為：
[0016] CDR1:GGTGAATCCATCAGTAGTGGCTACTAC ;
[0017] CDR2 :ATGTGGCACAATGGGACCACC ;
[0018] CDR3 :ACTAGAGGGATGTTTAGTCCACTGCCCTGG ;
[0019] 所述抗體的輕鏈DNA序列為：
[0020] CDR1 :CACGACATTAGGAATTAT ;
[0021] CDR2 :GCTGAATCCACTTTACAGAAT ;
[0022] CDR3 :CAACAGCTTAATAGTTACCCTCTCACTTTC。
[0023] 本發(fā)明所述抗體的全抗體重鏈類別可為IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的任意一種，優(yōu)選 IgGl，所述IgGl的序列為：
[0024] QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGESISSGYYffGffIRQPPGRGLEffIGTMffHNGTTYSSPSLTGRVT ISVDRSRNRFSLKLTSVTAADTAMYYCATRGMFSPLPWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0025] 本發(fā)明所述抗體的全抗體輕鏈類別可為k和A，優(yōu)選為k，其序列為：
[0026] ELVMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASHDIRNYLGWYQQKPGKAPNPLISAESTLQNGVPSRFSGTGSGT EFTLTISSLQPEDFATYHCQQLNSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QffKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC〇
[0027] 本發(fā)明所述抗體的表達細胞可為CHO、HEK293、NS0和Per 6哺乳動物細胞的任意 一種，優(yōu)選為CH0細胞。
[0028] 本發(fā)明同時提供了所述的單克隆抗體用于制備治療具有潛在的肝癌和黑色素瘤 疾病的藥物中的用途。
【附圖說明】：
[0029] 圖1 :ELISA方法檢測glypican-3多肽與Fab抗體結(jié)合；
[0030] 圖2 :Biacore 3000檢測Fab抗體和glypican-3多肽的親和力；
[0031] 圖3 :BY20 SDS-PAGE電泳；1，BY20非還原電泳；2,蛋白分子量標準；3, BY20非還 原電泳。
[0032] 圖4 :免疫熒光檢測BY20抗體與肝癌細胞IfepG2的結(jié)合
【具體實施方式】：
[0033] 本發(fā)明參考下述實施例進行更詳細的描述。然而，本發(fā)明不局限于這些實施例。
[0034] 實施例1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican_3)C末端多肽的合成
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