本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用植物內(nèi)生真菌Cytospora rhizophorae A761制備cytosporaphenone A的方法，化合物cytosporaphenone A及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用和作為抗腫瘤藥物活性成份方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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癌癥是目前危害人類健康的主要疾病之一。國際抗癌聯(lián)盟發(fā)布的數(shù)據(jù)表明，2008年，全球有1270萬人患癌，死亡人數(shù)高達(dá)760萬。世界范圍內(nèi)因癌癥死亡的人數(shù)，比艾滋病、瘧疾和結(jié)核病加起來還要多。如果不采取有效的措施，預(yù)計到2030年，每年將出現(xiàn)2600萬新增癌癥病例，癌癥死亡人數(shù)將達(dá)1700萬。我國癌癥發(fā)生率正處于快速上升時期，每年癌癥發(fā)病人數(shù)約260萬，死亡180萬。癌癥已成為中國城市和農(nóng)村居民的第一死因，癌癥帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和對社會發(fā)展的不良影響也日益突顯。在癌癥的三大療法中，藥物治療占有主要位置。

植物內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物組織內(nèi)，但不對植物組織引起明顯病害癥狀的真菌(Tan RX and Zou WX,2001)。內(nèi)生真菌物種豐富多樣，它們處于植物內(nèi)部的特殊環(huán)境中，能夠產(chǎn)生各種結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物，其化合物的結(jié)構(gòu)類型遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其植物代謝產(chǎn)物的范圍，容易從中發(fā)現(xiàn)新穎結(jié)構(gòu)的化合物，并且具有多種生物活性，因此內(nèi)生真菌已成為發(fā)現(xiàn)新天然活性物質(zhì)的重要資源，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力(施琦淵等，2007)。

巴戟天(Morinda officinalis)為茜草科多年生攀援木質(zhì)藤本植物，是我國著名的四大南藥之一，有補(bǔ)腎壯陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用，用于陽痿遺精、宮冷不孕、月經(jīng)不調(diào)、少腹冷痛、風(fēng)濕痹痛、筋骨痿軟等癥(國家藥典委員會，2000)?，F(xiàn)代研究表明，巴戟天含有蒽醌類、環(huán)烯醚萜苷萜、有機(jī)酸類、糖類、甾醇類(林美珍等，2010)。現(xiàn)代藥理研究表明，巴戟天具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、消炎鎮(zhèn)痛等廣泛藥理作用(徐吉銀等，2006)。因此，從巴戟天內(nèi)生真菌發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤活性作用的新化合物cytosporaphenone A可為新藥研發(fā)提供化學(xué)實體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的第一個目的是提供一種具有抗腫瘤活性的化合物cytosporaphenone A。

本發(fā)明的化合物cytosporaphenone A，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示：

本發(fā)明的第二個目的是提供一種化合物cytosporaphenone A的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：化合物cytosporaphenone A是從巴戟天內(nèi)生真菌Cytospora rhizophorae A761的發(fā)酵培養(yǎng)物中分離制備得到的。

所述的化合物cytosporaphenone A從巴戟天內(nèi)生真菌Cytospora rhizophorae A761的發(fā)酵培養(yǎng)物中分離制備得到的，具體步驟如下：

(1)制備巴戟天內(nèi)生真菌Cytospora rhizophorae A761的發(fā)酵培養(yǎng)物，分離菌絲體和發(fā)酵液，取菌絲體干燥后粉碎用乙醇或乙醇水溶液浸提，濃縮浸提液至無乙醇，再用水懸浮，懸浮液用乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng)濃縮后得浸膏；

(2)浸膏經(jīng)C₁₈反相柱層析，用甲醇-水作為洗脫劑，從體積比30:70至100:0梯度洗脫，收集甲醇-水體積比為40:60洗脫下來的餾分，經(jīng)凝膠柱層析Sephadex LH-20，以氯仿-甲醇體積比1:1作為洗脫劑洗脫，再經(jīng)純化后得到化合物cytosporaphenone A。

所述的步驟(1)制備巴戟天內(nèi)生真菌Cytospora rhizophorae A761的發(fā)酵培養(yǎng)物具體步驟為：挑取Cytospora rhizophorae A761的菌絲接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，在28℃、120r/min條件下培養(yǎng)5天，制得種子液，然后將種子液按10％的接種量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃、120r/min條件下培養(yǎng)7天，而制得Cytospora rhizophorae A761的液體發(fā)酵培養(yǎng)物，所述的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，每升是通過以下方法配制的：用500mL的純水煮200g的馬鈴薯，煮沸20min，過濾得馬鈴薯汁，再加入葡萄糖20g、KH₂PO₄ 3g、MgSO₄ 1.5g、維生素B₁ 10mg、用水補(bǔ)足至1000mL。

所述的乙醇水溶液優(yōu)選為體積分?jǐn)?shù)98％的乙醇水溶液。

所述的純化是用高效液相色譜和制備薄層層析純化。

本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，化合物cytosporaphenone A對HepG-2細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的IC₅₀值分別為19.2和22.4μg/mL，陽性對照物順鉑對上述四種腫瘤細(xì)胞株的IC₅₀值分別為0.51和1.84μg/mL。此結(jié)果表明：本發(fā)明的化合物cytosporaphenone A具有比較顯著的抗腫瘤活性。

因此，本發(fā)明的第二個目的是提供化合物cytosporaphenone A在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

所述的抗腫瘤藥物優(yōu)選為抗肝癌和乳腺癌的藥物。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種抗腫瘤藥物，其特征在于，包含化合物cytosporaphenone A作為活性成分。

所述的抗腫瘤藥物優(yōu)選為抗肝癌和乳腺癌的藥物。

本發(fā)明的第四個目的是提供巴戟天內(nèi)生真菌Cytospora rhizophorae A761在制備化合物cytosporaphenone A中的應(yīng)用。

本發(fā)明從巴戟天內(nèi)生真菌Cytospora rhizophorae A761中制備分離得到化合物cytosporaphenone A，該化合物cytosporaphenone A具有抗腫瘤活性，可以用于制備抗腫瘤藥物，為研究與開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了候選化合物，為開發(fā)利用植物內(nèi)生微生物來源的天然活性物質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。

本發(fā)明的巴戟天內(nèi)生真菌Cytospora rhizophorae A761于2016年12月15日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，地址：中國.廣州.廣東省微生物研究所，其保藏編號為GDMCC No.3.617，該菌種保藏中心的菌株是對外銷售的，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在申請日之前獲得該菌株。

附圖說明：

圖1是化合物1(cytosporaphenone A)的¹H-NMR譜；

圖2是化合物1(cytosporaphenone A)的¹³C-NMR譜；

圖3是化合物1(cytosporaphenone A)的HSQC譜；

圖4是化合物1(cytosporaphenone A)的HMBC譜；

圖5是化合物1(cytosporaphenone A)的HR-ESIMS譜。

圖6是化合物1的X-ray晶體衍射圖。

具體實施方式：

下面通過具體實施例來對本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述，但是本發(fā)明并不受限于下面的實施例。

實施例1：

一、巴戟天內(nèi)生真菌Cytospora rhizophorae A761的分離純化和鑒定

本發(fā)明的內(nèi)生真菌Cytospora rhizophorae A761是2015年1月從采自廣東省高要市的巴戟天植物的葉中分離得到的，經(jīng)ITS序列分析鑒定，GenBank基因登錄號為：KU529867，經(jīng)blast比對，同源分析，鑒定該菌株屬于Cytospora屬真菌，命名為Cytospora rhizophorae A761。

二、Cytospora rhizophorae A761的液體發(fā)酵

培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基是通過以下方法配制的：用500mL水煮200g的馬鈴薯，煮沸20min，過濾得馬鈴薯汁，再加入葡萄糖20g、KH₂PO₄ 3g、MgSO₄1.5g、維生素B₁ 10mg、用水補(bǔ)足至1000mL，121℃高壓滅菌20min，冷卻待用。

挑取適量的Cytospora rhizophorae A761的菌絲接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，在28℃、120r/min條件下培養(yǎng)5天，制得種子液。然后將種子液按體積分?jǐn)?shù)10％的接種量接種于裝有500mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中，共發(fā)酵100L，28℃、120r/min條件下培養(yǎng)7天，制得Cytospora rhizophorae A761的液體發(fā)酵培養(yǎng)物。

三、化合物cytosporaphenone A的制備

50L Cytospora rhizophorae A761的液體發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)離心得發(fā)酵液和菌絲體。菌絲體置于55℃烘箱烘干、粉碎，用體積分?jǐn)?shù)98％的乙醇水溶液冷浸提取多次至提取液基本無色，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加500mL水懸浮，再用乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取物，在40℃下減壓濃縮得浸膏26g。

浸膏經(jīng)C₁₈反相柱層析，用甲醇-水作為洗脫劑，從體積比30:70至100:0梯度洗脫，收集甲醇-水體積比為40:60洗脫下來的餾分，經(jīng)凝膠柱層析Sephadex LH-20，以氯仿-甲醇體積比1:1作為洗脫劑洗脫，通過TLC板合并相同流分，得到組分1(展開劑正己烷：乙酸乙酯＝1:5v/v，rf＝0.3～0.4)和組分2(展開劑正己烷：乙酸乙酯＝1:5v/v，rf＝0.5～0.7)。組分2再經(jīng)C₁₈反相柱色譜，以甲醇-水為洗脫劑，從體積比40:60至100:0梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜合并相同點(diǎn)組分，收集以正己烷：乙酸乙酯＝1:5v/v作為展開劑，rf＝0.5～0.7的餾分，該餾分再經(jīng)硅膠柱層析，用正己烷-乙酸乙酯做洗脫劑，從體積比5:1-1:5進(jìn)行梯度洗脫，合并正己烷-乙酸乙酯(1:2)極性段得到目標(biāo)化合物1(化合物cytosporaphenone A)(20mg)。

四、化合物cytosporaphenone A的結(jié)構(gòu)鑒定

¹H NMR、¹³C NMR、HMBC核磁共振譜圖用Bruker Advance-500核磁共振光譜儀測定，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)；ESI-MS數(shù)據(jù)用VG Autospec-3000型質(zhì)譜儀測定；紫外光譜用上海元析儀器有限公司UV6000紫外可見分光光度計測定。

圖1是化合物1(cytosporaphenone A)的¹H-NMR譜；

圖2是化合物1(cytosporaphenone A)的¹³C-NMR譜；

圖3是化合物1(cytosporaphenone A)的HSQC譜；

圖4是化合物1(cytosporaphenone A)的HMBC譜；

圖5是化合物1(cytosporaphenone A)的HR-ESIMS譜。

圖6是化合物1的X-ray晶體衍射圖

化合物1(Cytosporaphenone A)：化合物1為暗黃色晶體；根據(jù)其ESIMS準(zhǔn)分子離子峰，確定化合物1的分子量為320；根據(jù)HRESIMS[M-H]^-m/z 319.0404，C₁₅H₁₁O₈計算值為319.0454，確定化合物的分子式為C₁₅H₁₂O₈，不飽和度為10；氫譜和碳譜(表1)顯示AB間位取代的苯的三個芳環(huán)質(zhì)子信號，一個方環(huán)單峰，以及一個甲基信號?；衔?的¹³C NMR和HSQC譜顯示該化合物共有14個碳信號，包括12個芳環(huán)碳信號(兩個苯環(huán))以及一個羰基碳信號，一個甲基信號。HMBC譜中H-2與C-4，C-6，C-7相關(guān)可以確定分子中的存在A環(huán)結(jié)構(gòu)片段；此外，H-11(H-13)與C-9和C-13的HMBC相關(guān)可以推測分子中含有一個部分對稱的B環(huán)片段；甲基與C-11，C-13的關(guān)鍵HMBC相關(guān)則可推測甲基位于C-12位(B環(huán)上)。通過H-11和H-13與C-8的相關(guān)可以確定羰基與B環(huán)的C-9位上。

因為化合物1高氧化度，使得鑒定他的結(jié)構(gòu)比較困難，因而我們嘗試對其進(jìn)行單晶培養(yǎng)，最終，通過努力獲得了它在甲醇溶液中的單晶，并通過X-ray單晶衍射最終確定了化合物1的結(jié)構(gòu)(圖6)。最終，化合物1被確定為一個二苯甲酮類新穎化合物。

表1 cytosporaphenone A的核磁數(shù)據(jù)(δin ppm,J in Hz)。

^a Recorded in CD₃OD

經(jīng)過上述方法分離的目標(biāo)化合物1命名為化合物cytosporaphenone A，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示：

實施例2：

采用SRB法[SkehanP,Storeng R,Dominic S.New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening[J].J Natl Cance Inst,]測試化合物cytosporaphenone A的抗腫瘤活性。

1、試驗用試劑：將本發(fā)明制備的化合物cytosporaphenone A用二甲基亞砜(DMSO)溶解得濃度為10mg/mL的母液，再用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。陽性對照為順鉑水溶液。

本實驗所用腫瘤細(xì)胞株為肝癌細(xì)胞HepG-2乳腺癌細(xì)胞MCF-7。

2、實驗方法：取對數(shù)生長期的HepG-2和MCF-7細(xì)胞，用胰酶消化，臺盼藍(lán)染色計數(shù)，臺盼藍(lán)排斥實驗檢測細(xì)胞活力大于95％后，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10⁴個/mL，細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入180μL的細(xì)胞懸液，并設(shè)3個空白孔調(diào)零，于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入20μL一定濃度的上述化合物cytosporaphenone A的溶液，陰性對照加20μL RPMI-1640培養(yǎng)基，以順鉑作陽性對照。置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，加入50μl 50％冷三氯醋酸固定細(xì)胞，4℃放置1小時后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的SRB 4mg/ml溶液100μL/孔，室溫中染色30min，去上清，用1％冰醋酸洗滌5次，空氣干燥。最后加入200μL/孔10mmol/ml的Tris溶液，用酶標(biāo)儀測定570nm處的吸光值(A)，用以下公式計算藥物對細(xì)胞生長的抑制率：細(xì)胞生長抑制率(％)＝(1-A_樣品組/A_對照組)×100％。

3、實驗結(jié)果：本發(fā)明制備的化合物cytosporaphenone A對HepG-2細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的IC₅₀值分別為19.2和22.4μg/mL，陽性對照物順鉑對上述兩種腫瘤細(xì)胞株的IC₅₀值分別為0.51和1.84μg/mL。此結(jié)果表明：本發(fā)明的化合物cytosporaphenone A具有顯著的抗腫瘤活性，因此，本發(fā)明為研究與開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了候選化合物，為開發(fā)利用植物內(nèi)生微生物來源的天然活性物質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。