本發(fā)明涉及一種Omega-3脂肪酸工業(yè)化制備色譜分離純化方法。

背景技術(shù)：

隨著人們對深海魚油的廣泛重視，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)對人體的醫(yī)療保健作用也越來越備受關(guān)注。富含EPA和DHA等Omega-3脂肪酸的深海魚油具有降低血脂和膽固醇，預(yù)防關(guān)節(jié)炎和緩解痛風(fēng)，預(yù)防老年癡呆，促進大腦神經(jīng)和視網(wǎng)膜發(fā)育等重要生理功能。魚油除了提供動物必需的n-3長鏈多聚不飽和脂肪酸外，還作為脂溶性維生素A、D和類胡蘿卜素等的載體促進維生素以脂溶性的物質(zhì)吸收利用，動物缺乏必需脂肪酸將引起生長停滯、繁殖機能下降、皮下水腫出血、體色暗淡等疾病。

目前主流的魚油提純方法主要為單次或多次分子蒸餾法，該方法每天的魚油產(chǎn)量可達噸級及以上，但該方法分離得到的魚油純度一般比較低，且純化步驟較為繁瑣；當(dāng)前，一種較好的分離純化得到高純度魚油的方法為液相色譜法，該方法可實時監(jiān)測魚油純化進度，較好地控制收集高純度魚油的時間段。

上述方法提取的魚油雖純度較高，但EPA和DHA的比例難以控制。而不同領(lǐng)域要求的EPA和DHA比例是有較大差異的，如嬰兒及孕婦食品和保健品中一般是要求只含DHA而不含EPA；而對于心腦血管疾病患者而言，他們食用的保健品魚油中DHA和EPA含量則一般為2:3。鑒于此，有必要開發(fā)一種魚油純化專用填料，通過控制優(yōu)化鍵合相的組成來調(diào)控純化得到的魚油中的DHA和EPA含量，以適應(yīng)不同人群的營養(yǎng)攝入要求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決目前魚油提純過程中EPA和DHA的比例難以控制的技術(shù)問題。

為實現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種Omega-3脂肪酸工業(yè)化制備色譜分離純化方法，包括如下步驟：

S10：制備分離專用填料，包括以下工序；

S101硅膠粒子的稀酸活化，

將未鍵合的硅膠粒子在濃度為0.01-0.1wt％的氫氟酸中回流20小時，使所述硅膠粒子的濃度保持在0.1g/ml；

S102復(fù)合烷基相鍵合，

將活化干燥后的所述硅膠粒子以分析純級的無水甲苯為溶劑，在分析純級的有機胺的存在下，依次分別加入氣相色譜分析純度>95％的正十八烷基二甲基氯硅烷、氣相色譜分析純度>95％的正辛基二甲基氯硅烷和氣相色譜分析純度>95％的正丁基二甲基氯硅烷進行鍵合得到所述專用填料；

所述硅膠粒子、正十八烷基二甲基氯硅烷、正辛基二甲基氯硅烷和正丁基二甲基氯硅烷的加入量遵循以下比例：

當(dāng)所述硅膠粒子表面羥基密度理論值為10umol/m²時，按投量比0.001-0.005mol/g進行投料，所述投量比＝三種鍵合相的總摩爾數(shù)/裸硅膠粒子克數(shù)；

所述正十八烷基二甲基氯硅烷、正辛基二甲基氯硅烷和正丁基二甲基氯硅烷三種鍵合相按序依次加入，加入時間間隔為10-20min分鐘，保證前一種鍵合相反應(yīng)完全后再加入下一種；

所述有機胺包括但不限于三甲胺、三乙胺、苯胺、咪唑和吡啶及其衍生物；

S20：采用所述專用填料進行色譜分離純化，如下；

將鍵合得到的所述專用填料直接裝填到動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)中用于對Omega-3脂肪酸中的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸進行色譜分離純化；

所述動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)的柱尺寸為所述專用填料的粒徑為10μm，所述專用填料中三種鍵合相的投料比例為正十八烷基二甲基氯硅烷：正辛基二甲基氯硅烷：正丁基二甲基氯硅烷＝1:3:6，流動相為乙醇和水，10：90-20：80，流速為90ml/min，洗脫時間60min；

或所述動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)的柱尺寸為所述專用填料的粒徑為20μm，所述專用填料中三種鍵合相的投料比例為正十八烷基二甲基氯硅烷：正辛基二甲基氯硅烷：正丁基二甲基氯硅烷＝1.5:2:6.5，流動相為乙醇與水，梯度范圍為20：80-30：70，流速為100ml/min，洗脫時間55min；

或所述動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)的柱尺寸為所述專用填料的粒徑為30μm，所述專用填料中三種鍵合相的投料比例為正十八烷基二甲基氯硅烷：正辛基二甲基氯硅烷：正丁基二甲基氯硅烷＝2:3:5，流動相為乙醇與水，梯度范圍為25：75～30：70，流速為100ml/min，洗脫時間60min。

進一步地，所述步驟S10中工序S102之后還包括：

對甲基或乙基進行封尾，

將鍵合后的所述硅膠粒子以分析純級的無水甲苯為溶劑，在分析純級的有機胺的存在下與氣相色譜分析純度>95％的三氯硅甲烷或氣相色譜分析純度>95％的三氯硅乙烷反應(yīng)，得到純化的所述專用填料；

所述三氯硅甲烷或三氯硅乙烷的加入量根據(jù)硅膠粒子表面羥基摩爾總數(shù)的兩倍確定(理論羥基密度10umol/m2)，以便完全封尾。

進一步地，步驟S102中所述投量比為0.003mol/g，如，1g裸硅膠粒子，投入所述正十八烷基二甲基氯硅烷、正辛基二甲基氯硅烷和正丁基二甲基氯硅烷的總摩爾數(shù)為0.003mol。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明直接采用粗提取后的魚油粗品來制備DHA和EPA比例可控的高純度魚油，無需大量復(fù)雜繁瑣的前處理過程，所用溶劑廉價、安全，分離純化過程一步完成，且可在線實時監(jiān)測，大大提高了安全性，節(jié)約了原料和時間成本，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。氣相色譜最終測定顯示，魚油純度(DHA+EPA)大于99.9％，總雜小于0.1％，DHA:EPA比例范圍在0.01～99.99范圍內(nèi)可調(diào)。

附圖說明

圖1是EPA和DHA標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜內(nèi)標(biāo)對照圖譜。

圖2-1是原始魚油粗品的高效液相色譜測定圖譜；圖2-2是原始魚油粗品的氣相色譜測定圖譜。

圖3-1是用填充了10μm DHA和EPA的色譜分離純化專用填料(C18：C8：C4＝1:3:6)的動態(tài)軸向壓縮柱分離純化魚油的高效液相色譜測定圖譜，進樣400mg；

圖3-2為提純產(chǎn)物氣相色譜檢測圖譜，顯示EPA/DHA＝147.41。

圖4-1是用填充了10μm DHA和EPA的色譜分離純化專用填料(C18：C8：C4＝1.5:2:6.5)的動態(tài)軸向壓縮柱分離純化魚油的高效液相色譜測定圖譜，進樣1g；

圖4-2為提純產(chǎn)物氣相色譜檢測圖譜，顯示EPA/DHA＝0.006。

圖5-1是用填充了10μm DHA和EPA的色譜分離純化專用填料(C18：C8：C4＝2:3:5)的動態(tài)軸向壓縮柱分離純化魚油的高效液相色譜測定圖譜，進樣3g；

圖5-2為提純產(chǎn)物氣相色譜檢測圖譜，顯示EPA/DHA＝8.00。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

如各圖所示，本發(fā)明的Omega-3脂肪酸工業(yè)化制備色譜分離純化方法具體可參考如下實施例進行：

實施例1

取400mg魚油粗品配置成溶液，過濾除去不溶物；

將魚油溶液泵入動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)，柱尺寸為Φ50×250mm，填料粒徑為10μm，正十八烷基二甲基氯硅烷(C18)，正辛基二甲基氯硅烷(C8)，正丁基二甲基氯硅烷(C4)的投料比例(或稱鍵合比例)為1:3:6，硅膠粒子上樣量為400mg，流動相為乙醇與水，梯度范圍為10：90～20：80，流速為90ml/min，洗脫時間60min。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為254nm，收集保留時間在30～35min的餾出液。如圖3-2所示，經(jīng)氣相色譜分析魚油EPA：DHA＝147.41。

實施例2

取1g魚油粗品配置成溶液，過濾除去不溶物；

將魚油溶液泵入動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)，柱尺寸為Φ50×250mm，填料粒徑為20μm，C18，C8，C4的投料比例(或稱鍵合比例)為1.5:2:6.5，硅膠粒子上樣量為1g，流動相為乙醇與水，梯度范圍為20：80～30：70，流速為100ml/min，洗脫時間55min。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為254nm，收集保留時間在25～30min的餾出液。如圖4-2所示，經(jīng)氣相色譜分析魚油EPA：DHA＝0.006。

實施例3

取3g魚油粗品配置成濃度溶液，過濾除去不溶物；

將魚油溶液泵入動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)，柱尺寸為Φ50×250mm，填料粒徑為30μm，C18，C8，C4的投料比例(或稱鍵合比例)為2:3:5，硅膠粒子上樣量為3g，流動相為乙醇與水，梯度范圍為25：75～30：70，流速為100ml/min，洗脫時間60min。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為254nm，收集保留時間在25～30min的餾出液。如圖5-2所示，氣相色譜分析魚油EPA：DHA＝8.00。

以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完全可以在不偏離本項發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進行多樣的變更以及修改。本項發(fā)明的技術(shù)性范圍并不局限于說明書上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來確定其技術(shù)性范圍。