水柏枝有效部位、其制備方法及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及到水柏枝有效部位、其制備方法及其在治療風濕、類風濕性關節(jié)炎的用途。經動物實驗證實，該有效部位能夠抑制巴豆油致小鼠耳腫脹和大鼠佐劑性或膠原性關節(jié)炎，可用于預防和/或治療風濕、類風濕性關節(jié)炎的用途。
【專利說明】
水柏枝有效部位、其制備方法及其用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及從傳統(tǒng)藏藥水柏枝提取的有效部位，包括該有效部位的制備方法，含 有這種有效部位的藥物組合物，以及含有這種有效部位和其藥物組合物在治療風濕、類風 濕性關節(jié)炎的藥物中的用途，本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域。
【背景技術】
[0002] 類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid Arthri ti s，RA)是一種以關節(jié)滑膜炎為特征的慢性自 身免疫疾病，常伴有炎癥細胞(T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等)侵襲、浸潤、微血管增生、關 節(jié)滑膜細胞增生、滑膜下層滑膜增厚形成絨毛狀突起以及骨與軟骨損傷等病理變化。這種 炎癥會造成關節(jié)變形直至殘廢，并會因關節(jié)痛楚及磨損而失去部分的活動能力。RA的特征 是手、足小關節(jié)的多關節(jié)、對稱性、侵襲性關節(jié)炎癥，經常伴有關節(jié)外器官受累及血清類風 濕因子陽性，可以導致關節(jié)疼痛、僵硬、疲勞、骨傷，最終出現畸形及功能喪失 [1]ΑΑ在世界 范圍內普遍存在，據統(tǒng)計全世界患病率約為1~2%，我國患病率約為0.5%，該病若未及時 治療，由于軟骨和骨組織的破壞，70 %的RA患者2年后可致殘，嚴重影響健康和生活質 量[2,3]。
[0003] 目前臨床上治療RA的藥物主要有三類，即留體類抗炎藥、非留體類抗炎藥和改善 病情抗風濕藥。但留體類抗炎藥長期使用可引起類腎上腺皮質功能亢進綜合癥、消化系統(tǒng) 并發(fā)癥、心血管系統(tǒng)疾病以及骨質疏松、大關節(jié)無菌性壞死、感染等不良反應等;非留體類 抗炎藥能控制RA患者的癥狀，但對疾病本身影響小，不影響RA的病程，不能阻止關節(jié)破壞和 器官損害進展，長期使用會帶來胃腸道、腎毒性等副反應，對關節(jié)軟骨也有損傷;改善病情 抗風濕藥只能改善病情，緩解癥狀，達不到治療的效果 [3,4]。盡管上述這些藥物可抑制炎癥 的發(fā)生，緩解RA的癥狀，但長期使用這些藥物都可出現嚴重的不良反應。因此發(fā)現、研制和 開發(fā)更安全、更有效的治療RA藥物具有重要應用價值。
[0004] 水柏枝為常用藏藥，其來源為檉柳科水柏枝屬植物水柏枝M y r i c a r i a germanicaL.Desv及同屬多種植物的嫩枝，廣泛分布于我國西藏、青海、甘肅、內蒙古等西部 地區(qū)。藏藥名"溫布"，其性平，味甘咸、辛甘溫，具有疏風解表、祛風通絡、透疹、止咳、清熱解 毒之功效 [5,6]。水柏枝作為傳統(tǒng)藏藥主要用于治療風濕痹痛，麻疹不透，瘟病時疫，臟腑毒 熱，咽喉腫痛，中毒癥，黃水病，血熱病等癥 [7]，目前水柏枝在臨床上主要用于治療風濕，主 治風濕性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、急慢性風濕性關節(jié)炎等[8]。同時，水柏枝也是多種復方 藏藥的主要藥物，如五味甘露藥浴散、奇正消痛貼等。五味甘露藥浴散是藏醫(yī)獨具特色的洗 浴制劑 [9]，現已收載于國家藥品標準，該復方由水柏枝、圓柏葉、烈香杜鵑、大籽蒿、麻黃等 藥味組成，具有祛風通絡，發(fā)汗止癢，增強自身免疫等功效，對風濕性、類風濕性關節(jié)炎等疾 病有特殊療效 [1(W2]。奇正消痛貼膏由獨一味、水柏枝等六味藏藥組成，具有活血化淤、消腫 止痛功效，其方中具有抗炎功效的主要藥物為水柏枝 [13]。經系統(tǒng)查閱文獻發(fā)現，國內外對 水柏枝化學成分研究主要集中在黃酮、沒食子酸和三萜類化合物，此外還有留醇、長鏈脂肪 醇等類。對水柏枝屬植物藥理活性研究表明其提取物具有抗菌作用 [14]，抗炎作用[15，16]，鎮(zhèn) 痛作用[17]，免疫調節(jié)[18]和細胞免疫作用[19]，抗疲勞 [2°]和抗氧化[21]等多種藥理活性。盡管 有研究報道水柏枝(翁布)水提取物和醇提物對SD大鼠 FCA誘導性關節(jié)炎具有抑制活性[16]， 其總黃酮對佐劑性關節(jié)炎大鼠具有免疫調節(jié)作用[18]。以上研究報道雖然證實了水柏枝在 治療關節(jié)炎方面的活性，但所確定的活性部位僅是粗提物，有效成分并不明確，本專利在前 期研究工作基礎上，進一步確證了水柏枝在治療關節(jié)炎方面的有效部位和有效成分，迄今 為止，未見到該方面的研究報道和專利。
[0005] 參考文獻
[0006] 1宋亞楠，紀偉.雷公藤多甙片治療類風濕性關節(jié)炎的研究進展[J]，臨床內科雜 志，2009,26(10):663-665。
[0007] 2陳飛虎，袁鳳來，李霞等.幾種抗類風濕性關節(jié)炎藥物對佐劑性關節(jié)炎大鼠關節(jié) 軟骨細胞酸敏感離子通道的表達影響及作用[J]，中國臨床藥理學與治療學，2008，13(2): 131-137。
[0008] 3王斌，唐福林.類風濕關節(jié)炎治療進展[J]，山西醫(yī)藥雜志，2001，30( 1): 34-38。 [0009] 4謝長好，曾小峰.類風濕關節(jié)炎治療進展[J]，實用全科醫(yī)學，2004,2(2) :176-177。
[0010] 5江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典上冊，上海:上?？茖W技術出版社，1998,535。
[0011] 6青海省藥品檢驗所青海省藏醫(yī)藥研究所.中國藏藥第三卷，上海:上?？萍汲霭?社，1996:277 ~279。
[0012] 7中國科學院西北高原生物研究所.藏藥志.西寧:青海人民出版社，1991.318。
[0013] 8羅達向.中華藏本草，北京：民族出版社，1997:160。
[0014] 9玉多?云登貢布.四部醫(yī)典(藏文）.拉薩西藏人民出版社，1982:639。
[0015] 10俞汝龍，崔芝忠，阿維天.藏醫(yī)藥浴療法治療類風濕性關節(jié)炎131例療效分析 [J]，中西醫(yī)結合雜志，1989，9( 1): 36。
[0016] 11李先加.藏藥浴治療類風濕性關節(jié)炎223例臨床觀察[J].中國民族醫(yī)藥雜志， 1997,3(2)：15〇
[0017] 12周小梅，陳秋紅，多杰，楊全余.金訶甘露藥浴顆粒的抗炎作用[J]，山西中醫(yī)， 2003,19(1)：50-52〇
[0018] 13蘇寶林，馬蓉.奇正消痛貼藥效學研究[J]，北京中醫(yī)，1996,6:57-59。
[0019] 14鮑敏，曾陽，米琴，陳振寧.藏藥翁布不同提取物的體外抑菌實驗研究[J].時珍 國醫(yī)國藥，2006,17(8): 1410-1411。
[0020] 15曾陽，陳振寧，羅桂花，等.藏藥翁布對急性炎癥模型小鼠超氧化物歧化酶的影 響[J] ·山東中醫(yī)雜志，2005，24(4):236-237。
[0021] 16鮑敏，曾陽，陳振寧.藏藥翁布提取物對SD大鼠 FCA誘導性關節(jié)炎的試驗研究 [J].青海師范大學學報：自然科學版，2012,28(4) :46-48。
[0022] 17曾陽，陳振寧，鐘亮，等.藏藥翁布抗炎鎮(zhèn)痛作用實驗研究[J].中成藥，2005,27 (5)：614-616〇
[0023] 18曾陽，鮑敏，馬繼雄，等.翁布總黃酮對佐劑性關節(jié)炎大鼠的免疫調節(jié)機制[J]. 中國藥理學通報，2011，27(4): 504-507。
[0024] 19曾陽，陳振寧，鐘亮，等.藏藥翁布對細胞免疫功能的影響及其毒性試驗研究
[J].青海師范大學學報：自然科學版，2005，21 (1):66-68。
[0025] 20鮑敏，羅桂花，曾陽，等.藏藥翁布對運動小鼠超氧化物歧化酶活性及脂質過氧 化作用的影響[J] ·中成藥，2005,27(11): 1348-1350。
[0026] 21金蘭，羅桂花，曾陽，等.藏藥翁布對力竭運動小鼠心肌過氧化物酶同工酶的影 響[J]·四川中醫(yī)，2005,23(4):13-14。

【發(fā)明內容】

[0027] 本發(fā)明要解決技術問題是，提供一類水柏枝有效部位、其制備方法、藥物組合物以 及其在制備預防和/或治療風濕、類風濕性關節(jié)炎藥物中的應用。
[0028] 為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了如下技術方案：
[0029] 本發(fā)明技術方案的第一方面是提供一種水柏枝有效部位的制備方法。
[0030] 本發(fā)明中的水柏枝，植物來源為檉柳科水柏枝屬植物的干燥嫩枝。其有效部位的 制備方法如下：
[0031] 步驟1).提取方法:將原料藥材(水柏枝)經干燥后，適當粉碎，然后用溶劑提取，提 取的溶劑包括水、醇類、丙酮或水與醇類或丙酮的混合溶劑。其中醇類溶劑優(yōu)選：甲醇、乙 醇、丙醇或丁醇中的一種或幾種的混合溶劑。水與醇的混合物，為40-95% (體積比）的醇溶 液;提取方法包括:滲漉、浸提或加熱回流提取;提取時溶劑用量為藥材重量的5-20倍，提取 可以在動態(tài)或靜態(tài)下進行，為提高提取效率還可選用超聲波提取;提取的溫度可以從室溫 到溶劑回流的溫度范圍內；提取可以連續(xù)進行或間歇進行，提取次數1-4次。提取液可以選 用常壓或減壓濃縮得浸膏或無醇的濃縮液。
[0032]步驟2).分離方法：
[0033] (1)將上述濃縮液加適量水使浸膏分散溶解，用石油醚(沸點為60-90°C )和醋酸乙 酯依次進行萃取，分別得到石油醚部位、醋酸乙酯部位和水部位。
[0034] (2)將上述水部位經大孔吸附樹脂層析，分別用水，30 %乙醇，50%乙醇和95%乙 醇洗脫，各洗脫部位經冷凍干燥得到水柏枝有效部位，優(yōu)選30 %乙醇洗脫得到的水柏枝有 效部位;其中，大孔吸附樹脂包括D101，HPD-100，HP-20等。
[0035] 本發(fā)明技術方案的第二方面是是提供一種水柏枝有效部位，所述的有效部位按照 本發(fā)明第一方面所述的制備方法制備得到。
[0036] 進一步的，上述的水柏枝有效部位的有效成分是可水解鞣質類化合物。其中，可水 解鞣質類化合物包括如下所述的12個化合物：



[0041] 本發(fā)明技術方案的第三個方面是提供一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括有 效劑量的第二方面所述的水柏枝有效部位和藥學上可接受的載體。
[0042] 該藥物組合物可以根據本領域公知的方法制備?？赏ㄟ^將水柏枝有效部位與一種 或多種藥學上可以接受的固體或液體賦形劑和/或輔料結合，制成適用于人使用的任何劑 型。水柏枝有效部位在其藥物組合物中的含量通常為1_95%(重量比）。
[0043] 此外，如果需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、抗氧化劑、防腐劑、香料、矯味 劑、甜味劑或其他材料。
[0044] 為達到用藥目的，增強治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給 藥方法給藥。
[0045] 本發(fā)明化合物、藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預防或治療疾 病的性質和嚴重程度，患者或動物的年齡、性別、體重、性格及個體反應，給藥途徑、給藥次 數、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明中藥學成分 的使用劑量是本領域技術人員所公知的?？筛鶕景l(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含 有的實際藥物數量，加以適當的調整，以達到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預防或治 療目的。
[0046] 本發(fā)明的水柏枝有效部位或組合物可以單獨使用，或與其它治療藥物或對癥藥物 合并使用。
[0047] 本發(fā)明技術方案的第四個方面是提供了水柏枝有效部位在制備預防和/或治療風 濕、類風濕性關節(jié)炎的藥物中的用途。
[0048]有益技術效果：
[0049]經動物實驗證實，本發(fā)明的水柏枝有效部位能明顯抑制巴豆油致小鼠耳腫脹和大 鼠佐劑性或膠原性關節(jié)炎引起的足腫脹。該有效部位具有預防和/或治療風濕、類風濕性關 節(jié)炎的用途。
【附圖說明】
[0050]圖1寬苞水柏枝有效部位的制備流程圖。
[0051 ]圖2寬苞水柏枝有效部位中水解鞣質類化合物的UV光譜。
[0052]圖3寬苞水柏枝有效部位中水解鞣質類化合物的高效液相色譜檢視圖。
[0053]圖4寬苞水柏枝有效部位對佐劑關節(jié)炎大鼠足腫脹的作用(注:與模型組相比**p〈 0·01)〇
[0054] 圖5膠原性關節(jié)炎大鼠體重變化情況。
【具體實施方式】
[0055] 下面的實例用來進一步說明本發(fā)明，但是這并不意味著本發(fā)明的任何限制。
[0056]水柏枝有效部位
[0057]實施例1:寬苞水柏枝有效部位的制備
[0058] 選用寬荀水柏枝(Myricaria bracteata)的干燥嫩枝15kg，用6倍量乙醇加熱回流 提取3次，每次2小時，提取液減壓回收乙醇并濃縮得到浸膏。加適量水使浸膏分散溶解，用 石油醚和醋酸乙酯依次進行萃取，分別得到石油醚部位、醋酸乙酯部位和水部位。水部位過 濾，濾液經處理的大孔吸附樹脂HP-20分離，分別用8倍量的水，30%乙醇，50%乙醇和95% 乙醇洗脫，減壓回收30%乙醇洗脫部位，經冷凍干燥即得有效部位141. lg。（見圖1)
[0059] 實施例2:寬苞水柏枝有效部位的成分分析
[0060] 水柏枝有效部位中的有效成分是可水解鞣質類化合物，該類化合物由葡萄糖和沒 食子酸以酯鍵或苷鍵連接而成。
[0061 ] 可水解鞣質類化合物的紫外(UV)光譜一般在205-224和260-283nm范圍內顯示2個 UV的特征吸收峰。（見圖2)
[0062] 水柏枝有效部位中的有效成分可水解鞣質類化合物的檢識方法采用，高效液相色 譜。高效液相色譜測定方法為采用二元高壓梯度洗脫方式，分析色譜柱為⑶SM0SIL5C 18-PAQ Waters(4.6i.d. X250mm)型，流動相為A(含有2%醋酸的水)和B(乙腈），洗脫梯度為0_ 111^11，5%8，1-5111丨11，5%-15%8,5-4〇111丨11，15%-20%8，柱溫為25°(：，檢測波長為28〇11111。高效 液相色譜圖見圖3。
[0063] 寬苞水柏枝有效部位中的有效成分可水解鞣質類化合物對應的結構式如下：




[0069] 藥理活性試驗：
[0070] 實驗例1:寬苞水柏枝有效部位(SBZ組)抑制巴豆油致小鼠耳腫脹的試驗。
[0071] 將昆明種小鼠隨機分為模型組，空白對照組，SBZ組，每組7只。各給藥組均灌胃 (ig)給予相應藥物1次，給藥量l〇〇mg/kg，模型組給予等體積0.1 %聚山梨酯-80溶液。lh后， 各組小鼠左耳兩面均勻涂抹2%巴豆油致敏，致敏4h后處死，剪下左右耳廓，用直徑8mm的不 銹鋼打孔器制成大小相同的耳片，分別稱質量，以兩耳質量差值作為腫脹度。
[0072]巴豆油致小鼠耳腫脹的試驗結果為：有效部位的抑制率為65.2%，且未見動物死 亡。提示有效部位有非常顯著的抗炎活性。
[0073]結論:巴豆油致小鼠耳炎是能夠模擬炎癥反應的模型，本發(fā)明通過實驗研究發(fā)現， 寬苞水柏枝提取活性部位有顯著抑制小鼠耳腫脹作用，可用于制備抗炎藥物。
[0074]實驗例2:寬苞水柏枝有效部位(SBZ組)對大鼠佐劑性關節(jié)炎的作用
[0075] 實驗動物:Wistar大鼠（180± 10)g，SPF級，軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，合 格證號 SCXK(軍）2007-004。
[0076]受試藥物：SBZ組分;地塞米松磷酸鈉注射液(Dex)，國藥集團容生制藥有限公司 (國藥準字H41020036)。
[0077] 實驗方法:將Wistar大鼠隨機分為模型(Model)組，Dex組和SBZ組，每組分別為10 只，10只，8只。將卡介苗置于57°C水浴滅活45min，溶解于石蠟與羊毛脂按2 :1混合的溶液 中，乳化制成卡介苗質量濃度為l〇mg/ml的乳劑。2周后，大鼠分為模型組，地塞米松(0.2mg/ kg)組，SBZ(20mg/kg)組，各組大鼠兩側足周長及體質量均無統(tǒng)計學差異。分組當日各組開 始皮下給予相應藥物l〇ml/kg，對照組、模型組給予相同體積0.1%聚山梨酯-80溶液，連續(xù) 給藥15d，每天1次。于給藥第5、9、12、15天測量大鼠兩后足周長，按5級評分法對全身各個關 節(jié)進行評價，即〇分，無紅腫；1分，趾關節(jié)紅腫；2分，趾關節(jié)和足跖腫脹;3分，踝關節(jié)以下的 足爪腫脹;4分，包括踝關節(jié)在內的全部足爪腫脹。
[0078]根據評分結果計算多發(fā)性關節(jié)炎指數(AI，AI =四肢關節(jié)評分之和）。給藥末處死 動物，大鼠取脾臟、胸腺稱重，計算脾臟指數、胸腺指數。每組取注射側踝關節(jié)，10%福爾馬 林溶液浸泡后以8%硝酸溶液脫鈣，經脫水、浸蠟、包埋、切片等處理，HE染色，光鏡下（X 100)觀察。
[0079] 實驗結果:見表1，表2,圖4。
[0080]表1寬苞水柏枝有效部位對佐劑性關節(jié)炎大鼠胸腺指數和脾臟指數的影響
[0082] 注：與空白組相比###p〈0 · 001，與模型組相比*p〈0 · 05 · IR:抑制率
[0083]表2寬苞水柏枝有效部位對佐劑性關節(jié)炎大鼠體重的影響 [0084]
[0085] 注：與模型組相比*ρ〈0·05。
[0086]寬苞水柏枝有效部位20mg/kg在給藥12d可以抑制佐劑性關節(jié)炎大鼠繼發(fā)性足腫 脹，抑制率為4.53% (P〈0.05)(Dex同時間點抑制率為11.4%)，在給藥15d可以抑制佐劑性 關節(jié)炎胸腺指數，但對脾臟指數沒有影響。SBZ在給藥期間對大鼠體重沒有明顯的抑制作 用。
[0087]實驗例3:寬苞水柏枝有效部位(SBZ組)對大鼠膠原型關節(jié)炎的作用評價 [0088] 實驗動物:Wistar大鼠，雄性，110-130g，SPF級，軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提 供，合格證號SCXK(軍)2007-004。實驗動物按體重隨機分為5組，分別為空白組（11只）、模型 組（12只）、SBZ組（12只）、和Dex組（12只）。
[0089]受試藥物：SBZ組分;地塞米松磷酸鈉注射液(Dex)，國藥集團容生制藥有限公司 (國藥準字H41020036)。
[0090] 實驗方法：
[0091] 1.造模配制膠原乳劑，膠原溶于0.1M的冰醋酸使成4mg/ml，4°C過夜，加入同等體 積的弗氏完全佐劑進行乳化，制備終濃度為2mg/ml的膠原乳劑。除空白組外，每只大鼠在0d 左后足跖皮內注射膠原乳劑0.1ml進行初次免疫，7d尾根部皮內注射膠原乳劑0.1ml進行加 強免疫。
[0092] 2.分組給藥加強免疫后觀察大鼠后肢足爪關節(jié)腫脹情況，出現明顯腫脹后根據踝 關節(jié)周長隨機平均分組。造模14d開始給藥，連續(xù)給藥20d。
[0093] 藥物分組及給藥：對照組（不作處理），模型組（給予溶媒），DeX(0.2mg/kg)，SBZ (200mg/kg)，各給藥組均為口服給藥。
[0094] 3.藥物對關節(jié)炎癥的治療作用
[0095]每天觀察左、右后腳爪的腫脹度，體重變化，毛色、進食及精神狀態(tài)。
[0096] 致炎16(1、20(1、23(1、26(1、29(1、32(1、34(1用特制的尺測量注射側和注射對側踝關節(jié)周 長，并按公式計算藥物抑制率：
[0098] 4.胸腺脾臟指數測定:34d處死所有動物，取胸腺、脾臟，稱重，
[0099] 計算胸腺指數、脾臟指數，臟器指數計算為每10g體重相應的臟器mg數。
[0100] 5.病理檢查：大鼠處死后，每組隨機取4只留取病理樣本。分別取下注射側和注射 對側大鼠踝關節(jié)，福爾馬林固定，5%硝酸脫鈣，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡檢查踝關節(jié)病 變情況，并進行評分。
[0101] 評分標準：
[0102] 1)關節(jié)周圍軟組織：
[0103] 0分:未見異常；
[0104] 1分:局部軟組織輕度炎性改變:關節(jié)周圍局部軟組織水腫，可見少量中性粒細胞、 淋巴細胞浸潤；
[0105] 2分:局部軟組織炎性改變明顯：關節(jié)周圍軟組織明顯水腫，小血管充血，大量中性 粒細胞、淋巴細胞浸潤，局部可見炎性肉芽組織形成；
[0106] 3分:局部軟組織炎性改變顯著：關節(jié)周圍軟組織顯著水腫，小血管充血，大量中性 粒細胞、淋巴細胞浸潤，局部炎性肉芽組織增生，大量肉芽腫及膿腫形成；
[0107] 2)滑膜組織
[0108] 0分:未見異常；
[0109] 1分:局部滑膜組織輕度炎性改變:軟骨周圍滑膜組織輕度水腫，滑膜細胞腫脹、單 層排列，周圍可見少量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤；
[0110] 2分:局部滑膜組織炎性改變明顯:軟骨周圍滑膜組織明顯水腫，滑膜細胞腫脹、增 生明顯、呈多層排列，滑膜組織周圍散在中性粒細胞及淋巴細胞浸潤；
[0111] 3分:局部滑膜組織炎性改變顯著:軟骨周圍滑膜組織顯著增生，炎性反應顯著，滑 膜周圍大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，毛細血管增生，局部可見炎性肉芽腫形成；
[0112] 3)軟骨
[0113] 0分:未見異常；
[0114] 1分:關節(jié)面軟骨組織輕度受損，可見軟骨內血管翳形成，關節(jié)面基本完整；
[0115] 2分:關節(jié)軟骨破壞明顯，局部關節(jié)面軟骨可見缺損，缺損部位炎性纖維組織增生， 中性粒細胞、淋巴細胞浸潤；
[0116] 3分:炎癥累積整個關節(jié)腔，關節(jié)軟骨破壞顯著，關節(jié)面軟骨嚴重缺損，缺損部位被 炎性纖維組織替代，局部大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤；
[0117] 4)骨組織、骨髓腔
[0118] 0分:未見異常；
[0119] 1分:局部可見個別骨小梁斷裂，骨髓腔融合，未見骨髓腔內出現炎癥反應；
[0120] 2分:骨組織受損明顯，受損處炎性纖維組織增生，大量中性粒細胞、淋巴細胞浸 潤，局部骨小梁斷裂明顯，骨髓腔融合，骨髓腔內可見中性粒細胞浸潤(或骨髓細胞增生活 躍），但未見骨髓腔內炎性組織增生；
[0121] 3分:骨組織受炎性組織侵蝕嚴重，炎癥累及骨髓腔，局部可見骨髓腔內大量炎性 纖維組織增生，骨髓為組織為炎性纖維組織所替代；
[0122] 5)總分
[0123] 由于從關節(jié)周圍軟組織呈現炎性表現，病程迀延，滑膜組織、軟骨、骨組織和骨髓 腔呈現炎性反應是一個病程逐漸加重的過程，在對每個樣品在上述四個方面的病理表現進 行綜合評定時使用加權平均數(關節(jié)周圍組織計權數為1，滑膜組織計權數為2,軟骨計權數 為3，骨組織及骨髓腔計權數為4)。
[0124] 實驗結果:模型組較對照組明顯腫脹，顯示造模成功;造模后動物足爪腫脹，活動 不便，毛色、精神狀態(tài)及進食無明顯變化，地塞米松組動物較模型組及對照組精神活躍，SBZ 組較模型組未見明顯變化；
[0125] 1)各實驗組體重變化情況。
[0126] 造模后，動物較對照組隨腫脹程度增加體重差加大，陽性對照藥地塞米松(Dex)與 模型組相比，體重顯著下降，SBZ對體重無明顯影響（見圖5);如圖5所示，給藥后，模型組與 對照組相比，體重差隨腫脹程度加重增加，造模后動物體重增長減緩，除行走不便，模型組 進食、毛色、精神狀態(tài)無明顯變化;DEX可顯著降低動物體重，且精神旺盛；SBZ給藥后，動物 體重無明顯變化，提示給藥劑量在給藥期間無明顯毒副作用。
[0127] 2)藥物對大鼠膠原性關節(jié)炎足爪腫脹的影響。
[0128] 造模后，陽性對照藥Dex顯著抑制膠原型關節(jié)炎大鼠注射側及對側腫脹（p〈 0.001)，SBZ組對足爪腫脹未見明顯抑制作用（見表3及表4);致炎14d后，動物后肢注射側及 對側明顯腫脹(P〈〇.〇〇1)，Dex給藥2d即顯示顯著性差異，至給藥20d對注射側及對側腫脹抑 制率分別為26.3%、11.4%，SBZ對足爪腫脹無明顯抑制作用。
[0129] 表3寬苞水柏枝有效部位對大鼠膠原性關節(jié)炎左后肢腫脹的作用(注射側）
[0130]
[0131] 1 ·#ρ〈0·05，##ρ〈0·01，###ρ〈0·001與對照組比較；*Ρ〈0·05，**Ρ〈0·01，***Ρ〈 0.001，與模型組比較；
[0132] 2.給藥組關節(jié)腫脹度后數值為踝關節(jié)腫脹抑制率（％ )。
[0133] 表4寬苞水柏枝有效部位對大鼠膠原性關節(jié)炎右后肢腫脹的作用(注射對側）
[0135] 1 ·#ρ〈0·05，##ρ〈0·01，###ρ〈0·001與對照組比較；*Ρ〈0·05，**Ρ〈0·01，***Ρ〈
0.001，與模型組比較；
[0136] 2.給藥組關節(jié)腫脹度后數值為踝關節(jié)腫脹抑制率（％ )。
[0137] 3)藥物對脾臟、胸腺指數的影響
[0138] 造模后，脾臟指數顯著升高(ρ〈0.001)，Dex顯著降低脾臟指數(ρ〈0.001)，SBZ組脾 臟指數稍有降低，但無顯著性差異;造模后，胸腺指數稍有降低，無顯著性差異，Dex顯著降 低脾臟指數(P〈〇. 001)，SBZ組胸腺指數降低(p〈0.05)(見表5)。
[0139] 表5寬苞水柏枝有效部位對大鼠膠原性關節(jié)炎脾臟、胸腺指數的影響
[0141] *臟器指數計算為每10g體重相應的臟器mg數;模型組與對照組比較p值，各給藥組 與模型組比較，分析統(tǒng)計學差異。
[0142] 脾臟和胸腺是主要的免疫器官，在炎癥反應中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。造模后脾臟 指數顯著升高(p〈〇.001)，胸腺指數稍有降低，無顯著性差異，提示免疫系統(tǒng)活化，參與炎癥 反應;DEX顯著降低脾臟和胸腺指數(p〈0.001)，具有明顯的免疫調節(jié)活性;給予SBZ后脾臟 指數稍有降低，但無顯著性差異，胸腺指數降低，其中SBZ組有顯著性差異(p〈0.05)，提示藥 物可能有一定的免疫調節(jié)活性，但作用不強。
[0143] 4.藥物對膠原性關節(jié)炎踝關節(jié)病理評分的影響
[0144] 模型組與對照組相比，病理評分顯著升高(p〈0.001)，Dex顯著降低注射側及對側 病理評分(P〈〇. 05); SBZ顯著降低注射側病理評分(p〈0.05)，但對對側的病理評分未見顯著 性影響（見表6及表7)。
[0145] 表6藥物對大鼠膠原性關節(jié)炎踝關節(jié)作用病理評分表(注射側）
[0147] 1 · #p〈〇 · 05，##p〈0 · 01，###p〈0 · 001與對照組比較；*P〈0 · 05，**P〈0 · 01，***P〈 0.001，與模型組比較；
[0148] 2.給藥組關節(jié)腫脹度后數值為與模型組相比對應的抑制率（％ )。
[0149] 表7藥物對大鼠膠原性關節(jié)炎踝關節(jié)作用病理評分表(注射對側）
[0150]
[0151] 1 · #p〈0 · 05，##p〈0 · 01，###p〈0 · 001與對照組比較；*P〈0 · 05，**P〈0 · 01，***P〈 0.001，與模型組比較；
[0152] 2.給藥組關節(jié)腫脹度后數值為與模型組相比對應的抑制率（％ )。
[0153] 模型組與對照組相比，注射側及對側病理評分顯著升高（p〈0.001)，關節(jié)周圍組 織、滑膜組織增生、軟骨破壞、骨組織及骨髓腔破壞均較為嚴重;DEX顯著抑制炎癥破壞，總 分抑制率分別為注射側46.6% (p〈0.001)、對側46.8% (p〈0.01); SBZ對注射側軟骨、骨組織 及骨髓腔破壞表現出一定的抑制作用，對對側病理評分無明顯抑制作用，總分抑制率分別 為 21·4%(ρ〈0·05)、8·8%。
[0154] 結論：以上結果顯示，寬苞水柏枝有效部位對膠原性關節(jié)炎大鼠足爪腫脹抑制活 性未見顯著統(tǒng)計學差異;對某些關鍵指標，如脾臟指數、胸腺指數，踝關節(jié)病理評分表現出 一定的抑制作用，顯示化合物對緩解和抑制類風濕關節(jié)炎局部炎癥的進展，具有潛在的調 節(jié)抑制活性，預防和治療風濕、類風濕性關節(jié)炎中的用途。
【主權項】
1. 水柏枝有效部位的制備方法，其特征在于，包括下面步驟： (1) 將水柏枝Myricaria germanica L.Desv及同屬植物的嫩枝，適當粉碎，然后用溶劑 滲漉、浸提或加熱回流提取，提取液常壓或減壓濃縮得浸膏； (2) 此浸膏經分離方法精制、純化得到水柏枝有效部位。2. 根據權利要求1的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述的水柏枝及其同屬植物為 寬苞水柏枝、水柏枝。3. 根據權利要求1的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述的提取溶劑為水、醇類、丙 酮、或水與醇類或丙酮的混合溶劑;其中所述的醇類包括：甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的一種 或幾種的混合溶劑。4. 根據權利要求1的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的分離方法為萃取后層析； 其中所述的層析方法包括大孔吸附樹脂層析、MCI樹脂層析、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20層 析、Toyoperal凝膠層析或反相硅膠層析、或上述層析方法的組合。5. 根據權利要求4的制備方法，其特征在于，所述的萃取所使用的溶劑為石油醚、甲苯、 乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、水中的一種或數種 混合溶劑;所述的層析所用的溶劑為石油醚、甲苯、乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正 丁醇、異丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、水中的一種或數種混合溶劑。6. 根據權利要求5的制備方法，其特征在于，所述的混合溶劑選自水和乙醇的混合溶 劑，其中乙醇的百分比為30%-50%。7. -種水柏枝有效部位，其特征在于，所述的有效部位按照權利要求2-6中任一所述的 制備方法制備得到。8. 根據權利要求7的水柏枝有效部位，其特征在于，所述的有效部位的有效成分是可水 解鞣質類化合物。9. 一種藥物組合物，其特征在于，含有有效劑量的權利要求7-8的水柏枝有效部位及藥 學上可接受的載體。10. 根據權利要求9中的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括注射液、片 劑、膠囊、丸劑、口服液、貼劑、湯劑、顆粒或滴丸劑型。11. 權利要求7-8任一所述的水柏枝有效部位或權利要求9-10任一所述的藥物組合物 在制備預防和/或治療風濕、類風濕性關節(jié)炎藥物中的用途。
【文檔編號】A61K31/7024GK106063802SQ201610262319
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年4月25日 公開號201610262319.0, CN 106063802 A, CN 106063802A, CN 201610262319, CN-A-106063802, CN106063802 A, CN106063802A, CN201610262319, CN201610262319.0
【發(fā)明人】李帥, 侯琦, 劉佳寶, 袁紹鵬, 白金葉, 張瑛
【申請人】中國醫(yī)學科學院藥物研究所