本發(fā)明涉及一類噁嗪化合物在生物專一性識(shí)別檢測(cè)中的新應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，熒光探針在生物、醫(yī)療等領(lǐng)域中發(fā)揮的巨大作用，逐漸成為人們的研究熱門。從熒光染料分子被發(fā)現(xiàn)之初到現(xiàn)在的兩百多年間，人們已經(jīng)取得了眾多研究成果。發(fā)展較為成熟的熒光染料包括菁類染料、氟硼吡咯、香豆素、羅丹明、熒光素、尼羅藍(lán)等，人們通過在其母體環(huán)上連接一系列官能團(tuán)進(jìn)行修飾，合成了多種具有檢測(cè)功能的熒光探針分子，用于目標(biāo)分子實(shí)現(xiàn)可視化監(jiān)測(cè)。熒光染料分子已被應(yīng)用于發(fā)光材料及傳感器、環(huán)境污染檢測(cè)、生物研究、醫(yī)療診斷等眾多領(lǐng)域。值得一提的是，熒光探針在醫(yī)療健康方面發(fā)揮著重要作用。它們可以進(jìn)入細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞內(nèi)各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)識(shí)定位，直觀的區(qū)分正常細(xì)胞及病變細(xì)胞，從而確定病癥根源，有利于針對(duì)性治療疾病。生物體的遺傳信息大都記錄于脫氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)上，因此核酸的一系列生物活動(dòng)是否正常對(duì)生物體維持正常生命便顯得尤為重要。若核酸的轉(zhuǎn)錄及復(fù)制等過程發(fā)生異常，便會(huì)對(duì)生物體的健康產(chǎn)生極大威脅，因此實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，對(duì)各種重大疾病的預(yù)防及治療具有實(shí)際意義。

核糖核酸(RNA)在一個(gè)正常細(xì)胞的一生中處于絕對(duì)重要的地位，在細(xì)胞的編碼、解碼、調(diào)控、基因的表達(dá)等過程中發(fā)揮著無(wú)可替代的作用。核糖核酸(RNA)連同脫氧核糖核酸(DNA)一同構(gòu)成生物重要大分子核酸，二者相互依存，不可分割。他們與生物體維持正常生命一切活動(dòng)均有十分密切的關(guān)系。例如，DNA上記錄著生物體必要的遺傳信息，而DNA大部分存在與細(xì)胞核中，要傳遞這些遺傳信息則必須要通過RNA。生物細(xì)胞通過腺嘌呤(G)、鳥嘌呤(A)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)之間的互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系，由DNA轉(zhuǎn)錄為信使核糖核酸(m-RNA)，由轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(t-RNA)轉(zhuǎn)運(yùn)所需氨基酸，在核糖體(r-RNA)上進(jìn)行蛋白質(zhì)的組裝來表達(dá)遺傳信息，以此指導(dǎo)細(xì)胞中各個(gè)細(xì)胞器協(xié)同作用合成維持生命活性的各種必須蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的合成過程充分表達(dá)了RNA分子在細(xì)胞中發(fā)揮著極其重要的作用，而DNA、RNA及蛋白質(zhì)三者成為構(gòu)成各種生命形式必要的三大高分子物質(zhì)。并且，目前已知許多病毒編碼遺傳信息并不是貯存與DNA上，而是記錄于單鏈的RNA上為其基因組。

有研究表明，許多嚴(yán)重的疾病跟RNA行為異常有關(guān)。神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆癥，作為一種復(fù)雜的神經(jīng)性紊亂，已證明與蛋白質(zhì)和RNA分子之間的相互作用有關(guān)；線粒體RNA代謝若發(fā)生缺陷則有可能發(fā)展為心肌癥、線粒體肌癥及鐵粒幼紅細(xì)胞性貧血等；癌癥的發(fā)生也與RNA的異常轉(zhuǎn)錄與表達(dá)有關(guān)。因此，檢測(cè)RNA分子在不同狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的其情況成為這些重大疾病病理學(xué)研究的一大熱點(diǎn)，這些研究對(duì)醫(yī)療診斷具有重要意義，截至目前，在這一方向，人們已經(jīng)取得了一定成果，一些核酸熒光探針以其在細(xì)胞中進(jìn)行成像的突出優(yōu)點(diǎn)被逐漸開發(fā)出來(Stevens N.,O’Connor N.A.,Vishwasra H.,et al.,J.Am.Chem.Soc.,2008,130,7182-7183.O’Connor N.A.,Stevens N.,Samaroo D.,et al.,Chem.Commun.,2009,2640-2642.Li Z.,Sun S.,Yang Z.,et al.,Biomaterials,2013,34,6473-6481.Song G.,Miao F.,Sun Y.,et al.,Sens.Actuators B Chem.,2012,173,329-337.Liu Y.,Zhang W.,Sun Y.,et al.,Dyes and Pigments,2014,103,191-201.)。但是，當(dāng)前報(bào)道的探針中，普遍存在染色濃度大，孵育時(shí)間長(zhǎng)，探針細(xì)胞毒性大等尚待改進(jìn)的不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開一類噁嗪類化合物在制備近紅外熒光探針中的應(yīng)用，所述的噁嗪類化合物具有通式F的結(jié)構(gòu)：

通式F中，

所述的R₁、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫和C_1-20的取代或未取代烷基；

所述的取代烷基由下述基團(tuán)任意取代：鹵素、羥基、烷氧基(醚)、醛基、羰基、胺基、羧基、酯基、酰胺基、硝基或磺酸基；

所述的X選自磷酸根，硫酸根，硫酸氫根，硝酸根，氯負(fù)離子，溴負(fù)離子，碘負(fù)離子或高氯酸根。

本發(fā)明中所述及的具有通式F的噁嗪類化合物對(duì)RNA分子具有特異性響應(yīng)，能夠快速進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞核內(nèi)RNA分子迅速結(jié)合并發(fā)出較強(qiáng)信號(hào)的熒光。無(wú)論在體外實(shí)驗(yàn)還是在固定細(xì)胞或活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，均對(duì)RNA體現(xiàn)較好的專一性識(shí)別標(biāo)記。進(jìn)一步通過一系列性能測(cè)試，發(fā)現(xiàn)該探針分子在水體系中具有近紅外的最大吸收波長(zhǎng)(約665nm)及最大發(fā)射波長(zhǎng)(約695nm)，長(zhǎng)波長(zhǎng)的激發(fā)及發(fā)射波長(zhǎng)光能量較低，對(duì)組織細(xì)胞的損傷較小，并且光透過性好，組織細(xì)胞的自發(fā)熒光對(duì)其干擾較小。并且在多種不同的有機(jī)溶劑中的熒光量子產(chǎn)量與其相應(yīng)的熒光強(qiáng)度相應(yīng)。所述的化合物具有一定水平的水溶性，同時(shí)具有良好的細(xì)胞膜通透性，并且生物毒性、光毒性、光漂白性均較低。其光譜范圍與生物樣品的光譜范圍有足夠大的差異。再者，所述化合物具有較好的光穩(wěn)定性、也能夠在生理pH值條件下穩(wěn)定存在，有利于其應(yīng)用于生物體內(nèi)發(fā)揮熒光探針功能。本發(fā)明也是基于此將所述的具有通式F的噁嗪類化合物應(yīng)用于制備近紅外熒光探針，該近紅外熒光探針產(chǎn)品可以僅僅包含通式F的噁嗪類化合物中的一種或多種，或者含有所述噁嗪類化合物的混合物，也可以是包括所述噁嗪類化合物及檢測(cè)用試劑的試劑盒。

附圖說明

本發(fā)明附圖12幅：

圖1是探針化合物F-1的結(jié)構(gòu)式。

圖2是探針化合物F-1在乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果(實(shí)施例2)。將F-1-DMSO溶液加入到含有2mL培養(yǎng)基的MCF-7細(xì)胞中震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。圖2(a)F-1通道；圖2(b)為細(xì)胞明場(chǎng)圖；圖2(c)為(a)與(b)混合通道。

圖3是探針化合物F-1在活體昆明鼠中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例3)?；铙w昆明鼠注射10％水合氯醛(10mg/Kg)麻醉，再吸入適量異氟醚加深麻醉并輕度抑制呼吸(將運(yùn)動(dòng)及呼吸偽影減少到最低)，F(xiàn)-1-DMSO溶液用純PBS稀釋1000倍后注射入活體昆明鼠腹部。將活體昆明鼠置于小動(dòng)物成像儀中，采取仰臥位置于固定板上進(jìn)行成像。

圖4是探針化合物F-2在體外PBS中對(duì)RNA的響應(yīng)(實(shí)施例5)。將F-2-DMSO溶液加入到含有不同濃度酵母RNA與小牛胸腺DNA的PBS溶液中，振蕩，分別測(cè)試溶液的熒光強(qiáng)度。以核酸含量為橫坐標(biāo)，溶液熒光強(qiáng)度與對(duì)照溶液(F-2-DMSO溶液加入PBS中)熒光強(qiáng)度的比值為縱坐標(biāo)作圖。

圖5是探針化合物F-2在肝癌細(xì)胞(HepG2)中標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例6)。將F-2-DMSO溶液加入到含有培養(yǎng)基的HepG2細(xì)胞中(細(xì)胞預(yù)先在37℃，5％CO₂下將加入商業(yè)化染料Hoechst-33342與商業(yè)化染料RNASelect^TM于培養(yǎng)基中孵育20分鐘。然后，PBS震蕩漂洗5min×3，再加入細(xì)胞培養(yǎng)基)震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。圖5(a)為商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖5(b)為商業(yè)化染料RNASelect^TM通道；圖5(c)為F-2通道；圖5(d)為(a)與(b)混合通道；圖5(e)為(a)與(c)混合通道；圖5(f)為(b)與(c)混合通道。

圖6為探針化合物F-2在饑餓培養(yǎng)肝癌細(xì)胞(HepG2)中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例7)。將F-2-DMSO溶液分別加入到含有培養(yǎng)基的正常培養(yǎng)(10％FBS，12h)與饑餓培養(yǎng)(1％FBS，12h)的HepG2細(xì)胞中(細(xì)胞預(yù)先在37℃，5％CO₂下將加入商業(yè)化染料Hoechst-33342于培養(yǎng)基中孵育20分鐘。然后，PBS震蕩漂洗5min×3，再加入細(xì)胞培養(yǎng)基)震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。圖6(a)為正常培養(yǎng)細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖6(b)為正常培養(yǎng)細(xì)胞的F-2通道；圖6(c)為(a)與(b)混合通道；圖6(d)為饑餓培養(yǎng)細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖6(e)為饑餓培養(yǎng)細(xì)胞的F-1通道；圖6(f)為(d)與(e)混合通道。

圖7為探針化合物F-2在Actinomycin D處理肝癌細(xì)胞(HepG2)中標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例8)。將F-2-DMSO溶液分別加入到含有2mL正常培養(yǎng)基與含Actinomycin D濃度為2μg/ml的培養(yǎng)基(孵育4h)的HepG2細(xì)胞中(細(xì)胞預(yù)先在37℃，5％CO₂下將加入商業(yè)化染料Hoechst-33342于培養(yǎng)基中孵育20分鐘。然后，PBS震蕩漂洗5min×3，再加入細(xì)胞培養(yǎng)基)震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。圖7(a)為正常培養(yǎng)細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖7(b)為正常培養(yǎng)細(xì)胞的F-2通道；圖7(c)為(a)與(b)混合通道；圖7(d)為Actinomycin D處理細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖7(e)為Actinomycin D處理細(xì)胞的F-2通道；圖7(f)為(d)與(e)混合通道。

圖8為探針化合物F-2在經(jīng)消化酶處理固定肝癌細(xì)胞(HepG2)中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例9)。將F-2-DMSO溶液分別加入含2mL PBS未經(jīng)消化酶處理和經(jīng)消化酶消化處理的固定細(xì)胞中(細(xì)胞預(yù)先在37℃，5％CO2下將加入商業(yè)化染料Hoechst-33342于培養(yǎng)基中孵育20分鐘。然后，PBS震蕩漂洗5min×3)震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。圖8(a)為未經(jīng)消化酶處理固定細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；8(b)為未經(jīng)消化酶處理固定細(xì)胞的F-2通道；圖8(c)為(a)與(b)混合通道；圖8(d)為經(jīng)DNA消化酶處理固定細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖8(e)為經(jīng)DNA消化酶處理固定細(xì)胞的F-2通道；圖8(f)為(d)與(e)混合通道；圖8(g)為經(jīng)RNA消化酶處理固定細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖8(h)為經(jīng)RNA消化酶處理固定細(xì)胞的F-2通道；圖8(i)為(g)與(h)混合通道。

圖9為探針化合物F-2在正常肝細(xì)胞(7702)中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例10)。將F-2-DMSO溶液分別加入到含有2mL培養(yǎng)基的7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中(細(xì)胞預(yù)先在37℃，5％CO₂下將加入商業(yè)化染料Hoechst-33342于培養(yǎng)基中孵育20分鐘。然后，PBS震蕩漂洗5min×3，再加入細(xì)胞培養(yǎng)基)震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。圖9(a)為HepG2細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖9(b)為HepG2細(xì)胞的F-2通道；圖9(c)為(a)與(b)混合通道；圖9(d)為7702細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖9(e)為7702細(xì)胞的F-2通道；圖9(f)為(d)與(e)混合通道。

圖10是探針化合物F-3在乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例12)。將F-3-DMSO溶液加入到含有2mL培養(yǎng)基的MCF-7細(xì)胞中震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。圖10(a)F-3通道；圖10(b)為細(xì)胞明場(chǎng)圖；圖10(c)為(a)與(b)混合通道。

圖11是探針化合物CM-1在體外PBS中對(duì)RNA的響應(yīng)(實(shí)施例14)。將CM-1-DMSO溶液加入到含有不同濃度酵母RNA與小牛胸腺DNA的PBS溶液中，振蕩，分別測(cè)試溶液的熒光強(qiáng)度。以核酸含量為橫坐標(biāo)，溶液熒光強(qiáng)度與對(duì)照溶液(CM-1-DMSO溶液加入PBS中)熒光強(qiáng)度的比值為縱坐標(biāo)作圖。

圖12是探針化合物CM-2在體外PBS中對(duì)RNA的響應(yīng)(實(shí)施例16)。將CM-2-DMSO溶液加入到含有不同濃度酵母RNA與小牛胸腺DNA的PBS溶液中，振蕩，分別測(cè)試溶液的熒光強(qiáng)度。以核酸含量為橫坐標(biāo)，溶液熒光強(qiáng)度與對(duì)照溶液(CM-2-DMSO溶液加入PBS中)熒光強(qiáng)度的比值為縱坐標(biāo)作圖。

具體實(shí)施方式

除另有說明外，本文中使用的術(shù)語(yǔ)具有以下含義。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“烷基”包括直鏈烷基和支鏈烷基。如提及單個(gè)烷基如“丙基”，則只特指直鏈烷基，如提及單個(gè)支鏈烷基如“異丙基”，則只特指支鏈烷基。例如，“C_1-6烷基”包括C_1-4烷基、C_1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。類似的規(guī)則也適用于本說明書中使用的其它基團(tuán)。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“鹵素”包括氟、氯、溴和碘。

本發(fā)明公開一類噁嗪類化合物在制備近紅外熒光探針中的應(yīng)用，所述的噁嗪類化合物具有通式F的結(jié)構(gòu)：

在現(xiàn)有技術(shù)中，盡管有類似化合物被報(bào)導(dǎo)過，但從未發(fā)現(xiàn)該類化合物具有特異的RNA染色特性。經(jīng)過研究，上述通式F所定義的化合物之所以能能夠?qū)崿F(xiàn)RNA的特異性染色，推測(cè)與其結(jié)構(gòu)有關(guān)：RNA中的堿基會(huì)與噁嗪環(huán)中的氮原子相結(jié)合形成穩(wěn)定的絡(luò)合物；而分子中的久洛尼定部分的兩個(gè)柔性碳骨架，由于其空間位阻較大，使分子不能進(jìn)入DNA(脫氧核糖核酸)的溝槽與DNA結(jié)合，故通式結(jié)構(gòu)內(nèi)的化合物分子具有良好的RNA選擇性。這也可用于解釋，為何結(jié)構(gòu)與通式F相似但不相同的化合物分子無(wú)法成功實(shí)現(xiàn)目標(biāo)RNA的標(biāo)記。

R₁、R₂和R₃可選擇的基團(tuán)范圍甚廣。其可以各自獨(dú)立地選自氫和C_1-20的取代或未取代烷基；這其中的烷基既包括直鏈烷基，也包括支鏈烷基；如選擇應(yīng)用于取代烷基，則所述的取代烷基可由下述基團(tuán)任意取代：鹵素、羥基、烷氧基、醛基、羰基、胺基、羧基、酯基、酰胺基、硝基或磺酸基。更為具體的實(shí)施方式中，上述通式F中所述的R₁、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫和C_1-14的取代或未取代烷基。更優(yōu)選自氫和C_1-10的取代或未取代烷基。

另一具體的實(shí)施方式中，通式F中所述的R₁和R₂的其中之一是氫。

更加優(yōu)選的，所述的R₃也是氫。

另一具體的實(shí)施方式中，上述本發(fā)明的應(yīng)用中，通式F中所述的X選自磷酸根，硫酸根，硫酸氫根，硝酸根，氯負(fù)離子，溴負(fù)離子，碘負(fù)離子或高氯酸根。

對(duì)各化合物的RNA特異性識(shí)別能力進(jìn)行甄別和比較的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供的最優(yōu)選的實(shí)施方式中，下述9個(gè)化合物在制備近紅外熒光探針中得以應(yīng)用，所述的化合物選自F-1、F-2、F-3、F-4、F-5、F-6、F-7、F-8和F-9：

本發(fā)明的噁嗪類化合物對(duì)RNA分子具有特異性響應(yīng)，能夠快速進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞核內(nèi)RNA分子迅速結(jié)合并發(fā)出較強(qiáng)信號(hào)的熒光。無(wú)論在體外實(shí)驗(yàn)還是在固定細(xì)胞或活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，均對(duì)RNA體現(xiàn)較好的專一性識(shí)別標(biāo)記。進(jìn)一步通過一系列性能測(cè)試，發(fā)現(xiàn)該探針分子在水體系中具有近紅外的最大吸收波長(zhǎng)(約665nm)及最大發(fā)射波長(zhǎng)(約695nm)，長(zhǎng)波長(zhǎng)的激發(fā)及發(fā)射波長(zhǎng)光能量較低，對(duì)組織細(xì)胞的損傷較小，并且光透過性好，組織細(xì)胞的自發(fā)熒光對(duì)其干擾較小。并且在多種不同的有機(jī)溶劑中的熒光量子產(chǎn)量與其相應(yīng)的熒光強(qiáng)度相應(yīng)。并且該類化合物具有一定水平的水溶性，同時(shí)具有良好的細(xì)胞膜通透性，并且生物毒性、光毒性、光漂白性均較低。其光譜范圍與生物樣品的光譜范圍有足夠大的差異。再者，該類化合物具有較好的光穩(wěn)定性、也能夠在生理pH值條件下穩(wěn)定存在，有利于其應(yīng)用于生物體內(nèi)發(fā)揮熒光探針功能。

基于此，本發(fā)明所述的應(yīng)用更為具體的實(shí)施方式是將本發(fā)明所述的噁嗪類化合物用于制備RNA靶向熒光探針類的近紅外熒光探針產(chǎn)品，用于細(xì)胞或組織中RNA的熒光成像。

上文中所述及的具有通式F的化合物，其制備方法已為現(xiàn)有技術(shù)所公開，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠結(jié)合相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)信息及有機(jī)合成的基本理論和技術(shù)來完成本發(fā)明所述化合物的獲得。本說明書中描述的下述噁嗪類化合物的制備方法提供該類化合物合成的一種具體方案，但不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)其的限定。

本發(fā)明中所述及的噁嗪類化合物通過下述方法合成：使用芳胺或其衍生物形成的偶氮化合物與8-羥基久洛尼定在含酸DMF中縮合，制備得到目標(biāo)噁嗪染料。該合成方法工藝簡(jiǎn)潔，轉(zhuǎn)化率高。更為具體的，本發(fā)明通式化合物F合成路線可以表示為：

上述路線所表示的通式F的化合物的制備方法包括如下步驟：

(1)鹽酸酸化體系中，氯化對(duì)硝基重氮苯與式I的化合物按照摩爾比1:1在25～35℃條件下反應(yīng)0.5～2小時(shí)，制備式II化合物；

(2)式II化合物與8-羥基久洛里啶按照摩爾比1:1在酸性DMF中于135～145℃條件下反應(yīng)2～4小時(shí)制備通式F的化合物。

本發(fā)明所述的以噁嗪為母體的近紅外熒光探針具備以下優(yōu)點(diǎn)：

所述化合物具有一定水平的水溶性，同時(shí)具有良好的細(xì)胞膜通透性。

所述化合物對(duì)于RNA分子具有專一性、特異性識(shí)別；

所述化合物具有優(yōu)異的熒光性能，應(yīng)用于生物樣品成像時(shí)具有低的生物光漂白、光損傷和生物毒性，并且產(chǎn)生的熒光信號(hào)可以穿透較深的生物組織；

所述化合物部分分子的熒光發(fā)射波長(zhǎng)大于600nm，可用于動(dòng)物活體成像；

所述化合物用于腫瘤與腫瘤細(xì)胞和組織的標(biāo)記，可以實(shí)現(xiàn)很好的RNA標(biāo)記，并能避免外在的環(huán)境因素對(duì)熒光強(qiáng)度的干擾；

所述化合物毒副性小，原料易得，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于制備，易產(chǎn)業(yè)化；

鑒于此，本發(fā)明所述的近紅外熒光探針化合物可用于腫瘤與非腫瘤細(xì)胞和組織標(biāo)記。除了以本文中所述的形式直接用于腫瘤與非腫瘤細(xì)胞和組織的染色外，含有本發(fā)明的近紅外熒光探針化合物的組合物也可以用于腫瘤細(xì)胞和組織的染色。所述組合物中應(yīng)當(dāng)包含有效量的本發(fā)明所提供的雙光子熒光探針化合物之一。另外，還可以包含生物樣品染色所需要的其它組分，例如溶劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些組分都是本行業(yè)內(nèi)已知的。上述組合物可以以水溶液形式存在，或者可以以臨用前用水配制為溶液的其它合適形式存在。

本發(fā)明還提供使用上述本發(fā)明的近紅外熒光探針化合物標(biāo)記腫瘤細(xì)胞和組織生物樣品的方法，該方法包括使所述化合物與生物樣品接觸的步驟。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“接觸”可包括在溶液或固相中接觸。

下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：制備探針化合物F-1

(1)中間體1-II的合成

鹽酸酸化體系中，氯化對(duì)硝基重氮苯與1-I的化合物按照摩爾比1:1在25～35℃條件下反應(yīng)0.5～2小時(shí)，反應(yīng)完畢，經(jīng)過抽濾洗滌操作后得到磚紅色固體粉末粗產(chǎn)品得式1-II的化合物，收率95％。

(2)化合物F-1的合成

將上述反應(yīng)(1)制備得到的中間體1-II與8-羥基久洛里定加入到含有DMF的圓底燒瓶中，滴入1mL高氯酸溶液。滴加完畢，體系攪拌2.5h后停止反應(yīng)，經(jīng)柱色譜分離提純得具金屬光澤的深藍(lán)色針狀晶體目標(biāo)探針化合物F-1，收率78.2％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.40(d,J＝5.3Hz,1H),8.64(d,J＝8.0Hz,1H),8.42(d,J＝8.3Hz,1H),7.88(t,J＝7.6Hz,1H),7.79(t,J＝7.6Hz,1H),7.38(s,1H),6.93(s,1H),5.08(t,J＝4.9Hz,1H),3.82–3.67(m,4H),3.58(d,J＝4.7Hz,4H),2.83(dt,J＝12.2,5.9Hz,4H),1.98(d,J＝4.8Hz,4H).

實(shí)施例2：探針化合物F-1在乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

使用實(shí)施例1中合成的化合物F-1，將F-1-DMSO溶液加入到含有2mL培養(yǎng)基的MCF-7細(xì)胞中震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。結(jié)果如圖2所示，其中：圖2(a)F-1通道；圖2(b)為細(xì)胞明場(chǎng)圖；圖2(c)為(a)與(b)混合通道?？梢奆-1分子能夠?qū)?xì)胞著色。

實(shí)施例3：探針化合物F-1在活體昆明鼠中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

活體昆明鼠注射10％水合氯醛(10mg/Kg)麻醉，再吸入適量異氟醚加深麻醉并輕度抑制呼吸(將運(yùn)動(dòng)及呼吸偽影減少到最低)，F(xiàn)-1-DMSO溶液用純PBS稀釋1000倍后注射入活體昆明鼠腹部。將活體昆明鼠置于小動(dòng)物成像儀中，采取仰臥位置于固定板上進(jìn)行成像。結(jié)果如圖3所示，可見F-1分子能夠?qū)铙w生物樣本著色成像。

實(shí)施例4：制備探針化合物F-2

(1)中間體2-II的合成

鹽酸酸化體系中，氯化對(duì)硝基重氮苯與2-I的化合物按照摩爾比1:1在25～35℃條件下反應(yīng)0.5～2小時(shí)，反應(yīng)完畢，經(jīng)過抽濾洗滌操作后得到磚紅色固體粉末粗產(chǎn)品得式2-II的化合物，收率95％。

(2)化合物F-2的合成

將上述反應(yīng)(1)制備得到的中間體2-II與8-羥基久洛里定加入到含有DMF的圓底燒瓶中，滴入1mL高氯酸溶液。滴加完畢，體系攪拌2.5h后停止反應(yīng)，經(jīng)柱色譜分離提純得具金屬光澤的深藍(lán)色針狀晶體目標(biāo)探針化合物F-2，收率74.4％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.17(s,1H),8.38(d,J＝8.1Hz,1H),8.23(d,J＝8.3Hz,1H),7.77(t,J＝7.5Hz,1H),7.68(t,J＝7.6Hz,1H),7.09(s,1H),6.58(s,1H),3.54(d,J＝5.7Hz,6H),2.78(t,J＝5.9Hz,2H),2.61(t,J＝5.9Hz,2H),1.94(d,J＝5.1Hz,4H),1.35(t,J＝7.1Hz,3H).

實(shí)施例5：探針化合物F-2在體外PBS中對(duì)RNA的響應(yīng)

使用實(shí)施例4合成的化合物F-2，將F-2-DMSO溶液分別加入到含有不同濃度酵母RNA與小牛胸腺DNA的PBS溶液中，振蕩，分別測(cè)試溶液的熒光強(qiáng)度。以核酸含量為橫坐標(biāo)，溶液熒光強(qiáng)度與對(duì)照溶液(F-2-DMSO溶液加入到純PBS中)熒光強(qiáng)度的比值為縱坐標(biāo)作圖，如圖4所示，可見化合物F-2對(duì)RNA有較好的響應(yīng)，對(duì)DNA不響應(yīng)。

實(shí)施例6：探針化合物F-2在肝癌細(xì)胞(HepG2)中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

使用實(shí)施例4合成的化合物F-2，將F-2-DMSO溶液加入到含有培養(yǎng)基的HepG2細(xì)胞中(細(xì)胞預(yù)先在37℃，5％CO₂下將加入商業(yè)化染料Hoechst-33342與商業(yè)化染料RNASelect^TM于培養(yǎng)基中孵育20分鐘。然后，PBS震蕩漂洗5min×3，再加入細(xì)胞培養(yǎng)基)震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。結(jié)果如圖5所示，圖5(a)為商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖5(b)為商業(yè)化染料RNASelect^TM通道；圖5(c)為F-2通道；圖5(d)為(a)與(b)混合通道；圖5(e)為(a)與(c)混合通道；圖5(f)為(b)與(c)混合通道?？梢奆-2分子能夠?qū)?xì)胞著色。

實(shí)施例7：探針化合物F-2在饑餓培養(yǎng)肝癌細(xì)胞(HepG2)中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

使用實(shí)施例4合成的化合物F-2，將F-2-DMSO溶液分別加入到含有培養(yǎng)基的正常培養(yǎng)(10％FBS，12h)與饑餓培養(yǎng)(1％FBS，12h)的HepG2細(xì)胞中(細(xì)胞預(yù)先在37℃，5％CO₂下將加入商業(yè)化染料Hoechst-33342于培養(yǎng)基中孵育20分鐘。然后，PBS震蕩漂洗5min×3，再加入細(xì)胞培養(yǎng)基)震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。結(jié)果如圖6，其中：圖6(a)為正常培養(yǎng)細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖6(b)為正常培養(yǎng)細(xì)胞的F-2通道；圖6(c)為(a)與(b)混合通道；圖6(d)為饑餓培養(yǎng)細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖6(e)為饑餓培養(yǎng)細(xì)胞的F-1通道；圖6(f)為(d)與(e)混合通道。可見饑餓細(xì)胞中RNA分布與含量均少于正常培養(yǎng)細(xì)胞中的RNA。

實(shí)施例8：探針化合物F-2在Actinomycin D處理肝癌細(xì)胞(HepG2)中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

使用實(shí)施例4合成的化合物F-2，將F-2-DMSO溶液分別加入到含有2mL正常培養(yǎng)基與含Actinomycin D濃度為2μg/ml的培養(yǎng)基(孵育4h)的HepG2細(xì)胞中(細(xì)胞預(yù)先在37℃，5％CO₂下將加入商業(yè)化染料Hoechst-33342于培養(yǎng)基中孵育20分鐘。然后，PBS震蕩漂洗5min×3，再加入細(xì)胞培養(yǎng)基)震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。結(jié)果如圖7所示，其中：圖7(a)為正常培養(yǎng)細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖7(b)為正常培養(yǎng)細(xì)胞的F-2通道；圖7(c)為(a)與(b)混合通道；圖7(d)為Actinomycin D處理細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖7(e)為Actinomycin D處理細(xì)胞的F-2通道；圖7(f)為(d)與(e)混合通道?？梢夾ctinomycin D處理細(xì)胞中RNA分布與含量均少于正常培養(yǎng)細(xì)胞中的RNA。

實(shí)施例9：探針化合物F-2在經(jīng)消化酶處理固定肝癌細(xì)胞(HepG2)中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

對(duì)于固定細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞先要用4％的甲醛處理。在對(duì)比DNA和RNA選擇性的測(cè)試中，DNA水解酶和RNA水解酶分別與固定細(xì)胞在37℃條件下孵育。隨后，PBS緩沖液洗去水解酶，用于染色。

使用實(shí)施例4合成的化合物F-2，將F-2-DMSO溶液分別加入含2mL PBS未經(jīng)消化酶處理和經(jīng)消化酶消化處理的固定細(xì)胞中(細(xì)胞預(yù)先在37℃，5％CO2下將加入商業(yè)化染料Hoechst-33342于培養(yǎng)基中孵育20分鐘。然后，PBS震蕩漂洗5min×3)震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。結(jié)果如圖8所示，其中：圖8(a)為未經(jīng)消化酶處理固定細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；8(b)為未經(jīng)消化酶處理固定細(xì)胞的F-2通道；圖8(c)為(a)與(b)混合通道；圖8(d)為經(jīng)DNA消化酶處理固定細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖8(e)為經(jīng)DNA消化酶處理固定細(xì)胞的F-2通道；圖8(f)為(d)與(e)混合通道；圖8(g)為經(jīng)RNA消化酶處理固定細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖8(h)為經(jīng)RNA消化酶處理固定細(xì)胞的F-2通道；圖8(i)為(g)與(h)混合通道?？梢奆-2能夠?qū)潭?xì)胞著色。

實(shí)施例10：探針化合物F-2在正常肝細(xì)胞(7702)中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

使用實(shí)施例4合成的化合物F-2，將F-2-DMSO溶液分別加入到含有2mL培養(yǎng)基的7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中(細(xì)胞預(yù)先在37℃，5％CO₂下將加入商業(yè)化染料Hoechst-33342于培養(yǎng)基中孵育20分鐘。然后，PBS震蕩漂洗5min×3，再加入細(xì)胞培養(yǎng)基)震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。結(jié)果如圖9所示，其中：圖9(a)為HepG2細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖9(b)為HepG2細(xì)胞的F-2通道；圖9(c)為(a)與(b)混合通道；圖9(d)為7702細(xì)胞的商業(yè)化染料Hoechst-33342通道；圖9(e)為7702細(xì)胞的F-2通道；圖9(f)為(d)與(e)混合通道?？梢娬＜?xì)胞中RNA分布與含量均少于癌細(xì)胞中的RNA。

實(shí)施例11：制備尼羅蘭衍生物F-3

(1)中間體3-II的合成

鹽酸酸化體系中，氯化對(duì)硝基重氮苯與3-I的化合物按照摩爾比1:1在25～35℃條件下反應(yīng)0.5～2小時(shí)，反應(yīng)完畢，經(jīng)過抽濾洗滌操作后得到磚紅色固體粉末粗產(chǎn)品得式3-II的化合物，收率94％。

(2)化合物F-3的合成

將上述反應(yīng)(1)制備得到的中間體3-II與8-羥基久洛里定加入到含有DMF的圓底燒瓶中，滴入1mL高氯酸溶液。滴加完畢，體系攪拌2.5h后停止反應(yīng)，經(jīng)柱色譜分離提純得具金屬光澤的深藍(lán)色針狀晶體目標(biāo)探針化合物F-3，收率55.9％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.33(s,1H),8.61(d,J＝8.1Hz,1H),8.39(d,J＝8.3Hz,1H),7.87(t,J＝7.6Hz,1H),7.77(t,J＝7.6Hz,1H),7.34(s,1H),6.86(s,1H),4.06(q,J＝7.1Hz,2H),3.58(s,6H),3.35(s,1H),2.94–2.69(m,4H),2.35(t,J＝7.3Hz,2H),1.97(d,J＝4.4Hz,4H),1.75(dd,J＝14.4,7.2Hz,2H),1.63(dd,J＝14.8,7.3Hz,2H),1.54–1.39(m,2H),1.17(t,J＝7.1Hz,3H).

實(shí)施例12：探針化合物F-3在乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)中的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

使用實(shí)施例11合成的化合物F-3，將F-3-DMSO溶液加入到含有2mL培養(yǎng)基的MCF-7細(xì)胞中震蕩，用激光共聚焦顯微鏡成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。如圖10所示，其中：圖10(a)F-3通道；圖10(b)為細(xì)

胞明場(chǎng)圖；圖10(c)為(a)與(b)混合通道?？梢奆-3分子能夠?qū)?xì)胞著色。

實(shí)施例13：制備對(duì)比化合物CM-1

將中間體2-II與N,N-二甲基對(duì)氨基苯酚加入到含有DMF的圓底燒瓶中，滴入1mL高氯酸溶液。滴加完畢，體系攪拌2.5h后停止反應(yīng)，經(jīng)柱色譜分離提純得具金屬光澤的深藍(lán)色針狀晶體目標(biāo)探針化合物CM-1，收率45.9％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.17(s,1H),8.38(d,J＝8.1Hz,1H),8.23(d,J＝8.3Hz,1H),7.77(t,J＝7.5Hz,1H),7.68(t,J＝7.6Hz,1H),7.09(s,1H),6.58(s,1H),3.54(q,J＝7.2Hz,2H),2.85(s,6H)1.35(t,J＝7.1Hz,3H).

實(shí)施例14：對(duì)比化合物CM-1在體外PBS中對(duì)RNA的響應(yīng)

使用實(shí)施例13合成的化合物CM-1，將CM-1-DMSO溶液分別加入到含有不同濃度酵母RNA與小牛胸腺DNA的PBS溶液中，振蕩，分別測(cè)試溶液的熒光強(qiáng)度。以核酸含量為橫坐標(biāo)，溶液熒光強(qiáng)度與對(duì)照溶液(CM-1-DMSO溶液加入到純PBS中)熒光強(qiáng)度的比值為縱坐標(biāo)作圖，如圖11所示，可見對(duì)比化合物CM-1對(duì)RNA與DNA不具備區(qū)分性能。

實(shí)施例15：制備對(duì)比化合物CM-2

將中間體2-II與N,N-二甲基對(duì)氨基苯酚加入到含有DMF的圓底燒瓶中，滴入1mL高氯酸溶液。滴加完畢，體系攪拌2.5h后停止反應(yīng)，經(jīng)柱色譜分離提純得具金屬光澤的深藍(lán)色針狀晶體目標(biāo)探針化合物CM-2，收率53.7％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.17(s,1H),8.38(d,J＝8.1Hz,1H),8.23(d,J＝8.3Hz,1H),7.77(t,J＝7.5Hz,1H),7.68(t,J＝7.6Hz,1H),7.09(s,1H),6.58(s,1H),3.58(m,4H),1.38(m,9H).

實(shí)施例16：對(duì)比化合物CM-2在體外PBS中對(duì)RNA的響應(yīng)

使用實(shí)施例15合成的化合物CM-2，將CM-2-DMSO溶液分別加入到含有不同濃度酵母RNA與小牛胸腺DNA的PBS溶液中，振蕩，分別測(cè)試溶液的熒光強(qiáng)度。以核酸含量為橫坐標(biāo)，溶液熒光強(qiáng)度與對(duì)照溶液(CM-2-DMSO溶液加入到純PBS中)熒光強(qiáng)度的比值為縱坐標(biāo)作圖，如圖12所示，可見對(duì)比化合物CM-2對(duì)RNA與DNA不具備區(qū)分性能。

實(shí)施例17：化合物F-4至F-9分別測(cè)試在體外PBS中對(duì)RNA的響應(yīng)

參照化合物F通式的合成方法，選用相應(yīng)取代基的中間原料物，制備化合物F-4至F-9。將制備得到化合物的DMSO溶液分別加入到含有不同濃度酵母RNA與小牛胸腺DNA的PBS溶液中，振蕩，分別測(cè)試溶液的熒光強(qiáng)度，可見對(duì)比化合物F-4至F-9對(duì)RNA具有響應(yīng)效果。