本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物領(lǐng)域，具體涉及五個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類化合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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長期以來，惡性腫瘤已成為嚴(yán)重危害人類生命和生活質(zhì)量的主要疾病之一。據(jù)報(bào)道，惡性腫瘤已經(jīng)成為我國居民首要死因，而且，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人們對(duì)環(huán)境保護(hù)的不力，惡性腫瘤的致死率還在不斷增長。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2020年，將有2000萬新發(fā)惡性腫瘤病例，其中死亡人數(shù)達(dá)1200萬，且絕大部分將發(fā)生在發(fā)展中國家。對(duì)于惡性腫瘤的治療，天然產(chǎn)物及其衍生物藥物發(fā)揮著重要作用。據(jù)報(bào)道，1981年到2008年間，天然產(chǎn)物來源的抗腫瘤藥物占上市抗腫瘤藥物的60％以上，而且，新型天然產(chǎn)物及其衍生物作為新的抗腫瘤藥物所占數(shù)量還在不斷增加。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供五個(gè)具有抗腫瘤活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物及其藥用鹽。

本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯類化合物或其藥用鹽，其結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)所示：

式(Ⅰ)中，化合物1：β-OH；或化合物2：α-OH；或式(Ⅱ)中，化合物3：β-OH；或化合物4：α-OH；或式(Ⅲ)中，化合物5。

本發(fā)明人通過對(duì)海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89發(fā)酵提取物的HPLC-DAD圖譜分析，發(fā)現(xiàn)其所產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物紫外吸收特征鮮明，通過搖床放大發(fā)酵和提取純化，得到5個(gè)紫外吸收基本一致的同類化合物。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析，其被確定為大環(huán)內(nèi)酯類化合物，具體結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)所示，化合物1：β-OH；或化合物2：α-OH；或式(Ⅱ)中，化合物3：β-OH；或化合物4：α-OH；或式(Ⅲ)中，化合物5。

通過對(duì)化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)化合物1-5對(duì)人肺癌(A549)、人鼻咽癌(CNE2)、人宮頸癌(HeLa)、人肝癌(HepG2)、人乳腺癌(MCF-7)具有明顯抑制作用。

因此，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供化合物1、化合物2、化合物3、化合物4或化合物5在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選，所述的抗腫瘤藥物為抗人肺癌、人鼻咽癌、人宮頸癌、人肝癌或人乳腺癌的藥物。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種抗腫瘤藥物，其特征在于，包括有效量的作為活性成份的如式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)所示的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4或化合物5，或其藥用鹽，和藥學(xué)上可以接受的載體。

優(yōu)選，所述的抗腫瘤藥物為抗人肺癌、人鼻咽癌、人宮頸癌、人肝癌或人乳腺癌的藥物。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種制備化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的方法，其特征在于，所述的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5是從海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89的發(fā)酵產(chǎn)物中制備分離得到的。

優(yōu)選，具體步驟如下：

A、制備海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89的發(fā)酵產(chǎn)物；

B、將海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行離心分離，獲得發(fā)酵液和菌絲體，發(fā)酵液用丁酮萃取，丁酮萃取液濃縮得發(fā)酵液浸膏；菌絲體用丙酮萃取，丙酮萃取液經(jīng)濃縮得菌體浸膏，該浸膏用硅膠分離，采用氯仿/甲醇從100/0,98/2,96/4,94/6,92/8,90/10,80/20,50/50,0/100,v/v梯度洗脫順序得9個(gè)組分A1-A9；

氯仿/甲醇94/6洗脫得餾份-組分A4用氯仿/甲醇100/0,98/2,96/4,94/6,92/8,90/10,v/v梯度洗脫順序得6個(gè)組分B1-B6，氯仿/甲醇96/4洗脫得餾份-組分B3用氯仿/甲醇100/0,98/2,96/4,94/6,92/8,v/v得5個(gè)組分C1-C5；

氯仿/甲醇92/8洗脫得餾份-組分A5、氯仿/甲醇94/6洗脫得餾份-B4合并，然后用石油醚/乙酸乙酯P/E，80/20,70/30,60/40,55/45,50/50,40/60,30/70,20/80,v/v梯度洗脫順序得到組分D1-D8，合并氯仿/甲醇94/6洗脫得餾份-組分C4、石油醚/乙酸乙酯40/60洗脫得餾份-D6和石油醚/乙酸乙酯30/70洗脫得餾份-D7，經(jīng)高效液相純化得到化合物5，合并組分氯仿/甲醇98/2洗脫得餾份-C2和氯仿/甲醇96/4洗脫得餾份-組分C3，經(jīng)高效液相純化得到化合物1、化合物4、化合物3和化合物2。

所述的制備海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89的發(fā)酵產(chǎn)物是以海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89作為發(fā)酵菌株在放大發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89的發(fā)酵產(chǎn)物；所述的放大發(fā)酵培養(yǎng)基，按總質(zhì)量分?jǐn)?shù)100％計(jì)，包括可溶性淀粉0.5％，大豆粉0.5％，葡萄糖2％，酵母膏0.2％，蛋白胨0.2％，K₂HPO₄0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NaCl 0.4％，CaCO₃ 0.2％，粗海鹽3％，pH 7.2-7.4，余量為水。

本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯類化合物-化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用，可以用于制備抗腫瘤藥物，用于治療腫瘤，因此本發(fā)明為開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了備選化合物，對(duì)開發(fā)中國海洋藥物資源具有重要的意義。

本發(fā)明的海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89于2016年11月22日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所，其保藏編號(hào)為：CGMCC NO.13322。

附圖說明：

圖1是化合物2-5的¹H-¹H COSY和部分HMBC相關(guān)信息，其中2代表化合物2，3代表化合物3，4代表化合物4，5代表化合物5。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

如式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)所示的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4或化合物5的制備和結(jié)構(gòu)鑒定

一、如式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)所示的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4或化合物5的制備

1.種子培養(yǎng)：

(1)種子培養(yǎng)基配方：按質(zhì)量分?jǐn)?shù)100％計(jì)，包括可溶性淀粉0.5％，大豆粉0.5％，葡萄糖2％，酵母膏0.2％，蛋白胨0.2％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NaCl 0.4％，CaCO₃ 0.2％，粗海鹽3％，pH 7.2-7.4，余量為水。按照配方將上述物質(zhì)混合在一起，配好后分裝于250mL的錐形瓶中，每瓶裝50mL，121℃滅菌20分鐘，做為備用的種子培養(yǎng)基。

(2)種子的培養(yǎng)：將海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89的菌絲體或孢子接入到上述種子培養(yǎng)基中，以200rpm的轉(zhuǎn)速、在28℃下、搖床培養(yǎng)36小時(shí)得種子培養(yǎng)液。

2.放大發(fā)酵培養(yǎng)：

(1)放大發(fā)酵培養(yǎng)基配方：按總質(zhì)量分?jǐn)?shù)100％計(jì)，包括可溶性淀粉0.5％，大豆粉0.5％，葡萄糖2％，酵母膏0.2％，蛋白胨0.2％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NaCl 0.4％，CaCO₃ 0.2％，粗海鹽3％，pH 7.2-7.4，余量為水。按照配方將上述物質(zhì)混合在一起，分批配好后共計(jì)21.8L放大發(fā)酵培養(yǎng)基，配好后分裝于1000mL的錐形瓶中，每瓶裝200mL，121℃滅菌20分鐘，做為備用的放大發(fā)酵培養(yǎng)基。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)：

在無菌操作下，將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液分別接種于放大發(fā)酵培養(yǎng)基中，每1000ml錐形瓶(含200mL放大發(fā)酵培養(yǎng)基)接種一瓶種子培養(yǎng)液(50mL)。每50ml種子培養(yǎng)液接入裝有200mL放大發(fā)酵培養(yǎng)基的1000mL錐形瓶中，以200rpm的轉(zhuǎn)速、在28℃下、搖床培養(yǎng)7天得海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89發(fā)酵產(chǎn)物。

3.提取分離：

將上述海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89發(fā)酵產(chǎn)物，以3600rpm離心，得上清發(fā)酵液和沉淀菌絲體。上清發(fā)酵液用丁酮等體積萃取3次，丁酮萃取液在低于40℃減壓濃縮得發(fā)酵液浸膏；沉淀菌絲體用共計(jì)3L丙酮反復(fù)萃取三次，丙酮萃取液在低于40℃下減壓濃縮得菌體浸膏；經(jīng)HPLC-DAD檢測(cè)后，合并發(fā)酵液浸膏和菌體浸膏共計(jì)得約31.22g浸膏。該浸膏用100-200目硅膠分離，經(jīng)拌樣、干法裝柱后，采用氯仿/甲醇(100/0,98/2,96/4,94/6,92/8,90/10,80/20,50/50,0/100,v/v)梯度洗脫順序得9個(gè)組分(A1-A9)。組分A4(氯仿/甲醇94/6洗脫的餾份)用氯仿/甲醇(100/0,98/2,96/4,94/6,92/8,90/10,v/v)梯度洗脫順序得6個(gè)組分(B1-B6)。組分B3(氯仿/甲醇96/4洗脫的餾份)用氯仿/甲醇(100/0,98/2,96/4,94/6,92/8,v/v)得5個(gè)組分(C1-C5)。組分A5(氯仿/甲醇92/8洗脫的餾份)、B4(氯仿/甲醇94/6洗脫的餾份)合并，然后用石油醚/乙酸乙酯(P/E，80/20,70/30,60/40,55/45,50/50,40/60,30/70,20/80,v/v)梯度洗脫順序得到組分D1-D8。合并組分C4(氯仿/甲醇94/6洗脫的餾份)、D6(石油醚/乙酸乙酯40/60洗脫的餾份)和D7(石油醚/乙酸乙酯30/70洗脫的餾份)，以254nm波長做檢測(cè)、采用2.5ml/min的流速、以42/58(水/乙腈，v/v)用反相柱YMC-Pack ODS-A column(250×10mm,5μm)進(jìn)行半制備高壓液相分離(SP-HPLC)洗脫，在保留時(shí)間為26min得到化合物5(39.9mg)，同樣，合并組分C2(氯仿/甲醇98/2洗脫的餾份)-C3(氯仿/甲醇96/4洗脫的餾份)，以254nm波長做檢測(cè)、采用2.5ml/min的流速、以40/60(水/乙腈，v/v)用反相柱YMC-Pack ODS-A column(250×10mm,5μm)進(jìn)行半制備高壓液相分離(SP-HPLC)洗脫，將在17.8min、20.4min、22.7min、24.7min得到化合物1(139.1mg)、化合物4(3.7mg)、化合物3(3.6mg)和化合物2(14.3mg)。

二、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)化合物1、化合物2、化合物3和化合物4和化合物5進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析測(cè)試，得到以下理化性質(zhì)數(shù)據(jù)，其核磁數(shù)據(jù)如表1和2所示：

化合物1:白色無定形粉末；[α]²⁵_D-18.0(c12.1,ethanol)；(+)-HR-ESI-MS m/z490.3171[M+H]⁺(calcd for C₂₈H₄₄NO₆,490.3163)and 512.2986[M+Na]⁺(calcd for C₂₈H₄₃NNaO₆,512.2983)。

化合物2:白色無定形粉末；[α]²⁵_D+14.1(c 3.0,ethanol)；(+)-HR-ESI-MS m/z 490.3161[M+H]⁺(calcd for C₂₈H₄₄NO₆,490.3169)and 512.2987[M+Na]⁺(calcd for C₂₈H₄₃NNaO₆,512.2988)

化合物3:白色無定形粉末；[α]²⁵_D+41.1(c 2.6,ethanol)；(+)-HR-ESI-MS m/z 490.3162[M+H]⁺(calcd for C₂₈H₄₄NO₆,490.3163)and 512.2980[M+Na]⁺(calcd for C₂₈H₄₃NNaO₆,512.2983)

化合物4:白色無定形粉末；[α]²⁵_D-35.8(c 3.1,ethanol)；(+)-HR-ESI-MS m/z 490.3161[M+H]⁺(calcd for C₂₈H₄₄NO₆,490.3163)and 512.2986[M+Na]⁺(calcd for C₂₈H₄₃NNaO₆,512.2983)

化合物5:白色無定形粉末；[α]²⁵_D-4.7(c 8.8,ethanol)；(+)-HR-ESI-MS m/z536.3566[M+H]⁺(calcd for C₃₀H₅₀NO₇,536.3582)and 558.3389[M+Na]⁺(calcd for C₃₀H₄₉NNaO₇,558.3401)

表1：化合物1-3在CD₃OD.中的¹H(500MHz)和¹³C NMR(125HMz)數(shù)據(jù)

*Resonances overlapped

表2：化合物4-5在CD₃OD.中的¹H(500MHz)和¹³C NMR(125HMz)數(shù)據(jù)

化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的2D NMR相關(guān)信息如圖1所示：

根據(jù)以上理化數(shù)據(jù)分析可知，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的具體結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)和(Ⅱ)所示。

式(Ⅰ)中，化合物1：β-OH；或化合物2：α-OH；或式(Ⅱ)中，化合物3：β-OH；或化合物4：α-OH；或式(Ⅲ)中，化合物5。

實(shí)施例2：

對(duì)實(shí)施例1的大環(huán)內(nèi)酯類化合物-化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的抗腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。

采用國際通用的腫瘤細(xì)胞株，即：人肺癌細(xì)胞株(A549)、人鼻咽癌細(xì)胞株(CNE2)、人宮頸癌細(xì)胞株(HeLa)、人肝癌細(xì)胞株(HepG2)、人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)和正常人肝細(xì)胞(L02)和正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Huvect-12)。試驗(yàn)方法為CCK-8法：

1)細(xì)胞培養(yǎng)：根據(jù)細(xì)胞生長速度，將處于對(duì)數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞以100μL/孔接種于96孔板，貼壁生長24小時(shí)。

2)加樣品(藥品)：每孔加10μL不同濃度的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的培養(yǎng)基稀釋溶液，并設(shè)相應(yīng)濃度的培養(yǎng)基溶媒對(duì)照及無細(xì)胞凋零孔。

3)加藥細(xì)胞培養(yǎng)：腫瘤細(xì)胞在37℃、5％的CO₂條件下培養(yǎng)48小時(shí)。

4)活性測(cè)試：經(jīng)培養(yǎng)后的細(xì)胞，每孔加入10μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，酶標(biāo)儀450nm波長測(cè)定OD值。以多柔比星、順鉑作為陽性對(duì)照。

5)活性報(bào)告。每株細(xì)胞系做五個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3：

表3：化合物1、2、3、4和5對(duì)腫瘤細(xì)胞株和正常細(xì)胞的的抑制作用(IC₅₀,μM)

^a陽性對(duì)照

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1、化合物2、化合物3和化合物4對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯抑制作用，尤其是化合物4，不但對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性明顯較強(qiáng)，而且相比于腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞的抑制活性明顯較弱，對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小。

綜上所述，本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，對(duì)開發(fā)中國海洋藥物資源具有重要的意義。