新型與人tlr2及人tlr4結(jié)合的雙特異性抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種雙特異性抗體，其與人TLR2及人TLR4這兩者作用，通過(guò)抑制人TLR2及人TLR4介導(dǎo)的免疫炎癥作用而預(yù)防或治療免疫炎癥性疾病。提供一種相對(duì)于人LR2及人TLR4的雙特異性抗體，其包含：由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗體的重鏈可變區(qū)、由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)、由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區(qū)、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區(qū)。
【專利說(shuō)明】
新型與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種新型的與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] Toll樣受體2(Toll-Like Receptor 2;TLR2)及Toll樣受體4(Toll-Like Receptor 4;TLR4)為在包含巨隧細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小 管上皮細(xì)胞等腎固有細(xì)胞的廣泛的細(xì)胞W及組織中表達(dá)的一次跨膜型的蛋白質(zhì)（Folia Biol (Pr址a).、2005、Vol. 51、No. 6、p. 188-197)?；?2與化1?1或化36形成復(fù)合體，與膚聚糖 或脂蛋白等的細(xì)菌成分進(jìn)行反應(yīng)。另一方面，TLR4與髓樣分化因子2(MD2)蛋白質(zhì)或CD14蛋 白質(zhì)等形成復(fù)合體，并與W脂多糖化PS)為代表的脂多糖等的細(xì)菌成分進(jìn)行反應(yīng)。另外，運(yùn) 些受體通過(guò)與作為內(nèi)源性的組織損傷因子的損傷相關(guān)分子模式(DAMPS)結(jié)合而被活化，從 而向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)。TLR2及化R4的活化例如經(jīng)由作為轉(zhuǎn)錄因子的核因子kB(NF-kB)的活 化而誘導(dǎo)腫瘤壞死因子曰(TNFa)或白細(xì)胞介素6(IL-6)等炎癥性的細(xì)胞活素的表達(dá)，從而引 起炎癥應(yīng)答(Nat. Immunol.、2010、V〇1.11、No.5、p.373-384)。
[0003] 已知運(yùn)種化R2及化R4介導(dǎo)的各種細(xì)胞的活化參與免疫炎癥性疾病如敗血癥、急性 腎損傷、慢性腎臟病、急性呼吸窘迫綜合征、硬皮病、急性膜腺炎、慢性閉塞性肺疾病等疾 病。
[0004] 作為與敗血癥的關(guān)聯(lián)，據(jù)報(bào)道在作為敗血癥模型的沙口氏菌感染模型中化R2的遺 傳缺陷動(dòng)物(基因敲除小鼠）顯示生存率改善，在大腸桿菌感染模型中化R4基因敲除小鼠顯 示生存率改善，進(jìn)而，在各模型中化R2及化R4的雙基因敲除小鼠與化R2或化R4的單獨(dú)基因 敲除小鼠相比，生存率大幅度改善(J.Exp.Med.、2008、V〇1.205、p. 1747-1754)。另外，據(jù)報(bào) 道在前述兩個(gè)模型中，在抗化R2抗體(T2.5)或抗化R4抗體（1A6)的單獨(dú)給藥中，生存率沒(méi)有 改善，與此相對(duì)，通過(guò)兩抗體的并用給藥，生存率得到改善（J.Exp.Med.、2008、V〇1.205、 p.1747-1754)。
[0005] 作為與急性膜腺炎的關(guān)聯(lián)，據(jù)報(bào)道在牛橫膽酸誘發(fā)膜腺炎模型中化R4的基因敲除 小鼠的血中淀粉酶、膜臟髓過(guò)氧化物酶、及膜臟組織損傷降低（Inf lamm. Res.、2011、 Vol .60、p. 1093-1098)。另外，據(jù)報(bào)道在雨蛙素誘導(dǎo)膜腺炎模型中，在膜臟中，TLR2及化R4的 表達(dá)量上升（Pancreas、2013、Vol.42、p. 114-122)。
[0006] 作為與人化R2結(jié)合的抗體，報(bào)道有小鼠單克隆抗體T2.5(專利文獻(xiàn)1)、小鼠單克隆 抗體11G7(專利文獻(xiàn)2)、及T2.5的人源化單克隆抗體0PN305(專利文獻(xiàn)3)。其中，報(bào)道有11G7 抑制化R2/TLR1信號(hào)，但不抑制化R2/TLR6信號(hào)，與此相對(duì)，0PN305對(duì)兩信號(hào)均抑制。具體而 言，據(jù)報(bào)道在使用了人單核系細(xì)胞THP-1細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，0PN305對(duì)Pam3CSK4(TLR2ALRl激動(dòng) 劑)刺激及F化-UTLR2ALR6激動(dòng)劑）刺激運(yùn)兩者具有中和活性，進(jìn)而抑制通過(guò)Pam3CSK4給 藥而誘導(dǎo)的小鼠血中炎癥性細(xì)胞因子濃度上升(專利文獻(xiàn)3)。
[0007] 作為與人化R4結(jié)合的抗體，報(bào)道有小鼠單克隆抗體HTA125(非專利文獻(xiàn)1)、小鼠單 克隆抗體1細(xì)10、16G7、15C1及7E3(專利文獻(xiàn)4)、15C1的人源化單克隆抗體hul5Cl(專利文獻(xiàn) 5)、W及通過(guò)對(duì)hul5Cl的互補(bǔ)決定區(qū)的隨機(jī)突變而發(fā)現(xiàn)的人源化單克隆抗體1A6及 1E11.C2E3等(專利文獻(xiàn)6)。其中，關(guān)于小鼠單克隆抗體，15C1由使用了人血液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而 示出中和活性最高（專利文獻(xiàn)4)，15C1的人源化單克隆抗體hul5Cl通過(guò)同樣的使用了人血 液的實(shí)驗(yàn)而確認(rèn)具有中和活性(專利文獻(xiàn)5)。進(jìn)而，據(jù)報(bào)道人源化單克隆抗體化11.C2E3與 hul5Cl相比，在使用了人血液的實(shí)驗(yàn)中具有優(yōu)異的中和活性(專利文獻(xiàn)6)。
[000引另外，據(jù)報(bào)道在對(duì)于使用了人血液的加熱處理的大腸桿菌、假單胞菌屬 (Pseudomonas)及克雷伯氏菌屬化lebsiella)刺激而產(chǎn)生化-6的評(píng)價(jià)系統(tǒng)中，抗人化32抗 體(T2.5)較弱地抑制IL-6產(chǎn)生，抗人化34抗體（15C1)為抑制約50%IL-6產(chǎn)生的程度，與此 相對(duì)，通過(guò)兩抗體的并用添加而幾乎完全抑制IL-6產(chǎn)生(專利文獻(xiàn)7)。
[0009] 但是，與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體迄今為止沒(méi)有進(jìn)行報(bào)道。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0011] 專利文獻(xiàn)
[0012] 專利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開(kāi)第2005/028509號(hào)
[0013] 專利文獻(xiàn)2:國(guó)際公開(kāi)第2005/019431號(hào)
[0014] 專利文獻(xiàn)3:國(guó)際公開(kāi)第2011/003925號(hào)
[0015] 專利文獻(xiàn)4:國(guó)際公開(kāi)第2005/065015號(hào)
[0016] 專利文獻(xiàn)5:國(guó)際公開(kāi)第2007/110678號(hào) [0017] 專利文獻(xiàn)6:國(guó)際公開(kāi)第2013/149111號(hào)
[0018] 專利文獻(xiàn)7:國(guó)際公開(kāi)第2006/077471號(hào)
[0019] 非專利文獻(xiàn)
[0020] 非專利文獻(xiàn) 1:。實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志（The Journal of Experimental Medicine)"、（美 國(guó)）、1999、Vol.189、No.11、p.1777-1782

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 發(fā)明所要解決的課題
[0022] 本發(fā)明的課題在于提供一種雙特異性抗體，其通過(guò)與人TLR2及人化R4運(yùn)兩者結(jié)合 而抑制人TLR2及人TLR4介導(dǎo)的免疫炎癥作用，由此預(yù)防或治療免疫炎癥性疾病。
[0023] 解決課題的手段
[0024] 本發(fā)明人等在與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體的制作中重復(fù)進(jìn)行了大量 的獨(dú)創(chuàng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):制作下述與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體(實(shí)施例1至8)，該 雙特異性抗體抑制由與化R2及TLR4反應(yīng)的源自臨床分離株的綠脈桿菌Pseudomonas aeruginosa PA0-1的加熱處理死菌體后稱為死菌)誘導(dǎo)的炎癥性細(xì)胞因子TWa的產(chǎn)生 (實(shí)施例10)，所述雙特異性抗體含有1)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成 的抗人化R2抗體的重鏈可變區(qū)、及由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗 人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)；W及2)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨基酸序列構(gòu)成的 抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗 人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)。運(yùn)些結(jié)果提供了前述與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體， 從而完成了本發(fā)明。另外發(fā)現(xiàn)：該雙特異性抗體也抑制由源自臨床分離株的大腸桿菌 Escherichia coli 21006的死菌所誘導(dǎo)的TN陽(yáng)產(chǎn)生(實(shí)施例11)。
[0025] 目P，本發(fā)明作為醫(yī)學(xué)上或工業(yè)上有用的物質(zhì)或方法包含W下的發(fā)明。
[0026] [ 1 ]-種與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體，其從W下的（1)或(2)中選擇：
[0027] (1) 一種與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體，包含：
[00%] 1)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的重鏈可變 區(qū)、及由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)，W 及
[0029] 2)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可 變區(qū)、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變 區(qū)；或
[0030] (2)作為通過(guò)（1)的雙特異性抗體的翻譯后修飾而生成的雙特異性抗體的與人 TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體。
[0031] [2]根據(jù)[1]所述的雙特異性抗體，其從W下的（1)或(2)中選擇：
[0032] (1)-種含有抗人TLR2抗體及抗人TLR4抗體片段的雙特異性抗體，
[0033] 該抗人化R2抗體為IgG抗體，且包含由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列 構(gòu)成的抗人化R2抗體的重鏈可變區(qū)、及由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成 的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)，
[0034] 該抗人化R4抗體片段為單鏈可變區(qū)片段（scFv)，且包含由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào) 491至609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625 至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區(qū);或
[0035] (2)作為通過(guò)（1)的雙特異性抗體的翻譯后修飾而生成的雙特異性抗體的與人 TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體。
[0036] [ 3 ]根據(jù)[2 ]所述的雙特異性抗體，該雙特異性抗體含有抗人化R2抗體及抗人化R4 抗體片段，
[0037] 該抗人化R2抗體為IgG抗體，且包含由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列 構(gòu)成的抗人化R2抗體的重鏈可變區(qū)、及由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成 的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)，
[0038] 該抗人化R4抗體片段為scFv，且包含由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨基酸 序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序 列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區(qū)。
[0039] [4]根據(jù)[2]所述的雙特異性抗體，其中，翻譯后修飾為抗人化R2抗體的重鏈可變 區(qū)氨基末端(N末端）的焦谷氨酷化口少瓜夕抗人化R2抗體的重鏈簇基末端(C末 端)的賴氨酸缺失、和/或抗人TLR4抗體片段的重鏈可變區(qū)N末端的焦谷氨酷化。
[0040] [5]根據(jù)[2]至[4]中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R2抗體包含作為人 Ig 丫 1恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)。
[0041] [6]根據(jù)[引所述的雙特異性抗體，其中，人Ig 丫 1恒定區(qū)為具有L234A及L235A的氨 基酸突變或L234A、L235A及I253A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區(qū)。
[0042] [7]根據(jù)[2]至[4]中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R2抗體包含作為人 IgK恒定區(qū)的輕鏈恒定區(qū)。
[0043] [引根據(jù)[2]至[4]中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R2抗體包含作為人 Ig 丫 1恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)及作為人IgK恒定區(qū)的輕鏈恒定區(qū)。
[0044] [9]根據(jù)[引所述的雙特異性抗體，其中，人Ig 丫 1恒定區(qū)為具有L234A及L235A的氨 基酸突變或L234A、L235A及I253A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區(qū)。
[0045] [10]根據(jù)[2]或[3]所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R2抗體含有由序列號(hào)4的氨 基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈、及由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈。
[0046] [11]根據(jù)[2]至[10]中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R4抗體片段為具 有在重鏈可變區(qū)的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)輕鏈可變區(qū)域的N末端的結(jié)構(gòu)的scFv。
[0047] [12]根據(jù)[2]至[11]中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R4抗體片段為由 序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列構(gòu)成的scFv。
[0048] [13]根據(jù)[2]或[3]所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R2抗體含有由序列號(hào)4的氨 基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈、及由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈，抗人 TLR4抗體片段為由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列構(gòu)成的scFv。
[0049] [14]根據(jù)[2]至[13]中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其中，在抗人化R2抗體的各重 鏈的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)抗人TLR4抗體片段的N末端。
[0050] [15]根據(jù)[14]所述的雙特異性抗體，其中，連結(jié)抗人化R2抗體的重鏈和抗人化R4 抗體片段的接頭由GS接頭構(gòu)成。
[0051] [16]根據(jù)[1引所述的雙特異性抗體，其中，GS接頭由序列號(hào)9的氨基酸序列構(gòu)成。
[0052] [17]根據(jù)[2]或[3]所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R2抗體含有由序列號(hào)4的氨 基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈、及由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈，抗人 化R4抗體片段為由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列構(gòu)成的scFv，在該抗人 TLR2抗體的各重鏈的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)該抗人TLR4抗體片段的N末端。
[0053] [1引根據(jù)[17]所述的雙特異性抗體，其中，連結(jié)抗人化R2抗體的重鏈和抗人化R4 抗體片段的接頭由GS接頭構(gòu)成。
[0054] [19]根據(jù)[1引所述的雙特異性抗體，其中，GS接頭由序列號(hào)9的氨基酸序列構(gòu)成。
[0055] [20]-種雙特異性抗體，其是通過(guò)[17]至[19]中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體的翻 譯后修飾而生成的。
[0056] [21]-種多核巧酸，其含有編碼[1]所述的雙特異性抗體的抗人化R2抗體的重鏈 可變區(qū)、抗人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)、抗人TLR4抗體的重鏈可變區(qū)、和/或抗人TLR4抗體的 輕鏈可變區(qū)的堿基序列。
[0057] [22]-種多核巧酸，其含有編碼在[17]至[19]中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體的抗 人化R2抗體的重鏈的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)抗人化R4抗體片段的N末端而成的融合體的堿基 序列。
[0058] [23]根據(jù)[22]所述的多核巧酸，其含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的所述 融合體的堿基序列。
[0059] [24]-種多核巧酸，其含有編碼[17]至[19]中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體的抗人 TLR2抗體的輕鏈的堿基序列。
[0060] [2引一種表達(dá)載體，其含有[21]所述的多核巧酸。
[0061] [26]-種表達(dá)載體，其含有[22]、[23]、和/或[24]所述的多核巧酸。
[0062] [27]-種用[25]所述的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其選自由W下的（a)至 (d)構(gòu)成的組：
[0063] (a)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基 序列的多核巧酸的表達(dá)載體、和包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序 列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿 主細(xì)胞；
[0064] (b)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由 序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序 列的多核巧酸、及含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2 抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；
[0065] (C)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基 序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;W及
[0066] (d)用包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0067] [2引一種用[26]所述的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其選自由W下的(a)至(d) 構(gòu)成的組：
[0068] (a)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸的表達(dá)載體和含有[24]所述的多核巧酸的 表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；
[0069] (b)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸和[24]所述的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了 轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；
[0070] (C)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；W及
[0071] (d)用含有[24]所述的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0072] [29] -種生產(chǎn)與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體的方法，包括:對(duì)選自由W 下的(a)至(C)構(gòu)成的組中的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并使與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗 體表達(dá)的工序：
[0073] (a)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基 序列的多核巧酸的表達(dá)載體、和包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序 列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿 主細(xì)胞；
[0074] (b)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由 序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序 列的多核巧酸、W及含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;W及
[0075] (C)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基 序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、W及用包含含有編碼由序列號(hào)6的氨 基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸 的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0076] [30] -種生產(chǎn)與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體的方法，包括:對(duì)選自由W 下的(a)至(C)構(gòu)成的組中的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并使與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗 體表達(dá)的工序：
[0077] (a)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸的表達(dá)載體和含有[24]所述的多核巧酸的 表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；
[0078] (b)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸和[24]所述的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了 轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；W及
[0079] (C)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、W及 用含有[24]所述的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0080] [31]-種用[29]所述的方法所生產(chǎn)的與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體。
[0081] [32]-種用[30]所述的方法所生產(chǎn)的與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體。
[0082] [33]-種醫(yī)藥組合物，其含有[1]至[20]、[31]及[32]中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗 體及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0083] [34]根據(jù)[33]所述的醫(yī)藥組合物，其為免疫炎癥性疾病的預(yù)防或治療用醫(yī)藥組合 物。
[0084] [3引根據(jù)[34]所述的醫(yī)藥組合物，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急性膜腺炎。
[0085] [36]-種預(yù)防或治療免疫炎癥性疾病的方法，包括施用治療有效量的[1]至[20]、 [31 ]及[32 ]中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體的工序。
[0086] [37]根據(jù)[36]所述的預(yù)防或治療的方法，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急性 膜腺炎。
[0087] [3引根據(jù)[1]至[20]、[31]及[32]中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其用于在免疫炎 癥性疾病的預(yù)防或治療中使用。
[0088] [39]根據(jù)[3引所述的雙特異性抗體，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急性膜腺 炎。
[0089] [40] [1]至[20]、[31]及[32]中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體在免疫炎癥性疾病的 預(yù)防或治療用醫(yī)藥組合物制造中的應(yīng)用。
[0090] [41]根據(jù)[40]所述的雙特異性抗體的應(yīng)用，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急 性膜腺炎。
[0091] [42] -種抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段，其從W下的（1)或(2)中選擇：
[0092] (1)含有由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)、W及由 序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗人化R2抗體或其抗原結(jié) 合片段;或
[0093] (2)作為通過(guò)（1)的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段的翻譯后修飾而生成的抗體 或其抗原結(jié)合片段的抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0094] [43]根據(jù)[42]所述的抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有由序列號(hào)8的氨基 酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)及由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸 序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)。
[0095] [44]根據(jù)[42]所述的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段，其為通過(guò)含有由序列號(hào)8 的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)及由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的 氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段的翻譯后修飾而生成的 抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0096] [45]根據(jù)[42]或[44]所述的抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，翻譯后修飾 為重鏈可變區(qū)N末端的焦谷氨酷化和/或重鏈C末端的賴氨酸缺失。
[0097] [46]根據(jù)[42]至[45]中任一項(xiàng)所述的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有作 為人Ig 丫 1恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)。
[0098] [47]根據(jù)[46]所述的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，人Ig 丫 1恒定區(qū)為具 有L234A及L235A的氨基酸突變或L234A、L235A及I253A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區(qū)。
[0099] [4引根據(jù)[42]至[45]中任一項(xiàng)所述的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有作 為人IgK恒定區(qū)的輕鏈恒定區(qū)。
[0100] [49]根據(jù)[42]至[44]中任一項(xiàng)所述的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有作 為人Ig 丫 1恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)及作為人IgK恒定區(qū)的輕鏈恒定區(qū)。
[0101] [50]根據(jù)[49]所述的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，人Ig 丫 1恒定區(qū)為具 有L234A及L235A、或L234A、L235A及I253A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區(qū)。
[0102] [51]根據(jù)[42]或[43]所述的抗人化R2抗體，其含有由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)1至 450的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈、及由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈。
[0103] [52]根據(jù)[42]至[50]中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合片段，其為單鏈可變區(qū)片段、Fab、 Fab'、或F(ab'）2。
[0104] [53]-種抗人化R2抗體，其為通過(guò)[51]所述的抗人化R2抗體的翻譯后修飾而生成 的抗體。
[0105] [54]根據(jù)[53]所述的抗人TLR2抗體，其中，翻譯后修飾為重鏈可變區(qū)N末端的焦谷 氨酷化和/或重鏈C末端的賴氨酸缺失。
[0106] [55]根據(jù)[42]或[44]所述的抗人化R2抗體，其含有由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)1至 449的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈、及由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈。
[0107] [56] -種生產(chǎn)抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，包括對(duì)選自由W下的（a) 至(C)構(gòu)成的組中的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段表達(dá)的工序：
[0108] (a)用包含含有編碼[43]所述的抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段的重鏈可變區(qū)的 堿基序列的多核巧酸和含有編碼該抗體或其抗原結(jié)合片段的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多 核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；
[0109] (b)用包含含有編碼[43]所述的抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段的重鏈可變區(qū)的 堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體和包含含有編碼該抗體或其抗原結(jié)合片段的輕鏈可變區(qū) 的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;W及
[0110] (C)用包含含有編碼[43]所述的抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段的重鏈可變區(qū)的 堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、W及用包含含有編碼該抗體或其 抗原結(jié)合片段的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0111] [57] -種生產(chǎn)抗人化R2抗體的方法，包括對(duì)選自由W下的(a)至(C)構(gòu)成的組中的 宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使抗人TLR2抗體表達(dá)的工序：
[0112] (a)用包含含有編碼[51]所述的抗人化R2抗體的重鏈的堿基序列的多核巧酸和含 有編碼該抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；
[0113] (b)用包含含有編碼[51]所述的抗人化R2抗體的重鏈的堿基序列的多核巧酸的表 達(dá)載體和包含含有編碼該抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿 主細(xì)胞；W及
[0114] (C)用包含含有編碼[51]所述的抗人化R2抗體的重鏈的堿基序列的多核巧酸的表 達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、W及用包含含有編碼該抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸 的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0115] [5引一種用[56]所述的方法所生產(chǎn)的抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0116] [ 59 ] -種用[57 ]所述的方法所生產(chǎn)的抗人TLR2抗體。
[0117] [60]-種醫(yī)藥組合物，其含有[42]至[55]、[5引及[59]中任一項(xiàng)所述的抗人化尺2 抗體或其抗原結(jié)合片段及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0118] [61]-種醫(yī)藥組合物，其含有[43]所述的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段、[44] 所述的抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段、及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0119] [62]-種醫(yī)藥組合物，其含有[51]所述的抗人化R2抗體、[55]所述的抗人化R2抗 體、及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0120] [63]根據(jù)[60]至[62]中任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物，其為癌的預(yù)防或治療用醫(yī)藥組 合物。
[0121] [64]-種預(yù)防或治療癌的方法，包括施用治療有效量的[42]至[55]、[5引及[59] 中任一項(xiàng)所述的抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段的工序。
[0122] [65]根據(jù)[42]至[55]、[5引及[59]中任一項(xiàng)所述的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片 段，其用于在癌的預(yù)防或治療中使用。
[0123] [66][42]至[55]、[5引及[59]中任一項(xiàng)所述的抗人化R2或其抗原結(jié)合片段在癌的 預(yù)防或治療用醫(yī)藥組合物制造中的應(yīng)用。
[0124] 所述與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體W及抗人化R2抗體及其抗原結(jié)合片 段也包含其與其它膚及蛋白質(zhì)的融合抗體、或使其結(jié)合修飾劑而成的修飾抗體。
[0125] 發(fā)明效果
[0126] 本發(fā)明的雙特異性抗體通過(guò)人化R2及人化R4的功能抑制而具有強(qiáng)的抗免疫炎癥 作用，可w作為免疫炎癥性疾病的預(yù)防或治療劑使用。
【附圖說(shuō)明】
[0127] 圖1表示在作為IgG抗體的抗人化R2抗體的各重鏈的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)抗人化R4 抗體scFv的N末端的本發(fā)明的雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)的一例。
[0128] 圖2表示各抗人化32抗體對(duì)于向THPl-xBlue細(xì)胞產(chǎn)生PamSCSM^LRS/e激動(dòng)劑）誘 導(dǎo)堿性憐酸酶(AP)的抑制效果。
[0129] 圖3表示各雙特異性抗體對(duì)于向正常人末梢血單核細(xì)胞產(chǎn)生大腸桿菌死菌誘導(dǎo) TNFa的抑制效果。
【具體實(shí)施方式】
[0130] W下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳述。
[0131] 在抗體中存在1邑6、1邑1、1邑4、1曲及1姐運(yùn)5類(lèi)?？贵w分子的基本結(jié)構(gòu)在各類(lèi)中是共 通的，由分子量5萬(wàn)~7萬(wàn)的重鏈和2~3萬(wàn)的輕鏈構(gòu)成。重鏈通常由含有約440個(gè)氨基酸的多 膚鏈構(gòu)成，每類(lèi)均具有特征性結(jié)構(gòu)，對(duì)應(yīng)于IgG、I gM、IgA、I曲、I巧被稱為Ig 丫、Igii、Iga、Ig 8、1邑6。此外，在1邑6中存在1邑61、1邑62、1邑63、1邑(；4的亞類(lèi)，分別與之對(duì)應(yīng)的重鏈被稱為1邑丫 l、Ig 丫 2、Ig 丫 3、Ig 丫 4。輕鏈通常由含有約220個(gè)氨基酸的多膚鏈構(gòu)成，已知有L型和K型2 種，分別被稱為Ig^、IgK。就抗體分子的基本結(jié)構(gòu)的膚構(gòu)成而言，各自同源的2條重鏈及2條 輕鏈通過(guò)二硫鍵(S-S鍵)及非共價(jià)鍵結(jié)合，分子量為15萬(wàn)~19萬(wàn)。巧巾輕鏈可W與任一個(gè)重 鏈構(gòu)成對(duì)。各個(gè)抗體分子通?？捎?條相同的輕鏈和2條相同的重鏈形成。
[0132] 鏈內(nèi)S-S鍵在重鏈上存在四個(gè)(在y、e鏈上存在五個(gè)），在輕鏈上存在兩個(gè)，每100~ 110個(gè)氨基酸殘基形成一個(gè)環(huán)，該立體結(jié)構(gòu)在各環(huán)間類(lèi)似，被稱為結(jié)構(gòu)單元或結(jié)構(gòu)域。即使 為來(lái)自同種動(dòng)物的相同類(lèi)(亞類(lèi))的標(biāo)準(zhǔn)品，重鏈、輕鏈中位于N末端的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列 也不恒定，被稱為可變區(qū)，各結(jié)構(gòu)域分別被稱為重鏈可變區(qū)(Vh)及輕鏈可變區(qū)(Vl)。來(lái)自可 變區(qū)的C末端側(cè)的氨基酸序列在各類(lèi)或亞類(lèi)中大致恒定，被稱為恒定區(qū)（各結(jié)構(gòu)域分別表示 為ChI、Ch2、Ch3或Cl)。
[0133] 抗體的抗原決定部位由Vh及化構(gòu)成，結(jié)合的特異性取決于該部位的氨基酸序列。另 一方面，與補(bǔ)體或各種細(xì)胞的結(jié)合運(yùn)樣的生物學(xué)活性反映各類(lèi)Ig的恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)差別。已 知輕鏈和重鏈的可變區(qū)的可變性大致限于在任一個(gè)鏈上均存在的3個(gè)小的超變區(qū)，將運(yùn)些 區(qū)域稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR;重鏈、輕鏈從N末端側(cè)起分別為CDR1、CDR2、CDR3)?？勺儏^(qū)的剩余 部分被稱為骨架區(qū)(FR)，相對(duì)恒定。
[0134] 含有抗體的Vh及化的各種抗體片段也具有抗原結(jié)合活性，作為運(yùn)種代表性的抗體 片段，可列舉單鏈可變區(qū)片段(3。。乂）^曰6^曰6'^仙'）2而6為由輕鏈和含有￥11、扣1結(jié)構(gòu)域 和較鏈區(qū)的一部分的重鏈片段構(gòu)成的一價(jià)的抗體片段。Fab'為由輕鏈和含有Vh、Ch1結(jié)構(gòu)域 和較鏈區(qū)的一部分的重鏈片段構(gòu)成的一價(jià)的抗體片段，在該較鏈區(qū)的部分中含有構(gòu)成了重 鏈間S-S鍵的半脫氨酸殘基。F(ab'）2片段為2個(gè)化b'片段通過(guò)較鏈區(qū)中的重鏈間S-S鍵結(jié)合 的二價(jià)的抗體片段。scFv為由用接頭(例如膚接頭)連結(jié)的Vh和化構(gòu)成的一價(jià)的抗體片段。
[0135] 雙特異性抗體為運(yùn)樣的抗體，其含有辨識(shí)兩個(gè)不同的抗原、并與各自的抗原結(jié)合 的兩個(gè)抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)。雙特異性抗體報(bào)道有各種格式（結(jié)構(gòu)）化xped Rev.Clin.I^armacol.、2010、V〇1.3、No. 4、p. 491-508)。例女日，報(bào)道有在一個(gè)抗體的重鏈可 變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的N末端經(jīng)由接頭而分別連結(jié)另一個(gè)抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的 C末端的四價(jià)的雙特異性抗體、將各抗體的重鏈及輕鏈利用knobs-into-hol es技術(shù)經(jīng)由C出 而接合的二價(jià)的雙特異性抗體、W及在一個(gè)抗體的重鏈或輕鏈的N末端經(jīng)由接頭而連結(jié)另 一個(gè)抗體的scFv的C末端、或在一個(gè)抗體的重鏈或輕鏈的C末端經(jīng)由接頭而連結(jié)另一個(gè)抗體 的scFv的N末端的四價(jià)的雙特異性抗體(NaUire Biotech.、1997、Vol.l5、p. 159-163)等。
[0136] <本發(fā)明的雙特異性抗體>
[0137] 在本說(shuō)明書(shū)中，"與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體"是指具有對(duì)人化R2的結(jié) 合活性及對(duì)人化R4的結(jié)合活性的雙特異性抗體，具體而言，本發(fā)明的雙特異性抗體包含具 有W下的特征的雙特異性抗體：
[0138] -種與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體，其包含：
[0139] 1)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的重鏈可變 區(qū)、及由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)；W 及
[0140] 2)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可 變區(qū)、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變 區(qū)。
[0141] 在本說(shuō)明書(shū)中，"抗人化32抗體"是指與人化32結(jié)合的抗體，"抗人化34抗體"是指 與人TLR4結(jié)合的抗體。本發(fā)明的雙特異性抗體只要具有抗人TLR2抗體及抗人TLR4抗體的各 個(gè)重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)即可，例如可W具有任意的雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)含有 抗人化R2抗體或具有對(duì)人化R2的結(jié)合活性的抗人化R2抗體片段、和抗人TLR4抗體或具有對(duì) 人化R4的結(jié)合活性的抗人TLR4抗體片段。作為運(yùn)種結(jié)構(gòu)，可列舉例如:在一個(gè)抗體的重鏈可 變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的N末端經(jīng)由接頭而分別連結(jié)另一個(gè)抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的 C末端的雙特異性抗體(DVD-Ig)、利用knobs-into-holes技術(shù)將各抗體的重鏈及輕鏈經(jīng)由 CH3而接合的雙特異性抗體、W及在一個(gè)抗體的重鏈或輕鏈的N末端經(jīng)由接頭而連結(jié)另一個(gè) 抗體的scFv的C末端、或在一個(gè)抗體的重鏈或輕鏈的C末端經(jīng)由接頭而連結(jié)另一個(gè)抗體的 scFv的N末端的四價(jià)的雙特異性抗體等。
[0142] 優(yōu)選本發(fā)明的雙特異性抗體為含有抗人化R2抗體及抗人化R4抗體片段、該抗人 化R2抗體為IgG抗體、且該抗人化R4抗體片段為scFv的四價(jià)的雙特異性抗體。W下，將該結(jié) 構(gòu)的四價(jià)的雙特異性抗體也稱為IgG(TLR2)-scFv(TLR4)。
[0143] 本發(fā)明的雙特異性抗體為1旨6(化32)-3。。巾(化1?4)的情況下，作為抗人化32抗體的 恒定區(qū)，也可W選擇任何亞類(lèi)的恒定區(qū)（例如作為重鏈的Ig 丫 1、Ig 丫 2、Ig 丫 3或Ig 丫 4的恒 定區(qū)、作為輕鏈的I gA或IgK的恒定區(qū)），作為重鏈恒定區(qū)，優(yōu)選人Ig 丫 1恒定區(qū)，作為輕鏈恒 定區(qū)，優(yōu)選人IgK恒定區(qū)。
[0144] 作為用作抗人化R2抗體的重鏈恒定區(qū)的人Ig 丫 1恒定區(qū)，可列舉例如由序列號(hào)8的 氨基酸序號(hào)121至450構(gòu)成的氨基酸序列。
[0145] 使用人Ig 丫 1恒定區(qū)作為抗人化R2抗體的重鏈恒定區(qū)的情況下，為了使抗體的抗 體依賴細(xì)胞毒性或補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性降低，也可W使用導(dǎo)入有L234A(基于Kabat等人的抓 索引的氨基酸234位的亮氨酸被丙氨酸取代KL235A(基于Kabat等人的抓索引的氨基酸235 位的亮氨酸被丙氨酸取代）等的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區(qū)（Mol. Immunol.、1992、 Vo 1.29、No. 5、p . 633-639)。另外，從體內(nèi)動(dòng)態(tài)的觀點(diǎn)出發(fā)，為了使抗體從血液中迅速地消 失，也可W使用導(dǎo)入有I253A(基于Kabat等人的抓索引的氨基酸253位的異亮氨酸被丙氨酸 取代)等的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區(qū)（J. Immunol.、1997、Vol. 158、p. 2211-2217)。關(guān)于 與本說(shuō)明書(shū)中所使用的抗體的恒定區(qū)中的氨基酸突變導(dǎo)入有關(guān)的殘基編號(hào)，基于EU索引 (Rabat等、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.、United States Public Health Service、National Institute of Health、Bethesda)。
[0146] 優(yōu)選抗人化R2抗體的重鏈恒定區(qū)為具有L234A及L235A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒 定區(qū)或具有L234A、L235A、及I253A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區(qū)。更優(yōu)選抗人化R2抗體的 重鏈恒定區(qū)為具有L234A、L235A、及I253A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區(qū)，作為運(yùn)種人Ig 丫 1恒定區(qū)，可列舉例如由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)121至450構(gòu)成的氨基酸序列。
[0147] 作為用作抗人化R2抗體的輕鏈恒定區(qū)的人IgK恒定區(qū)，可列舉例如由序列號(hào)6的氨 基酸序號(hào)114至219構(gòu)成的氨基酸序列。
[0148] 優(yōu)選抗人化R2抗體為含有作為人Ig 丫 1恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)及作為人IgK恒定區(qū) 的輕鏈恒定區(qū)的抗人化32抗體，更優(yōu)選該人Ig 丫 1恒定區(qū)為具有L234A、L235A、及I253A的氨 基酸突變的人Ig 丫 1恒定區(qū)。
[0149] 例如作為抗人化R2抗體，可列舉含有由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序 列構(gòu)成的重鏈、及由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0150] 本發(fā)明的雙特異性抗體為1旨6(化32)-3。。乂(化1?4)的情況下，抗人化1?4抗體片段可 W為具有在重鏈可變區(qū)的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)輕鏈可變區(qū)的N末端的結(jié)構(gòu)（重鏈可變區(qū)-接 頭-輕鏈可變區(qū)）的scFv、及具有在輕鏈可變區(qū)的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)重鏈可變區(qū)的N末端的 結(jié)構(gòu)(輕鏈可變區(qū)-接頭-重鏈可變區(qū)）的scFv的任一種，優(yōu)選為具有重鏈可變區(qū)-接頭-輕鏈 可變區(qū)的結(jié)構(gòu)的scFvdScFv中的"接頭"為連結(jié)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的任意的長(zhǎng)度的膚 (膚接頭），優(yōu)選為具有至少5個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選15~50個(gè)的氨基酸的膚。作為 優(yōu)選的膚接頭，為含有氨基酸序列GlyGlyGlyGlySer(也表示為(Gly)4Ser)的膚接頭(本說(shuō) 明書(shū)中稱為"GS接頭"），優(yōu)選含有多個(gè)、更優(yōu)選3~5個(gè)(Gly)4Ser。
[0151] 例如，作為抗人化R4抗體片段，可列舉作為由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨 基酸序列構(gòu)成的S cFv的抗人TLR4抗體片段。
[0152] 在1個(gè)實(shí)施方式中，作為IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本發(fā)明的雙特異性抗體，為抗人 化R2抗體含有由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈及由序列號(hào)6的氨 基酸序列構(gòu)成的輕鏈、抗人化R4抗體片段為由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序 列構(gòu)成的S cFv的雙特異性抗體。
[0153] 優(yōu)選在IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本發(fā)明的雙特異性抗體中，在抗人化R2抗體的各 重鏈的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)抗人化R4抗體片段的N末端。將運(yùn)種雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)示于圖 1〇
[0154] 在抗人化R2抗體的各重鏈的C末端連結(jié)抗人化R4抗體片段的N末端的接頭為連結(jié) 兩者的任意的長(zhǎng)度的膚(膚接頭），優(yōu)選為具有至少5個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選15~ 50個(gè)的氨基酸的膚。作為優(yōu)選的膚接頭，為GS接頭，優(yōu)選含有多個(gè)、更優(yōu)選5~10個(gè)(Gly) 4Ser。作為運(yùn)種接頭，可列舉由序列號(hào)9所示的氨基酸序列構(gòu)成的膚接頭。
[0巧5]在1個(gè)實(shí)施方式中，作為IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本發(fā)明的雙特異性抗體，為抗人 化R2抗體含有由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈及由序列號(hào)6的氨 基酸序列構(gòu)成的輕鏈、抗人化R4抗體片段為由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序 列構(gòu)成的scFv、且在該抗人化R2抗體的各重鏈的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)該抗人化R4抗體片段 的N末端的雙特異性抗體。將在抗人化R2抗體的重鏈的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)抗人化R4抗體片 段的N末端的融合體也稱為"抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體"。優(yōu)選在該雙特 異性抗體中，連結(jié)該抗人化R2抗體的重鏈和抗人化R4抗體片段的接頭為GS接頭，更優(yōu)選該 GS接頭由序列號(hào)9的氨基酸序列構(gòu)成。作為運(yùn)種本發(fā)明的雙特異性抗體，可列舉含有由序列 號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體、及由序列號(hào)6的氨 基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗體的輕鏈的雙特異性抗體。
[0156] -般而言，已知在使抗體在細(xì)胞中表達(dá)的情況下，在翻譯后抗體受到修飾。作為翻 譯后修飾的實(shí)例，可列舉:重鏈C末端的賴氨酸利用簇基膚酶的切斷、重鏈及輕鏈N末端的谷 氨酷胺或谷氨酸通過(guò)焦谷氨酷化修飾為焦谷氨酸等，在各種抗體中，已知重鏈C末端的賴氨 酸缺失或重鏈N末端的谷氨酷胺的大部分被修飾為焦谷氨酸(Journal of Pharmaceutical Sciences、2008、Vol.97、p.2426-p2447)。
[0157] 在本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體中，也包含與人化R2及人化R4 結(jié)合的受到了翻譯后修飾的雙特異性抗體。例如，不僅包含具有全長(zhǎng)重鏈的雙特異性抗體， 而且也包含具有C末端的賴氨酸缺失的重鏈的雙特異性抗體。另外，也包含N末端的谷氨酷 胺或谷氨酸通過(guò)焦谷氨酷化被修飾為焦谷氨酸的雙特異性抗體。運(yùn)種N末端的焦谷氨酷化 或C末端側(cè)賴氨酸缺失引起的翻譯后修飾對(duì)抗體的活性并不產(chǎn)生影響也是該領(lǐng)域中所公知 的（Analytical Biochemistry、Vol.：M8、2006、p.24-39)。
[0158] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體中也包含 W下記載的雙特異性抗體。
[0159] 含有由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成、且序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1的谷氨酸被修飾為 焦谷氨酸的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體、及由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成 的抗人TLR2抗體的輕鏈的、與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體。
[0160] 本發(fā)明也包含具有W下的特征的與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體。
[0161 ] -種與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體，其包含：
[0162] 1)含有由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)31至35的氨基酸序列構(gòu)成的CDR1、由序列號(hào)4的氨 基酸序號(hào)50至66的氨基酸序列構(gòu)成的CDR2、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)99至109的氨基酸序 列構(gòu)成的CDR3的抗人化R2抗體的重鏈可變區(qū)、W及含有由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)24至39的 氨基酸序列構(gòu)成的CDR1、由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)55至61的氨基酸序列構(gòu)成的CDR2、及由序 列號(hào)6的氨基酸序號(hào)94至102的氨基酸序列構(gòu)成的CDR3的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)；W及
[0163] 2)含有由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)521至525的氨基酸序列構(gòu)成的CDR1、由序列號(hào)4的 氨基酸序號(hào)540至556的氨基酸序列構(gòu)成的CDR2、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)589至598的氨 基酸序列構(gòu)成的CDR3的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)、W及含有由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)648 至658的氨基酸序列構(gòu)成的CDR1、由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)674至680的氨基酸序列構(gòu)成的 CDR2、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)713至721的氨基酸序列構(gòu)成的CDR3的抗人化R4抗體的輕 鏈可變區(qū)。
[0164] 作為評(píng)價(jià)本發(fā)明的雙特異性抗體的活性的方法，可列舉評(píng)價(jià)對(duì)人化R2和/或人 TLR4的結(jié)合活性或中和活性的方法。
[0165] 是否具有對(duì)人化R2或人化R4的結(jié)合活性可W使用該領(lǐng)域中公知的測(cè)定方法來(lái)確 認(rèn)。作為運(yùn)種測(cè)定方法，可列舉例如表面等離子體共振（SPR)解析、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 化nzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)等方法。例如，關(guān)于對(duì)人化1?2的結(jié)合活性進(jìn) 行SPR解析的情況下，可W使用Biacore T200(GE Healthcare)，該情況下，通過(guò)將人化32蛋 白質(zhì)（R&D systems公司）固相化于傳感器忍片的表面，將被驗(yàn)抗體添加于流路并解析被驗(yàn) 抗體和人TLR2蛋白質(zhì)的解離常數(shù)化D)，由此可W評(píng)價(jià)被驗(yàn)抗體對(duì)人TLR2的結(jié)合活性。作為 具體的評(píng)價(jià)方法，可W使用例如后述實(shí)施例5中所記載的方法。作為其它的實(shí)例，關(guān)于對(duì)人 化R4的結(jié)合活性使用化ISA進(jìn)行評(píng)價(jià)的情況下，將人化R4及MD2復(fù)合體（W下，稱為人化R4/ MD2)蛋白質(zhì)固定化于ELISA用板，向其中添加被驗(yàn)抗體而使其反應(yīng)之后，使利用辣根過(guò)氧化 物酶化RP)等酶進(jìn)行了標(biāo)記的抗IgG抗體等二次抗體反應(yīng)并清洗，之后使用檢測(cè)其活性的試 劑(例如在HRP標(biāo)記的情況下，3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB;M0S公司））等進(jìn)行活性測(cè)定， 確定二次抗體的結(jié)合，由此可W評(píng)價(jià)被驗(yàn)抗體對(duì)于人化R4的結(jié)合活性。作為具體的評(píng)價(jià)方 法，例如可W使用后述實(shí)施例9中所記載的方法。
[0166] 抗體對(duì)人化R2的中和活性是指利用對(duì)人化R2的結(jié)合抑制經(jīng)由人化R2而產(chǎn)生的任 意的生物活性的活性，可運(yùn)些1個(gè)或多個(gè)生物活性為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，作為運(yùn)種對(duì) 人化R2的中和活性，可列舉抑制人單核系細(xì)胞THPl-xBlue細(xì)胞中的Pam2CSK4誘導(dǎo)性的AP產(chǎn) 生的活性，作為活性的具體的評(píng)價(jià)方法，例如可W使用后述實(shí)施例6中所記載的方法。
[0167] 對(duì)人化R4的中和活性是指利用對(duì)人化R4的結(jié)合抑制經(jīng)由人化R4而產(chǎn)生的任意的 生物活性的活性，可運(yùn)些1個(gè)或多個(gè)生物活性為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，作為運(yùn)種對(duì)人 化R4的中和活性，可列舉抑制人單核系細(xì)胞株即U937細(xì)胞中的LPS誘導(dǎo)性的IL-6產(chǎn)生的活 性。
[0168] 本發(fā)明的雙特異性抗體具有對(duì)人化R2和人化R4的中和活性。具有對(duì)人化R2和人 化R4的中和活性是指具有對(duì)人化R2的中和活性和對(duì)人化R4的中和活性運(yùn)兩者。是否具有對(duì) 人化R2和人化R4的中和活性可W分別使用前述對(duì)人TLR2或人TLR4的中和活性的評(píng)價(jià)方法 進(jìn)行評(píng)價(jià)，可W使用表達(dá)人化R2和人TLR4運(yùn)兩者的細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)抑制人化R2和人化R4介導(dǎo)的 該細(xì)胞的1個(gè)或多個(gè)生物活性的活性。作為后者的評(píng)價(jià)方法的實(shí)例，可列舉例如抑制表達(dá)人 化R2及人化R4的人末梢血單核細(xì)胞中作為敗血癥的致病菌的綠脈桿菌Pseudomonas aeruginosa PA0-1 (例如ATCC:BAA-47)誘導(dǎo)性TN化產(chǎn)生的活性。具有運(yùn)種活性的抗體可W 判斷為具有對(duì)人化R2和人化R4的中和活性的抗體。作為具體的評(píng)價(jià)方法，可W使用例如后 述實(shí)施例10中所記載的方法。
[0169] 本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體可W基于本說(shuō)明書(shū)中所公開(kāi)的 本發(fā)明的雙特異性抗體中所含的抗人TLR2抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)、W及抗人TLR4 抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的序列信息，并使用該領(lǐng)域中公知的方法由本領(lǐng)域技術(shù)人 員容易地制作。本發(fā)明的與人TLR2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體沒(méi)有特別限定，例如，可W 按照后述的<本發(fā)明的雙特異性抗體的生產(chǎn)方法及利用該方法所生產(chǎn)的雙特異性抗體> 中記載的方法來(lái)制造。
[0170] 本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體根據(jù)需要進(jìn)一步精制之后，按照 常規(guī)方法進(jìn)行制劑化，可w用于免疫炎癥性疾病如敗血癥、急性腎損傷、慢性腎臟病、急性 呼吸窘迫綜合征、硬皮病、急性膜腺炎、慢性閉塞性肺疾病等人化R2及人化R4參與病態(tài)形成 的疾病的預(yù)防或治療。
[0171] <本發(fā)明的多核巧酸>
[0172] 本發(fā)明的多核巧酸包含:含有編碼本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗 體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可變區(qū)（由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu) 成）的堿基序列的多核巧酸、含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的輕鏈可變 區(qū)（由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成）的堿基序列的多核巧酸、含有編碼 該雙特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)（由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609 的氨基酸序列構(gòu)成）的堿基序列的多核巧酸、或含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人 化R4抗體的輕鏈可變區(qū)（由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成）的堿基序列 的多核巧酸。
[0173] 本發(fā)明的多核巧酸只要為含有編碼本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性 抗體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、或?yàn)楹芯幋a該雙特異 性抗體中所含的抗人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、或?yàn)楹芯幋a該雙特 異性抗體中所含的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、或?yàn)楹芯幋a該雙 特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸，就沒(méi)有特別限 定。例如，作為含有編碼該抗人化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸，可列舉含有 從序列號(hào)3的堿基序號(hào)1至360的堿基序列的多核巧酸，作為含有編碼該抗人化R2抗體的輕 鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸，可列舉含有從序列號(hào)5的堿基序號(hào)1至339的堿基序列的 多核巧酸，作為含有編碼該抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸，可列舉含 有從序列號(hào)3的堿基序號(hào)1471至1827的堿基序列的多核巧酸，作為含有編碼該抗人化R4抗 體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸，可列舉含有從序列號(hào)3的堿基序號(hào)1873至2196的 堿基序列的多核巧酸。
[0174] 作為優(yōu)選的本發(fā)明的多核巧酸，可列舉例如:含有編碼本發(fā)明的雙特異性抗體IgG (TLR2)-scFv (化R4)的堿基序列的多核巧酸，即含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體 scFv融合體的堿基序列的多核巧酸，在抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體中，在 由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的重鏈的C末端經(jīng)由接 頭而連結(jié)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體片段的N末 端；W及含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多核 巧酸。作為前述含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的多核 巧酸，優(yōu)選含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的該融合體的堿基序列的多核巧酸。
[0175] 在1個(gè)實(shí)施方式中，作為編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體重鏈- 抗人TLR4抗體scFv融合體的多核巧酸，可列舉由序列號(hào)3的堿基序列構(gòu)成的多核巧酸，作為 由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈的多核巧酸，可列舉由序列號(hào)5的堿基 序列構(gòu)成的多核巧酸。
[0176] 本發(fā)明的多核巧酸可W基于其堿基序列，使用本領(lǐng)域中公知的方法由本領(lǐng)域技術(shù) 人員容易地制作。例如，可W利用本領(lǐng)域中公知的基因合成方法而合成。作為運(yùn)種基因合成 方法，可W使用W090/07861中記載的抗體基因的合成方法等本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的各種 方法。另外，如果一旦取得本發(fā)明的多核巧酸，則通過(guò)在該多核巧酸的預(yù)定位點(diǎn)導(dǎo)入突變， 也可W取得本發(fā)明的其它多核巧酸。作為運(yùn)種突變導(dǎo)入方法，可W使用位點(diǎn)特異性突變誘 發(fā)法（Current Protocols in Molecular Biology edi t.、1987 John Wi ley&Sons Section 8.1-8.5)等本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的各種方法。
[0177] <本發(fā)明的表達(dá)載體>
[0178] 本發(fā)明的表達(dá)載體包含W下表達(dá)載體，其包含:含有編碼本發(fā)明的與人化R2及人 化R4結(jié)合的雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含 有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有 編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、和/或 含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸，其 為可W用于本發(fā)明的與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體的生產(chǎn)的載體。本領(lǐng)域中各種 格式的雙特異性抗體及其生產(chǎn)方法為公知的，本發(fā)明的表達(dá)載體可W按照運(yùn)些生產(chǎn)方法， 根據(jù)所表達(dá)的雙特異性抗體的格式由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地構(gòu)建。
[0179] 例如，作為用于生產(chǎn)IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本發(fā)明的雙特異性抗體的表達(dá)載 體，優(yōu)選W下表達(dá)載體，其包含:含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可 變區(qū)、該雙特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)、及該雙特異性抗體中所含的 抗人TLR4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、和含有編碼該雙特異性抗體中所含的 抗人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸的任一個(gè)或兩者。
[0180] 更優(yōu)選的是，用于生產(chǎn)IgG(TLR2)-scFv(化R4)即本發(fā)明的雙特異性抗體的表達(dá)載 體為運(yùn)樣的表達(dá)載體，其包含:含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿 基序列的多核巧酸、和含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿 基序列的多核巧酸的任一個(gè)或兩者，其中在抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體 中，在由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的重鏈的C末端經(jīng) 由接頭而連結(jié)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體片段的 N末端。
[0181] 用于生產(chǎn)IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本發(fā)明的雙特異性抗體的表達(dá)載體進(jìn)一步優(yōu) 選為運(yùn)樣的表達(dá)載體，其包含：含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體重 鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸、和含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列 構(gòu)成的抗人TLR2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的任一個(gè)或兩者。
[0182] 作為用于表達(dá)多核巧酸的表達(dá)載體，只要在真核細(xì)胞(例如動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、 植物細(xì)胞、酵母)和/或原核細(xì)胞(例如大腸桿菌)的各種宿主細(xì)胞中表達(dá)含有編碼本發(fā)明的 與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列 的多核巧酸、含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的 多核巧酸、含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人TLR4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多 核巧酸、和/或含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列 的多核巧酸，并可W產(chǎn)生運(yùn)些多膚，就沒(méi)有特別限制，可使用例如質(zhì)粒載體、病毒載體(例如 腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒)等，優(yōu)選可W使用祀E6.4或祀E12.4(Lonza公司）。另外，也可W通過(guò)在 AG-丫 1或AG-K(例如參照W0 94/20632)等預(yù)先具有人Ig恒定區(qū)基因的表達(dá)載體中導(dǎo)入可變 區(qū)基因片段而表達(dá)抗體基因。
[0183] 使用動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或酵母作為宿主細(xì)胞的情況下，本發(fā)明的表達(dá)載體可W 含有起始密碼子及終止密碼子。而且該情況下，本發(fā)明的表達(dá)載體可W含有增強(qiáng)子序列、編 碼本發(fā)明的雙特異性抗體或其重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的基因的5'側(cè)及3'側(cè)的非翻譯區(qū) 域、分泌信號(hào)序列、剪接接合部、聚腺巧酸化位點(diǎn)、或者可復(fù)制單元等。另一方面，使用大腸 桿菌作為宿主細(xì)胞的情況下，本發(fā)明的表達(dá)載體可W含有起始密碼子、終止密碼子、終止子 區(qū)域、及可復(fù)制單元。而且本發(fā)明的表達(dá)載體可W根據(jù)目的含有通常所使用的選擇標(biāo)記(例 如四環(huán)素抗性基因、氨節(jié)青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氨葉酸 還原酶基因）。
[0184] 本發(fā)明的表達(dá)載體可W含有能夠與多核巧酸可操作地連接的啟動(dòng)子。作為用于用 動(dòng)物細(xì)胞使本發(fā)明的多核巧酸表達(dá)的啟動(dòng)子，可列舉例如：CMV、RSV、SV40等來(lái)自病毒的啟 動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、EF(elongation factorHa啟動(dòng)子、熱激啟動(dòng)子等。宿主細(xì)胞為大腸 桿菌(例如大腸埃希氏菌屬菌）的情況下，可列舉例如：trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、WL啟動(dòng)子、 tac啟動(dòng)子等。另外，作為酵母中的表達(dá)用啟動(dòng)子，可列舉例如:GAL1啟動(dòng)子、GAL10啟動(dòng)子、 P冊(cè)5啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子等。
[0185] <本發(fā)明的進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞>
[0186] 本發(fā)明的進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞只要用本發(fā)明的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，就沒(méi)有特別 限定，例如，作為用于生產(chǎn)IgG(化R2)-ScFv(TLR4)即本發(fā)明的雙特異性抗體的本發(fā)明的進(jìn) 行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，可列舉用W下表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，該表達(dá)載體包含:含 有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可變區(qū)、該雙特異性抗體中所含的抗 人化R4抗體的重鏈可變區(qū)、及該雙特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基 序列的多核巧酸、和含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基 序列的多核巧酸的任一個(gè)或兩者。
[0187] IgG巧LR2)-scFv(TLR4)即本發(fā)明的進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞包含選自由W下的(a) ~(d)構(gòu)成的組中的、用本發(fā)明的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞：
[0188] (a)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、和含有編碼 由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基 序列的多核巧酸的表達(dá)載體、W及包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸 序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞；
[0189] (b)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由 序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序 列的多核巧酸、及含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2 抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；
[0190] (C)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基 序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;W及
[0191] (d)用包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0192] 在1個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞為選自由W下的（a)~(d)構(gòu) 成的組中的、用本發(fā)明的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞：
[0193] (a)用包含含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的 多核巧酸的表達(dá)載體、和包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕 鏈的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中在抗人化R2抗體重鏈- 抗人化R4抗體scFv融合體中，由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈的C末端經(jīng)由接頭而連結(jié)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列 構(gòu)成的抗人TLR4抗體片段的N末端；
[0194] (b)用包含含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的 多核巧酸和含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多 核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中在抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv 融合體中，在由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的重鏈的C 末端經(jīng)由接頭而連結(jié)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體 片段的N末端。
[01M] (C)用包含含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的 多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中在抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體 scFv融合體中，在由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的重 鏈的C末端經(jīng)由接頭而連結(jié)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 TLR4抗體片段的N末端；W及
[0196] (d)用包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基 序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0197] 在1個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞為選自由W下的（a)~(d)構(gòu) 成的組中的、用本發(fā)明的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞：
[0198] (a)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4 抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體、和包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸 序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì) 胞；
[0199] (b)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4 抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸和含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 TLR2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；
[0200] (C)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4 抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;W及
[0201] (d)用包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基 序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0202] 作為IgG巧LR2)-scFv(TLR4)即本發(fā)明的進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，優(yōu)選列舉：用包 含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體 的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體、和包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；W及用包含含 有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗體重鏈-抗人TLR4抗體scFv融合體的堿 基序列的多核巧酸和含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基 序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0203] 生產(chǎn)本發(fā)明的IgG(化R2)-scFv(TLR4)的方法只要包括將本發(fā)明的進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、并使IgG(TLR2)-scFv(化R4)表達(dá)的工序，就沒(méi)有特別限定。作為該方法 中所使用的優(yōu)選的宿主細(xì)胞，可列舉上述的優(yōu)選的本發(fā)明的進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0204] 作為進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，只要適合于所使用的表達(dá)載體、用該表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn) 化從而能夠表達(dá)抗體，就沒(méi)有特別限定，例如可舉出在本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的天 然細(xì)胞或人工建立的細(xì)胞等各種細(xì)胞(例如，動(dòng)物細(xì)胞(例如CH0-K1SV細(xì)胞）、昆蟲(chóng)細(xì)胞(例 如Sf9)、大腸桿菌(大腸埃希氏菌屬菌等）、酵母(酵母屬、畢赤酵母屬等)等），優(yōu)選可W使用 CH0-K1SV細(xì)胞、CH0-DG44細(xì)胞、293細(xì)胞、NS0細(xì)胞等培養(yǎng)細(xì)胞。
[0205] 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法沒(méi)有特別限定，例如可W使用憐酸巧法、電穿孔法等。
[0206] <生產(chǎn)本發(fā)明的雙特異性抗體的方法及利用該方法所生產(chǎn)的雙特異性抗體>
[0207] 生產(chǎn)本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體的方法只要包括對(duì)本發(fā)明 的進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、并使與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體表達(dá)的工 序，就沒(méi)有特別限定。作為該方法中所使用的優(yōu)選的宿主細(xì)胞，可列舉上述的優(yōu)選的本發(fā)明 的進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0208] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在生產(chǎn)IgG (化R2) -scFv (TLR4)即本發(fā)明的雙特異性抗體的方 法中，包括運(yùn)樣的生產(chǎn)與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體的方法:該方法包括對(duì)選自 由W下的(a)~(C)構(gòu)成的組中的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并使與人化R2及人TLR4結(jié)合的雙特異 性抗體表達(dá)的工序。
[0209] (a)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基 序列的多核巧酸的表達(dá)載體、和包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序 列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿 主細(xì)胞；
[0210] (b)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由 序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序 列的多核巧酸、及含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2 抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;W及
[0211] (C)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基 序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、W及用包含含有編碼由序列號(hào)6的氨 基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧酸 的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0212] 在1個(gè)實(shí)施方式中，生產(chǎn)本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體的方法 包括運(yùn)樣的生產(chǎn)與人TLR2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體的方法:該方法包括對(duì)選自由W下 的(a)~k)構(gòu)成的組中的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并使與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體 表達(dá)的工序。
[0213] (a)用包含含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的 多核巧酸的表達(dá)載體、和包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕 鏈的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中在抗人化R2抗體重鏈- 抗人化R4抗體scFv融合體中，在由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 化R2抗體的重鏈的C末端經(jīng)由接頭而連結(jié)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列 構(gòu)成的抗人TLR4抗體片段的N末端；
[0214] (b)用包含含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的 多核巧酸和含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多 核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中在抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv 融合體中，在由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的重鏈的C 末端經(jīng)由接頭而連結(jié)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體 片段的N末端；W及
[0215] (C)用包含含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的 多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、和用包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列 構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其 中在抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體中，在由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至450的 氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的重鏈的C末端經(jīng)由接頭而連結(jié)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào) 491至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體片段的N末端。
[0216] 在1個(gè)實(shí)施方式中，生產(chǎn)本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體的方法 包括運(yùn)樣的生產(chǎn)與人TLR2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體的方法:該方法包括對(duì)選自由W下 的(a)~k)構(gòu)成的組中的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并使與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體 表達(dá)的工序。
[0217] (a)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗體重鏈-抗人TLR4 抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體、和包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸 序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì) 胞；
[0218] (b)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗體重鏈-抗人TLR4 抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸和含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 TLR2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;W及
[0219] (c)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗體重鏈-抗人TLR4 抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、和用包含含有 編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達(dá)載 體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0220] 進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)可W利用公知方法來(lái)進(jìn)行。培養(yǎng)條件例如溫度、培 養(yǎng)基的pH及培養(yǎng)時(shí)間可適當(dāng)選擇。宿主細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞的情況下，作為培養(yǎng)基，例如可W使 用含有約5~20% 的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基（Science，1959，Vol. 130，No. 3373，p.432-7)、 DMEM 培養(yǎng)基（Virology ,1959, Vol. 8，p. 396)、RPMI 1640 培養(yǎng)基（J. Am. Med. Assoc. ,1967， Vol. 199，p. 519)、199 培養(yǎng)基化邱.Biol.Med. ,1950, Vol. 73，p. 1-8)等。培養(yǎng)基的抑優(yōu)選為 約6~8,培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)需要一邊進(jìn)行通氣或攬拌，一邊在通常約30~4(TC下進(jìn)行約15~72小 時(shí)。宿主細(xì)胞為昆蟲(chóng)細(xì)胞的情況下，作為培養(yǎng)基，例如可W使用含有胎牛血清的Grace's培 養(yǎng)基(Proc.化11.4。日(1.5(31.1]54，1985，￥〇1.82,9.8404)等。培養(yǎng)基的抑優(yōu)選為約5~8，培養(yǎng) 時(shí)，根據(jù)需要一邊進(jìn)行通氣或攬拌，一邊在通常約20~40°C下進(jìn)行約15~100小時(shí)。宿主細(xì) 胞為大腸桿菌或酵母的情況下，作為培養(yǎng)基，例如含有營(yíng)養(yǎng)源的液體培養(yǎng)基是適當(dāng)?shù)摹I(yíng)養(yǎng) 培養(yǎng)基優(yōu)選含有進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)所必需的碳源、無(wú)機(jī)氮源或有機(jī)氮源。作為 碳源，例如可列舉葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、薦糖等，作為無(wú)機(jī)氮源或有機(jī)氮源，例如可 列舉錠鹽類(lèi)、硝酸鹽類(lèi)、氨基酸、玉米漿、腺、酪蛋白、肉類(lèi)提取物、大豆巧、馬鈴馨提取液等。 根據(jù)期望可W含有其它營(yíng)養(yǎng)素(例如，無(wú)機(jī)鹽(例如氯化巧、憐酸二氨鋼、氯化儀）、維生素類(lèi) 等）、抗生素(例如四環(huán)素、新霉素、氨節(jié)青霉素、卡那霉素等）。培養(yǎng)基的抑優(yōu)選為約5~8。宿 主細(xì)胞為大腸桿菌的情況下，作為優(yōu)選的培養(yǎng)基，例如可W使用LB培養(yǎng)基、M9培養(yǎng)基 (Mol.Clo.，Cold Spring 化rbor Laborato;ry，Vol.3，A2.2)等。培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)需要一邊進(jìn)行 通氣或攬拌，一邊在通常約14~39°C下進(jìn)行約3~24小時(shí)。宿主細(xì)胞為酵母的情況下，作為 培養(yǎng)基，例如可 W 使用Burkholder 基本培養(yǎng)基（Proc.化 tl. Acad. Sci.USA，1980, Vol. 77， P .4505)等。培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)需要一邊進(jìn)行通氣或攬拌，一邊在通常約20~35°C下進(jìn)行約14~ 144小時(shí)。通過(guò)如上所述的培養(yǎng)，可W使本發(fā)明的與人化R2和人化R4結(jié)合的雙特異性抗體表 達(dá)。
[0221] 生產(chǎn)本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體的方法除了包括對(duì)如上所 述的進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、并使本發(fā)明的雙特異性抗體表達(dá)的工序之外，還可 W進(jìn)一步包括從該進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中回收(優(yōu)選分離或精制)本發(fā)明的雙特異性抗 體的工序。作為分離或精制方法，例如可列舉:鹽析、溶劑沉淀法等利用溶解度的方法，透 析、超濾、凝膠過(guò)濾等利用分子量差的方法，離子交換色譜或徑基憐灰石色譜等利用電荷的 方法，親和色譜法等利用特異親和性的方法，反相高效液相色譜等利用疏水性差的方法，等 電點(diǎn)電泳等利用等電點(diǎn)差的方法等。優(yōu)選的是，蓄積于培養(yǎng)上清液中的抗體可W利用各種 色譜法(例如使用了Protein A柱或Protein G柱的各種柱色譜法)進(jìn)行精制。
[0222] <本發(fā)明的醫(yī)藥組合物>
[0223] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物包含含有本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體 及藥學(xué)上可接受的賦形劑的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可W使用該領(lǐng)域中通常所用 的賦形劑（即，藥劑用賦形劑或藥劑用載體等)并通過(guò)通常所使用的方法來(lái)制備。作為運(yùn)些 醫(yī)藥組合物的劑型的實(shí)例，例如可列舉注射劑、點(diǎn)滴用劑等非經(jīng)口劑，可W通過(guò)靜脈內(nèi)給 藥、皮下給藥等進(jìn)行給藥。在制劑時(shí)，可w在藥學(xué)上所允許的范圍內(nèi)使用與運(yùn)些劑型相應(yīng)的 載體或添加劑等。
[0224] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可W含有多種本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性 抗體。例如，含有沒(méi)有經(jīng)受翻譯后修飾的抗體、W及通過(guò)該抗體的翻譯后修飾而生成的抗體 的醫(yī)藥組合物也包含在本發(fā)明中。
[0225] 在1個(gè)實(shí)施方式中，含有與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體的本發(fā)明的醫(yī)藥 組合物也包含下述中記載的醫(yī)藥組合物。
[0226] 一種醫(yī)藥組合物，其包含下述與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體，該雙特異 性抗體為含有1)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的重鏈 可變區(qū)、及由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體的輕鏈可變 區(qū)、W及
[0227] 2)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的重鏈可 變區(qū)、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R4抗體的輕鏈可變 區(qū)的、與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體、W及
[0228] 通過(guò)該雙特異性抗體的翻譯后修飾而生成的雙特異性抗體。
[0229] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物也包含運(yùn)樣的醫(yī)藥組合物，其含有:重鏈C末端的賴氨酸缺失 的雙特異性抗體、經(jīng)受了 N末端翻譯后修飾的雙特異性抗體、重鏈C末端賴氨酸缺失且經(jīng)受 了 N末端翻譯后修飾的雙特異性抗體、和/或具有重鏈C末端賴氨酸且沒(méi)有經(jīng)受N末端翻譯后 修飾的雙特異性抗體。
[0230] 在1個(gè)實(shí)施方式中，含有下述（1)和（2)的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體 的醫(yī)藥組合物也包含在本發(fā)明中。
[0231] (1)含有由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成、氨基酸序號(hào)1的谷氨酸被修飾為焦谷氨酸 的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體、及由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人 TLR2抗體的輕鏈的、與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體。
[0232] (2)含有由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融 合體、及由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗體的輕鏈的、與人TLR2及人TLR4結(jié)合的 雙特異性抗體。
[0233] 進(jìn)而，在1個(gè)實(shí)施方式中，含有與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體的本發(fā)明的 醫(yī)藥組合物也包含下述中記載的醫(yī)藥組合物。
[0234] 一種醫(yī)藥組合物，其包含與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體、及藥學(xué)上可接 受的賦形劑，所述與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體含有由序列號(hào)4所示的氨基酸序 列構(gòu)成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體及由序列號(hào)6所示的氨基酸序列構(gòu) 成的抗人TLR2抗體的輕鏈。
[0235] 在上述制劑化時(shí)本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體的添加量根據(jù) 患者的癥狀程度或年齡、使用的制劑的劑型、或抗體的結(jié)合效價(jià)等而不同，例如可W使用 0.0 Olmg/kg ~lOOmg/kg左右。
[0236] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可W作為人化R2及人化R4參與病態(tài)形成的免疫炎癥性疾病 (例如敗血癥、急性腎損傷、慢性腎臟病、急性呼吸窘迫綜合征、硬皮病、急性膜腺炎、慢性閉 塞性肺疾病等)的預(yù)防或治療劑使用。
[0237] 本發(fā)明包括免疫炎癥性疾病的預(yù)防或治療用醫(yī)藥組合物，其含有本發(fā)明的與人 化R2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體。另外，本發(fā)明包括預(yù)防或治療免疫炎癥性疾病的方法， 包括施用治療有效量的該雙特異性抗體的工序。另外，本發(fā)明包括用于在免疫炎癥性疾病 的預(yù)防或治療中使用的本發(fā)明的雙特異性抗體。此外，本發(fā)明包括本發(fā)明的雙特異性抗體 在免疫炎癥性疾病的預(yù)防或治療用醫(yī)藥組合物制造中的用途。
[0238] <本發(fā)明的抗人TLR2抗體及含有其的醫(yī)藥組合物>
[0239] 本發(fā)明含有抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含含有由序列號(hào)8的氨基酸序 號(hào)31至35的氨基酸序列構(gòu)成的CDR1、由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)50至66的氨基酸序列構(gòu)成的 CDR2、及由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)99至109的氨基酸序列構(gòu)成的CDR3的抗人化R2抗體的重鏈 可變區(qū)、W及含有由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)24至39的氨基酸序列構(gòu)成的CDR1、由序列號(hào)6的 氨基酸序號(hào)55至61的氨基酸序列構(gòu)成的CDR2、及由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)94至102的氨基酸 序列構(gòu)成的CDR3的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)。
[0240] 另外，本發(fā)明也包含含有由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的重 鏈可變區(qū)及由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗人化R2抗 體或其抗原結(jié)合片段、W及通過(guò)該抗體或其抗原結(jié)合片段的翻譯后修飾而生成的抗體或其 抗原結(jié)合片段。作為翻譯后修飾的實(shí)例，可列舉重鏈可變區(qū)N末端的焦谷氨酷化和/或重鏈C 末端的賴氨酸缺失。在本發(fā)明的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段中優(yōu)選的重鏈恒定區(qū)及輕 鏈恒定區(qū)與關(guān)于上述的< 本發(fā)明的雙特異性抗體> 中的抗人化R2抗體所記載的重鏈恒定 區(qū)及輕鏈恒定區(qū)相同。
[0241] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗人TLR2抗體為具有下述的特征的抗人TLR2抗體。
[0242] 含有由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈及由序列號(hào)6的氨 基酸序列構(gòu)成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0243] 進(jìn)而，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗人化R2抗體為具有下述的特征的抗人化R2 抗體。
[0244] 含有由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)1至449的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈及由序列號(hào)6的氨 基酸序列構(gòu)成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0245] 本發(fā)明的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段可W使用含有各自編碼上述的本發(fā)明 的雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核巧 酸，參照上述的 <本發(fā)明的表達(dá)載體 >、<本發(fā)明的進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞 >及< 生產(chǎn)本 發(fā)明的雙特異性抗體的方法及利用該方法所生產(chǎn)的雙特異性抗體>的記載由本領(lǐng)域技術(shù) 人員容易地生產(chǎn)。
[0246] 本發(fā)明也包含含有本發(fā)明的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段、及藥學(xué)上可接受的 賦形劑的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可W使用該領(lǐng)域中通常所用的賦形劑（即，藥劑 用賦形劑或藥劑用載體等)并通過(guò)通常所使用的方法來(lái)制備。作為運(yùn)些醫(yī)藥組合物的劑型 的實(shí)例，例如可列舉注射劑、點(diǎn)滴用劑等非經(jīng)口劑，可W通過(guò)靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥等進(jìn)行 給藥。在制劑時(shí)，可W在藥學(xué)上所允許的范圍內(nèi)使用與運(yùn)些劑型相應(yīng)的賦形劑、載體、添加 劑等。
[0247] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可W含有多種本發(fā)明的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段。例 如，含有沒(méi)有經(jīng)受翻譯后修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段、及通過(guò)該抗體或其抗原結(jié)合片段 的翻譯后修飾而生成的抗體或其抗原結(jié)合片段的醫(yī)藥組合物也包含在本發(fā)明中。
[0248] 在1個(gè)實(shí)施方式中，含有抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段的本發(fā)明的醫(yī)藥組合物 也包含下述中記載的醫(yī)藥組合物。
[0249] 包含含有由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)及由序 列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合 片段、W及作為通過(guò)該抗體或其抗原結(jié)合片段的翻譯后修飾而生成的抗體或其抗原結(jié)合片 段的抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段的醫(yī)藥組合物。
[0250] 在1個(gè)實(shí)施方式中，在含有抗人化R2抗體的本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中，含有下述（1) 至(4)的與人TLR2結(jié)合的抗體的醫(yī)藥組合物也包含在本發(fā)明中。
[0251] (1)含有由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)1至449的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈及由序列號(hào)6所 示的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0252] (2)含有由序列號(hào)8所示的氨基酸序列構(gòu)成且氨基酸序號(hào)1的谷氨酸被修飾為焦谷 氨酸的重鏈及由序列號(hào)6所示的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0253] (3)含有由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)1至449的氨基酸序列構(gòu)成且氨基酸序號(hào)1的谷氨 酸被修飾為焦谷氨酸的重鏈及由序列號(hào)6所示的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0254] (4)含有由序列號(hào)8所示的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈及由序列號(hào)6所示的氨基酸序列 構(gòu)成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0255] 進(jìn)而，在一個(gè)實(shí)施方式中，在含有抗人化R2抗體的本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中，下述的 含有與人TLR2結(jié)合的抗體的醫(yī)藥組合物也包含在本發(fā)明中。
[0256] 包含含有由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈及由序列號(hào)6 的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈的抗人化R2抗體、含有由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)1至449的氨基酸 序列構(gòu)成的重鏈及由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈的抗人化R2抗體、及藥學(xué)上可接受 的賦形劑的醫(yī)藥組合物。
[0257] 在上述制劑化時(shí)，本發(fā)明的抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段的添加量根據(jù)患者的 癥狀程度或年齡、使用的制劑的劑型、或抗體的結(jié)合效價(jià)等而不同，例如可W使用O.OOlmg/ kg ~lOOmg/kg 左右。
[0258] 本發(fā)明的抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段根據(jù)需要進(jìn)一步進(jìn)行精制之后，按照常 規(guī)方法進(jìn)行制劑化，可W用于治療敗血癥、癌等人TLR2參與病態(tài)形成的疾病。
[0259] <融合抗體及修飾抗體>
[0260] 如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員，則也可W使用該領(lǐng)域中公知的方法將與人化R2及人化R4 結(jié)合的雙特異性抗體、抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段制作成融合有其它膚或蛋白質(zhì)的融 合抗體，或制作成使之與修飾劑結(jié)合而成的修飾抗體。本發(fā)明的與人TLR2及人TLR4結(jié)合的 雙特異性抗體、抗人化R2抗體或其抗原結(jié)合片段也包含運(yùn)種融合體或修飾體的形態(tài)的抗體 或抗原結(jié)合片段。只要本發(fā)明的與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體作為融合抗體具有 對(duì)人TLR2及人TLR4的結(jié)合活性、或本發(fā)明的抗人TLR2抗體或其抗原結(jié)合片段作為融合抗體 具有對(duì)人化R2的結(jié)合活性，則用于融合的其它膚或蛋白質(zhì)沒(méi)有特別限定，例如，可列舉:人 血清白蛋白、各種標(biāo)記膚、人工螺旋基序膚、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)、谷脫甘膚S轉(zhuǎn)移酶、各種毒 素、能夠促進(jìn)多聚化的其它膚或蛋白質(zhì)等。只要本發(fā)明的與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異 性抗體作為融合抗體具有對(duì)人化R2及人化R4的結(jié)合活性、或本發(fā)明的抗人化R2抗體或其抗 原結(jié)合片段作為修飾抗體具有對(duì)人化R2的結(jié)合活性，則用于修飾的修飾劑沒(méi)有特別限定， 可列舉例如聚乙二醇、糖鏈、憐脂、脂質(zhì)體、低分子化合物等。
[0261] 為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行理解在此提供參考的特定實(shí)施例，但是它們作為例示性 目的，而并不限定本發(fā)明。
[0262] 實(shí)施例
[0263] 關(guān)于使用了市售試劑盒或試劑等的部分，如果沒(méi)有特殊說(shuō)明，則按照隨附的實(shí)驗(yàn) 方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。另外，為了方便，將濃度mol/L表示為M。例如，1M氨氧化鋼水溶液是指Imol/L 的氨氧化鋼水溶液。（實(shí)施例1:產(chǎn)生抗人TLR2抗體的雜種瘤的制作）
[0264] 使用人單克隆抗體開(kāi)發(fā)技術(shù) "Veloclmmune" (Velocimmune antibody technology; Regeneron公司（美國(guó)專利6596541號(hào)））小鼠制作抗人化R2抗體。與引起免疫反 應(yīng)的佐劑一起，用人化32蛋白質(zhì)（R&D systems公司、2616-TR-050)免疫Velocimmune小鼠。 按照常規(guī)方法摘出免疫后的小鼠的脾臟或淋己節(jié)等并收集淋己細(xì)胞，將其與小鼠骨髓瘤細(xì) 胞SP2/0(ATCC:邸L-1581)進(jìn)行細(xì)胞融合而制作雜種瘤。進(jìn)行單克隆化，在作為無(wú)血清培養(yǎng) 基的CD雜種瘤培養(yǎng)基（ク^フテ夕7 口公一乂社）中進(jìn)行培養(yǎng)。由得到的培養(yǎng)上清液使用 Protein G柱(GE~瓜乂少7社）將抗體進(jìn)行精制。在Velocimmune技術(shù)中，使用了內(nèi)源性的 免疫球蛋白重鏈及輕鏈的可變區(qū)被對(duì)應(yīng)的人可變區(qū)取代的轉(zhuǎn)基因小鼠，因此，得到的抗體 為具有人抗體的可變區(qū)和小鼠抗體的恒定區(qū)的抗體(也稱為嵌合抗體）。
[0265] (實(shí)施例2:抗人TLR2抗體的中和活性評(píng)價(jià)）
[0266] 為了評(píng)價(jià)實(shí)施例1中確定的抗人化R2抗體的中和活性，使用內(nèi)源性表達(dá)人化R2的 人單核系細(xì)胞THPl-xBlue細(xì)胞，檢測(cè)對(duì)化R2/6激動(dòng)劑Pam2CSK4誘導(dǎo)堿性憐酸酶(AP)產(chǎn)生的 抑制。
[0267] 其結(jié)果可知:命名為31-5F5-2F3的抗人化R2抗體(嵌合抗體)抑制了 AP產(chǎn)生，具有 對(duì)人TLR2的中和活性。
[0268] (實(shí)施例3:抗人TLR2抗體的序列確定及突變體制作）
[0269] 由產(chǎn)生抗人化R2抗體31-5巧-2F3的雜種瘤解析編碼抗體的重鏈及輕鏈的基因的 序列，進(jìn)行序列確定。
[0270] 抗體的序列確定后，為了提高抗體的物性及穩(wěn)定性，將31-5F5-2F3的重鏈及輕鏈 的FR替換為其它人抗體的FR，制作抗人TLR2抗體31-5巧-2F3 .ml。
[0271] (實(shí)施例4:完全人型抗人TLR2抗體的制作）
[0272] 實(shí)施例3中制作的抗體為可變區(qū)源自人、恒定區(qū)源自小鼠的抗體。因此，使用哺乳 細(xì)胞表達(dá)用載體GS載體化onza公司）構(gòu)建含有重鏈及輕鏈的兩基因的表達(dá)載體，制作完全 人型抗體。具體而言，在31-5F5-2F3.ml的抗體的重鏈可變區(qū)基因的5'側(cè)連接編碼信號(hào)序列 (化gel 怖ittle等、Protein Enginee;ring、1987、Vol. l、No.6、p.499-505.)的基因，而且在 3'側(cè)連接人Ig 丫 1恒定區(qū)基因（由序列號(hào)7的堿基編號(hào)361至1350的堿基序列構(gòu)成），將該重 鏈基因插入于GS載體pEE6.4。另外，在輕鏈可變區(qū)基因的5'側(cè)連接編碼信號(hào)序列（Nigel Whittle等、前述）的基因，而且在3'側(cè)連接人K鏈的恒定區(qū)基因（由序列號(hào)5的堿基編號(hào)340 至657的堿基序列構(gòu)成），將該輕鏈基因插入于GS載體祀E12.4。
[0273] 用測(cè)序儀分析插入于pEE6.4的抗體的重鏈基因序列、插入于PEE12.4的抗體的輕 鏈基因序列，由該結(jié)果得到的氨基酸序列，參照Kabat等的數(shù)據(jù)庫(kù)（"Sequences of Proteins of Immunological Interest''、US Department of Health and Human Services'US Government Printing Office)確定CDR序列。
[0274] 將制作的31-5F5-2F3.ml的完全人型抗體(完全人型31-5F5-2F3.ml)的重鏈的堿 基序列示于序列號(hào)7,將由此所編碼的氨基酸序列示于序列號(hào)8,將該抗體的輕鏈的堿基序 列示于序列號(hào)5,將由此所編碼的氨基酸序列示于序列號(hào)6。
[0275] 序列號(hào)8所示的重鏈的可變區(qū)由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成， 重鏈的CDR1、CDR2、CDR3分別由序列號(hào)8的氨基酸序號(hào)31至35、50至66、99至109的氨基酸序 列構(gòu)成。序列號(hào)6所示的輕鏈的可變區(qū)由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成， 輕鏈的CDR1、CDR2、CDR3分別由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)24至39、55至61、94至102的氨基酸序 列構(gòu)成。
[0276] 使用分別插入有抗體的重鏈和輕鏈的基因的上述的GS載體，用瞬時(shí)表達(dá)及永久表 達(dá)運(yùn)兩種方法進(jìn)行抗體表達(dá)。關(guān)于瞬時(shí)表達(dá)，對(duì)于在化eeSt^e 293Expression medium(弓 斗フテ夕7 口公一乂社）中W約100萬(wàn)cells/mL培養(yǎng)的Freestyle 293細(xì)胞（弓^フテ夕7 口公一乂社），使用基因?qū)朐噭?93Fectin(^ 斗フテ夕7 口公一乂社)將上述的重鏈及輕 鏈的兩表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)7天?；蛘?，對(duì)于在Expi293Expression medium(^ ^フテ夕7 口 公一乂社）中W約300萬(wàn)ce 11 s/mL培養(yǎng)的E邱i293細(xì)胞（弓^ 7テ夕7 口公一乂社），使用基 因?qū)朐噭〦邱iFectamine293(ク^フテ夕7口ッ一乂社）將上述的重鏈及輕鏈的兩表達(dá) 載體轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)7天?；蛘?，對(duì)于在CD-C冊(cè)medium(ク^フテ夕7 口公一乂社）中W約1000萬(wàn) cells/mL培養(yǎng)的C冊(cè)-K1SV細(xì)胞化onza公司），使用電穿孔法將上述的重鏈及輕鏈的兩表達(dá) 載體轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)7天。將培養(yǎng)上清液使用Protein A或Protein G柱（均為GE~瓜乂少7社)進(jìn) 行精制，得到完全人型抗體的精制抗體。關(guān)于永久表達(dá)，將分別插入有抗體的重鏈和輕鏈的 基因的上述的GS載體用Notl和Pvul進(jìn)行限制酶切斷，使用連接用試劑盒Ligation- Convenience Kit(NIPP0NGE肥公司）或連接試劑Ligation-higMTOYOBO公司）進(jìn)行連接，構(gòu) 建插入有重鏈和輕鏈的兩基因的GS載體。該表達(dá)載體編碼全長(zhǎng)的重鏈及輕鏈和谷氨酷胺合 成酶，通過(guò)對(duì)C冊(cè)-K1SV細(xì)胞的轉(zhuǎn)染使抗體表達(dá)。將培養(yǎng)上清液用Protein A柱或Protein G 柱進(jìn)行精制，得到完全人型抗體的精制抗體。（實(shí)施例5:完全人型抗人化R2抗體的結(jié)合活性 評(píng)價(jià)）
[0277] 為了評(píng)價(jià)實(shí)施例4中制作的完全人型31-5巧-2F3.ml對(duì)人化R2的結(jié)合活性，實(shí)施 SPR分析。
[027引在sra分析中，使用Biacore T200(GE~瓜乂少7社）。使用His Capture Kit(GE~ 瓜乂少7社、28-9950-56)和Amine Coupling Kit(GE~瓜乂少7社、BR-1000-50)將Anti- His IgG化is CapUire Kit附屬）固定于CM5傳感器忍片（GE~瓜乂少7社、BR-1005-30)。將 流路No. 1作為參照，在該流路上不結(jié)合人化R2蛋白質(zhì)，分別在其它流路(No. 2、No. 3、No .4) 上W流速化L/分鐘添加用皿S-EP+buffer(GE~瓜乂少7社、BR-1006-69)稀釋為0.66iig/mL 的人化R2蛋白質(zhì)(R&Dsystems公司、2616-TR-050)2分鐘，并使其固相化。其后，W流速50化/ 分鐘添加將完全人型31-5F5-2F3.ml用皿S-EP+buffer稀釋為200nM的溶液2分鐘，測(cè)定完全 人型抗體和人化R2的結(jié)合。接著，W流速50化/分鐘添加皿S-EP+buff er 5分鐘，測(cè)定完全人 型抗體和人化R2的解離。用Fit local分析二價(jià)分析物模型、Rmax，算出結(jié)合速度常數(shù)化a) 及解離速度常數(shù)化d)，用kd除Wka，由此算出結(jié)合解離常數(shù)化D)。
[02巧]其結(jié)果可知:邸為88.5pM，完全人型31-5F5-2F3.ml具有對(duì)人TLR2的結(jié)合活性。
[0280] (實(shí)施例6:完全人型抗人TLR2抗體的中和活性評(píng)價(jià)）
[0281] 為了評(píng)價(jià)實(shí)施例4中制作的完全人型31-5巧-2F3.ml對(duì)人化R2的中和活性，使用 THPl-xBlue細(xì)胞實(shí)施Pam2CSK4誘導(dǎo)AP產(chǎn)生抑制檢測(cè)。W在96孔板（貝克頓-迪金森公司）上 W75化/孔在RPMI1640培養(yǎng)基（弓斗フテ夕7 口公一乂社）下接種THPl-xBlue細(xì)胞 (Invivogen公司、thpx-sp)使之成為5X 104cells/孔。細(xì)胞接種后立即添加25化的在855nM ~2.19pM的范圍內(nèi)用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋了9級(jí)的完全人型31-5巧-2F3 .ml，并在37°C、5% C〇2條件下培養(yǎng)30分鐘。進(jìn)而，添加25化用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的化m2CSK4(Invivogen公 司、tlrl-pm2s;最終濃度lOOng/mL)。作為對(duì)照，準(zhǔn)備取代抗體而添加有RPMI1640培養(yǎng)基的 孔，準(zhǔn)備取代化m2CSK4而添加有RPMI1640培養(yǎng)基的孔。在37 °C、5 %C〇2條件下培養(yǎng)一夜之 后，回收培養(yǎng)上清液，使用市售的Quanti-Blue(Invivogen公司）測(cè)定培養(yǎng)上清液中所含的 AP濃度。進(jìn)一步算出抗體對(duì)于Pam2CSK4誘導(dǎo)AP產(chǎn)生的IC50值。在計(jì)算IC50值時(shí)，將取代抗體 而添加有RPMI1640培養(yǎng)基的孔設(shè)為0 %抑制對(duì)照，將取代Pam2CSK4而添加有RPMI1640培養(yǎng) 基的孔作為100%抑制對(duì)照設(shè)定。通過(guò)4參數(shù)logistic曲線擬合來(lái)計(jì)算IC50值。
[0282] 其結(jié)果，完全人型31-5巧-2F3 .ml抑制AP產(chǎn)生，I巧0值為97.7pM?？芍和耆诵?31-5F5-2F3. ml具有對(duì)人TLR2的中和活性。
[0283] (實(shí)施例7:完全人型抗人TLR2抗體的中和活性評(píng)價(jià)(2))
[0284] 為了評(píng)價(jià)實(shí)施例4中制作的完全人型31-5巧-2F3.ml對(duì)人化R2的中和活性，使用 THPl-xBlue細(xì)胞實(shí)施Pam2CSK4誘導(dǎo)AP產(chǎn)生抑制檢測(cè)。作為比較抗體，使用作為抗人化R2抗 體的T2.5(專利文獻(xiàn)1)及0PN305(專利文獻(xiàn)3)。
[0285] 對(duì)于完全人型31-5F5-2F3.ml(在855nM~2.19pM的范圍內(nèi)WRPMI1640培養(yǎng)基稀釋 9級(jí)）、T2.5(在83：3nM~2.13pM的范圍內(nèi)WRPMI1640培養(yǎng)基稀釋9級(jí)）、W及0PN305(在861nM ~2.20pM的范圍內(nèi)WRPMI1640培養(yǎng)基稀釋9級(jí)）的巧巾抗體實(shí)施與實(shí)施例6同樣的實(shí)驗(yàn)，并通 過(guò)4參logistic曲線擬合算出IC50值。
[02化]其結(jié)果，完全人型31-5F5-2F3.ml完全抑制Pam2CSK4誘導(dǎo)引起的AP產(chǎn)生，I巧0值為 130pM。另一方面，T2.5及0PN305的Pam2CSK4誘導(dǎo)引起的AP產(chǎn)生抑制為部分的（圖2)。
[0287] (實(shí)施例8:與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體的制作）
[0288] 制作含有抗人化R2抗體(IgG抗體)和抗人化R4抗體單鏈可變區(qū)片段(scFv)的兩種 抗人化R2及抗人化R4雙特異性抗體。本實(shí)施例中制作的雙特異性抗體為上述的IgG(化R2)- scFv(TLR4)型的雙特異性抗體，具有在抗人化R2抗體的各重鏈的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)抗人 TLR4抗體scFv的N末端的結(jié)構(gòu)（圖1)。
[0289] 使用PCR法在實(shí)施例4中制作的完全人型31-5巧-2F3.ml的重鏈基因的3'末端連結(jié) 編碼GS接頭(序列號(hào)9)的基因，進(jìn)而使用PCR法在編碼該GS接頭的基因的3'末端連結(jié)編碼抗 人化34抗體scFv的基因，制作將完全人型31-5F5-2F3.ml的重鏈的C末端和抗人化34抗體 scFv的N末端用該GS接頭連結(jié)的、編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的基 因。該基因所編碼的該融合體中所含的抗人化R4抗體scFv由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 732的氨基酸序列構(gòu)成，具有在由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈 可變區(qū)的C末端經(jīng)由GS接頭(序列號(hào)10)連結(jié)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序 列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)的N末端的結(jié)構(gòu)。將制作的抗人TLR2抗體重鏈-抗人TLR4抗體scFv融合 體稱為ICU-1-Ig 丫 1重鏈。在ICU-1-Ig 丫 1重鏈基因的5'側(cè)連接編碼信號(hào)序列（Nigel Whittle等、前述)的基因，并插入于祀E6.4載體。
[0巧0] 另外，制作在ICU-1-Ig 丫 1重鏈的人Ig 丫 1重鏈恒定區(qū)導(dǎo)入有L2%A、L235A、及 I253A的氨基酸突變的改變型的ICU-1-Ig 丫 1重鏈(稱為ICU-1-Ig 丫 1-LAsh重鏈)的基因，將 該基因插入于祀E6.4載體。
[0巧1] 將插入有ICU-1-Ig 丫 1重鏈基因或ICU-1-Ig 丫 1-LAsh重鏈基因的祀E6.4載體和實(shí) 施例4中制作的插入有完全人型31-5巧-2F3.ml的輕鏈基因的祀E12.4組合，使用與實(shí)施例4 中記載的抗體的表達(dá)及精制法同樣的方法，制作兩種與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗 體。
[0292] 將含有ICU-1-Ig 丫 1重鏈和完全人型31-5F5-2F3.ml的輕鏈的雙特異性抗體稱為 完全人型ICU-1-Ig 丫 1，將含有ICU-1-Ig 丫 1-LAsh重鏈和完全人型31-5巧-2F3 .ml的輕鏈的 雙特異性抗體稱為完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh。
[029；3]將完全人型ICU-1-Ig 丫 1的ICU-1-Ig 丫 1重鏈的堿基序列示于序列號(hào)1，將由此所 編碼的氨基酸序列示于序列號(hào)2。將完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh的ICU-1-Ig 丫 1-LAsh重鏈 的堿基序列示于序列號(hào)3,將由此所編碼的氨基酸序列示于序列號(hào)4。
[0294]序列號(hào)2所示的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體中所含的抗人化R2 抗體重鏈由序列號(hào)2的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成。
[0巧日]序列號(hào)4所示的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體中所含的抗人化R2 抗體重鏈由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成。
[0296] 序列號(hào)2及序列號(hào)4所示的所述兩個(gè)抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體 中所含的抗人化R2抗體重鏈的可變區(qū)是共通的，由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸 序列構(gòu)成，該重鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2、CDR3分別由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)31至35、50至66、 99至109的氨基酸序列構(gòu)成。
[0297] 序列號(hào)2及序列號(hào)4所示的所述兩個(gè)抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體 中所含的抗人化R4抗體scFv是共通的，由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列構(gòu) 成，構(gòu)成該抗人化R4抗體scFv的抗人化R4抗體的重鏈可變區(qū)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成，該重鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2、CDR3分別由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)521 至525、540至556、589至598的氨基酸序列構(gòu)成。構(gòu)成該抗人化R4抗體scFv的抗人化R4抗體 的輕鏈可變區(qū)由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成，該輕鏈可變區(qū)的CDR1、 CDR2、CDR3分別由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)648至658、674至680、713至721的氨基酸序列構(gòu)成。
[0298] 完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh的輕鏈的堿基序列是共通 的，將該堿基序列示于序列號(hào)5,將由此所編碼的氨基酸序列示于序列號(hào)6。序列號(hào)6所示的 抗人化R2抗體輕鏈的可變區(qū)由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成，該輕鏈可 變區(qū)的CDR1、CDR2、CDR3分別由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)24至39、55至61、94至102的氨基酸序 列構(gòu)成。
[0299] (實(shí)施例9:與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體的結(jié)合活性評(píng)價(jià)）
[0300] 為了評(píng)價(jià)實(shí)施例8中制作的兩種雙特異性抗體對(duì)人化R2及人化R4的各自的結(jié)合活 性，使用人化R2蛋白質(zhì)及人化R4/MD2蛋白質(zhì)進(jìn)行化ISA。在透明的MAXIS0RP384孔板(哥一子 フ々/シ中一哥斗工シテ^フ々/夕社）中W15化/孔添加用PBS(^ 斗フテ夕7 口公一乂社、 10010-023)稀釋為lOiig/mL的濃度的人化32蛋白質(zhì)（R&D systems公司、2616-TR-050)，在室 溫下固相化1小時(shí)。同樣地，W15化/孔添加 lOiig/mL的濃度的人I'LRA/MDS蛋白質(zhì)（R&D systems公司、3146-TM/CF)，在室溫下固相化1小時(shí)。在1小時(shí)后用清洗液(含0.05%Tween- 20的Tris緩沖生理食鹽水(TBS))清洗孔3次，W10化L/孔添加 Blocking化e(十力弓^テ乂 夕社、03953-95)，在室溫下進(jìn)行封閉1小時(shí)。再次用清洗液清洗3次，分別對(duì)固相化有人化R2 蛋白質(zhì)的孔、固相化有人化R4/MD2蛋白質(zhì)的孔W15化/孔添加實(shí)施例8中制作的兩種雙特異 性抗體。使用等量混合有PBS及Blocking One的反應(yīng)緩沖液進(jìn)行運(yùn)些抗體的稀釋，從75. OnM 至4.47fM稀釋13級(jí)。在室溫下靜置1小時(shí)后，用清洗液進(jìn)行清洗3次。W15化/孔添加用反應(yīng) 緩沖液將人IgG重鏈輕鏈交叉吸附抗體化uman IgG-heavy and light chain cross- adsorbed Antibody) (BETHYL 公司、 A80-219P) 稀釋 4000 倍而成的液體 ，在室溫下靜置 1 小 時(shí)。用清洗液清洗3次，W 15化/孔添加 TMB PEROXIDASE SUBSTRATE化ISA(M0SS公司、# TMBE-500)。15分鐘后在固相化有人化R2蛋白質(zhì)的孔中W15化/孔添加1M硫酸（和光純藥工 業(yè)公司、198-09595)而停止反應(yīng)。5分鐘后在固相化有人化R4/MD2蛋白質(zhì)的孔中W15化/孔 添加1M硫酸而停止反應(yīng)。用Safire2(TECAN公司）測(cè)定450皿處的吸光度，分別算出相對(duì)于人 化R2蛋白質(zhì)及人化R4/MD2蛋白質(zhì)的各抗體的EC50值。在計(jì)算EC50值時(shí)，由縱軸W測(cè)定值描 繪、橫軸W抗體濃度值描繪的圖表上的Sigmoid曲線的形狀，將隨著濃度的上升可W判斷為 測(cè)定值達(dá)到收斂值的各抗體的測(cè)定值的最大值設(shè)定為100%，將隨著抗體濃度的下降可W 判斷為測(cè)定值達(dá)到收斂值的各抗體的測(cè)定值的最小值設(shè)定為0%。將通過(guò)4參數(shù)logistic曲 線擬合算出的EC50值示于W下(表1、表2)。
[0301] 表1:相對(duì)于人TLR2蛋白質(zhì)的結(jié)合活性
[0302] [表1]
[0303] _
[0304]表2:相對(duì)于人TLR4/MD2蛋白質(zhì)的結(jié)合活性
[0305][表 2] 「nwAl
[0307] ~其結(jié)果可知：完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh與人化32蛋白' 質(zhì)及人TLR4/MD2蛋白質(zhì)運(yùn)兩者結(jié)合。
[0308] (實(shí)施例10:與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體的正常人末梢血單核細(xì)胞綠 脈桿菌死菌誘導(dǎo)TN陽(yáng)產(chǎn)生抑制檢測(cè)）
[0309] 為了評(píng)價(jià)實(shí)施例8中制作的雙特異性抗體的中和活性，使用內(nèi)源性表達(dá)人化R2及 人化R4/MD2的人末梢血單核細(xì)胞實(shí)施綠脈桿菌死菌誘導(dǎo)TWa產(chǎn)生抑制檢測(cè)。已知的是，綠 脈桿菌Pseudomonas aeruginosa為敗血癥的致病菌的一個(gè)，刺激人末梢血單核細(xì)胞上的 TLR2和TLR4并產(chǎn)生TN陽(yáng)（Scand.J. Immunol.、2008、V〇1.67、No.2、p. 193-203)。
[0310] 在384孔板シ夕社）中使用含有適當(dāng)制備成終濃度10~30%的人血清化onza公 司、14-490E)的RPMI1640培養(yǎng)基（弓^ 7テ夕7 口公一乂社）W30化/孔接種正常人末梢血 單核細(xì)胞化onza公司、CC-2702)使之成為1.875X 104cells/孔。其后立即添加在375nM~ 7.680fM的范圍內(nèi)用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋12級(jí)的精制抗體完全人型ICU-1-Ig 丫 1或在5(K)nM ~10.24fM的范圍內(nèi)用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋13級(jí)的完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh 10化，并在 37°C、5%C02條件下培養(yǎng)30分鐘。進(jìn)而，將臨床分離株的綠脈桿菌Pseudomonas aeruginosa PAO-1的加熱處理死菌用RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，W終濃度成為1X106C即(菌落形成單 位)/mL的方式添加10化。作為對(duì)照，分別準(zhǔn)備取代抗體而添加有RPMI1640培養(yǎng)基的孔、取代 綠脈桿菌死菌而添加有RPMI1640培養(yǎng)基的孔。在37 °C、5 % C〇2條件下培養(yǎng)一夜之后，回收培 養(yǎng)上清液，使用市售的A1地aLISA TN化試劑盒一年シ工瓜7-社、AL208C)測(cè)定培養(yǎng)上 清液中所含的TWa濃度。進(jìn)一步算出各抗體對(duì)于綠脈桿菌死菌誘導(dǎo)TWa產(chǎn)生的IC50值。在 IC50值算出時(shí)，將取代抗體而添加有RPMI1640培養(yǎng)基的孔作為0%抑制對(duì)照、將取代綠脈桿 菌死菌而添加有RPMI1640培養(yǎng)基的孔作為100%抑制對(duì)照設(shè)定。將通過(guò)4參數(shù)logistic曲線 擬合算出的IC50值示于W下(表3)。
[0311] 表3:正常人末梢血單核細(xì)胞綠脈桿菌死菌誘導(dǎo)TNFa產(chǎn)生抑制活性
[0312] [表 3]
[0314] 由其結(jié)果可知：完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh抑制TN化產(chǎn) 生，具有對(duì)人TLR2及人TLR4的中和活性。
[0315] (實(shí)施例11:正常人末梢血單核細(xì)胞大腸桿菌死菌誘導(dǎo)TNFa產(chǎn)生抑制檢測(cè)）
[0316] 在384孔板（スシ夕社）中使用含有適當(dāng)制備成終濃度10%的人血清化onza公司、 14-490E)的RPMI1640培養(yǎng)基（ク^フテ夕7 口公一乂社）W30化/孔接種正常人末梢血單核 細(xì)胞化onza公司、CC-2702)使之成為lX104Cells/孔。其后立即添加在2.500咖至20.00fM 的范圍內(nèi)用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋12級(jí)的精制完全人型ICU-1-Ig 丫 1或完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh 1化L。另外，作為比較抗體，添加在7.75祉M至52.96fM的范圍內(nèi)用RPMI1640培養(yǎng)基 稀釋13級(jí)的精制抗人化R4抗體化ll.C2E3(專利文獻(xiàn)6)及抗人化R2抗體0PN305(專利文獻(xiàn)3) 的混合溶液10化。其后，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)30分鐘。進(jìn)而，將臨床分離株的大腸桿菌 Escherichia coli (21006)的加熱處理死菌用RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，W終濃度成為1 X 106C即/mL的方式添加10化。作為對(duì)照，分別準(zhǔn)備取代抗體而添加有RPMI1640培養(yǎng)基的孔、 取代大腸桿菌死菌而添加有RPMI1640培養(yǎng)基的孔。在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)一夜之后，回 收培養(yǎng)上清液，使用市售的A1地aLISA TN化試劑盒一年シ工瓜7-社)測(cè)定培養(yǎng)上清液 中所含的TWa濃度。進(jìn)一步算出各抗體對(duì)于大腸桿菌死菌誘導(dǎo)TWa產(chǎn)生的IC50值。在計(jì)算 IC50值時(shí)，將取代抗體而添加有RPMI1640培養(yǎng)基的孔作為0 %抑制對(duì)照、將取代大腸桿菌死 菌而添加有RPMI1640培養(yǎng)基的孔作為100%抑制對(duì)照設(shè)定。將通過(guò)4參數(shù)logistic曲線擬合 算出的IC50值示于W下(表4、圖3)。
[0317] 表4:正常人末梢血單核細(xì)胞大腸桿菌死菌誘導(dǎo)TNFa產(chǎn)生抑制活性
[031 引[表4]
[0319]
[0320] 由其結(jié)果可知:完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh與化11.C沈3 及0PN305的并用相比，具有約10倍的效力(潛能）的TN陽(yáng)產(chǎn)生抑制活性。
[0321] 工業(yè)實(shí)用性
[0322] 本發(fā)明的與人化R2及人化R4結(jié)合的雙特異性抗體對(duì)參與人化R2及人化R4介導(dǎo)的 病態(tài)形成的各種疾病的預(yù)防或治療是有用的。另外，本發(fā)明的多核巧酸、表達(dá)載體、進(jìn)行了 轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞及生產(chǎn)雙特異性抗體的方法對(duì)生產(chǎn)所述與人TLR2及人化R4結(jié)合的雙特異 性抗體是有用的。
[0323] 序列表自由文本
[0324] 在W下的序列表的數(shù)字標(biāo)題<223>中，記載"人工序列"的說(shuō)明。具體而言，序列 表的序列號(hào)1表示的堿基序列為完全人型ICU-1-Ig 丫 1的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體 scFv融合體的堿基序列，序列號(hào)2表示的氨基酸序列為由序列號(hào)1所編碼的抗人化R2抗體重 鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的氨基酸序列。序列表的序列號(hào)3表示的堿基序列為完全人型 ICU-1-Ig 丫 1-LAsh的抗人化R2抗體重鏈-抗人TLR4抗體scFv融合體的堿基序列，序列號(hào)4表 示的氨基酸序列為由序列號(hào)3所編碼的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的氨 基酸序列。序列表的序列號(hào)5表不的堿基序列為完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh的抗人化R2抗體輕鏈、W及完全人型31-5F5-2F3.ml的輕鏈的堿基序列，序列號(hào)6 表示的氨基酸序列為由序列號(hào)5所編碼的抗人化R2抗體輕鏈的氨基酸序列。序列表的序列 號(hào)7表不的堿基序列為完全人型31-5F5-2F3 .ml的重鏈的堿基序列，序列表的序列號(hào)8表不 的氨基酸序列為由序列號(hào)7所編碼的重鏈的氨基酸序列。序列表的序列號(hào)9表不的氨基酸序 列為連結(jié)完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh中所含的抗人化32抗體的重 鏈恒定區(qū)的C末端和抗人化R4抗體scFv的N末端的GS接頭的氨基酸序列。序列表的序列號(hào)10 表示的氨基酸序列為連結(jié)完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh中所含的抗 人TLR4抗體scFv中的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的GS接頭的氨基酸序列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體，其從以下的（1)或(2)中選擇： (1) 一種與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體，包含： 1) 由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗體的重鏈可變區(qū)、 及由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)、以及 2) 由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的重鏈可變 區(qū)、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區(qū)； 或 (2) 作為通過(guò)（1)的雙特異性抗體的翻譯后修飾而生成的雙特異性抗體的與人TLR2及 人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙特異性抗體，其從以下的（1)或(2)中選擇： (1) 一種包含抗人TLR2抗體及抗人TLR4抗體片段的雙特異性抗體， 該抗人TLR2抗體為IgG抗體，且包含由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成 的抗人TLR2抗體的重鏈可變區(qū)、及由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗 人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)， 該抗人TLR4抗體片段為單鏈可變區(qū)片段(scFv)，且包含由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至 609的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區(qū)、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732 的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區(qū);或 (2) 作為通過(guò)（1)的雙特異性抗體的翻譯后修飾而生成的雙特異性抗體的與人TLR2及 人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙特異性抗體，該雙特異性抗體含有抗人TLR2抗體及抗人 TLR4抗體片段， 該抗人TLR2抗體為IgG抗體，且包含由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成 的抗人TLR2抗體的重鏈可變區(qū)、及由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗 人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)， 該抗人TLR4抗體片段為scFv，且包含由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨基酸序列 構(gòu)成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區(qū)、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu) 成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區(qū)。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙特異性抗體，其中，翻譯后修飾為抗人TLR2抗體的重鏈可變 區(qū)氨基末端(N末端）的焦谷氨酰化、抗人TLR2抗體的重鏈羧基末端(C末端）的賴氨酸缺失、 和/或抗人TLR4抗體片段的重鏈可變區(qū)N末端的焦谷氨?；?. 根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR2抗體包含作為人 Igyl恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙特異性抗體，其中，人Igy 1恒定區(qū)為具有L234A及L235A的 氨基酸突變或L234A、L235A及I253A的氨基酸突變的人Ig γ 1恒定區(qū)。7. 根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR2抗體包含作為人 IgK恒定區(qū)的輕鏈恒定區(qū)。8. 根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR2抗體包含作為人 Igyl恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)及作為人IgK恒定區(qū)的輕鏈恒定區(qū)。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的雙特異性抗體，其中，人Igy 1恒定區(qū)為具有L234A及L235A的 氨基酸突變或L234A、L235A及I253A的氨基酸突變的人Ig γ 1恒定區(qū)。10. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR2抗體包含由序列號(hào)4的氨 基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈、及由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈。11. 根據(jù)權(quán)利要求2至10中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR4抗體片段為具 有在重鏈可變區(qū)的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)輕鏈可變區(qū)的Ν末端的結(jié)構(gòu)的scFv。12. 根據(jù)權(quán)利要求2至11中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR4抗體片段為由 序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列構(gòu)成的scFv。13. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR2抗體包含由序列號(hào)4的氨 基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈、及由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈，抗人 TLR4抗體片段為由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列構(gòu)成的scFv。14. 根據(jù)權(quán)利要求2至13中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其中，在抗人TLR2抗體的各重 鏈的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)抗人TLR4抗體片段的N末端。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的雙特異性抗體，其中，連結(jié)抗人TLR2抗體的重鏈和抗人TLR4 抗體片段的接頭由GS接頭構(gòu)成。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙特異性抗體，其中，GS接頭由序列號(hào)9的氨基酸序列構(gòu)成。17. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR2抗體包含由序列號(hào)4的氨 基酸序號(hào)1至450的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈、及由序列號(hào)6的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈，抗人 TLR4抗體片段為由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至732的氨基酸序列構(gòu)成的scFv，在該抗人 TLR2抗體的各重鏈的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)該抗人TLR4抗體片段的N末端。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的雙特異性抗體，其中，連結(jié)抗人TLR2抗體的重鏈和抗人TLR4 抗體片段的接頭由GS接頭構(gòu)成。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的雙特異性抗體，其中，GS接頭由序列號(hào)9的氨基酸序列構(gòu)成。20. -種雙特異性抗體，其是通過(guò)權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體的翻 譯后修飾而生成的。21. -種多核苷酸，其含有編碼權(quán)利要求1所述的雙特異性抗體的抗人TLR2抗體的重鏈 可變區(qū)、抗人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)、抗人TLR4抗體的重鏈可變區(qū)、和/或抗人TLR4抗體的 輕鏈可變區(qū)的堿基序列。22. -種多核苷酸，其含有編碼在權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體的抗 人TLR2抗體的重鏈的C末端經(jīng)由接頭連結(jié)抗人TLR4抗體片段的N末端的融合體的堿基序列。23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列構(gòu)成的所述 融合體的堿基序列。24. -種多核苷酸，其含有編碼權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體的抗人 TLR2抗體的輕鏈的堿基序列。25. -種表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求21所述的多核苷酸。26. -種表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求22、23、和/或24所述的多核苷酸。27. -種用權(quán)利要求25所述的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其選自由以下的（a)至 (d)構(gòu)成的組： (a)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗 體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨 基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸、及含有編碼由序列號(hào) 4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多 核苷酸的表達(dá)載體、和包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的 抗人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞； (b) 用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗 體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨 基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號(hào)4 的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多 核苷酸、及含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗體的 輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞； (c) 用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗 體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨 基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸、及含有編碼由序列號(hào) 4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多 核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;以及 (d) 用包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗 體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。28. -種用權(quán)利要求25所述的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其選自由以下的（a)至 (d)構(gòu)成的組： (a) 用含有權(quán)利要求22或23所述的多核苷酸的表達(dá)載體和含有權(quán)利要求24所述的多核 苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞； (b) 用含有權(quán)利要求22或23所述的多核苷酸和權(quán)利要求24所述的多核苷酸的表達(dá)載體 進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞； (c) 用含有權(quán)利要求22或23所述的多核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；以及 (d) 用含有權(quán)利要求24所述的多核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。29. -種生產(chǎn)與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體的方法，包括：對(duì)選自由以下的 (a)至(c)構(gòu)成的組中的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體表達(dá) 的工序： (a) 用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗 體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨 基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸、及含有編碼由序列號(hào) 4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多 核苷酸的表達(dá)載體、和包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的 抗人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞； (b) 用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗 體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨 基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號(hào)4 的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多 核苷酸、及含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗體的 輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;以及 (C)用包含含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)1至120的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗 體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)491至609的氨 基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸、及含有編碼由序列號(hào) 4的氨基酸序號(hào)625至732的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多 核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、以及用包含含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)1 至113的氨基酸序列構(gòu)成的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)的堿基序列的多核苷酸的表達(dá)載體 進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。30. -種生產(chǎn)抗與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體的方法，包括:對(duì)選自由以下的 (a)至(c)構(gòu)成的組中的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體表達(dá) 的工序： (a) 用含有權(quán)利要求22或23所述的多核苷酸的表達(dá)載體和含有權(quán)利要求24所述的多核 苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞； (b) 用含有權(quán)利要求22或23所述的多核苷酸和權(quán)利要求24所述的多核苷酸的表達(dá)載體 進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；以及 (c) 用含有權(quán)利要求22或23所述的多核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、以及 用含有權(quán)利要求24所述的多核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。31. -種與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體，其是通過(guò)權(quán)利要求29所述的方法生 產(chǎn)的。32. -種與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體，其是通過(guò)權(quán)利要求30所述的方法生 產(chǎn)的。33. -種醫(yī)藥組合物，其含有權(quán)利要求1至20、31及32中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體及 藥學(xué)上可接受的賦形劑。34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的醫(yī)藥組合物，其為免疫炎癥性疾病的預(yù)防或治療用醫(yī)藥組 合物。35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的醫(yī)藥組合物，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急性胰腺 炎。36. -種預(yù)防或治療免疫炎癥性疾病的方法，包括施用治療有效量的權(quán)利要求1至20、 31及32中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體的工序。37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的預(yù)防或治療的方法。其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急性 胰腺炎。38. 根據(jù)權(quán)利要求1至20、31及32中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其用于在免疫炎癥性 疾病的預(yù)防或治療中使用。39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的雙特異性抗體，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急性胰腺 炎。40. 權(quán)利要求1至20、31及32中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體在免疫炎癥性疾病的預(yù)防或 治療用醫(yī)藥組合物制造中的應(yīng)用。41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的雙特異性抗體的應(yīng)用，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急 性胰腺炎。42. -種與人TLR2及人TLR4結(jié)合的雙特異性抗體，包含： 1) 含有由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)31至35的氨基酸序列構(gòu)成的CDR1、由序列號(hào)4的氨基酸 序號(hào)50至66的氨基酸序列構(gòu)成的CDR2、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)99至109的氨基酸序列構(gòu) 成的CDR3的抗人TLR2抗體的重鏈可變區(qū)、以及含有由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)24至39的氨基 酸序列構(gòu)成的CDR1、由序列號(hào)6的氨基酸序號(hào)55至61的氨基酸序列構(gòu)成的CDR2、及由序列號(hào) 6的氨基酸序號(hào)94至102的氨基酸序列構(gòu)成的CDR3的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區(qū)；以及 2) 含有由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)521至525的氨基酸序列構(gòu)成的CDR1、由序列號(hào)4的氨基 酸序號(hào)540至556的氨基酸序列構(gòu)成的CDR2、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)589至598的氨基酸 序列構(gòu)成的CDR3的抗人TLR4抗體的重鏈可變區(qū)、以及含有由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)648至 658的氨基酸序列構(gòu)成的CDR1、由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)674至680的氨基酸序列構(gòu)成的 CDR2、及由序列號(hào)4的氨基酸序號(hào)713至7 21的氨基酸序列構(gòu)成的⑶R3的抗人TLR4抗體的輕 鏈可變區(qū)。
【文檔編號(hào)】C12N1/15GK106062193SQ201580011160
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2015年2月27日 公開(kāi)號(hào)201580011160.9, CN 106062193 A, CN 106062193A, CN 201580011160, CN-A-106062193, CN106062193 A, CN106062193A, CN201580011160, CN201580011160.9, PCT/2015/55860, PCT/JP/15/055860, PCT/JP/15/55860, PCT/JP/2015/055860, PCT/JP/2015/55860, PCT/JP15/055860, PCT/JP15/55860, PCT/JP15055860, PCT/JP1555860, PCT/JP2015/055860, PCT/JP2015/55860, PCT/JP2015055860, PCT/JP201555860
【發(fā)明人】竹內(nèi)聰, 佐藤雅人, 鈴木丈太郎, 曽我真司, 高崎淳, 青山康二, 奧山千枝
【申請(qǐng)人】安斯泰來(lái)制藥株式會(huì)社