新型玉米泛素啟動子的制作方法
【專利摘要】玉米栽培種B73泛素?1(玉米栽培種B73 Ubi?1)啟動子在植物中驅(qū)動組成型轉(zhuǎn)基因的高水平表達(dá)。在多基因構(gòu)建體中反復(fù)使用相同的玉米栽培種B73 Ubi?1啟動子還會導(dǎo)致基因沉默，從而使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物有效性降低。提供了基因調(diào)控啟動子元件、構(gòu)建體，和使用來自不同玉米基因型玉米栽培種Hi?II的Ubi?1啟動子的基因調(diào)節(jié)元件在植物細(xì)胞和/或植物組織中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的方法。
【專利說明】新型玉米泛素啟動子
[0001] 相關(guān)專利申請相互參考
[0002] 本申請要求根據(jù)35 US巧119(e)獲得于2013年12月31日提交的美國臨時專利申請 系列號61/922，526的利益，其全部公開內(nèi)容通過提述并入本文。
[0003] 援引電子提交的序列表
[0004] 序列表的正式拷貝已作為ASCII格式序列表通過EFS-Web電子提交，文件名為 "75664_ST25.txt"，創(chuàng)建于2014年12月30日，大小為11.4千字節(jié)，并與本說明書同時提交。 該ASCII格式文檔中包含的序列表是本說明書的一部分，并且其全部內(nèi)容通過提述并入本 文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明一般地設(shè)及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，設(shè)及在植物中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的 領(lǐng)域。
[0006] 背景
[0007]許多植物物種能夠被轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化，W引入農(nóng)藝學(xué)期望的性狀或特征。開發(fā)和/或修 飾植物物種使之具有特定的期望性狀。一般地，期望的性狀包括，例如，提高營養(yǎng)價值品質(zhì)、 增加產(chǎn)量、賦予病蟲害抗性、提高干旱和脅迫耐受性、提高園藝品質(zhì)（例如，色素沉著和生 長）、賦予除草劑抗性、能夠從植物生產(chǎn)工業(yè)上有用的化合物和/或材料，和/或賦予生產(chǎn)藥 物的能力。
[000引通過植物轉(zhuǎn)化技術(shù)產(chǎn)生在單個基因組座位上堆疊多個轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物物種。 植物轉(zhuǎn)化技術(shù)將轉(zhuǎn)基因引入到植物細(xì)胞中，回收在植物基因組中穩(wěn)定整合了轉(zhuǎn)基因拷貝的 能育的轉(zhuǎn)基因植物，隨后通過轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)，從而產(chǎn)生具有期望性 狀和表型的轉(zhuǎn)基因植物。不過，能夠產(chǎn)生高表達(dá)W性狀堆疊的形式工程構(gòu)建的多個轉(zhuǎn)基因 的轉(zhuǎn)基因植物物種的辦法是令人期望的。
[0009] 類似地，能夠在植物的特定組織或器官中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的辦法也是令人期望的。例 如，通過用病原體抗性基因轉(zhuǎn)化植物基因組從而使病原體抗性蛋白在植物的根部強(qiáng)烈表 達(dá)，可能實(shí)現(xiàn)植物對±壤源性病原體感染的抗性提高?；蛘?，可能期望在處于特定生長或發(fā) 育階段，例如細(xì)胞分裂或伸長期，的植物組織中表達(dá)轉(zhuǎn)基因。
[0010] 本文描述了玉米化i-1啟動子調(diào)節(jié)元件，其包括啟動子、上游啟動子、5'-UTR和內(nèi) 含子。進(jìn)一步描述了使用該基因調(diào)節(jié)元件的構(gòu)建體和方法。
[00川概要
[0012] 本文公開了用于在植物細(xì)胞和/或植物組織中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的啟動子、構(gòu)建體和方 法。在一個實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)包括使用啟動子。在一個實(shí)施方案中，啟動子包含多 核巧酸序列。在一個實(shí)施方案中，啟動子多核巧酸序列包含上游啟動子，5'-非翻譯區(qū)（5'- UTR)或前導(dǎo)序列，和內(nèi)含子。在一個實(shí)施方案中，啟動子多核巧酸序列包含泛素-1基因 化bi-1)。在一個實(shí)施方案中，啟動子多核巧酸序列包含玉米(Z.mays)的化i-1基因。
[0013] 在一個實(shí)施方案中，構(gòu)建體包括基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒包含從玉米化i-1基 因獲得的啟動子多核巧酸序列。在一個實(shí)施方案中，來自玉米的化i-1啟動子多核巧酸序列 包括上游啟動子區(qū)，5'-UTR或前導(dǎo)序列，和內(nèi)含子。在一個實(shí)施方案中，構(gòu)建體包括基因表 達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒包含從玉米化i-1基因獲得的啟動子多核巧酸序列，該啟動子多核巧 酸序列與來自杯水母屬(PMalidium)物種的黃色巧光蛋白編碼基因（PMYFP)的內(nèi)含子融 合。在一個實(shí)施方案中，構(gòu)建體包括基因表達(dá)盒，該基因表達(dá)盒包含來自玉米化i-1基因的 啟動子多核巧酸序列，所述啟動子多核巧酸序列與來自杯水母屬物種的黃色巧光蛋白編碼 基因（PMYFP)的內(nèi)含子融合，隨后是來自玉米過氧化物酶5基因（ZmPer5)的3'-非翻譯區(qū) (3'-UTR)。所得的多核巧酸序列包括新的啟動子基因調(diào)控元件。
[0014] 在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括與轉(zhuǎn)基因或異源編碼序列可操作連接的基因 啟動子調(diào)節(jié)元件。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更 多個轉(zhuǎn)基因。
[0015] 本文公開了培植植物的方法，所述植物使用新型基因啟動子調(diào)節(jié)元件(例如，上游 啟動子，5'-UTR和內(nèi)含子)表達(dá)轉(zhuǎn)基因。本文還公開了培養(yǎng)植物組織和細(xì)胞的方法，所述植 物組織和細(xì)胞使用新的基因啟動子調(diào)節(jié)元件表達(dá)轉(zhuǎn)基因。在一個實(shí)施方案中，本文公開的 方法包括植物葉、根、愈傷組織和花粉中的組成型基因表達(dá)。本文還公開了純化包含新的基 因啟動子調(diào)節(jié)元件的多核巧酸序列的方法。
[0016] 附圖簡述
[0017]圖1顯示構(gòu)成玉米栽培種B73化i-1基因的示意性的新型啟動子。該啟動子包括上 游元件、5'-UTR或前導(dǎo)序列，和內(nèi)含子。該上游元件位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS)的5'上游，用長 箭頭指示。該上游元件由調(diào)節(jié)元件（例如TATA盒，用短箭頭指示）和熱休克元件（用星號指 示)構(gòu)成。
[0018]圖2顯示了載體PDAB105713的質(zhì)粒圖，其包括PCR擴(kuò)增的玉米栽培種化-II Ubi-1 基因的啟動子序列。
[0019] 圖3顯示了玉米栽培種B73 Ubi-1基因?qū)φ諉幼樱⊿EQ ID N0:1)的多核巧酸序 列，上游啟動子區(qū)用下劃線指示，5'-UTR/前導(dǎo)序列用陰影指示，內(nèi)含子區(qū)用小寫字母指示。
[0020] 圖4顯示了玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子(SEQ ID N0:2)的多核巧酸序列，上游 啟動子區(qū)用下劃線指示，5'-UTR/前導(dǎo)序列用陰影指示，內(nèi)含子區(qū)用小寫字母指示。
[0021] 圖5顯示了玉米栽培種化-II的上游啟動子區(qū)（SEQ ID NO:4)與玉米栽培種B73的 對照上游啟動子序列(SEQ ID N0:3)的多核巧酸序列比對。
[0022] 圖6顯示了玉米栽培種化-n的5'-UTR/前導(dǎo)區(qū)（SEQ ID N0:6)與玉米栽培種B73的 對照5'-UTR/前導(dǎo)序列（SEQ ID N0:5)的多核巧酸序列比對。
[0023] 圖7顯示了玉米栽培種化-II的內(nèi)含子區(qū)（SEQ ID NO:8)與玉米栽培種B73的對照 內(nèi)含子序列(SEQ ID NO:7)的多核巧酸序列比對。
[0024] 圖8顯示了二元表達(dá)構(gòu)建體PDAB105748的載體圖，其包括插入在目的載體 pDABl0197中的對照入口載體pDABl05742(玉米栽培種B73)。
[002引圖9顯示了二元表達(dá)構(gòu)建體PDAB105746的載體圖，其包括插入在目的載體 PDAB10197中的入口載體pDAB105740(玉米栽培種Hi-II)。
[0026] 詳細(xì)說明
[0027] 定義
[002引如本文所使用的，除非在上下文中清晰且明確地指出，否則冠詞"一"、"一個"和 "該"包括復(fù)數(shù)指代。
[0029] 如本文所使用的，術(shù)語"回交"是指如下的過程，其中育種者將雜交后代與其中一 個親本雜交，例如第一代雜交體F1與F1雜交體的親本基因型的其中一個雜交。
[0030] 如本文所使用的，術(shù)語"內(nèi)含子"是指基因（或者被表達(dá)的感興趣核巧酸序列）中包 含的任何被轉(zhuǎn)錄但不被翻譯的核酸序列。內(nèi)含子包括被表達(dá)的DNA序列內(nèi)的非翻譯核酸序 列，W及從其轉(zhuǎn)錄的RNA分子中的相應(yīng)序列。
[0031] 本文所述的構(gòu)建體還可W包含可增強(qiáng)翻譯和/或mRNA穩(wěn)定性的序列，例如內(nèi)含子。 運(yùn)樣的一個內(nèi)含子的實(shí)例是擬南芥組蛋白H3變異體基因 II的第一內(nèi)含子，或者任何其它公 知的內(nèi)含子序列。內(nèi)含子可W和啟動子序列組合使用，W提高翻譯和/或mRNA穩(wěn)定性。
[0032] 如本文所使用的，術(shù)語"5 '非翻譯區(qū)"或"5 ' -UTR"是指前mRNA或成熟mRNA 5 '端的 非翻譯區(qū)段。例如，在成熟的mRNA上，5'-UTR通常在其5'端有一個7-甲基鳥巧帽，并且參與 許多過程，例如剪接、多酷巧酸化、mRNA外排到細(xì)胞質(zhì)、mRNA的5 '端被翻譯機(jī)構(gòu)識別，和保護(hù) mRNA免于降解。
[0033] 如本文所使用的，術(shù)語"3 '非翻譯區(qū)"或"3 ' -UTR"是指前mRNA或成熟mRNA 53 '端的 非翻譯區(qū)段。例如，在成熟的mRNA上，運(yùn)個區(qū)域具有多-(A)尾己，并且已知在mRNA穩(wěn)定性、翻 譯起始和mRNA外轉(zhuǎn)運(yùn)中具有多種功能。
[0034] 如本文所使用的，術(shù)語"多腺巧酸化信號"是指mRNA轉(zhuǎn)錄本中存在的核酸序列，其 在多-(A)聚合酶存在時允許轉(zhuǎn)錄本的多酷巧酸化位點(diǎn)（例如位于多-(A)信號下游10-30個 堿基）多酷巧酸化。許多多酷巧酸化信號是本領(lǐng)域已知的，并可用于本發(fā)明。一個示例性序 列包括AAUAAA及其變異體，如Loke J.，et al.，（2005)Plant Physiology 138(3); 1457- 1468所述。
[0035] 如本文所使用的，術(shù)語"分離的"是指與該組分自然存在的生物體細(xì)胞中的其它生 物組分（即，其它染色質(zhì)和染色質(zhì)外DNA)分離的生物組分(包括核酸或蛋白質(zhì)）。
[0036] 如本文所使用的，在指示核酸分子時，術(shù)語"純化的"不需要絕對的純(例如，同質(zhì) 的制備物）。相反，它表示該序列比其在天然的細(xì)胞環(huán)境中相對更純。例如，核酸的"純化"水 平在濃度或基因表達(dá)水平上應(yīng)當(dāng)比自然水平大至少2-5倍。
[0037] 請求保護(hù)的DNA分子可W從總DNA或總RNA中直接分離。此外，cDNA克隆不是自然存 在的，但優(yōu)選地通過對部分純化的、天然存在的物質(zhì)（信使RNA)進(jìn)行操作而得。從mRNA構(gòu)建 cDNA文庫設(shè)及創(chuàng)制合成的物質(zhì)（cDNA)。單個cDNA克隆能夠通過對攜帶cDNA文庫的細(xì)胞進(jìn)行 克隆選擇而從合成文庫中純化。因此，包括從mRNA構(gòu)建cDNA文庫和純化不同cDNA克隆的過 程會產(chǎn)出純化大約1〇6倍的天然信息。類似地，啟動子DNA序列可W被克隆到質(zhì)粒中。運(yùn)種質(zhì) 粒不是天然存在的，而是優(yōu)選地通過對部分純化的、天然存在的物質(zhì)例如基因組DNA文庫進(jìn) 行操作而獲得的。因此，在運(yùn)些技術(shù)中，優(yōu)選地使純化放大至少1個數(shù)量級，在一些實(shí)施方案 中，放大2個或3個數(shù)量級，在其它實(shí)施方案中，放大4個或5個或更多個數(shù)量級。
[003引類似地，純化表示組分DNA序列發(fā)生了化學(xué)或功能上的改變。"被純化"的核酸分子 和蛋白質(zhì)包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸分子和蛋白質(zhì)。術(shù)語"純化的"還包括通過重組 DNA方法在宿主細(xì)胞(例如植物細(xì)胞）中制備的核酸和蛋白質(zhì)，W及化學(xué)合成的核酸分子、蛋 白質(zhì)和膚。
[0039] 術(shù)語"重組的"意思是其中發(fā)生了遺傳重組的細(xì)胞或生物體。它還包括通過人為干 預(yù)被人工或合成（即非自然的）改變的分子(例如，載體、質(zhì)粒、核酸、多膚或小RNA)。對分子 進(jìn)行改變可W在其自然環(huán)境或狀態(tài)下執(zhí)行或者從其自然環(huán)境或狀態(tài)下移除。
[0040] 如本文所使用的，術(shù)語"表達(dá)"是指多核巧酸被轉(zhuǎn)錄成mRNA(包括小RNA分子）的過 程，和/或被轉(zhuǎn)錄的mRNA(也稱作"轉(zhuǎn)錄本"）被隨后翻譯成膚、多膚或蛋白質(zhì)的過程?；虮?達(dá)可能受到外部信號的影響，例如細(xì)胞、組織或生物體暴露于可增加或降低基因表達(dá)的試 劑?；虻谋磉_(dá)還可W在從DNA到RNA到蛋白質(zhì)的通路的任何位置被調(diào)節(jié)?；虮磉_(dá)的調(diào)節(jié) 通過例如控制轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和加工、中間分子如mRNA的降解，或者通過在特定蛋白質(zhì) 分子被制造出后使它們激活、失活、區(qū)室化或降解，或者通過它們的組合，而發(fā)生?；虮磉_(dá) 可W在RNA水平或蛋白質(zhì)水平通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行測量，包括但不僅限于， No;rthe;rn印跡、RT-PCR、Weste;rn印跡、或者體外、原位或體內(nèi)蛋白活性測定。
[0041 ]如本文所使用的，術(shù)語"基于同源性的基因沉默"或"HBGS"是通用術(shù)語，其包括轉(zhuǎn) 錄基因沉默和轉(zhuǎn)錄后基因沉默。祀基因座被非連鎖的沉默基因座沉默可W由轉(zhuǎn)錄抑制(轉(zhuǎn) 錄基因沉默;TGS)或mRNA降解(轉(zhuǎn)錄后基因沉默;PTGS)導(dǎo)致，它們分別是由于產(chǎn)生了相應(yīng)于 啟動子或轉(zhuǎn)錄序列的雙鏈RNA(dsRNA)。每個過程設(shè)及不同的細(xì)胞組分，運(yùn)表明dsRNA誘導(dǎo)的 TGS和PTGS很可能來自于一個共同的古老機(jī)制的多樣化。然而，難W進(jìn)行對TGS和PTGS的嚴(yán) 格比較，因?yàn)檫\(yùn)一般依賴于對不同沉默基因座的分析。單個轉(zhuǎn)基因座位可W被描述為可觸 發(fā)TGS和PTGS二者，因?yàn)樗鼤a(chǎn)生相應(yīng)于不同祀基因的啟動子和被轉(zhuǎn)錄序列的dsRNA。
[0042] 如本文所使用的，術(shù)語"核酸分子"、"核酸"或"多核巧酸"（所有運(yùn)S個術(shù)語彼此之 間是同義的）是指多聚體形式的核巧酸，其可W包括RNA、cDNA、基因組DNA的有義和反義鏈， 及其合成形式和混合聚合物。"核巧酸"可W指核糖核巧酸、脫氧核糖核巧酸或或任一種核 巧酸的修飾形式。除非另外指出，否則核酸分子的長度通常為至少10個堿基。該術(shù)語可W指 不定長度的RNA或DNA分子。該術(shù)語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。核酸分子可W包括天然存在 的和/或經(jīng)過修飾的核巧酸，藉由天然存在的和/或非天然存在的核巧酸鍵連而連接在一 起。
[0043] 核酸分子可W被化學(xué)修飾或者生物化學(xué)修飾，或者可W包含非天然的或衍生化的 核巧酸堿基，運(yùn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員可W容易理解的。運(yùn)些修飾包括，例如，標(biāo)簽、甲基化、一 個或多個天然發(fā)生的核巧酸用類似物取代、核巧酸內(nèi)部修飾(例如不帶電的連接:例如，甲 基麟酸醋，憐酸=醋，憐酷胺，氨基甲酸醋等;帶電荷的連接:例如，硫代憐酸醋，二硫代憐酸 醋等;懸垂部分:例如，膚;嵌入劑:例如，叮晚，補(bǔ)骨脂素等;馨合劑;燒化劑;和修飾的鍵:例 如，a異頭核酸等）。術(shù)語"核酸分子"還包括任何拓?fù)錁?gòu)象，包括單鏈、雙鏈、部分雙鏈體、= 鏈體(triplexed)，發(fā)針式化airpinned)，圓形和掛鎖構(gòu)象。
[0044] 轉(zhuǎn)錄沿著DNA鏈沿著5'-3'的方式前進(jìn)。運(yùn)意味著，RNA的制備是通過向生長鏈的3' 端順次添加核糖核巧酸-5'-=憐酸(要求清除焦憐酸）。在線性或環(huán)狀核酸分子中，如果離 散的元件（例如，特定的核巧酸序列）鍵合或者將要鍵合于相同核酸上的其他元件的5'方 向，則其被稱作位于該其他元件的"上游"。類似地，如果離散的元件鍵合或者將要鍵合于相 同核酸上的其他元件的3'方向，則其被稱作位于該其他元件的"下游"。
[0045] 如本文所使用的，術(shù)語"堿基位置"是指給定堿基或核巧酸殘基在指定核酸內(nèi)的位 置。指定的核酸可W通過與參考核酸進(jìn)行比對加 W定義。
[0046] 如本文所使用的，術(shù)語"雜交"是指多核巧酸或寡核巧酸和它們的類似物通過互補(bǔ) 堿基之間的氨鍵鍵合而雜交的過程，氨鍵包括巧曰13011-吐；[。4、化0旨3166]1或反向化0旨3166]1 氨鍵。一般地，核酸分子包括含氮堿基，含氮堿基是喀晚(胞喀晚(C)，尿喀晚化)和胸腺喀晚 (T))或者嚷嶺（腺嚷嶺(A)和鳥嚷嶺(G))。運(yùn)些含氮堿基在喀晚與嚷嶺之間形成氨鍵，喀晚 與嚷嶺的鍵合稱作"堿基配對"。更具體地，A與T或U氨鍵鍵合，G與C鍵合。巧補(bǔ)"是指兩個不 同核酸序列或同一核酸序列的兩個不同區(qū)域之間發(fā)生的堿基配對。
[0047] 如本文所使用的，術(shù)語"可特異性雜交"或"特異性互補(bǔ)"是指足夠程度的互補(bǔ)性， 使得在寡核巧酸/多核巧酸和DNA或RNA祀之間發(fā)生穩(wěn)定而特異的結(jié)合。寡核巧酸/多核巧酸 不需要與祀序列100%互補(bǔ)才能特異性雜交。當(dāng)寡核巧酸/多核巧酸與祀DNA或RNA分子的結(jié) 合會干擾祀DNA或RNA的正常功能，并且存在足夠程度的互補(bǔ)性W避免寡核巧酸/多核巧酸 在特異性結(jié)合所期望的條件下（例如在體內(nèi)測定或系統(tǒng)的生理?xiàng)l件下）與非祀序列發(fā)生非 特異性結(jié)合時，寡核巧酸/多核巧酸是可特異性雜交的。運(yùn)種結(jié)合被稱作特異性雜交。導(dǎo)致 特定嚴(yán)格程度的雜交條件隨著所選雜交方法的性質(zhì)和雜交核酸序列的組成和長度而改變。 一般地，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強(qiáng)度(特別是化+和/或Mgh濃度)對雜交嚴(yán)格度有貢 獻(xiàn)，但清洗次數(shù)也會影響嚴(yán)格度。關(guān)于獲得特定嚴(yán)格程度所需的雜交條件的計算在 Sambrooket al. (ed.) .Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2片反，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York, 1989中有討論。
[0048] 如本文所使用的，術(shù)語"嚴(yán)格條件"包括如下條件，其中只有當(dāng)雜交分子和DM祀之 間的錯配小于50 %時才會發(fā)生雜交。"嚴(yán)格條件"包括進(jìn)一步特定水平的嚴(yán)格性。因此，如本 文所使用的，"中等嚴(yán)格"條件是指序列錯配超過50%的分子不會雜交的條件；"高嚴(yán)格"條 件是指序列錯配超過20 %的序列不會雜交的條件；和"極高嚴(yán)格"條件是指序列錯配超過 10%的序列不會雜交的條件。在特定的實(shí)施方案中，嚴(yán)格條件可W包括在65°C雜交，隨后在 65°C用0. lx SSC/0.1 %SDS清洗40分鐘。下面是代表性的、非限制性的雜交條件：
[0049] ?極高嚴(yán)格性:在5x SSC緩沖液中65°C雜交16個小時；在2x SSC緩沖液中室溫下 清洗2次，每次15分鐘;和在0.5x SSC緩沖液中65 °C清洗2次，每次20分鐘。
[0化0] ?高嚴(yán)格性:在5-6x SSC緩沖液中65-70°C雜交16-20個小時；在2x SSC緩沖液中 室溫下清洗2次，每次5-20分鐘;和在lx SSC緩沖液中55-70°C清洗2次，每次30分鐘。
[0化1] ?中等嚴(yán)格性:在6x SSC緩沖液中在室溫-55°C雜交16-20個小時；在2-3x SSC緩 沖液中室溫下清洗至少2次，每次20-30分鐘。
[0052] 在一個實(shí)施方案中，可特異性雜交的核酸分子能夠在極高嚴(yán)格性雜交條件下保持 結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，可特異性雜交的核酸分子能夠在高嚴(yán)格性雜交條件下保持結(jié)合。 在一個實(shí)施方案中，可特異性雜交的核酸分子能夠在中等嚴(yán)格性雜交條件下保持結(jié)合。
[0053] 如本文所使用的，術(shù)語"寡核巧酸"是指短核酸多聚體。寡核巧酸可W通過切割長 核酸區(qū)段或者通過聚合單個核巧酸前體而形成。自動合成儀允許合成長度達(dá)數(shù)百個堿基對 的寡核巧酸。因?yàn)楣押饲伤峥蒞結(jié)合互補(bǔ)的核巧酸序列，所W它們被用作檢測DNA或RNA的 探針。由DNA構(gòu)成的寡核巧酸(寡脫氧核糖核巧酸)可W用在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，運(yùn)是一種用 于擴(kuò)增小DNA序列的技術(shù)。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，寡核巧酸通常被稱作"引物"，其允許DNA聚 合酶延伸寡核巧酸并復(fù)制互補(bǔ)鏈。
[0054] 如本文所使用的，術(shù)語"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"或"PCR"是指一種微量的核酸、RNA和/或 DM被擴(kuò)增的程序或技術(shù)，其中，如美國專利No. 4，683，195所述。一般地，來自感興趣區(qū)域末 端或超過該末端的序列信息必須可得，才能設(shè)計寡核巧酸引物;運(yùn)些引物在序列上與待擴(kuò) 增模板的相對鏈相同或相似。兩個引物的5'端核巧酸可W和被擴(kuò)增材料的末端一致。PCR可 用于擴(kuò)增特定的RNA序列，從總基因組DNA中擴(kuò)增特定的DNA序列，和從總細(xì)胞RNA、隧菌體或 質(zhì)粒序列中轉(zhuǎn)錄cDNA，等。一般地參見Mul 1 is et al Cold Spring Harbor Symp .Quant .Biol. ,51: 263( 1987) ;E；;rlich編輯，PCR Technology, (Stockton Press ,NY, 1989)。
[0055] 如本文所使用的，術(shù)語"引物"是指當(dāng)條件適合于合成引物延伸產(chǎn)物時，能夠作為 沿著互補(bǔ)鏈的合成起始點(diǎn)的寡核巧酸。合成條件包括四種不同的脫氧核糖核巧酸=憐酸和 至少一種聚合誘導(dǎo)劑例如逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶的存在。它們處于合適的緩沖液中，該緩沖 液包括輔助因子或可W在各種合適的溫度下影響條件(例如抑等）的成分。引物優(yōu)選地是單 鏈序列，從而可W使擴(kuò)增效率最佳，但是也可W使用雙鏈序列。
[0056] 如本文所使用的，術(shù)語"探針"是指與祀序列雜交的寡核巧酸或多核巧酸序列。在 TaqMan 1'或TaqMan K類測定程序中，探針與位于兩個引物退火位點(diǎn)之間的祀部分雜交。 探針包括大約8個核巧酸，大約10個核巧酸，大約15個核巧酸，大約20個核巧酸，大約30個核 巧酸，大約40個核巧酸，或者大約50個核巧酸。在一些實(shí)施方案中，探針包括大約8個核巧 酸-大約15個核巧酸。
[0化7] 在Southern印跡測定程序中，探針與附著在膜上的DNA片段雜交。在運(yùn)種測定中， 探針包括大約10個核巧酸，大約100個核巧酸，大約250個核巧酸，大約500個核巧酸，大約1， 000個核巧酸，大約2，500個核巧酸，或者大約2，500個核巧酸。
[0058] 探針可W進(jìn)一步包括可檢測的標(biāo)簽，例如放射性標(biāo)簽、生物素化標(biāo)簽、巧光團(tuán)（ Texas-Red?,異硫氯酸巧光素，等）?？蓹z測的標(biāo)簽可W直接共價連接到探針寡核巧酸上， 例如位于探針的5'端或探針的3'端。包含巧光團(tuán)的探針還進(jìn)一步包括澤滅劑（例如Black Hole 如encher?,i〇wa Black?等）。
[0059] 如本文所使用的，術(shù)語"序列同一性"或"同一性"可W互換使用，指當(dāng)通過比對兩 個序列W在特定比較窗口上實(shí)現(xiàn)最大的相應(yīng)度時，兩個序列中相同的核酸殘基。
[0060] 如本文所使用的，術(shù)語"百分比序列同一性"是指通過比較在比較窗口上最佳比對 的序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)而確定的數(shù)值，其中為了使兩個序列實(shí)現(xiàn)最佳比對， 一個序列在比較窗口中的部分與參考序列（其不包含添加或缺失)相比，可W包含添加或缺 失（即，缺口）。通過確定兩個序列中出現(xiàn)相同核酸或氨基酸殘基的位置的數(shù)目W產(chǎn)生匹配 位置的數(shù)目，用匹配位置的數(shù)目除W比較窗口中的位置總數(shù)，所得結(jié)果乘W100計算出百分 數(shù)，從而產(chǎn)生百分比序列同一性。比對序列W供比較的方法是眾所周知的。各種程序和比對 算法在下列文獻(xiàn)中有描述，例如：Smith and Watermark 1981)AdV. A郵1. Math . 2 : 482 ; Needleman and Wunsch(1970)J.Mo 1. Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988) Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444;Higgins and 化arp(1988)Gene 73:237-44; Higgins and Sha;rp(1989)CABI0S 5:151_3;Corpetet al.(1988)Nucleic Acids Res.16: 10881-90;Huang et al.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155_65;Pearson et al.(1994) Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999)FEMS Microbiol. Lett.174:247- 50 o
[0061 ] 美國國家生物技術(shù)信息中屯、(NCBI)基本局部比對捜索工具(BLAST?;Altschulet al.( 1990) J.Mol. Biol. 215:403-10)可W從多個來源訪問，包括美國國家生物技術(shù)信息中 屯、(Bethesda，MD)和在互聯(lián)網(wǎng)上，用于和多種序列分析程序結(jié)合使用。關(guān)于如何使用該程序 確定序列同一性的描述可W在互聯(lián)網(wǎng)上在化AST?的"幫助"部分獲得。對于核酸序列的比 較，可W使用默認(rèn)參數(shù)執(zhí)行BLAST?程序的"blast 2序列"功能(Blastn)。當(dāng)使用運(yùn)種方法進(jìn) 行評估時，與參考序列的相似性越大的核酸序列將顯示更高的百分比同一性。
[0062] 如本文所使用的，術(shù)語"可操作連接"是指核酸被置于與另一個核酸的功能關(guān)系 中。一般地，"可操作連接"可W表示被連接的各核酸是郵連的。連接可W通過在方便限制位 點(diǎn)處進(jìn)行連接作用來實(shí)現(xiàn)。如果不存在運(yùn)些位點(diǎn)，則用合成的寡核巧酸銜接子或結(jié)構(gòu)與核 酸進(jìn)行連接作用或退火，并用于連接郵連的多核巧酸片段。然而，元件不必是郵連的才能可 操作連接。
[0063] 如本文所使用的，"啟動子"是指一段DNA區(qū)域，其一般位于基因的上游(朝著基因 的5'區(qū)），并且是觸發(fā)和驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄所需要的。啟動子可W允許它所控制的基因被合適地 激活或抑制。啟動子可能含有被轉(zhuǎn)錄因子識別的特定序列。運(yùn)些因子可W結(jié)合啟動子DNA序 列，導(dǎo)致RNA聚合酶被招募，運(yùn)種酶從基因的編碼區(qū)合成RNA。啟動子一般指位于基因上游的 全部基因調(diào)節(jié)元件，包括上游啟動子、5'-UTR、內(nèi)含子和前導(dǎo)序列。
[0064] 如本文所使用的，術(shù)語"上游啟動子"是指足夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始的一段郵連的多核巧 酸序列。如本文所使用的，上游啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，其具有多個序列基序，包括TATA 盒、起始子序列（initiator sequence)、TFI IB識別元件（BRE )和其它啟動子基序 (Jennifer，E.F.et al.，（ 2002 )Genes&Dev .，16: 2583-2592)。上游啟動子提供了RNA 聚合酶 11( 一種多亞基酶)與基礎(chǔ)或一般轉(zhuǎn)錄因子如TFIIA，B，D，E，F(xiàn)和H的作用位點(diǎn)。運(yùn)些因子組裝 成轉(zhuǎn)錄前-起始復(fù)合體，后者催化從DNA模板合成RNA。
[0065] 上游啟動子的激活是通過加入調(diào)節(jié)性DNA序列元件，多種蛋白質(zhì)與調(diào)節(jié)性DNA序列 元件結(jié)合，并隨后與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體接觸從而激活基因表達(dá)。運(yùn)些基因調(diào)節(jié)元件序列與特 定的DNA結(jié)合因子相互作用。運(yùn)些序列基序有時被稱作順式元件。運(yùn)些順式元件與組織特異 性或發(fā)育特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，它們可W單獨(dú)或者組合地在轉(zhuǎn)錄水平上決定啟動子的時空 表達(dá)模式。運(yùn)些順式元件對可操作連接基因的控制類型可能差異很大。一些元件會響應(yīng)環(huán) 境響應(yīng)(例如溫度、濕度、和致傷)使可操作連接基因的轉(zhuǎn)錄增加。其它順式元件可W響應(yīng)發(fā) 育線索（例如萌發(fā)、種子成熟和開花）或者響應(yīng)空間信息（例如組織特異性）。參見例如 Langridge et al.,(1989)P;roc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3219-23。運(yùn)些順勢元件的位置與 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離并不相同，一些順式元件(稱作鄰近元件)與最小核屯、啟動子區(qū)域郵鄰， 而其它元件可W位于啟動子上游或下游數(shù)千堿基的位置(增強(qiáng)子）。
[0066] 如本文所使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"包括所有能夠?qū)⒑怂岱肿右氲郊?xì)胞內(nèi)的技術(shù)。實(shí) 例包括，但不僅限于：病毒載體轉(zhuǎn)染；質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化；電穿孔；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；顯微注射 (Mueller et al.(1978)Cell 15:579-85) ;±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移;直接DNA攝入;WHISKERS? 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化;和微射彈轟擊。運(yùn)些技術(shù)可用于植物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時轉(zhuǎn)化二者。"穩(wěn)定 轉(zhuǎn)化"是指核酸片段引入到宿主生物體的基因組內(nèi)，導(dǎo)致在遺傳上穩(wěn)定的繼承。一旦被穩(wěn)定 轉(zhuǎn)化，核酸片段便穩(wěn)定地整合進(jìn)宿主生物體和任何后代的基因組中。含有轉(zhuǎn)化核酸片段的 宿主生物被稱為"轉(zhuǎn)基因"生物。"瞬時轉(zhuǎn)化"是指核酸片段被引入到宿主生物體的細(xì)胞核或 含DNA的細(xì)胞器中，引起基因表達(dá)但不會在遺傳上穩(wěn)定的繼承。
[0067] 如本文所使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)導(dǎo)"是指病毒將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的過程。
[0068] 如本文所使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"是指外源核酸序列。在一個實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因是基因 序列(例如，除草劑抗性基因），編碼工業(yè)或制藥上有用的化合物的基因，或者編碼期望農(nóng)藝 學(xué)性狀的基因。在另外的實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因是反義核酸序列，其中該反義核酸序列的表達(dá)會 抑制祀核酸序列的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因可W含有與轉(zhuǎn)基因可操作連接的調(diào)節(jié)序列（例如，啟動子、 內(nèi)含子或3'-UTR)。在一些實(shí)施方案中，感興趣的核酸是轉(zhuǎn)基因。然而，在其它實(shí)施方案中， 感興趣的核酸是內(nèi)源核酸，其中該內(nèi)源核酸的額外基因組拷貝是期望的，或者是與宿主生 物體中的祀核酸序列處于反義取向的核酸。
[0069] 如本文所使用的，術(shù)語"載體"是指被引入到細(xì)胞內(nèi)從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞的核酸分 子。載體可W包括允許它在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的核酸序列，例如復(fù)制原點(diǎn)。實(shí)例包括，但不僅 限于，質(zhì)粒、粘粒、隧菌體、細(xì)菌人工染色體(BAC)，或可攜帶外來DNA進(jìn)入細(xì)胞的病毒。載體 還可W包括一個或多個基因、反義分子和/或選擇標(biāo)志物基因和本領(lǐng)域已知的其它遺傳元 件。載體可W轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或感染細(xì)胞，借此導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)核酸分子和/或由該載體編碼的蛋 白質(zhì)。載體可W任意地包括幫助核酸分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的材料(例如脂質(zhì)體）。
[0070] 如本文所使用的，術(shù)語"盒子"、"表達(dá)盒"和"基因表達(dá)盒"是指能夠被插入到核酸 或多核巧酸的特定限制位點(diǎn)處或者通過同源重組插入核酸或多核巧酸的DNA區(qū)段。DNA區(qū)段 包括含有感興趣基因的多核巧酸，感興趣基因編碼感興趣的小RNA或多膚，并且該盒子和限 制位點(diǎn)被設(shè)計成確保盒子W正確的閱讀框被插入，W保證轉(zhuǎn)錄和翻譯。在一個實(shí)施方案中， 表達(dá)盒可包括編碼感興趣的小RNA或多膚的多核巧酸，并可具有除該多核巧酸之外的促進(jìn) 特定宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的元件。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒還可W包括如下元件，其允許 在宿主細(xì)胞中增強(qiáng)編碼感興趣的小RNA或多膚的多核巧酸的表達(dá)。運(yùn)些元件可W包括，但不 僅限于：啟動子，最小啟動子，增強(qiáng)子，應(yīng)答元件，內(nèi)含子，5'非翻譯區(qū)序列，3'非翻譯區(qū)序 列，終止子序列，多腺巧酸化序列，等。
[0071] 如本文所使用的，術(shù)語"異源編碼序列"用于指示任何編碼、或者最終編碼膚或蛋 白質(zhì)或其等價氨基酸序列(例如酶)的多核巧酸，所述膚或蛋白質(zhì)或其等價氨基酸序列在宿 主生物體中通常不存在，并且在合適的條件下能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)。運(yùn)樣，"異源編碼序 列"可W包括一個或多個拷貝的在宿主細(xì)胞中通常不存在的編碼序列，從而使細(xì)胞表達(dá)額 外拷貝的在細(xì)胞中通常不存在的編碼序列。異源編碼序列可W是RNA或者其任何類型(例如 mRNA)，DNA或其任何類型（例如cDNA)，或RNA/DNA的雜交體。編碼序列的實(shí)例包括，但不僅限 于，全長轉(zhuǎn)錄單元，其包括例如編碼序列、內(nèi)含子、啟動子區(qū)、5/-UTR、3/-UTR和增強(qiáng)子區(qū)等 特征。
[0072] "異源編碼序列"還包括膚或酶的編碼部分（即cDNA或mRNA序列），全長轉(zhuǎn)錄單元的 編碼部分（即包含內(nèi)含子和外顯子的基因），編碼酶或者編碼其等價氨基酸序列的"密碼子 優(yōu)化"序列、截短的序列和其它具有改變的序列的形式，前提是該等價氨基酸序列可產(chǎn)生功 能性蛋白。運(yùn)樣的等價氨基酸序列可W具有一個或多個氨基酸缺失，該缺失在N端、C端或內(nèi) 部。也設(shè)想了截短的形式，只要它們具有本文所述的催化能力即可。
[0073] 如本文所使用的，術(shù)語"對照"是指在分析程序中用于比較目的的樣品。對照可W 是"陽性"或"陰性"。例如，當(dāng)分析程序的目的是檢測細(xì)胞或組織中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本或多 膚時，一般優(yōu)選地包含陽性對照，例如來自已知顯示期望表達(dá)的植物的樣品，和陰性對照， 例如來自已知缺少期望表達(dá)的植物的樣品。
[0074]如本文所使用的，術(shù)語"植物"包括植物和植物部分，包括但不僅限于，植物細(xì)胞和 植物組織，例如葉、愈傷組織、莖、根、花、花粉和種子。可W在本發(fā)明中使用的植物類別寬泛 到包括適合于誘變的高等和低等植物，包括被子植物，裸子植物，藤類植物和多細(xì)胞藻類。 因此，"植物"包括雙子葉和單子葉植物。雙子葉植物的實(shí)例包括煙草，擬南芥，大豆，番茄， 木瓜，芥花(canola),向日葵，棉花，首猜，馬鈴馨，葡萄，木豆，魏豆，蕓苔(Brassica)，鷹嘴 豆，甜菜，油菜，西瓜，甜瓜，辣椒，花生，南瓜，蘿h渡菜，倭瓜，西蘭花，卷屯、菜，胡蘿h花挪 菜，芹菜，大白菜，黃瓜，茄子，和窩宦。單子葉植物的實(shí)例包括玉米，大米，小麥，甘薦，大麥， 黑麥，高梁，蘭花，竹，香蕉，香蒲，百合，燕麥，洋蔥，小米和黑小麥。
[007引如本文所使用的，術(shù)語"植物部分"是指葉、愈傷組織、莖、根、花或花的部分、果實(shí)、 花粉、卵細(xì)胞、合子、種子、插條、細(xì)胞或組織培養(yǎng)物，或者植物的任何其它部分或產(chǎn)物。在一 個實(shí)施方案中，植物材料包括子葉和葉。在一個實(shí)施方案中，植物材料包括根組織和其它位 于地下的植物組織。
[0076] 如本文所使用的，術(shù)語"選擇標(biāo)志物基因"是指在植物轉(zhuǎn)化中被任選地用于例如保 護(hù)植物細(xì)胞免于選擇劑的傷害或者提供對選擇劑的抗性/耐受性的基因。此外，"選擇標(biāo)志 物基因"意圖包括報告基因。只有那些接受了功能性的選擇標(biāo)志物的細(xì)胞或植物才能夠在 具有選擇劑的條件下分裂或生長。選擇劑的實(shí)例可包括，例如，抗生素，包括壯觀霉素，新霉 素，卡那霉素，己龍霉素，慶大霉素，和潮霉素。運(yùn)些選擇標(biāo)志物包括新霉素憐酸轉(zhuǎn)移(npt II)，其表達(dá)的酶可賦予對抗生素卡那霉素的抗性，和針對相關(guān)抗生素新霉素、己龍霉素、慶 大霉素和G418的基因，或者潮霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶化pt)的基因，其表達(dá)的酶可賦予對潮霉素的 抗性。其它選擇標(biāo)志物基因可W包括編碼除草劑抗性的基因，包括bar或pat(抵抗草錠麟錠 鹽或麟絲菌素），乙酷乳酸合酶(ALS，抵抗抑制劑例如橫酷脈類(SU)，咪挫嘟酬類（IMI)，S 挫并喀晚(TP)，喀晚氧基苯甲酸(pyrimidinyloxybenzoate)(POB)，和橫酷幾基S挫嘟酬， 其可阻止支鏈氨基酸合成的第一步，草甘麟，2,4-D和金屬抗性或敏感性?？蒞用來作為選 擇標(biāo)志物基因的"報告基因"的實(shí)例包括可W視覺觀察所表達(dá)報告基因的蛋白，例如編碼0 葡糖巧酸酶(GUS)、巧光素酶、綠色巧光蛋白（GFP)、黃色巧光蛋白蛋白（YFP)、化RecUe-半乳 糖巧酶、氯霉素乙酷轉(zhuǎn)移酶(CAT)、堿性憐酸酶和類似物的蛋白質(zhì)。短語"標(biāo)志物陽性"是指 已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為包含選擇標(biāo)志物基因的植物。
[0077] 如本文所使用的，術(shù)語"可檢測標(biāo)志物"是指能夠檢測的標(biāo)記，例如放射性同位素， 巧光化合物，生物發(fā)光化合物，化學(xué)發(fā)光化合物，金屬馨合劑，或酶?？蓹z測標(biāo)記物的實(shí)例包 括，但不僅限于，下述者：巧光標(biāo)記(例如，F(xiàn)ITC，羅丹明，銅系憐光體），酶標(biāo)記(例如辣根過 氧化物酶，e半乳糖巧酶，蛋光素酶，堿性憐酸酶），化學(xué)發(fā)光，生物素基團(tuán)，可W被第二報告 分子識別的預(yù)定多膚表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列，第二抗體的結(jié)合位點(diǎn)，金屬結(jié)合結(jié)構(gòu) 域，附加表位）。在一個實(shí)施方案中，可檢測標(biāo)記物可W附加各種長度的間隔臂，W減少潛在 的空間位阻。
[0078] 如本文所使用的，術(shù)語"檢測"使用其最廣泛的含義，包括對特定分子的定性和定 量測量，例如測量特定的多膚。
[0079] 除非另有具體說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開所屬領(lǐng)域 普通技術(shù)人員所公知的相同的含義。分子生物學(xué)常用術(shù)語的定義可W在列文獻(xiàn)中找到，例 如：Lewin,Genes V,Oxford University Press,1994;Kendrew et al.(編輯），^6 Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd., 1994;和Meyers(編輯）， Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference ,VCH Publishers,Inc.,1995。
[0080] 啟動子作為基因表達(dá)調(diào)節(jié)元件
[0081] 用于基礎(chǔ)研究或生物技術(shù)應(yīng)用的植物啟動子一般是單向的，指導(dǎo)融合到其3'端 (下游）的轉(zhuǎn)基因的組成型表達(dá)。代謝工程和性狀堆疊通常需要在植物體內(nèi)強(qiáng)表達(dá)轉(zhuǎn)基因。 此外，在轉(zhuǎn)基因作物中通常需要多個新啟動子來驅(qū)動多個基因的表達(dá)。本文公開了能夠指 導(dǎo)融合在其3'端的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的組成型啟動子。
[0082] 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的開發(fā)日益復(fù)雜，需要強(qiáng)表達(dá)轉(zhuǎn)基因并在單個基因座中堆疊多個轉(zhuǎn)基 因。傳統(tǒng)上，每個轉(zhuǎn)基因的表達(dá)通常需要一個獨(dú)特的啟動子，其中在一個基因堆疊內(nèi)需要多 個啟動子來表達(dá)不同的轉(zhuǎn)基因。隨著基因堆疊規(guī)模的增加，運(yùn)經(jīng)常導(dǎo)致為了表達(dá)單個多基 因性狀而重復(fù)使用相同的啟動子，W獲得不同轉(zhuǎn)基因的相似水平的表達(dá)模式。
[0083] 已知受相同啟動子驅(qū)動的多基因構(gòu)建體會導(dǎo)致基因沉默，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在大田 中有效的效力降低。由于啟動子重復(fù)而產(chǎn)生的過多的轉(zhuǎn)錄因子(TF)結(jié)合位點(diǎn)會導(dǎo)致內(nèi)源TF 的枯竭，從而使轉(zhuǎn)錄失活。轉(zhuǎn)基因沉默很可能對為表達(dá)轉(zhuǎn)基因而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的性能 帶來不利影響。轉(zhuǎn)基因內(nèi)的重復(fù)序列會導(dǎo)致基因座位內(nèi)的同源重組，進(jìn)而導(dǎo)致多核巧酸重 排。
[0084] 除了組成型啟動子，組織特異性或者器官特異性啟動子驅(qū)動基因在特定的組織 中，如在谷粒、根、葉、愈傷組織、花粉或植物的絨拉層中表達(dá)。組織和發(fā)育階段特異的啟動 子驅(qū)動基因在特定的組織中或者在植物發(fā)育過程的特定時間段內(nèi)表達(dá)。組織特異性啟動子 對于轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)業(yè)的某些應(yīng)用是需要的，并且是期望的，因?yàn)樗鼈冊试S在不同組織和/或 在選定的發(fā)育階段中特異性地表達(dá)異源基因，指示異源基因在各種器官、組織和/或在不同 時間內(nèi)差異性表達(dá)，而非在其他情況下表達(dá)。
[0085] 例如，可W通過用病原抗性基因轉(zhuǎn)化植物基因組，使得病原體抗性蛋白在植物中 強(qiáng)烈表達(dá)，來實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)植物對±壤傳播的病原體的感染的抵抗力。或者，可能期望在處于特 定生長或發(fā)育階段，例如細(xì)胞分裂或伸長期，的植物組織中表達(dá)轉(zhuǎn)基因。另一個應(yīng)用是使用 組織特異性啟動子的可取之處，使得啟動子能夠?qū)⒕幋a農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)限制在發(fā) 育中的植物部分(即，根，葉，愈傷組織，或花粉)中。
[0086] 本文所述的啟動子可望成為制備含有多個基因的商業(yè)轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的工具。運(yùn)些 啟動子還提供了在細(xì)菌宿主內(nèi)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和在植物細(xì)胞中的功能穩(wěn)定性，例如減少轉(zhuǎn)基 因沉默，從而為轉(zhuǎn)基因表達(dá)創(chuàng)造條件。具有不同表達(dá)范圍的啟動子，也可W通過使用本文所 述的方法獲得。相比于多次使用單個啟動子的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，本申請中描述的多樣化啟動 子構(gòu)建體更加適合轉(zhuǎn)基因事件的下游分子分析。使用本文描述的多樣化啟動子還可W減少 在用鋒指技術(shù)進(jìn)行祀定過程中轉(zhuǎn)基因多基因座位的重排(SHUKLA等人.2009)。
[0087] 玉米泛素-1啟動子
[0088] 玉米師i-1啟動子已經(jīng)成為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)手段，主要用于在玉米中穩(wěn)定高 表達(dá)轉(zhuǎn)基因 （CHRISTENSEN and QUAIL 1996;CHRISTENSEN et al.l992;T0KI et al. 1992)。每個轉(zhuǎn)基因的充分表達(dá)通常需要一個特定的啟動子。在一個基因堆疊中通常需 要多個啟動子來表達(dá)不同的轉(zhuǎn)基因。運(yùn)種范式經(jīng)常導(dǎo)致重復(fù)使用玉米化i-1啟動子，因?yàn)樗?有令人期望的高水平蛋白質(zhì)表達(dá)和組成型表達(dá)模式。
[0089] 然而，在轉(zhuǎn)基因座位內(nèi)故意引入重復(fù)的序列也會對轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和穩(wěn)定性產(chǎn)生不 期望的負(fù)面影響（FLADUNG and KUMAR 2002;KUMAR and FLADUNG 2000a;KUMAR and FLADUNG 2000b；KUMAR and FLADUNG 200la；KUMAR and FLADUNG 2001b；KUMAR and 化ADUNG 2002;METTE et al.l999;M0URRAIN et al.2007)。多個轉(zhuǎn)基因協(xié)調(diào)表達(dá)運(yùn)一挑戰(zhàn) 可W使用啟動子多樣化方法來解決，其中不同的啟動子用于驅(qū)動具有相同的表達(dá)概貌的不 同轉(zhuǎn)基因 （PEREMARTI et al.2010)。本申請描述了通過從不同玉米基因型中鑒定和純化新 啟動子而獲得的多樣化化i-1啟動子序列。
[0090] 植物基因中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)節(jié)受到多個DNA序列元件的指導(dǎo)，運(yùn)些序列 元件集合排列成一個較大的序列，稱為啟動子。真核啟動子通常由最小核屯、啟動子和上游 調(diào)節(jié)序列構(gòu)成。核屯、啟動子是足W指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確起始的最小一段連續(xù)DNA序列。植物中的 核屯、啟動子一般包括與轉(zhuǎn)錄起始相關(guān)的規(guī)范區(qū)（canonical region)，例如CAAT和TATA框 (共有序列TATAWAWKTATA框元件通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS)上游大約20-35個堿基對 (bp)。核屯、啟動子的激活由上游調(diào)節(jié)序列實(shí)現(xiàn)，它們結(jié)合各種蛋白質(zhì)，隨后與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合 體相互作用，從而激活基因表達(dá)。運(yùn)些調(diào)節(jié)元件包括確定啟動子時空表達(dá)模式的DNA序列。
[0091] 參考圖1，玉米化i-1基因啟動子來自于玉米近交細(xì)胞系B73。玉米師i-1啟動子包 括位于TSS 5'上游的大約89化P的DNA序列（即，上游元件）。此外，玉米師i-1啟動子包括位 于TSS 3'下游的大約1093bp的DNA序列（參見美國專利5,510,474)。因此，玉米化1-1啟動子 的總DNA序列包括大約2000個堿基對化b)。
[0092] 玉米化i-1啟動子的上游元件包括位于TSS 5'上游大約30bp的TATA框（圖1和3)。 此外，該上游元件包括位于TSS 5 '直接上游的兩個重疊的熱休克共有元件。一個82bp的5 '- UTR或前導(dǎo)序列位于TSS的3'直接下游，隨后是內(nèi)含子，其從堿基83延伸到1093(圖1和3)。
[0093] W前的工作已經(jīng)描述了由玉米師i-1啟動子調(diào)節(jié)的基因和/或轉(zhuǎn)基因的基因表達(dá) 增加。例如，氯霉素乙酷轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因與玉米化i-1啟動子的轉(zhuǎn)錄融合使得CAT在玉米原 生質(zhì)體中的活性是由花挪菜花葉病毒35S啟動子驅(qū)動的表達(dá)的超過10倍(CHRISTENSEN and QUAIL 1996;CHRISTENSEN et al.1992)。
[0094] 除了對照玉米化i-1啟動子之外，本申請還描述了新型玉米化i-1啟動子。與來自 玉米基因型栽培種B73的對照化i-1啟動子不同，新型化i-1啟動子來自玉米基因型栽培種 化-II。還提供了使用包含多核巧酸序列的玉米化i-1啟動子的構(gòu)建體和方法。在一個實(shí)施 方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培種B73化i-1基因的多核巧酸，如下：
[0095] GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATA TTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATA TAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAA TTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGC TTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAAT TTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTT AATAGTTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACT AAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACC AGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTC GAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCC GGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTT TCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCA CACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCC CCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCA TGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACA CGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCG ATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTT GTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGAT CGGAGTAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATATTCAT AGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCA TATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGG AGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTGTCATACATCTTCATAGT TACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACA TGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATA ATTATTTCGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATA CGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCA(SEQ ID N0:1)
[0096] 在一個實(shí)施方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培種化-II Ubi-1基因的多核巧 酸序列，如下：
[0097] GACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAAAGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACAATTTTTTAAGT GCAGTTTACGTATCTCTATACATATATTTAAACTTTACTATACGAATAATATAGTTTATAATACTAAAATAATATCA GTGTTTTAGAGAATTATATAAATGAACTGCTAGACATGGTCTAAATAACAATTGAGTGTTTTGACAACAGGACTCTA CAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTCCTATTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCACCAATT TATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTCTATAGACTAATTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTT TAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTTTATTTTAGTTTTTTTAATAATTTAGATATAAATAGAATAAAATAAAGT GACTAAAAATTAACTAAATACCTTTTAAAAAAATAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTCCGAGTAGATAATGA CAGGCTGTTCAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAG CAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTG TCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGGCGGCACGGCAGGCGGCCTCTTCCTCCTCTCACGGCA CCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCC CTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTCGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCC GTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCATCCTCCCCCCCCCCCCCCCTCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGT TCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTG CTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACATCAGACATGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGG GGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTT GGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGTTTTTTTTTGGCT TGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGGATT TATTAAAGGATCTGTATGTATGTGCCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTA GGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTTTTTCGCTTGGTTGTGATGAT GTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTAACTGGTGGATTTATTAATTTTGGA TCTGTATGTGTGTGCCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAGTATCGATCTAGGATAGGTAT ACATGTTGATGTTGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATTCATATGCTCTAACCTT GAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGC AGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCTCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGC TCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAG(SEQ ID NO:2)
[0098] 對本文所描述的啟動子通過克隆W及隨后的DM序列同源性分析進(jìn)行了表征，W 鑒定啟動子的特定區(qū)域（即，上游的啟動子，5'-UTR，和內(nèi)含子區(qū)域）。提供了使用組成型玉 米化i-1啟動子在植物中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建體和方法，其包括上游啟動子區(qū)，5-UTR或前導(dǎo) 區(qū)，和內(nèi)含子。在一個實(shí)施方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培種B73 Ubi-1基因的上游 啟動子多核巧酸序列，如下：
[0099] GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATA TTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATA TAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAA TTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGC TTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAAT TTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTT AATAGTTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACT AAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACC AGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTC GAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCC GGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTT TCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTT(沈Q ID N0:3)
[0100] 在另一個實(shí)施方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培種化-II Ubi-1基因的上游 啟動子多核巧酸序列，如下：
[0101] GACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAAAGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACAATTTTTTAAGT GCAGTTTACGTATCTCTATACATATATTTAAACTTTACTATACGAATAATATAGTTTATAATACTAAAATAATATCA GTGTTTTAGAGAATTATATAAATGAACTGCTAGACATGGTCTAAATAACAATTGAGTGTTTTGACAACAGGACTCTA CAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTCCTATTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCACCAATT TATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTCTATAGACTAATTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTT TAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTTTATTTTAGTTTTTTTAATAATTTAGATATAAATAGAATAAAATAAAGT GACTAAAAATTAACTAAATACCTTTTAAAAAAATAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTCCGAGTAGATAATGA CAGGCTGTTCAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAG CAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTG TCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGGCGGCACGGCAGGCGGCCTCTTCCTCCTCTCACGGCA CCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCC CTCCACACCCTCTT(沈Q ID N0:4)
[0102] 其他的基因調(diào)節(jié)元件
[0103] 轉(zhuǎn)基因表達(dá)還可W受到位于上游啟動子序列3'下游的5'-UTR和/或內(nèi)含子區(qū)的調(diào) 節(jié)。包含與5'-UTR和/或內(nèi)含子可操作連接的上游啟動子區(qū)的啟動子能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的表 達(dá)。上游啟動子是驅(qū)動轉(zhuǎn)錄必需的，而5'-UTR和/或內(nèi)含子的存在能夠增加表達(dá)水平，導(dǎo)致 產(chǎn)生更多的mRNA轉(zhuǎn)錄物用于翻譯和蛋白質(zhì)合成。在上游啟動子多核巧酸序列中添加5'-UTR 和/或內(nèi)含子能夠幫助轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達(dá)。
[0104] 此外，包含上游啟動子多核巧酸序列的組成型啟動子的后面可W跟隨5'-UTR或前 導(dǎo)序列，W幫助轉(zhuǎn)基因在植物內(nèi)的表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培 種B73化i-1基因的5'-UTR或前導(dǎo)多核巧酸序列，如下：
[0105] TCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCT TCAAG(SEQ ID NO:5)
[0106] 在另一個實(shí)施方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培種化-II Ubi-1基因的5'- UTR或前導(dǎo)多核巧酸序列，如下：
[0107] TCCCCAACCTCGTGTTCGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGC TTCAAG(SEQ ID NO:6)
[010引進(jìn)一步地，包含上游啟動子多核巧酸序列后隨5'-UTR或前導(dǎo)序列的組成型啟動子 還可W后隨內(nèi)含子，W幫助轉(zhuǎn)基因在植物內(nèi)的表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，啟動子可W包括來 自玉米栽培種B73化i-1基因的內(nèi)含子多核巧酸序列，如下：
[0109] GTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGCATGGTTAGGG CCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACAC GGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTC TAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTT ATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGT CTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGT ATGTGTGTGCCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATG TTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCG GTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATG TGTGTGTCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATG TGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATT ATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTCGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGG ATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTG GTGTTACTTCTGCA(SEQ ID NO:7)
[0110] 在另一個實(shí)施方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培種化-II Ubi-1基因的內(nèi)含 子多核巧酸序列，如下：
[0111] GTACGCCGCTCATCCTCCCCCCCCCCCCCCCTCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAGGGCC CGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGG ATGCGACCTGTACATCAGACATGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTA GCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTAT TTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGTTTTTTTTTGGCTTGGTTGTGATGATGTGGTCT GGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAAAGGATCTGTATGTA TGTGCCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGAT GCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTTTTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCG TTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTAACTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATAC ATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAGTATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTTGGTTTTA CTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAAT AAACAAGTATGTTTTATAATTATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTT TTTAGCTCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTT ACTTCTGCAG(SEQ ID NO:8)
[0112] 轉(zhuǎn)基因和報告基因表達(dá)盒
[0113] 轉(zhuǎn)基因表達(dá)還可W受到基因表達(dá)盒的調(diào)節(jié)。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括 啟動子。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括化i-1啟動子。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒 包括來自植物的化i-1啟動子。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括來自玉米栽培種化-II 的化i-1啟動子。
[0114] 在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其中該啟動 子與SEQ ID N0:2具有至少80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98 %，99 %，99.5 %，99.8 %，或100 %的同一性。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括組成型 啟動子，例如玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其與報告基因或轉(zhuǎn)基因可操作連接。在一個 實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括與轉(zhuǎn)基因可操作連接的組成型啟動子，其中該轉(zhuǎn)基因可W是 殺蟲抗性轉(zhuǎn)基因，除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因，氮利用效率轉(zhuǎn)基因，水利用效率轉(zhuǎn)基因，營養(yǎng)品質(zhì) 轉(zhuǎn)基因，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基因，選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因，或其組合。在一個實(shí)施方案中，包含組成型啟 動子的基因表達(dá)盒可W驅(qū)動一個或多個轉(zhuǎn)基因或報告基因的表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，包 含組成型啟動子的基因表達(dá)盒可W驅(qū)動兩個或多個轉(zhuǎn)基因或報告基因的表達(dá)。
[0115] 在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其中上游啟 動子序列與SEQ ID N0:4至少80% ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97%, 98% ,99% ,99.5% ,99.8%，或100%相同。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括組成型啟動 子，例如玉米栽培種化-II Ubi-1上游啟動子，其與報告基因或轉(zhuǎn)基因可操作連接。在一個 實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括與轉(zhuǎn)基因可操作連接的組成型上游啟動子，其中該轉(zhuǎn)基因可 W是殺蟲抗性轉(zhuǎn)基因，除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因，氮利用效率轉(zhuǎn)基因，水利用效率轉(zhuǎn)基因，營養(yǎng) 品質(zhì)轉(zhuǎn)基因，DM結(jié)合轉(zhuǎn)基因，選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因，或其組合。在一個實(shí)施方案中，包含組成 型上游啟動子的基因表達(dá)盒可W驅(qū)動一個或多個轉(zhuǎn)基因或報告基因的表達(dá)。在一個實(shí)施方 案中，包含組成型上游啟動子的基因表達(dá)盒可W驅(qū)動兩個或更多個轉(zhuǎn)基因或報告基因的表 達(dá)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，上游啟動子可W包括內(nèi)含子。在一個實(shí)施方案中，上游啟動子 可W包括與報告基因或轉(zhuǎn)基因可操作連接的內(nèi)含子序列。在另一個實(shí)施方案中，上游啟動 子可W包括5'-UTR或前導(dǎo)序列。在一個實(shí)施方案中，上游啟動子可W包括與報告基因或轉(zhuǎn) 基因可操作連接的5'-UTR或前導(dǎo)序列。在另外一個實(shí)施方案中，上游啟動子可W包括5'- UTR或前導(dǎo)序列和內(nèi)含子序列。在一個實(shí)施方案中，上游啟動子可W包括與報告基因或轉(zhuǎn)基 因可操作連接的5 '-UTR或前導(dǎo)序列和內(nèi)含子序列。
[0116] 在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其中該5'- 1^'尺或前導(dǎo)序列與560 1〇^:6至少80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%， 97% ,98% ,99% ,99.5% ,99.8%，或100%相同。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括來自 編碼泛素-1蛋白的玉米基因的或前導(dǎo)序列，其與啟動子可操作連接，其中該啟動子是玉米 栽培種化-II Ubi-1啟動子，或者來自植物(例如玉米泛素-1啟動子）、病毒(例如木馨葉脈 花葉病毒啟動子），或細(xì)菌(例如±壤桿菌delta mas)的啟動子。在一個例示性實(shí)施方案中， 基因表達(dá)盒包括玉米栽培種化-II 5'-UTR或前導(dǎo)序列，其來自編碼泛素-1蛋白的玉米基 因，并與轉(zhuǎn)基因可操作連接，其中該轉(zhuǎn)基因可W是殺蟲抗性轉(zhuǎn)基因，除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因， 氮利用效率轉(zhuǎn)基因，水利用效率轉(zhuǎn)基因，營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基因，選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基 因，或其組合。
[0117] 在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其中內(nèi)含子 序列與沈Q ID N0:8至少80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99% ,99.5% ,99.8%，或100%相同。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括來自編碼泛素-1 蛋白的玉米基因的內(nèi)含子，其與啟動子可操作連接，其中該啟動子是玉米栽培種Hi-II 郵i-1啟動子，或者來自植物(例如玉米泛素-1啟動子）、病毒(例如木馨葉脈花葉病毒啟動 子），或細(xì)菌(例如±壤桿菌delta mas)的啟動子。在一個例示性實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包 括來自編碼泛素-1蛋白的玉米基因的內(nèi)含子，其與轉(zhuǎn)基因可操作連接，其中該轉(zhuǎn)基因可W 是殺蟲抗性轉(zhuǎn)基因，除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因，氮利用效率轉(zhuǎn)基因，水利用效率轉(zhuǎn)基因，營養(yǎng)品 質(zhì)轉(zhuǎn)基因，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基因，選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因，或其組合。
[0118] 在一個實(shí)施方案中，載體可W包括如本文所述的基因表達(dá)盒。在一個實(shí)施方案中， 載體可W是質(zhì)粒、粘粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)、隧菌體、病毒、或用于直接轉(zhuǎn)化或基因祀定 的切離的多核巧酸片段，例如供體DNA。
[0119] 在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞或植物包括如本文所述的基因表達(dá)盒。在一個實(shí)施方案 中，細(xì)胞或植物包括包含如本申請中公開的基因表達(dá)盒的載體。在一個實(shí)施方案中，載體可 W是質(zhì)粒、粘粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)、隧菌體、或病毒。據(jù)此，包含基因表達(dá)盒的細(xì)胞或植 物分別是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物。
[0120] 在一個實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物可W是單子葉植物或雙子葉植物。轉(zhuǎn)基因單子葉 植物的實(shí)施方案可W是，但不僅限于，玉米、小麥、水稻、高梁、燕麥、黑麥、香蕉、甘薦、和小 米。轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的實(shí)施方案可W是，但不僅限于大豆、棉花、向日葵、或芥花。實(shí)施方 案還包括來自轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子，如本文所述的。
[0121] 選擇標(biāo)志物
[0122] 各種選擇標(biāo)志物，也稱為報告基因，可W整合到所選表達(dá)載體中，W允許鑒定和選 擇被轉(zhuǎn)化的植物（"轉(zhuǎn)化體"）。有多種方法可用于確認(rèn)選擇標(biāo)志物在轉(zhuǎn)化的植物中的表達(dá)， 包括例如DNA測序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、Southern印跡、RNA印跡、用于檢測從載體表達(dá)的 蛋白質(zhì)的免疫學(xué)方法，例如介導(dǎo)麟絲菌素抗性的沉淀蛋白，或者視覺觀察其它蛋白質(zhì)，例如 編碼e-葡糖巧酸酶(GUS)、巧光素酶、綠色巧光蛋白（GFP)、黃色巧光蛋白（YFP)、DsRed、0-半 乳糖巧酶、氯霉素乙酷轉(zhuǎn)移酶（CAT)、堿性憐酸酶等的報告基因（參見Sambrook，et al.， Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,第；片反，Cold Spring Harbor Press,N.Y., 2001，其全部內(nèi)容通過引用并入本文）。
[0123] 選擇標(biāo)志物基因用于選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。選擇標(biāo)志物基因包括編碼抗生素 抗性的基因，例如編碼新霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶化PT)的基因，W及 賦予對除草化合物抗性的基因。除草劑抗性基因一般編碼經(jīng)過修飾的對除草劑不敏感的祀 蛋白，或者編碼在除草劑在植物中發(fā)揮作用之前將其降解或脫毒的酶。例如，已經(jīng)通過使用 編碼突變型祀酶，5-締醇丙酬莽草酸-3-憐酸合酶化PSPS)，的基因而獲得了對草甘麟的抗 性。EPSPS的基因和突變體是眾所周知的，并且在下文中有進(jìn)一步的描述。對草胺麟錠鹽、漠 苯臘和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-0)的抗性已經(jīng)通過使用編碼9曰1:或051-2、臘水解酶、曰曰(1-1 或aad-12基因的細(xì)菌基因得W實(shí)現(xiàn)，運(yùn)些基因可W將各自的除草劑脫毒。
[0124] 在一個實(shí)施方案中，除草劑可W抑制生長點(diǎn)或分生組織，包括咪挫嘟酬或橫酷脈， 且用于抵抗/耐受運(yùn)些除草劑的乙酷徑酸合酶(AHAS)和乙酷乳酸合酶(ALS)的基因。草甘麟 抗性基因分別包括突變的5-締醇丙酬莽草酸-3-憐酸合酶化PSPS)和dgt-28基因（通過引入 重組核酸和/或各種形式的天然EPSP基因的體內(nèi)誘變），aroA基因和草甘麟乙酷轉(zhuǎn)移酶 (GAT)基因。對其它含麟化合物的抗性基因包括來自鏈霉菌屬，包括吸水鏈霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)和Streptomyces viridichromogenes，的BAR基因，和口比晚 氧基(pyridinoxy)或苯氧基(phenoxy)丙酸和環(huán)己酬(ACC酶抑制劑編碼基因）。可賦予對環(huán) 己二酬和/或芳氧苯氧丙酸（a巧1〇巧地enoxypropanoic acid)(包括蓋草能，禾草靈，嗯挫 禾草靈，化氣禾草靈，精哇禾靈）的抗性的示例性基因包括乙酷輔酶A簇化酶(ACC酶)一一 Accl-Sl，Accl-S2和ACC1-S3的基因。在一個實(shí)施方案中，除草劑能夠抑制光合作用，包括S 嗦(psbA和ls+基因）或節(jié)臘(臘水解酶基因）。
[0125] 在一個實(shí)施方案中，選擇標(biāo)志物包括，但不僅限于，編碼如下的基因：新霉素憐酸 轉(zhuǎn)移酶II;氨臘水合酶;天冬氨酸激酶;二氨化晚二簇酸合酶;色氨酸脫簇酶;二氨化晚二簇 酸合酶和脫敏的天冬氨酸激酶;bar基因；色氨酸脫簇酶;新霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶(NE0);潮霉素 憐酸轉(zhuǎn)移酶化PT或肌G);二氨葉酸還原酶(畑FR);麟絲菌素乙酷轉(zhuǎn)移酶;2,2-二氯丙酸脫面 素酶；乙酷徑酸合成酶;5-締醇丙酬酸-莽草酸-憐酸合酶(aroA);面代乙臘；乙酷輔酶A簇化 酶;二氨蝶酸合酶(sul I);和32kD光系統(tǒng)II多膚(psbA)。
[0126] 實(shí)施方案還包括編碼對如下者的抗性的基因：氯霉素；甲氨蝶嶺；潮霉素;壯觀霉 素;漠苯臘;草甘麟;和麟絲菌素。
[0127] 上述的選擇標(biāo)志物基因的列表并不意味著有限制性。本發(fā)明可W包含任何報告或 選擇標(biāo)志物基因。
[0128] 選擇標(biāo)志物基因 W在植物中最佳表達(dá)為目的而合成。例如，在一個實(shí)施方案中，基 因的編碼序列已經(jīng)被密碼子優(yōu)化修飾，w提高在植物中的表達(dá)。選擇標(biāo)志物基因可w被優(yōu) 化用于在特定的植物物種中表達(dá)，或者，可W被修飾用于在雙子葉或單子葉植物中最佳表 達(dá)。植物優(yōu)選的密碼子可W從感興趣的特定植物物種中W表達(dá)量最大的蛋白質(zhì)的頻率最高 的密碼子中確定。在一個實(shí)施方案中，選擇標(biāo)志物基因被設(shè)計成在植物中W更高的水平被 表達(dá)，從而產(chǎn)生更高的轉(zhuǎn)化效率。對于植物基因優(yōu)化的方法是眾所周知的。關(guān)于合成多核巧 酸序列的優(yōu)化和制造的指導(dǎo)可見于，例如，W02013016546，W02011146524，W01997013402,美 國專利6166302和美國專利5,380,831，其內(nèi)容通過引用并入本文。
[0129] 轉(zhuǎn)基因
[0130] 公開的方法和組合物可用于在植物基因組中表達(dá)多核巧酸基因序列。因此，編碼 除草劑抗性、昆蟲抗性、營養(yǎng)、抗生素或治療性分子的基因的表達(dá)可W被新型啟動子驅(qū)動。
[0131] 在一個實(shí)施方案中，本公開的組成型啟動子調(diào)節(jié)元件與一個或多個編碼多核巧酸 序列的基因組合或可操作連接，該基因可提供對草甘麟、2,4-D、草錠麟或其他除草劑的抗 性或耐受性，提供對選擇昆蟲或疾病的抗性或耐受性，和/或營養(yǎng)增強(qiáng)，改良的農(nóng)學(xué)特征，用 于在飼料、食品、工業(yè)、醫(yī)藥或其它用途中有用的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)品。轉(zhuǎn)基因可W在植物基 因組中與兩個或多個感興趣的核酸序列"堆疊"。堆疊可W通過例如使用兩個或多個事件的 傳統(tǒng)植物育種，用含有感興趣序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)基因植物的再轉(zhuǎn)化，或者通過同源 重組的祀向整合添加新的性狀，來實(shí)現(xiàn)。
[0132] 運(yùn)些感興趣的多核巧酸序列包括，但不僅限于，下面提供的實(shí)例：
[0。引 1.賦予害蟲或疾病抗性的轉(zhuǎn)基因或編碼序列(例如iRNA)
[0134] (A)植物疾病抗性基因。植物防御經(jīng)常通過植物中疾病抗性基因(R)的產(chǎn)物與病原 體中相應(yīng)的無毒性(Avr)基因的產(chǎn)物的特異相互作用而被激活?？蒞用克隆的抗性基因轉(zhuǎn) 化植物品種，從而工程構(gòu)建對特定病原體株有抗性的植物。運(yùn)些基因的實(shí)例包括:提供黃枝 抱霉（Cladosporium fulvum)抗性的番茄Cf-9 基因 （Jones et al., 1994 Science 266: 789);，提供下香假單胞桿菌番茄致病變種抗性的番茄Pto基因，其編碼一種蛋白激酶 (Madin et al.，1993 Science 262:1432)，和提供下香假單胞菌抗性的擬南芥RSSP2基因 (Mindrinos et al.，1994 Cell 78:1089)。
[0135] (B)蘇云金芽抱桿菌蛋白質(zhì)、其衍生物或W其為模本的人造多膚，例如化S-內(nèi)毒素 基因的多核巧酸序列（Geiser et al.，1986 Gene 48:109)和植物殺蟲(VIP)基因（見，例 如，Estruch et al.(1996)P;roc .Natl .Acad. Sci . 93:5389-94)。此外，編碼S-內(nèi)毒素基因的 DM分子可W從美國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（Rockville，Md.)購得，ATCC登錄號為40098， 67136,31995和31998。
[0136] (C)植物凝集素，例如，多種君子蘭(Clivia miniata)甘露糖結(jié)合性植物凝集素基 因的核巧酸序列（化n Damme et al. ,1994 Plant Molec.Biol.24:825)。
[0137] (D)維生素結(jié)合蛋白質(zhì)，例如親和素及親和素同源物，其可用作針對昆蟲類害蟲的 殺幼蟲劑。見美國專利5，659，026。
[0138] 化)酶抑制劑，例如蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。運(yùn)些基因的實(shí)例包括水稻半脫 氨酸蛋白質(zhì)酶抑制劑(Abe et al. ,1987 J.Biol.化em.262:16793)，煙草蛋白酶抑制劑I 化uubetal.，1993 PlantMolec.Biol.21:985)，和a-淀粉酶抑制劑（Sumitanietal.， 1993 Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)。
[0139] (F)昆蟲特異性激素或信息素，例如蟻皮激素和保幼激素或其變體、基于它們的模 擬物，或其括抗劑或激動劑，例如桿狀病毒表達(dá)的克隆保幼激素醋酶，保幼激素的失活子 (Hammock et al.,1990 Na1:ure 344:458)。
[0140] (G)昆蟲特異性膚或神經(jīng)膚，其在表達(dá)時會擾亂受影響的害蟲的生理機(jī)能 (J.Biol.化em. 269:9)。運(yùn)些基因的實(shí)例包括昆蟲利尿激素受體(Regan, 1994)，在太平洋折 翅賺(Diploptera punctata)中鑒定的咽側(cè)體抑制素（allostatin) (Pratt, 1989)，和昆蟲 特異性麻搏神經(jīng)毒素(美國專利No. 5，266，361)。
[0141] 化)在自然界中由蛇、馬蜂等產(chǎn)生的昆蟲特異性毒液，例如蝸?zhàn)永ハx毒性膚(Pang, 1992 Gene 116:165)。
[0142] (I)負(fù)責(zé)超富集單祗、倍半祗、醬體、異徑朽酸、苯丙烷衍生物或其它具有殺蟲活性 的非蛋白質(zhì)分子的酶。
[0143] (J)參與生物活性分子修飾(包括翻譯后修飾）的酶；例如糖酵解酶、蛋白質(zhì)水解 酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、醋酶、水解酶、憐酸酶、激酶、憐酸化酶、聚合酶、彈 性蛋白酶、幾下質(zhì)酶和葡聚糖酶，無論是天然的還是人造的。運(yùn)些基因的實(shí)例包括馬蹄蓮 (callas)基因（PCT公開的申請W0 93/02197)，幾下質(zhì)酶編碼序列（其可W從例如ATCCW登 錄號3999637和67152獲得），煙草鉤蟲幾下質(zhì)酶（Kramer et al. ,1993 Insect Molec.Biol.23:691)，和歐芹ubi4-2多聚泛素基因化awalleck et al. ,1993 Plant Molec.Biol.21:673)。
[0144] 化)刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。運(yùn)些分子的實(shí)例包括綠豆巧調(diào)蛋白cDNA克隆的核巧酸 序列（Botella et al. ,1994 Plant Molec.Biol.24:757)，和玉米巧調(diào)蛋白cDNA克隆的核 巧酸序列(Griess et al., 1994 Plant F*hysiol. 104:1467)。
[0145] (L)疏水矩膚化yho曲obic moment peptide)。見例如美國專利Nos.5,659,026和 5，607，914，后者教導(dǎo)了賦予疾病抗性的人造抗微生物膚。
[0146] (M)膜透性酶，通道形成劑或通道阻斷劑，例如殺菌膚-0裂解膚類似物(Jaynes et al. ,1993 Plant Sci.89:43)，其使轉(zhuǎn)基因煙草植物對青枯病有抗性。
[0147] (N)病毒侵襲性蛋白質(zhì)或由其衍生的復(fù)雜毒素。例如，在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中，病 毒衣殼蛋白的積累可賦予針對該衣殼蛋白所來源的病毒W(wǎng)及相關(guān)病毒所致的病毒感染和/ 或疾病發(fā)展的抗性。已經(jīng)給轉(zhuǎn)化植物賦予了衣殼蛋白介導(dǎo)的，針對首猜花葉病毒、黃瓜花葉 病毒、煙草條紋病毒、馬鈴馨X病毒、馬鈴馨Y病毒、煙草蝕紋病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉 病毒的抗性。參見，例如，Beachy et al. (1990)Ann.Rev.F*h}ftopathol.28:451。
[0148] (0)昆蟲特異性抗體或由其衍生的免疫毒素。因此，祀向昆蟲腸道關(guān)鍵代謝功能的 抗體可W使受影響的酶失活，殺死昆蟲。例如，Taylor等人(1994)，在第屯屆國際分子植物- 微生物相互作用研討會（Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant Microbe Interactions)上的第497號摘要顯示了轉(zhuǎn)基因煙草中通過產(chǎn)生單鏈抗體片段的酶失活。
[0149] (P)病毒特異性抗體。見例如hvladoraki et al. (1993)化 1:ure 266:469,其顯示 了表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物被保護(hù)免于病毒攻擊。
[0150] (Q)由病原體或寄生物自然產(chǎn)生的發(fā)育阻滯(developmen^^arrestive)蛋白質(zhì)。 因此，真菌內(nèi)切Q-1，4-D多聚半乳糖醒酸酶通過溶解植物細(xì)胞壁的均聚-a-1，4-D-半乳糖醒 酸而促進(jìn)真菌定殖和植物營養(yǎng)素釋放化amb et al.,1992)Bio/Technology 10:1436。 1'〇油曰的等（1992 Plant J.2:367)描述了豆類內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白的編碼基因 的克隆和表征。
[0151] (R)由植物自然產(chǎn)生的發(fā)育阻滯(developmental-arrestive)蛋白質(zhì)，例如大麥核 糖體失活基因，其提供了增加的針對真菌疾病的抗性化ongemann et al.，1992) .Bio/ Technology 10:3305。
[0152] (S)RNA干擾，其中用RNA分子抑制祀基因的表達(dá)。一個實(shí)施例中的RNA分子是部分 或完全雙鏈的，其觸發(fā)沉默響應(yīng)，導(dǎo)致dsRNA被切割成小的干擾RNA，它們隨后被納入到祀向 復(fù)合體中，祀向復(fù)合體破壞同源的mRNA。見例如Fire等人，美國專利6,506,559; Graham等 人，美國專利6,573,099。
[。巧引 2.賦予除草劑抗性的基因
[0154] ( A )編碼針對抑制生長點(diǎn)或分生組織的除草劑，例如咪挫嘟酬類 (imidazalinone)、橫酷苯胺類（3111的]1日]1；[11(1日）或橫酷脈類除草劑的抗性或耐受性的基 因。運(yùn)類基因的實(shí)例編碼一種突變ALS酶化ee et al.，1988 6]\?〇17:1241)，其也稱4歴巧每 (Miki et al.,1990 Hieor.Appl.Genet.80:449)。
[0155] (B)-種或多種額外的編碼針對草甘麟抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性 是由突變體EPSP合酶和aroA基因賦予的，或者是通過一些基因如DGT-28、2mEPSPS、GAT(草 甘麟乙酷轉(zhuǎn)移酶)或G0X(草甘麟氧化酶)和其它麟酷基化合物，如草胺麟(pat, bar,和dsm-2 基因），和芳氧基苯氧基丙酸和環(huán)己二酬(ACC酶抑制劑編碼基因）所致的代謝失活而獲得 的。見例如美國專利4,940,835，其公開了可賦予草甘麟抗性的6?5?形式的核巧酸序列。編 碼突變體aroA基因的DNA分子能夠WATCC登錄號39256獲得，突變體基因的核巧酸序列在美 國專利4，769，061中公開。歐洲專利申請No. 0 333 033和美國專利4，975，374公開了可賦予 除草劑如心草錠麟抗性的谷氨酷胺合酶基因的核巧酸序列。歐洲專利申請No.0 242 246提 供了草錠麟乙酷轉(zhuǎn)移酶基因的核巧酸序列。De Greef et al.(1989)Bio/Technology 7:61 中描述了表達(dá)編碼草錠麟乙酷轉(zhuǎn)移酶活性的嵌合bar基因的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。賦予針對 芳氧基苯氧基丙酸和環(huán)己二酬如稀禾定和甲禾靈化aloxWop)的抗性的示例性基因是 Acc]_-Sl ,Acc]_-S2和Accl-S3基因，如Marshall et al. (1992)111601^.Appl .Genet.83:435所 述。
[0156] (C)編碼針對可抑制光合作用的除草劑例如=嗦(psbA和gs+基因）和節(jié)臘(臘水解 酶基因）的抗性的基因。Prz化illaetal.a991)PlantCell3:169描述了使用編碼突變 體psbA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣藻。在美國專利4,810,648中公開了臘水解酶基因的核巧酸序列， 含有運(yùn)些基因的DNA分子可W通過ATCC登錄號53435、67441和67442獲得。Hayes et al. (1992)81〇油6111.1285:173中描述了編碼谷脫甘膚5-轉(zhuǎn)移酶的0臟的克隆和表達(dá)。
[0157] (D)編碼針對可結(jié)合徑基苯基丙酬酸二加氧酶化PPD)的除草劑的抗性基因 ，HPPD 是催化對-?基苯基丙酬酸（HPP)轉(zhuǎn)化形成尿黑酸的反應(yīng)的酶。運(yùn)包括例如異嗯挫 化口418175,6口470856,6口487352,6口527036,6口560482,6口682659，美國專利5,424,276)，特 別是異嗯挫草酬，其是玉米的選擇性除草劑，二酬臘（diketonitrileKEP496630, EP496631)，特別是2-氯基-3-環(huán)丙基-1-(2-S02C冊-4-CF3苯基）丙烷-1，3-二酬和2-氯基- 3-環(huán)丙基-1-(2-S02C 冊-4-2，3C12 苯基）丙烷-1，3-二酬，S 酬類化 P625505，EP625508，美國 專利5,506，195)，特別是橫草酬、和pyrazolinate等除草劑。在植物中產(chǎn)生過量HPPD的基因 能夠提供針對運(yùn)些除草劑的耐受性或抗性，包括例如美國專利6，268，549和6，245，968和美 國專利申請公開No. 2003/0066102中描述的基因。
[0158] 化)編碼針對苯氧基生長素除草劑，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受 性的基因，其也可W賦予針對芳氧基苯氧基丙酸類(A0PP)除草劑的抗性或耐受性。運(yùn)些基 因的實(shí)例包括a-酬戊二酸依賴性的雙加氧酶(aad-1)基因，如美國專利7，838，733所述。
[0159] (F)編碼針對苯氧基生長素除草劑如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受 性的基因，其也可W賦予針對化晚基氧基生長素除草劑，如氣草煙或綠草定的抗性或耐受 性。運(yùn)些基因的實(shí)例包括a-酬戊二酸依賴性的雙加氧酶(aad-12)基因，如W02007/053482- A2所述。
[0160] (G)編碼針對麥草畏的抗性或耐受性的基因（見例如美國專利公開0030135879)。
[0161] 化)編碼針對抑制原化嘟原氧化酶(PP0)的除草劑的抗性或耐受性的基因（見美國 專利No. 5,767,373)。
[0162] (I)提供針對可結(jié)合光系統(tǒng)II反應(yīng)中屯、(PS II)核屯、蛋白質(zhì)的S嗦除草劑(例如莽 去津）和尿素衍生物（如敵草?。┏輨┑目剐曰蚰褪苄缘幕?。見化ussian et al.， (1989)EMB0 J.1989,8(4):1237-1245。
[01創(chuàng) 3.可賦予或貢南犬?dāng)?shù)量疊加性狀(Value Added Trait)的基因
[0164] (A)修飾的脂肪酸代謝，例如通過用反義基因或硬脂酷-ACP去飽和酶轉(zhuǎn)化玉米或 蕓苔屬植物從而增加植物的硬脂酸含量化nultzon et al. ,1992)P;roc.Nat.Acad.Sci.USA 89:2624。
[0165] (B)降低的植酸含量
[0166] (1)引入植酸酶編碼基因，如黑曲霉植酸酶基因 （Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87)，提高植酸降解，向被轉(zhuǎn)化植物添加更多游離憐酸鹽。
[0167] (2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，運(yùn)可W通過，例如，克隆然后重新導(dǎo)入 如下所述的單個等位基因的相關(guān)DNA來實(shí)現(xiàn):該單個等位基因?qū)е耊植酸水平低為特征的 玉米突變體的原因 （Raboy et al. ,1990 Maydica 35:383)。
[0168] (C)改良的碳水化合物組成，例如通過用編碼改變淀粉的分支模式的酶的基因轉(zhuǎn) 化植物而實(shí)現(xiàn)。運(yùn)些酶的實(shí)例包括，粘液鏈球菌(Streptococcus mucus)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因 (化iroza et al.,1988)J.Bacte;riol.170:810,枯草芽抱桿菌果聚糖薦糖酶基因 (Steinmetz et al.,1985 Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽抱桿菌a-淀粉酶（Pen et al. ,1992 Bio/Technology 10:292)，番茄轉(zhuǎn)化酶基因巧lliot et al. ,1993)，大麥淀粉酶 基因 （Sogaard et al. ,1993 J.Biol.Chem.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶 iKFisher et al., 1993 Plant F*hysiol. 102:10450)。
[0169] 轉(zhuǎn)化
[0170] 用于轉(zhuǎn)化植物的合適方法包括任何能夠?qū)NA引入到細(xì)胞內(nèi)的方法，例如但不僅 限于：電穿孔(參見例如美國專利5,384,253);微粒射彈(參見例如美國專利5,015,580;5， 550，318; 5，538，880; 6，160，208; 6，399，861;和6，403，865); ±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(參見例 如美國專利5,635,055 ;5,824,877; 5,591，616;5,981,840;和 6,384,301);和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 (參見例如美國專利5,508，184)。運(yùn)些方法可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或瞬時轉(zhuǎn)化植物。
[0171] DNA構(gòu)建體可W使用下述技術(shù)直接引入到植物細(xì)胞的基因組DNA中，例如用碳化娃 纖維攬動(參見，例如，美國專利5,302,523和5,464,765)，或者DNA構(gòu)建體可W使用生物射 彈方法，例如DNA粒子轟擊，直接引入到植物組織中（參見，例如，Klein et al. ,(1987) 化ture 327 :70-73)。或者，DNA構(gòu)建體可W通過納米顆粒轉(zhuǎn)化引入到植物細(xì)胞中（參見，例 如，美國專利公開No. 2009/0104700，通過提述將其整體并入本文）。
[0172] 此外，基因轉(zhuǎn)移可W使用非±壤桿菌或病毒實(shí)現(xiàn)，例如根瘤菌NGR234、首猜中華根 瘤菌、中慢生根瘤菌、馬鈴馨X病毒、花挪菜花葉病毒、木馨葉脈花葉病毒和/或煙草花葉病 毒，參見例如，Qiung et 日1.,(2006)化611(13 Plant Sci.ll(l):l-4。
[0173] 通過運(yùn)些轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用，幾乎任何植物物種的細(xì)胞都可W被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，并且 運(yùn)些細(xì)胞可W通過眾所周知的技術(shù)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因植物。例如，美國專利5，846，797; 5，159， 135 ; 5，004，863和6，624，344中描述了特別可用于棉花轉(zhuǎn)化內(nèi)容的技術(shù)；例如美國專利5， 750,871中描述了特別用于轉(zhuǎn)化蕓苔屬植物的技術(shù);美國專利6,384,301中描述了用于轉(zhuǎn)化 大豆的技術(shù);美國專利7,060,876和5,591，616和國際口(：1'公開胖0 95/06722中描述了用于轉(zhuǎn) 化玉米的技術(shù)。
[0174] 在將外源核酸遞送到受體細(xì)胞之后，通常要鑒定出轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于進(jìn)一步的培養(yǎng)和 植物再生。為了提高鑒定轉(zhuǎn)化體的能力，可能期望采用選擇標(biāo)志物基因，與用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體 的轉(zhuǎn)化載體一起使用。在示例性實(shí)施方案中，可W通過將細(xì)胞暴露于一種或多種選擇劑對 被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體進(jìn)行測定，或者可W根據(jù)期望的標(biāo)記基因性狀對細(xì)胞進(jìn)行篩選。
[0175] 對于在暴露于選擇劑時存活的細(xì)胞，或者在篩選測定中被評定為陽性的細(xì)胞，可 W在支持植物再生的培養(yǎng)基中加 W培養(yǎng)。在一個實(shí)施方案中，可W對任何合適的植物組織 培養(yǎng)基進(jìn)行修改，使之包含更多的物質(zhì)，例如生長調(diào)節(jié)劑。植物組織可W維持在含有生長調(diào) 節(jié)劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，直到可W獲得足夠的組織用于開始植物再生工作，或者經(jīng)過重復(fù)多 輪的人工選擇，直到組織的形態(tài)適合于再生為止(例如，至少2周），然后可W將組織轉(zhuǎn)移到 有助于芽形成的培養(yǎng)基中。周期性地轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物，直到發(fā)生充分的芽形成。一旦形成芽，便 將它們轉(zhuǎn)移到有助于根形成的培養(yǎng)基中。一旦形成了足夠的根，可將植物轉(zhuǎn)移到±壤中，用 于進(jìn)一步的生長和成熟。
[0176] 為了確認(rèn)再生植物中存在包含所提供構(gòu)建體的期望核酸，可W多種測定。運(yùn)樣的 測定可W包括:分子生物學(xué)測定，例如Southern和Nodhern印跡和PCR;生物化學(xué)測定，通過 免疫學(xué)方法如化ISA，western印跡，和/或LC-MS MS分光光度法，或者通過酶促功能檢測蛋 白質(zhì)產(chǎn)物的存在，例如通過植物部分測定法，例如葉、愈傷組織或花粉測定;和/或分析整個 再生植物的表型。
[0177] 可W通過例如PCR擴(kuò)增，使用特異針對感興趣的核酸分子的寡核巧酸引物對轉(zhuǎn)基 因事件進(jìn)行篩選。PCR基因分型被理解為包括，但不僅限于，對分離和/或純化自預(yù)計含有整 合在基因組內(nèi)的感興趣核酸分子的宿主植物組織的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后進(jìn)行常規(guī) 克隆和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析。PCR基因分型方法已經(jīng)有充分描述(參見，例如，Rios et al. (2002)Plant J.32:243-53)，并且可應(yīng)用于來自任何植物物種或組織類型（包括細(xì)胞培養(yǎng) 物）的基因組DNA。一組結(jié)合祀序列和引入序列的寡核巧酸引物可W在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中順次 使用或復(fù)用。可W產(chǎn)生設(shè)計為結(jié)合祀位點(diǎn)、引入核酸序列、和/或運(yùn)兩種類型的核酸序列之 組合的寡核巧酸引物。因此，PCR基因分型策略可W包括，例如但不僅限于:擴(kuò)增植物基因組 中的特有序列;擴(kuò)增植物基因組中的多個特有序列;擴(kuò)增植物基因組中的非特有序列;和上 述的任意組合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可w設(shè)計出其它的引物和擴(kuò)增反應(yīng)的組合來查詢基因 組。例如，可W設(shè)計一組正向和反向寡核巧酸引物，使之與引入核酸序列的邊界之外的祀標(biāo) 特有序列退火。
[0178] 正向和反向寡核巧酸引物可被設(shè)計為與引入的核酸分子特異性退火，例如在引入 的核酸分子中包含的感興趣核巧酸序列內(nèi)的編碼區(qū)的相應(yīng)序列處退火，或者在該核酸分子 的其它部分退火。引物可W和本文描述的引物聯(lián)合使用。寡核巧酸引物可W根據(jù)期望的序 列合成，并且是可商購的（例如，從Integrated DNA Technologies,Inc. ,Coralville,IA)。 擴(kuò)增之后可W進(jìn)行克隆和測序，或者對擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行序列分析。在一個實(shí)施方案中，在 PCR擴(kuò)增中使用特異針對基因祀標(biāo)的寡核巧酸引物。
[0179] 表達(dá)轉(zhuǎn)基因的方法
[0180] 在一個實(shí)施方案中，在植物中表達(dá)至少一種轉(zhuǎn)基因的方法包括培植包含與至少一 個轉(zhuǎn)基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子(SEQ ID NO: 2)的植物。在一個實(shí)施 方案中，在植物組織或植物細(xì)胞中表達(dá)至少一種轉(zhuǎn)基因的方法包括培植包含與至少一個轉(zhuǎn) 基因可操作連接的玉米栽培種化-II化i-1啟動子(SEQ ID N0:2)的植物組織或植物細(xì)胞。
[0181] 在一個實(shí)施方案中，在植物中表達(dá)至少一種轉(zhuǎn)基因的方法包括培植包含與至少一 個轉(zhuǎn)基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子(SEQ ID N0:2)的基因表達(dá)盒的植 物。在一個實(shí)施方案中，在植物組織或植物細(xì)胞中表達(dá)至少一種轉(zhuǎn)基因的方法包括培養(yǎng)包 含與至少一個轉(zhuǎn)基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子(SEQ ID NO: 2)的基因 表達(dá)盒的植物組織或植物細(xì)胞。
[0182] 在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒，其包括與轉(zhuǎn)基因 可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子（SEQ ID NO: 2)。其中，該玉米栽培種化-II Ubi-1 啟動子(SEQ ID N0:2)包括上游啟動子(SEQ ID N0:4)、5'-UTR(SEQ ID N0:6)、和內(nèi) 含子(SEQ ID NO:8)。在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒，其包 括玉米栽培種化-II Ubi-1上游啟動子(SEQ ID N0:4)、5'-UTR(SEQ ID N0:6)、和內(nèi)含子 (SEQ ID NO:8)。在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒，其包括玉 米栽培種化-II Ubi-1上游啟動子(SEQ ID N0:4)、5'-UTR(SEQ ID N0:6)、和玉米栽培種 Hi-II Ubi-1基因的內(nèi)含子(SEQ ID N0:8)。在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞 包括基因表達(dá)盒，其包括玉米栽培種化-II Ubi-1上游啟動子(SEQ ID N0:4)、5'-UTR(SEQ ID N0:6)和玉米栽培種化-II化i-1基因的內(nèi)含子(SEQ ID N0:8)。
[0183] 在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括玉米栽培種化-II化i-1啟動 子。在一個實(shí)施方案中，玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子可W是SEQ ID N0:2。在一個實(shí)施方 案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒包含啟動子，其中該啟 動子與沈Q ID N0:2至少80% ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98%, 99 %，99.5 %，99.8 %，或100 %相同。在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括基 因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒包含與轉(zhuǎn)基因可操作連接的玉米栽培種化-II化i-1啟動子。在 一個示例性實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒包含 與轉(zhuǎn)基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其中該轉(zhuǎn)基因可W是殺蟲抗性轉(zhuǎn) 基因，除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因，氮利用效率轉(zhuǎn)基因，水利用效率轉(zhuǎn)基因，營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因 ，DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)基因，選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因，或其組合。
[0184]在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括玉米栽培種化-II化i-1上游 啟動子。在一個實(shí)施方案中，玉米栽培種化-II化i-1上游啟動子可W是SEQ ID N0:4。在一 個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒包含上游啟動 子，其中該上游啟動子與SEQ ID N0:4至少80% ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95%, 96%，97% ,98% ,99% ,99.5% ,99.8%，或100%相同。在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織 或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒，其包含與轉(zhuǎn)基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1上游 啟動子。在一個示例性實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒，其包含與 轉(zhuǎn)基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1上游啟動子，其中該轉(zhuǎn)基因可W是殺蟲抗性 轉(zhuǎn)基因，除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因，氮利用效率轉(zhuǎn)基因，水利用效率轉(zhuǎn)基因，營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因， DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基因，選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因，或其組合。
[01化]在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括玉米栽培種化-II Ubi-1 5'- UTR或前導(dǎo)序列。在一個實(shí)施方案中，玉米栽培種Hi-II Ubi-1 5'-UTR或前導(dǎo)序列可W是 SEQ ID N0:6的多核巧酸。在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒， 所述基因表達(dá)盒含有5'-UTR或前導(dǎo)序列，其中該5'-UTR或前導(dǎo)序列與SEQ ID NO:6至少 80% ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98% ,99% ,99.5% ,99.8%,或 100%相同。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括與啟動子可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1 5'-UTR或前導(dǎo)序列，其中該啟動子是泛素啟動子，或者來自植物(例如玉米泛素-1啟 動子）、病毒(例如木馨葉脈花葉病毒啟動子），或細(xì)菌(例如±壤桿菌delta mas)的啟動子。 在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒含有與轉(zhuǎn) 基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1 5'-UTR或前導(dǎo)序列。在一個示例性實(shí)施方案 中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒含有與轉(zhuǎn)基因可操作連接 的玉米栽培種化-II師i-1 5'-UTR或前導(dǎo)序列，其中該轉(zhuǎn)基因可W是殺蟲抗性轉(zhuǎn)基因，除 草劑耐受性轉(zhuǎn)基因，氮利用效率轉(zhuǎn)基因，水利用效率轉(zhuǎn)基因，營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基 因，選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因，或其組合。
[0186] 在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括化i-1內(nèi)含子。在一個實(shí)施方 案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括玉米栽培種化-II Ubi-1內(nèi)含子。在一個實(shí)施方案中， 玉米栽培種化-II化i-1內(nèi)含子可W是SEQ ID N0:8的多核巧酸。在一個實(shí)施方案中，植物、 植物組織或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒含有內(nèi)含子，其中該內(nèi)含子與SEQ ID NO: 8 至少 80 % ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98% ,99%， 99.5% ,99.8%，或100%相同。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括與啟動子可操作連接的 玉米栽培種化-II Ubi-1內(nèi)含子，其中該啟動子是泛素啟動子，或者來自植物(例如玉米泛 素-1啟動子）、病毒(例如木馨葉脈花葉病毒啟動子），或細(xì)菌(例如±壤桿菌delta mas)的 啟動子。在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒 含有與轉(zhuǎn)基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1內(nèi)含子。在一個示例性實(shí)施方案中，植 物、植物組織或植物細(xì)胞包括基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒含有與轉(zhuǎn)基因可操作連接的玉 米栽培種化-II Ubi-1內(nèi)含子，其中該轉(zhuǎn)基因可W是殺蟲抗性轉(zhuǎn)基因，除草劑耐受性轉(zhuǎn)基 因，氮利用效率轉(zhuǎn)基因，水利用效率轉(zhuǎn)基因，營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基因，選擇標(biāo)志物 轉(zhuǎn)基因，或其組合。
[0187] 在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括與轉(zhuǎn)基因可操作連接的玉米 栽培種化-II Ubi-1上游啟動子、Ubi-1內(nèi)含子和化i-1 5'-UTR。當(dāng)基因表達(dá)盒包括2個或更 多個轉(zhuǎn)基因時，該玉米栽培種化-II Ubi-1上游啟動子、Ubi-1內(nèi)含子和化i-1 5'-UTR可W 和基因表達(dá)盒內(nèi)的不同轉(zhuǎn)基因可操作連接。在一個示例性實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括與 轉(zhuǎn)基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其中該轉(zhuǎn)基因可W是殺蟲抗性轉(zhuǎn)基 因，除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因，氮利用效率轉(zhuǎn)基因，水利用效率轉(zhuǎn)基因，營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因，DNA結(jié) 合轉(zhuǎn)基因，選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因，或其組合。在一個示例性實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括與轉(zhuǎn) 基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1內(nèi)含子，其中該轉(zhuǎn)基因可W是殺蟲抗性轉(zhuǎn)基因， 除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因，氮利用效率轉(zhuǎn)基因，水利用效率轉(zhuǎn)基因，營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因，DNA結(jié)合轉(zhuǎn) 基因，選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因，或其組合。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括與啟動子可操作 連接的玉米栽培種化-II Ubi-1內(nèi)含子，其中該啟動子是泛素啟動子，或者來自植物(例如 玉米泛素-1啟動子）、病毒（例如木馨葉脈花葉病毒啟動子），或細(xì)菌（例如±壤桿菌delta mas)的啟動子。在一個示例性實(shí)施方案中，基因表達(dá)盒包括與轉(zhuǎn)基因可操作連接的玉米栽 培種化-II Ubi-1 5'-UTR，轉(zhuǎn)基因可W是殺蟲抗性轉(zhuǎn)基因，除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因，氮利用效 率轉(zhuǎn)基因，水利用效率轉(zhuǎn)基因，營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基因，選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因，或其 組合。
[0188] 在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括含有如本文所述的組成型基 因啟動子調(diào)節(jié)元件的載體。在一個實(shí)施方案中，植物、植物組織或植物細(xì)胞包括含有如本文 所述的與轉(zhuǎn)基因可操作連接的組成型基因啟動子調(diào)節(jié)元件的載體。在一個實(shí)施方案中，植 物、植物組織或植物細(xì)胞包括含有如本文所述的基因表達(dá)盒的載體。在一個實(shí)施方案中，載 體可W是質(zhì)粒、粘粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)、隧菌體、或病毒片段。
[0189] 在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本文公開方法的植物、植物組織或植物細(xì)胞可W是單子 葉植物。該單子葉植物、植物組織或植物細(xì)胞可W是，但不僅限于，玉米，水稻，小麥，甘薦， 大麥，黑麥，高梁，蘭花，竹子，香蕉，香蒲，百合，燕麥，洋蔥，小米，和黑小麥。
[0190] 在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)本文公開方法的植物、植物組織或植物細(xì)胞可W是雙 子葉植物。該雙子葉植物、植物組織或植物細(xì)胞可W是，但不僅限于，油菜，芥花(canola)， 印度芥，埃塞俄比亞芥，大豆，向日葵和棉花。
[0191] 關(guān)于遺傳修飾植物的產(chǎn)生，用于將植物基因工程的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例 如，已經(jīng)開發(fā)了許多用于植物轉(zhuǎn)化的方法，包括用于雙子葉植物W及單子葉植物的生物和 物理轉(zhuǎn)化方案（例如Goto-Fumiyukiet al.,化 ture Biotech 17:282-286( 1999) ;M;Lki et al.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology ,G1ick,B.R.和 Thompson, J. E.編輯，CRC Press , Inc. ,Boca Raton,第67-88頁（1993))。此外，用于植物細(xì) 胞或組織轉(zhuǎn)化和植物再生的載體和體外培養(yǎng)方法可W在例如下列文獻(xiàn)中獲取:Gruber et al.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology ,G1ick,B.R.和 HiompsonJ.E.編輯，CRC Press,Inc.,Boca Raton,第89-119頁（1993)。
[0192] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員會意識到，在外源序列穩(wěn)定組入到轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)并被確認(rèn)可 W工作之后，可W通過有性雜交將它引入到其它植物中。可W使用大量標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)中的 任一種，取決于待雜交的物種。
[0193] 通過對經(jīng)過工程化的植物材料選擇或篩選由轉(zhuǎn)化DNA上存在的標(biāo)記基因所編碼的 性狀，可W鑒定并分離出轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、根、葉、愈傷組織、組織或植物。例如，可W通過在 含有抑制量的抗生素或除草劑(轉(zhuǎn)化基因構(gòu)建體可w賦予對該抗生素或除草劑的抗性）的 培養(yǎng)基上培育工程化的植物材料來進(jìn)行選擇。另外，還可W通過篩選重組核酸構(gòu)建體上可 能存在的任何可見的標(biāo)志物基因（例如，YFP，GFP，e-葡萄糖醒酸酶，巧光素酶，B或C1基因） 的活性來鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。運(yùn)些選擇和篩選方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
[0194] 還可W使用物理和生物化學(xué)方法鑒定含有插入基因構(gòu)建體的植物或植物細(xì)胞轉(zhuǎn) 化體。運(yùn)些方法包括但不僅限于：1) Southern分析或PCR擴(kuò)增，用于檢測和確定重組DNA插入 物的結(jié)構(gòu)；2)Northern印跡、S1 RNA酶保護(hù)、引物延伸或逆轉(zhuǎn)錄酶-RNA擴(kuò)增，用于檢測并檢 查基因構(gòu)建體RNA轉(zhuǎn)錄本;3)酶學(xué)測定，用于檢測酶或核酶活性，如果運(yùn)樣的基因產(chǎn)物由所 述基因構(gòu)建體編碼的話;4)二代測序(NGS)分析;或5)蛋白凝膠電泳、we stern印跡技術(shù)、免 疫沉淀或酶聯(lián)免疫吸附測定巧LISA)，如果所述基因構(gòu)建體的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)的話。也可W使 用其它的技術(shù)，例如原位雜交、酶染色和免疫染色，來檢測重組構(gòu)建體在特定植物器官和組 織中的存在或表達(dá)。實(shí)施運(yùn)些實(shí)驗(yàn)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
[0195] 使用本文公開的方法進(jìn)行的基因操作的效果可W通過，例如，從感興趣的組織中 分離的RNA(例如，mRNA)的Nodhern印跡來進(jìn)行觀察。通常，如果存在mRNA或者mRNA的量增 加了，則可W推定相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因被表達(dá)?？蒞使用其它用于測量基因和/或編碼多膚活性的 方法?？蒞使用不同類型的酶測定，取決于所用的底物W及檢測反應(yīng)產(chǎn)物或副產(chǎn)物增加或 降低的方法。此外，多膚的表達(dá)水平可W用免疫化學(xué)手段測量，通過使用化ISA，RIA，EIA和 本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其它基于抗體的測定，例如通過電泳檢測方法(無論是與染色 還是印跡法聯(lián)用）。作為一個非限制性的實(shí)例，在美國專利公開號2009/0093366(通過提述 并入其全部內(nèi)容）中描述了使用化ISA測定檢測AAD-1 (芳氧基鏈燒酸雙加氧酶；參見W0 2005/107437)和PAT(麟絲菌素-N-乙酷基轉(zhuǎn)移酶)蛋白。轉(zhuǎn)基因還可W選擇性地在一些細(xì)胞 類型或植物組織中表達(dá)，或者在某些發(fā)育階段中表達(dá)。轉(zhuǎn)基因還可W在基本上所有的植物 組織中沿著其整個生命周期表達(dá)。然而，任何組合的表達(dá)模式也是可W使用的。
[0196] 本公開還包括上述轉(zhuǎn)基因植物的種子，其中該種子包括報告基因、轉(zhuǎn)基因、或基因 表達(dá)盒。本公開進(jìn)一步包括上述轉(zhuǎn)基因植物的后代、克隆、細(xì)胞系或細(xì)胞，其中所述后代、克 隆、細(xì)胞系或細(xì)胞包括所述報告基因、轉(zhuǎn)基因或基因構(gòu)建體。
[0197] 盡管已經(jīng)參考具體的方法和實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)意識到，在 不背離本文中描述的本發(fā)明的前提下可W進(jìn)行各種修改和變化。 實(shí)施例
[0198] 實(shí)施例1:新型啟動子鑒定和分離
[0199] 使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從玉米栽培種化-n的化i-1基因擴(kuò)增了新型啟動子序 列。設(shè)計用于擴(kuò)增該新型啟動子，稱為玉米栽培種化-II，的寡核巧酸(表1)來自于用作對照 的玉米栽培種B73化i-1啟動子序列的保守區(qū)。從玉米栽培種化-II獲得了一個PCR產(chǎn)物，并 進(jìn)行了表征。
[0200] 使用Invi化ogen ZeroBlimt敏TQPO⑥PCR克隆試劑盒并根據(jù)制造商的使用說 明，將包含新型啟動子的PCR產(chǎn)物克隆到Topo?載體中。提供了一幅載體圖來顯示包含新型 啟動子PCR產(chǎn)物的克隆質(zhì)粒。質(zhì)粒PDAB105713對應(yīng)于玉米栽培種化-IK圖2)。
[0201]
[0202] 克隆之后，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法對含有PCR產(chǎn)物的啟動子插入物進(jìn)行 測序。將玉米栽培種化-II的各啟動子多核巧酸序列（圖4)計算比對，隨后分析它們與玉米 栽培種B73郵i-1對照序列（圖3)的序列同源性。序列同源性分析使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的生物信息學(xué)方法和/或軟件程序，例如Clus化1W或Sequencher來執(zhí)行。
[0203] 實(shí)施例2:新啟動子表征
[0204] 序列同源性分析（圖3-7)，包括與玉米栽培種B73 Ubi-1對照序列（SEQ ID N0:1; 圖3)的序列比對和比較，顯示了一個供進(jìn)一步表征的新化i-1啟動子。還觀察到運(yùn)個獲自玉 米栽培種化-II的新化i-1啟動子序列（SEQ ID N0:2;圖4)包括S個不同區(qū)域的多核巧酸序 列：1)上游啟動子區(qū)（SEQ ID N0:4)，2)5'-UTR(SEQ ID N0:6)，和3)內(nèi)含子（SEQ ID N0:8)。 分析了來自玉米栽培種化-n的啟動子區(qū)和特異性啟動子元件與玉米栽培種B73 Ubi-1對 照序列的序列同源性（圖5-7)。更具體地，進(jìn)行序列比對來獨(dú)立地比較玉米栽培種化-II啟 動子的上游啟動子、5'-UTR和內(nèi)含子區(qū)，W及TATA框和熱休克元件化SE)調(diào)節(jié)元件與玉米栽 培種B73化i-1對照序列的相應(yīng)區(qū)域(圖5-7,表2)。
[0205]
[0206] 圖5顯示了玉米栽培種化-II啟動子的上游啟動子區(qū)與玉米栽培種B73 Ubi-1對照 啟動子序列的上游啟動子區(qū)的序列比對。圖6顯示了玉米栽培種化-n啟動子的5'-UTR或前 導(dǎo)序列與玉米栽培種B73 Ubi-1對照啟動子序列的5'-UTR或前導(dǎo)序列的序列比對。圖7顯示 了玉米栽培種化-II啟動子的內(nèi)含子區(qū)與玉米栽培種B73 Ubi-1對照啟動子序列的內(nèi)含子 序列的序列比對。
[0207] 從玉米栽培種化-II得到的啟動子元件與玉米栽培種B73 Ubi-1序列顯示94.7% 的總體序列同一性(表2)。來自玉米栽培種化-II的新型啟動子序列的特征確認(rèn)，通常在功 能性啟動子中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)啟動子調(diào)節(jié)元件（即，TATA框或熱休克元件)在玉米栽培種化- II啟動子的核屯、啟動子區(qū)域內(nèi)也是高度保守的（表2)。例如，圖5顯示了高度保守的TATA框 (堿基對861-873,用斜體和下劃線顯示），它被鑒定并被發(fā)現(xiàn)定位在新型玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子的上游啟動子區(qū)的TSS 5'上游大約50bp處。類似地，圖5顯示了兩個重疊的熱 休克元件化SE)序列(分別為堿基對454-781，用下劃線顯示，和479-498,用雙下劃線顯示）， 它們在本項(xiàng)研究分析的新型玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子中是相當(dāng)保守的，并且位于TSS 5'上游大約2(K)bp處。
[0208] 新型玉米栽培種化-II化i-1啟動子的5'-UTR或前導(dǎo)序列中僅觀察到低水平的變 化，其與玉米栽培種B73 Ubi-1對照序列具有98.8%的同一性（圖6)，但是在上游啟動子區(qū) (圖5)和內(nèi)含子區(qū)（圖7)中也鑒定了序列保守性較低的區(qū)域。例如，位于玉米栽培種化-II Ub i -1啟動子的上游啟動子區(qū)中的一個1 Obp啟動子調(diào)控元件(堿基對90-100，下劃線表示） 不是保守的（圖5)。實(shí)際上，玉米栽培種化-II啟動子中大多數(shù)的序列變化是專口由上游啟 動子序列和內(nèi)含子序列貢獻(xiàn)的，運(yùn)兩者與玉米栽培種B73 Ubi-1上游啟動子和內(nèi)含子區(qū)域 顯示的序列相似性分別僅為93.3%和95.4% (圖5和7，表2)。
[0209] 此外，在延伸到TSS 5'上游100-2(K)bp的玉米化i-1上游啟動子區(qū)內(nèi)存在更多的調(diào) 芐基序。運(yùn)些基序與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，運(yùn)些轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體相互作用并易化其組 裝，提高其穩(wěn)定性，或一旦轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)開始工作，增加啟動子脫離的效率（PEREMARTI et al.2010)。因此，運(yùn)個調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的缺失、取代和錯配會潛在影響啟動子的強(qiáng)度和特異性。
[0210] 實(shí)施例3:使用新型啟動子用于基因表達(dá)的載體構(gòu)建
[0211] 除非另外指出，否則運(yùn)個實(shí)施例和后續(xù)實(shí)施例中描述的分子生物學(xué)和生物化學(xué)操 作通過標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施，例如在Ausubel et al.(1995)和Sambrook et al.(1989)及其更新 版本中公開的。本實(shí)驗(yàn)中使用的構(gòu)建體在下面有更詳細(xì)的描述(表3)。
[0212] 從玉米物種的化i-1基因提取包含如前所述上游啟動子、5'-UTR和內(nèi)含子區(qū)的玉 米啟動子，并且PCR擴(kuò)增子使用QIAquick凝膠提取試劑盒愈（Qiagen Ca;rlsbad，CA)進(jìn)行凝 膠純化。然后使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)將啟動子多核巧酸序列克隆到Gateway入口 載體⑧（Invitrogen)中。通過限制性消化和測序進(jìn)行確認(rèn)所得的Gateway入口載體猿包括 玉米栽培種化-II的化i-1啟動子序列。將包括玉米栽培種B73 Ubi-1啟動子序列的對照入 口載體也使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)克隆到Gateway入口載體中。
[0213] 除了師i-1啟動子序列之外，入口載體還包括來自杯水母物種的黃色巧光蛋白報 告基因（PhiYFP;aiagin, D.A.，（2004)M〇1 Biol Evol. 21; 841-50)，在其序列中納入了ST- LS1 內(nèi)含子(Vancann巧t，G.，（ 1990)M〇1 Gen Genet. 220; 245-50)，和玉米過氧化物酶5基因 (ZmPer5;美國專利6，699，984)的3 ' -UTR區(qū)。提供了顯示包含每一個啟動子序列的克隆入口 載體的載體圖。構(gòu)建體PDAB105742對應(yīng)于包含玉米栽培種B73 Ubi-1啟動子序列的對照入 口載體。構(gòu)建體PDAB105740對應(yīng)于包含玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子序列的對照入口載 體。運(yùn)樣，建立了包含玉米化i-1啟動子、PhiYFP基因和ZmPe巧3'-UTR的基因表達(dá)盒的入口 載體。
[0214] 如表3所示，構(gòu)建了二元表達(dá)載體構(gòu)建體，其包括受所述新啟動子序列驅(qū)動并W ZmPe巧3'-UTR終止的曲巧FP報告基因。使用標(biāo)準(zhǔn)目的二元載體PDAB101917和包含如上所 述的基因表達(dá)盒的入口載體通過使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法和G勸eway夠重組反應(yīng)構(gòu)建了用于± 壤桿菌介導(dǎo)的玉米胚轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化或表達(dá)載體。
[021引二元目的載體PDAB101917包括除草劑耐受基因，草胺麟乙酷轉(zhuǎn)移酶（PAT; Wehrmann et al., 1996,Nature Biotechnology 14:1274-1278)。在pDAB101917載體中， PAT基因的表達(dá)受到玉米化i-1啟動子、5'-UTR和內(nèi)含子的控制。該P(yáng)DAB101917載體還包括 來自玉米脂肪酶基因（ZmLip;美國專利7，179，902)的3 ' -UTR區(qū)。該ZmLip 3 ' -UTR用于終止 PAT mRNA的轉(zhuǎn)錄。該Gateway貨重組反應(yīng)能夠?qū)⒚總€包含基因表達(dá)盒（即玉米栽培種化-II 或玉米栽培種B73 Ubi-1啟動子、PhiYFP基因和ZmPer5 3'-UTR)的入口載體插入到 pDAB 101917目的二元載體中。入口載體被插入在pDAB 101917目的載體內(nèi)T-DNA邊界A和B之 間，并位于PAT表達(dá)盒的上游。
[0216]
[0217]提供了顯示二元表達(dá)載體PDAB101917的載體圖，其具有基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒包 括納入的玉米Ubi-1啟動子、PhiYFP基因和Zm化巧3'-UTR。對照構(gòu)建體PDAB105748對應(yīng)于 包含玉米栽培種B73 Ubi-1啟動子的基因表達(dá)盒（圖8)。此外，構(gòu)建體PDAB105746對應(yīng)于包 含玉米栽培種化-II化i-1啟動子序列（圖9)的基因表達(dá)盒。
[021引實(shí)施例4:植物轉(zhuǎn)化
[0219] 使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化技術(shù)將二元載體構(gòu)建體，pDAB105748(玉米栽培種 B73)和PDAB105746(玉米栽培種化-II)，各自轉(zhuǎn)化進(jìn)入根癌±壤桿菌菌株EHA101中。分離細(xì) 菌菌落，并提取二元質(zhì)粒DNA，純化，并通過限制酶消化進(jìn)行確認(rèn)。
[0220] 玉米植物的轉(zhuǎn)化根據(jù)Vega et al.，2008，Plant Cell Rep 27:297-305中描述的 方案進(jìn)行，采用±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和麟絲菌素乙酷轉(zhuǎn)移酶基因（PAT;Wehrmann et al.， 1996,化1:ure Biotechnology 14:1274-1278)作為選擇性植物標(biāo)志物。使用包含二元載體 構(gòu)建體(如上所述）的根癌±壤桿菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化玉米栽培種化-II植物，產(chǎn)生了第一輪To轉(zhuǎn) 基因玉米事件。在轉(zhuǎn)化2.5個月之后，產(chǎn)生、制備并收獲了未成熟的合子胚。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基因表達(dá)盒，其包括與轉(zhuǎn)基因可操作連接的啟動子，其中該啟動子包括與SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的多核苷酸。2. 權(quán)利要求1的基因表達(dá)盒，其中該啟動子在嚴(yán)格條件下與如下所述的多核苷酸探針 雜交:該多核苷酸探針包含與SEQ ID NO:2的互補(bǔ)物的至少90%的序列同一性。3. 權(quán)利要求1的基因表達(dá)盒，其中該可操作連接的轉(zhuǎn)基因編碼多肽或小RNA。4. 權(quán)利要求1的基因表達(dá)盒，其中該轉(zhuǎn)基因選自下組:殺蟲劑抗性轉(zhuǎn)基因、除草劑耐受 性轉(zhuǎn)基因、氮利用效率轉(zhuǎn)基因、水分利用效率轉(zhuǎn)基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基因、和 選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因。5. 權(quán)利要求1的基因表達(dá)盒，其進(jìn)一步包括3 非翻譯區(qū)。6. -種重組載體，其包括權(quán)利要求1的基因表達(dá)盒。7. 權(quán)利要求6的重組載體，其中該載體選自下組:質(zhì)粒、粘粒、細(xì)菌人工染色體、病毒、和 噬菌體。8. -種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其包括權(quán)利要求1的基因表達(dá)盒。9. 權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。10. -種轉(zhuǎn)基因植物，其包括權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。11. 權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物是單子葉植物或雙子葉植物。12. 權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物，其中該單子葉植物選自下組:玉米植物，水稻植物，和小 麥植物。13. 來自權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。14. 一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其包含與SEQ ID N0:2具有至少90%序列同一性的合成多核苷 酸。15. 權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中該合成多核苷酸在嚴(yán)格條件下與如下所述的多核 苷酸探針雜交:該多核苷酸探針與SEQ ID NO:2的互補(bǔ)物包含至少90%的序列同一性。16. 權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。17. 權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是通過植物轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生的。18. 權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中該植物轉(zhuǎn)化方法選自下組：土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 法，生物射彈轉(zhuǎn)化法，碳化硅轉(zhuǎn)化法，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。19. 一種轉(zhuǎn)基因植物，其包括權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。20. 權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物是單子葉植物。21. 權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)基因植物，其中該單子葉植物選自下組:玉米植物，水稻植物，和小 麥植物。22. 來自權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。23. -種重組載體，其包括權(quán)利要求14的基因表達(dá)盒。24. 權(quán)利要求23的重組載體，其中該載體選自下組:質(zhì)粒、粘粒、細(xì)菌人工染色體、病毒 和噬菌體。25. -種用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)異源編碼序列的方法，該方法包括： a) 用含有如下所述的多核苷酸序列的基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞:該多核苷酸序列包含 與異源編碼序列可操作連接的SEQ ID N0:2,該異源編碼序列與3'非翻譯區(qū)可操作連接； b) 分離包含該基因表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞； C)將該轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生成轉(zhuǎn)基因植物;和 d)獲得該轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物包括所述含有包含SEQ ID NO: 2的多核苷酸 序列的基因表達(dá)盒。26. 權(quán)利要求25的方法，其中該異源編碼序列選自下組:殺蟲劑抗性編碼序列、除草劑 抗性編碼序列、氮利用效率編碼序列、水分利用效率編碼序列、營養(yǎng)品質(zhì)編碼序列、DNA結(jié)合 編碼序列、和選擇標(biāo)志物編碼序列。27. 權(quán)利要求25的方法，其中轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞是植物轉(zhuǎn)化方法。28. 權(quán)利要求27的方法，其中該植物轉(zhuǎn)化方法選自下組:土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，生物 射彈轉(zhuǎn)化法，碳化硅轉(zhuǎn)化法，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。29. 權(quán)利要求25的方法，其中該轉(zhuǎn)基因植物是單子葉植物或雙子葉轉(zhuǎn)基因植物。30. 權(quán)利要求29的方法，其中該單子葉轉(zhuǎn)基因植物選自下組:玉米植物，小麥植物，和水 稻植物。31. 來自權(quán)利要求25的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。32. 權(quán)利要求25的方法，其中該異源編碼序列在轉(zhuǎn)基因植物組織中表達(dá)。33. 權(quán)利要求25的方法，其中該轉(zhuǎn)基因植物組織是轉(zhuǎn)基因植物根、芽、莖或花粉組織。34. -種用于分離包含與SEQ ID NO: 2的至少90%序列同一性的多核苷酸序列的方法， 該方法包括： a) 鑒定包含與SEQ ID的至少90%序列同一性的多核苷酸序列； b) 產(chǎn)生多個寡核苷酸引物序列，其中該寡核苷酸引物序列能結(jié)合包含與SEQ ID的至少 90 %序列同一性的多核苷酸序列； c) 用選自該多個寡核苷酸引物序列的寡核苷酸引物序列從DNA樣品擴(kuò)增包含與SEQ ID 的至少90%序列同一性的多核苷酸序列;和 d) 分離包含與SEQ ID的至少90%序列同一性的多核苷酸序列。35. 權(quán)利要求34的方法，其中該包含與SEQ ID N0:2的至少90%序列同一性的分離多核 苷酸序列與轉(zhuǎn)基因可操作連接。36. 權(quán)利要求35的方法，其中該可操作連接的轉(zhuǎn)基因編碼多肽或小RNA。37. -種純化的多核苷酸序列，其包含與SEQ ID N0:2的至少90%的序列同一性，其中 該純化的多核苷酸序列促進(jìn)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。38. 權(quán)利要求37的純化多核苷酸序列，其中包含與SEQ ID NO: 2的至少90%序列同一性 的多核苷酸探針序列在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求37的純化多核苷酸序列雜交。39. 權(quán)利要求37的純化多核苷酸序列，其中該純化多核苷酸序列與轉(zhuǎn)基因可操作連接。40. 權(quán)利要求39的可操作連接的轉(zhuǎn)基因，其中該可操作連接的轉(zhuǎn)基因編碼多肽。41. 一種基因表達(dá)盒，其包含與轉(zhuǎn)基因可操作連接的權(quán)利要求37的純化多核苷酸序列， 所述轉(zhuǎn)基因與3 非翻譯區(qū)可操作連接。42. 權(quán)利要求41的基因表達(dá)盒，其中該轉(zhuǎn)基因選自下組:殺蟲劑抗性轉(zhuǎn)基因、除草劑抗 性轉(zhuǎn)基因、氮利用效率轉(zhuǎn)基因、水分利用效率轉(zhuǎn)基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因、DNA結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)基 因、和選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因。43. -種重組載體，其包括權(quán)利要求41的基因表達(dá)盒。44. 權(quán)利要求43的重組載體，其中該載體選自下組:質(zhì)粒載體、粘粒載體、和BAC載體。45. -種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其包括權(quán)利要求37的純化多核苷酸序列。46. 權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。47. -種轉(zhuǎn)基因植物，其包括權(quán)利要求46的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。48. 權(quán)利要求47的轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物是單子葉植物。49. 權(quán)利要求48的轉(zhuǎn)基因植物，其中該單子葉植物選自下組:玉米植物，小麥植物，和水 稻植物。50. 來自權(quán)利要求49的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。
【文檔編號】C12N15/00GK106062189SQ201480076574
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年12月31日
【發(fā)明人】S·庫馬爾, M·古普塔, T·R·賴特, S·M·杰恩, D·A·史密斯, D·阿拉貝德
【申請人】美國陶氏益農(nóng)公司