植物胚乳特異強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子pENP4及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明設(shè)及一種水稻 胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子祀NP4及其應(yīng)用，該啟動(dòng)子能夠在水稻轉(zhuǎn)基因調(diào)控體系中驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基 因的表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是最主要的糧食作物之一，世界上=分之一W上的人口都W稻米為主食。隨 著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，全球范圍內(nèi)對(duì)稻米產(chǎn)量和品質(zhì)提出了越來(lái)越高的要求。因而，利用各種方法 來(lái)提高水稻單產(chǎn)、改良稻米品質(zhì)，有著極其重要的意義。將現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用到水稻品種改 良中，可W解決一些常規(guī)方法難W解決的問(wèn)題。自九十年代W來(lái)，水稻生物技術(shù)取得了很大 的發(fā)展，一些控制重要農(nóng)藝性狀基因的相繼分離和水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善為用基因工 程技術(shù)來(lái)改良水稻品種奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0003] 概括來(lái)講，植物基因工程中常用的啟動(dòng)子按其作用方式及功能大致可分為=類： 組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織器官特異型啟動(dòng)子。運(yùn)種分類大體上反映了它們各自 的特點(diǎn)，但在某些情況下，一種類型的啟動(dòng)子往往兼有其它類型啟動(dòng)子的特性。所謂組織特 異型啟動(dòng)子是指除具有一般啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)外，通常還有增強(qiáng)子和沉默子的一般特性。在組 織特異型啟動(dòng)子的調(diào)控下，基因的表達(dá)往往只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，并常常 表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。運(yùn)些啟動(dòng)子的調(diào)控往往受到組織細(xì)胞生理狀態(tài)和化學(xué)物理信號(hào)等 物質(zhì)的誘導(dǎo)，還受到發(fā)育階段的調(diào)控，其表達(dá)是多種因子相到作用的結(jié)果。
[0004] 目前，植物基因工程中常用35S啟動(dòng)子構(gòu)建工程質(zhì)粒，該啟動(dòng)子能使外源基因在 雙子葉植物中獲得較高的表達(dá)。然而35S啟動(dòng)子在單子葉植物中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的能力不 強(qiáng)，并且它驅(qū)動(dòng)的表達(dá)無(wú)明顯的組織與器官專一性。
[0005] 高產(chǎn)水稻品種目前所存在的一個(gè)普遍問(wèn)題就是食味品質(zhì)較差，而引起食味品質(zhì) 差的主要原因是米粒的直鏈淀粉含量偏高。水稻種子胚乳中的淀粉可分為直鏈淀粉和支 鏈淀粉兩種，不同水稻品種稻米胚乳中的直鏈淀粉含量有所不同，釉稻品種一般為20 %~ 30%，梗稻品種為15%~22%，懦稻為0~2%。直鏈淀粉含量偏高則往往會(huì)使飯質(zhì)變硬、 口感差。
[0006]化Ush等于1984年在Genetics中報(bào)道，水稻第3條染色體上的水稻蠟質(zhì)基因(Waxy基因）控制著胚乳中直鏈淀粉的合成。該基因編碼結(jié)合于淀粉粒上的淀粉合成酶，從 而控制水稻花粉、胚乳和胚囊中直鏈淀粉的合成，是影響水稻胚乳中淀粉組成的一個(gè)關(guān)鍵 基因。由于該基因只在水稻的花粉、胚乳和胚囊中高效表達(dá)，因此它是時(shí)空專一性表達(dá)的基 因。
[0007] 胚乳是糧食作物營(yíng)養(yǎng)的最重要組成部分，分離胚乳特異性強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子對(duì)植物品 質(zhì)的改良具有重要的意義。
[0008] 但是，目前所公開(kāi)報(bào)道并且能夠投入到研發(fā)和生產(chǎn)中使用的胚乳特異性啟動(dòng)子很 少，難W滿足需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 因此，本發(fā)明希望從水稻基因中分離出能在水稻胚乳中專一性表達(dá)的啟動(dòng)子和表 達(dá)調(diào)控元件，W用于在單子葉植物、特別包括水稻在內(nèi)的糧食作物中指導(dǎo)外源基因表達(dá)。本 發(fā)明希望提供一種驅(qū)動(dòng)外源基因在水稻胚乳中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子、獲得含有該啟動(dòng)子序 列的轉(zhuǎn)化子W及該啟動(dòng)子的應(yīng)用。其中，本文中所設(shè)及的"植物"是指單子葉植物，例如水 稻、小麥、玉米、大麥、高梁或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種胚乳特異性強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子祀NP4， 所述植物胚乳特異強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子祀NP4提取自水稻屬植物，優(yōu)選地，提取自日本晴水稻 (OryzasativaLCV.化卵onbare)，本文中稱為祀NP4或啟動(dòng)子祀NP4。具體而言，本申請(qǐng) 的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)日本晴水稻（OryzasativaLCV.化卵onbare)基因上游包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 在內(nèi)的1942bp的DNA序列，具有驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因水稻胚乳中特異性表達(dá)的功能，并且分離克 隆、并鑒定了該DNA序列的功能。
[0011] 本發(fā)明還包含該DNA序列的各種變體。具體而言，所述植物胚乳特異強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng) 子祀NP4包含：
[001引 1)序列表中所示的DNA分子
[0013] 2)在嚴(yán)格條件下與1)中的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；或者
[0014]如與1)或。限定的DNA序列具有70% -75%的同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA 序列；或者
[001引 4)與1)或。限定的DNA序列具有75% -80%的同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA序列；或者
[001引W與1)或。限定的DNA序列具有80% -85%的同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA序列；或者
[0017] 6)與1)或。限定的DNA序列具有85% -90%的同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA 序列；或者
[001引 7)與1)或。限定的DNA序列具有90% -95%的同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA序列；或者
[001引 8)與1)或。限定的DNA序列具有95%W上的同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA序列；或者
[0020] 9)在SEQIDNO: 1中所示的核巧酸序列中添加一個(gè)或多個(gè)核巧酸后所獲得的具有 啟動(dòng)子功能的核巧酸序列；或者
[0021] 10)在SEQIDNO: 1中所示的核巧酸序列中去除一個(gè)或多個(gè)核巧酸后所獲得的具 有啟動(dòng)子功能的核巧酸序列；或者
[0022] 11)在SEQIDNO: 1中所示的核巧酸序列中取代一個(gè)或多個(gè)核巧酸后所獲得的具 有啟動(dòng)子功能的核巧酸序列。
[0023] 運(yùn)些水稻胚乳特異性強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子序列與SEQIDNo:1所示的DNA序列具有相同 的功能，即驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因在水稻胚乳中特異性表達(dá)。
[0024] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的水稻胚乳特異性強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子的DNA序列為SEQIDNo:l 所示的序列，即祀NP4或啟動(dòng)子祀NP4。
[00巧]另一方面，本發(fā)明提供擴(kuò)增所述植物胚乳特異強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子祀NP4的全長(zhǎng)或其任 意片段的引物對(duì)。
[0026] 另一方面，本發(fā)明提供所述植物胚乳特異強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子祀NP4的應(yīng)用，其特征在 于，所述植物胚乳特異強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子祀NP4用于構(gòu)建重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿 主菌。優(yōu)選地，所述宿主菌為根癌農(nóng)桿菌。
[0027] 此外，所述植物胚乳特異強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子祀NP4還可W用于構(gòu)建轉(zhuǎn)化子。其中，所述 轉(zhuǎn)化子優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、愈傷組織或植株。
[0028] 另一方面，本發(fā)明提供所述水稻胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子祀NP4在培育轉(zhuǎn)基因植物 中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括：（1)將根據(jù)權(quán)利要求1中任意一項(xiàng)所述的水稻胚乳特異性表達(dá)的 啟動(dòng)子PENP4與目標(biāo)基因相連接，并轉(zhuǎn)化至載體中，從而構(gòu)建重組表達(dá)載體；（2)將所述重 組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。
[0029] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用用于改良植物胚乳的生長(zhǎng)特性，所述植物為單子葉植物：水稻、 玉米、小麥、大麥、高梁或燕麥。
[0030] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括利用凍融法將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105。
[0031] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括將轉(zhuǎn)入了重組表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺 傳轉(zhuǎn)化，獲得包含水稻胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子祀NP4和目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0032] 又一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含上述的水 稻胚乳特異性強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子，在所述重組表達(dá)載體中，所述水稻胚乳特異性強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng) 子連接于待表達(dá)的基因序列的上游；優(yōu)選的，所述待表達(dá)的基因?yàn)榫哂懈纳婆呷樾誀?功能的基因，比如抑制直鏈淀粉合成的基因。在一種實(shí)現(xiàn)方式中，所述重組表達(dá)載體為 pCAMBIA1391-pENP4,該重組表達(dá)載體為將SEQIDNo:l所示的序列即祀NP4或啟動(dòng)子 祀NP4構(gòu)建于PCAMBIA1391中得到的重組表達(dá)載體，本文中稱為pCAMBIA1391-pENP4。
[0033] 本發(fā)明中所提供的啟動(dòng)子的DNA序列為（與序列表中SEQIDNo:1中相同）：
[0034]
[003引需要說(shuō)明的是：上述啟動(dòng)子的DM序列中，序列開(kāi)頭W斜體并加粗表示的序列 "巧殺巧.誕W潑0?篡增0健茲護(hù)為獲得啟動(dòng)子過(guò)程中使用的正向引物的留存序列，共計(jì)22bp; 序列末尾W斜體并加粗表示的序列"cWaWdadaamxwffAg"為獲得啟動(dòng)子過(guò)程中使用的 反向引物的留存序列（該留存序列與反向引物的相應(yīng)序列互補(bǔ)），共計(jì)22bp;該DNA序列 中剩余的部分則為獲自日本晴水稻中的DNA序列。需要強(qiáng)調(diào)的是，本文中所提到的啟動(dòng)子 既可W指上述整個(gè)DNA序列，也可W指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要說(shuō)明的 是，即便本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，采用其他引物獲得了類似序列，其也落入本發(fā) 明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0036] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、提取并鑒定了日本晴水稻（化yzasativaL cv.Nipponbare)祀NP4基因上游包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在內(nèi)的1942bp的DNA序列，并將其命名 為啟動(dòng)子祀NP4。將該序列經(jīng)酶切后連接到植物
[0037]
雙元表達(dá)載體PCAMBIA1391上，獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒（即重組表達(dá)載體），利用該重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105,然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因水稻 植株。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行Gus組織化學(xué)染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，代表報(bào)告基因Gus活性的藍(lán) 色僅出現(xiàn)于成熟種子的胚乳細(xì)胞中，表明祀NP4啟動(dòng)子僅在胚乳細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)表達(dá)。
[0038] 本發(fā)明所述的啟動(dòng)子序列可與植物雙元表達(dá)載體連接，用于取代組成型啟動(dòng)子。 并且，該啟動(dòng)子序列可W與所需的祀標(biāo)基因連接，構(gòu)建重組植物表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，在水 稻的胚乳部位特異性的驅(qū)動(dòng)祀標(biāo)基因的表達(dá)，增加轉(zhuǎn)基因的效果，避免不必要部位表達(dá)帶 來(lái)的物質(zhì)能量浪費(fèi)，有效改良水稻的特性。
[00測(cè)技術(shù)效果
[0040] 本發(fā)明所克隆的水稻啟動(dòng)子祀NP4能夠調(diào)控基因在水稻胚乳中特異性集中表達(dá)， 在實(shí)際應(yīng)用中具有顯著價(jià)值。通過(guò)該啟動(dòng)子對(duì)農(nóng)作物品種進(jìn)行基因改造，如通過(guò)該啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因在植株胚乳中集中表達(dá)，可W提高和改善水稻的生殖和產(chǎn)出特性，從而培育 出理想的轉(zhuǎn)基因植物品種，比如，可W培育出高產(chǎn)、耐病蟲(chóng)害的水稻。本發(fā)明的啟動(dòng)子可W 與抑制直鏈淀粉合成的基因結(jié)合使用，使種植出的稻米口感更好。
【附圖說(shuō)明】
[0041] W下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：
[0042] 圖1為將祀NP4啟動(dòng)子構(gòu)建于PCAMBIA1391載體質(zhì)粒中的示意圖，其中圖1中A 為PCAMBIA1391示意圖，圖I中B為pCAMBIA1391-pENP4示意圖，其中示出了利用祀NP4啟 動(dòng)子驅(qū)動(dòng)位于其下游的Gus基因表達(dá)；
[0043] 圖2為對(duì)本發(fā)明啟動(dòng)子進(jìn)行酶切驗(yàn)證的結(jié)果示意圖；
[0044]圖3為成熟植株（90天）的根（a)、莖化）、葉（C)、帶殼的成熟