一種桑樹(shù)青枯病鑒定的特異性引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于青枯病技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種桑樹(shù)青枯病鑒定的特異性引物及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 桑樹(shù)青枯病是一種毀滅性±傳病害，其發(fā)病速度快，蔓延迅速，發(fā)病范圍廣，嚴(yán)重 時(shí)發(fā)病面積達(dá)90%W上，使得桑葉產(chǎn)量急劇下降直至絕收，給蠶農(nóng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 桑樹(shù)青枯病一旦爆發(fā)，防治非常困難。但在早期檢測(cè)出病害的發(fā)生，可W通過(guò)病株拔除、農(nóng) 藥灌根、±壤消毒等方法有效預(yù)防青枯病的大面積爆發(fā)。
[0003] 目前，對(duì)青枯病鑒定的方法主要有表型鑒定和培養(yǎng)基病原菌分離鑒定。表型鑒定 即通過(guò)觀測(cè)桑葉和桑根的發(fā)病表型特征來(lái)判定青枯病的發(fā)生。由于植株病癥表型在發(fā)病中 后期才能觀測(cè)到，而青枯病中后期防治比較困難，因此運(yùn)種方法對(duì)青枯病的防治意義不大。 培養(yǎng)基病原菌分離鑒定即利用TTC培養(yǎng)基分離病根木質(zhì)部中的病原菌，通過(guò)觀察病原菌形 態(tài)鑒定青枯病的發(fā)生。運(yùn)種方法能在較早期檢測(cè)青枯病的發(fā)生，但培養(yǎng)中易出現(xiàn)腸桿菌等 雜菌污染，影響鑒定的準(zhǔn)確度。因此發(fā)明一種早期快速的桑樹(shù)青枯病鑒定方法，為桑樹(shù)青枯 病早期診斷和防治提供理論基礎(chǔ)，對(duì)保障蠶桑產(chǎn)業(yè)穩(wěn)產(chǎn)持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種桑樹(shù)青枯病鑒定的特異性引物，該引物特異性 強(qiáng)，快速、靈敏。 陽(yáng)〇化]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種早期快速鑒定桑樹(shù)青枯病的方法，該方法在發(fā) 病早期能快速鑒定桑樹(shù)青枯病，為防治桑樹(shù)青枯病的發(fā)生提供可靠的依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供上述桑樹(shù)青枯病鑒定的特異性引物在制備具有 鑒定桑樹(shù)青枯病功能的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種桑樹(shù)青枯病鑒定的特異 性引物，由上游引物RS-16S-F和下游引物RS-16S-R組成，所述上游引物RS-16S-F的核巧 酸序列如SEQIDNO: 1中所示，所述下游引物RS-16S-R的核巧酸序列如SEQIDNO:2中所 /J、-O
[0008] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中桑樹(shù)青枯菌的ieSrRNA(GenBankID:JXl12350)序列特征，利 用PrimerPremier5.0和01igo6.0設(shè)計(jì)和篩選了上述桑樹(shù)青枯菌巧光PCR特異性引物 (RS-16S-F:TGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGT如沈QIDNO:1 中所示/RS-16S-R:TCGAGCACCTAA TGCATCTCTGCTTC，如SEQIDN0:2中所示）。該引物對(duì)理論擴(kuò)增片段大小為IWbp，該引物 可由華大基因等公司合成。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種早期快速鑒定桑樹(shù)青枯 病的方法，包括W下步驟：
[0010] (1)取疑似青枯病桑樹(shù)的根部，提取該桑樹(shù)根部的DNA;
[00川 似W該桑樹(shù)根部的DM為模板，利用上述桑樹(shù)青枯病鑒定的特異性引物 RS-16S-F/RS-16S-R進(jìn)行巧光定量qPCR; 陽(yáng)01引 做記錄該桑樹(shù)根部的DNA的qPCR反應(yīng)體系的Ct值，當(dāng)Ct值《36時(shí)，表明有桑 樹(shù)青枯菌的存在，該桑樹(shù)為發(fā)病植株；當(dāng)Ct值> 36時(shí)，表明沒(méi)有桑樹(shù)青枯病的存在，該桑樹(shù) 為健康植株。
[0013] 步驟（1)中優(yōu)選采用DNAiso reagent kit試劑盒提取桑樹(shù)根部的DNA。
[0014] 步驟似中巧光定量qPCR優(yōu)選采用Roche Li曲t切Cler480實(shí)時(shí)巧光PCR儀和 SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行。 陽(yáng)01引步驟似中巧光定量qPCR的反應(yīng)體系優(yōu)選包括：SYBRPremixEx TaqII(2X) 10. 0化、濃度為10yM的上游引物RS-16S-F0. 8化、濃度為10yM的下游引 物RS-16S-R0. 8yL模板 2. 0yL雙蒸水 6. 4yL。
[0016] 步驟（2)中巧光定量qPCR的擴(kuò)增程序優(yōu)選為：第一步95°C預(yù)變性30s，第二步 95°C變性5s，60°C退火30s，72°C延伸15s，45個(gè)循環(huán)。
[0017] 步驟做中Ct值的確定方式優(yōu)選為：選取桑樹(shù)青枯病菌，配制一組具有濃度梯度 的桑樹(shù)青枯病菌溶液，W該組具有濃度梯度的桑樹(shù)青枯病菌溶液為模板，利用權(quán)利要求1 中的桑樹(shù)青枯病鑒定的特異性引物RS-16S-F/RS-16S-R進(jìn)行巧光定量qPCR，記錄該組具有 濃度梯度的桑樹(shù)青枯病菌溶液的Ct值，建立Ct值與桑樹(shù)青枯病菌溶液各濃度log值之間 的線性關(guān)系，將最低濃度的桑樹(shù)青枯病菌溶液的Ct值作為評(píng)判該桑樹(shù)是否具有桑樹(shù)青枯 病的臨界值。 陽(yáng)01引其中最低濃度的桑樹(shù)青枯菌溶液的濃度為0. 95XIO2~1. 05X10 2CFU/mL。
[0019] 本發(fā)明的第=個(gè)目的是通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：上述桑樹(shù)青枯病鑒定的特異 性引物在制備具有鑒定桑樹(shù)青枯病功能的藥物（如試劑盒等）中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明中的桑樹(shù)青枯病鑒定的特異性引物，靈敏、高效、特 異性好，本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)桑樹(shù)青枯菌ISSrRNA的特異引物，結(jié)合巧光定量PCR的方法，在發(fā) 病早期快速鑒定桑樹(shù)青枯病，為防治桑樹(shù)青枯病的發(fā)生提供可靠的依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1是實(shí)施例1中青枯菌巧光PCR引物特異性檢測(cè)。泳道1、2模板為桑青枯菌 DNA;泳道3、4模板為桑腸桿菌DNA;泳道5、6模板為桑假單胞菌DNA;泳道7、8模板為桑歐 文氏菌DNA;泳道9、10模板為桑黃單胞菌DNA;M為2000bpDNALadder;
[0022] 圖2是實(shí)施例I中待測(cè)菌株與已知青枯菌ieSrRNA序列比對(duì)； 陽(yáng)02引圖3是實(shí)施例2中細(xì)菌含量Log值和qPCRCt值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0024]圖4是實(shí)施例3中青枯菌侵染前和侵染后桑根樣本的Ct值。
【具體實(shí)施方式】 陽(yáng)〇2引 實(shí)施例1
[00%] 桑樹(shù)青枯菌特異引物的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證
[0027] 1. 1根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中桑樹(shù)青枯菌的ieSrRNA(GenBankID:JXl12350)序列特征， 利用PrimerPremier5. 0和01igo6. 0設(shè)計(jì)和篩選了一對(duì)桑樹(shù)青枯菌巧光PCR特異性引物 (RS-16S-F:TGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGT/RS-16S-R:TCGAGCACCTAATGCATCTCTGCTTC)。該引 物對(duì)理論擴(kuò)增片段大小為IWbp，該引物由華大基因公司合成。引物稀釋前先在4°C條件 下，W1XIO4巧m離屯、2min，然后加入去離子水配成10yM的膽存液保存于-20°C待用。
[0028] 1. 2桑樹(shù)腸桿菌、假單胞菌、歐文氏菌和黃單胞菌為對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)菌株均接種于 LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫氣浴搖床中W20化pm的轉(zhuǎn)速，在30°C條件下過(guò)夜培養(yǎng)，待ODe。。為 1時(shí)即可取樣。采用DNAisoreagentkit(Takara,Otsu,Japan)提取各菌株的DNA，保存 于-20°C條件下待用。
[0029] 1. 3W各菌株DNA為模板，利用青枯菌巧光PCR特異性引物RS-16S-F和RS-16S-R 進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下：25iiL的反應(yīng)體系中包含12.5iiLTaqPCR Mix(2X)，8. 5化雙蒸水，2化模板，1化上游引物RS-16S-F，1化下游引物RS-16S-R。 擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸20s，30個(gè)循環(huán)； 72°C延伸5min，4°C保存。PCR完成后，產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0030] 1. 4同時(shí)將電泳條帶切膠回收，連接到T-easy載體上，并轉(zhuǎn)化至E.CO1i中，獲得陽(yáng) 性菌落并送至公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，確定其菌屬類型。 陽(yáng)03U 1.5結(jié)果
[0032] 1. 5. 1W桑樹(shù)腸桿菌、假單胞菌、歐文氏菌和黃單胞菌為對(duì)照，利用青枯菌特異性 引物RS-16S-F和RS-16S-R進(jìn)行常規(guī)PCR，電泳分析結(jié)果表明：僅青枯菌能擴(kuò)增出條帶，而 對(duì)照菌株腸桿菌、假單胞菌、歐文氏菌和黃單胞菌均未擴(kuò)增出條帶，詳情見(jiàn)圖1。
[0033] 1.5. 2將電泳條帶回收轉(zhuǎn)化并測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上已知的青枯菌 ieSrRNA序列化T748524)進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明，該序列為青枯菌的ieSrRNA特征序列， 詳情見(jiàn)圖2。
[0034] 綜上所述，該青枯菌引物的特異性好，可用于后續(xù)青枯菌的巧光定量分析實(shí)驗(yàn)。 陽(yáng)0對(duì)實(shí)施例2
[0036] 早期快速鑒定桑樹(shù)青枯病的方法
[0037] 2. 1Ct值的確定 陽(yáng)03引2.1.1將1 X IO8CFlVmL的青枯菌懸液按梯度進(jìn)行稀釋，使其終濃度分別為1 X108、5 X1〇7、1 X1〇\5 X1〇6、1 X1〇6、1 X1〇5、1 X1〇4、1 X1〇3、1 Xl〇2c即/mL。
[0039] 2. 1. 2取2yL各梯度稀釋的菌懸液為模板，利用引物對(duì)RS-16S-F/RS-16S-R進(jìn)行 巧光定量qPCR實(shí)驗(yàn)。qPCR采用Roche Li曲t切Cler 480實(shí)時(shí)巧光PCR儀和SYBR Premix Ex !"aq?燈akar,Otsu,Japan)試劑盒進(jìn)行。20JiLqPCR反應(yīng)體系包括：SYBR Premix Ex Taq II(2 X)10.0祉，上游引物RS-16S-F (10yM) 0. 8yL下游引物RS-16S-R(10yM) 0. 8yL模 板2.雙蒸水6.4yL。擴(kuò)增程序如下：第一步95°C預(yù)變性30s，第二步95°C變性5s， 60°C退火30s，72°C延伸15s，45個(gè)循環(huán)，PCR結(jié)束后立即進(jìn)行溶解曲線分析，驗(yàn)證擴(kuò)增的特 異性。每個(gè)qPCR反應(yīng)重復(fù)3次。
[0040] 2. 1. 3記錄qPCR反應(yīng)體系的Ct值，并分析其與青枯菌懸液濃度的相關(guān)性。
[0041] 結(jié)果表明，利用qPCR技術(shù)對(duì)各梯度稀釋的青枯菌懸液進(jìn)行檢測(cè)，記錄Ct值， 并分析菌液濃度的Log值和對(duì)應(yīng)的循環(huán)闊值（Ct)的相關(guān)性。如圖3所示，菌液濃度在 IO2~10