一種煙草根特異啟動子NtR2驅(qū)動AhRESS基因產(chǎn)白藜蘆醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種煙草根特異啟動子NtR2驅(qū)動AhRESS基因產(chǎn)白藜蘆醇的方法，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]白藜蘆醇，其化學(xué)名為3，5，4’_三羥基-反-二苯乙烯(3，5，4’_trihydroxysitlbene)，又名苗三酸，是一種重要的植物抗毒素，存在于虎杖、葡萄、花生等植物中，在葡萄果皮和花生根中含量尤為豐富。它具有多種生物活性，是一種天然的抗氧化劑，可以降低血脂，抑制血小板凝結(jié)，抗癌，抗炎，抗輻射，抗衰老，防治心血管疾病等。但自然界中存在的白藜蘆醇的含量較少，利用生物技術(shù)生產(chǎn)白藜蘆醇有望高效生產(chǎn)白藜蘆醇。
[0003]為了提高植物材料白藜蘆醇的含量，研究者進(jìn)行了白藜蘆醇合成的關(guān)鍵基因RESS遺傳轉(zhuǎn)化的研究。G1vinazzo等以35S啟動子調(diào)控白藜蘆醇合酶基因進(jìn)行番前遺傳轉(zhuǎn)化，測定轉(zhuǎn)基因番茄中的抗壞血酸鹽與谷胱甘肽還原酶的總體水平，結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因植物的抗氧化性較之野生型植物的抗氧化性有了顯著的提高。Hilsken等人利用油菜種子特異表達(dá)啟動子驅(qū)動白藜蘆醇合酶基因表達(dá)，轉(zhuǎn)化油菜，同時，阻斷消耗白藜蘆醇合酶底物的另一條支路，檢測T0代油菜種籽中的Res含量，發(fā)現(xiàn)以鮮重計其最高含量為361yg/g，同時還獲得到品質(zhì)改善且保健性提高的油菜種籽。林榮華等以花生中的白藜蘆醇合酶基因為目的基因，構(gòu)建了含目的基因的植物重組表達(dá)載體PB6RS，利用電穿孔法將pB6RS質(zhì)粒直接導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將pB6RS轉(zhuǎn)化煙草(云煙85)，得到了陽性植株。但是目前利用煙草根特異表達(dá)啟動子驅(qū)動花生白藜蘆醇合酶基因在煙草根部特異表達(dá)，并產(chǎn)生白藜蘆醇的研究未見報道。
[0004]煙草是葉用作物，具有發(fā)達(dá)的根系，一般根被作為廢棄物處理掉，若使煙草根生產(chǎn)白藜蘆醇，則可能變廢為寶，提高煙草的利用價值。本發(fā)明在分別克隆了煙草根特異啟動子NtR2和花生AhRESS基因的基礎(chǔ)上，以pBI121-GUSA為母體載體，通過酶切連接的方法構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI 121-NtR2-AhRESS，之后轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌C58，以葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化煙草翠碧一號(CB-1)，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草植株并對其進(jìn)行了分子鑒定。提取轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株根、莖、葉各組織的RNA，分別進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果表明，花生AhRESS基因只在煙草根表達(dá)。提取轉(zhuǎn)基因煙草根中的白藜蘆醇，進(jìn)行HPLC分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草只在根中合成了花生的白藜蘆醇。本發(fā)明為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在煙草根大量生產(chǎn)白藜蘆醇奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)和開發(fā)利用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種煙草根特異啟動子NtR2驅(qū)動AhRESS基因產(chǎn)白藜蘆醇的方法。目的在于提供利用煙草根特異啟動子驅(qū)動花生白藜蘆醇合酶基因只在煙草根部表達(dá)，以生產(chǎn)白藜蘆醇的技術(shù)，以便高效利用植物基因工程手段高效生產(chǎn)白藜蘆醇。本發(fā)明是利用已有的煙草根特異啟動子驅(qū)動花生白藜蘆醇合酶基因AhRESS(花生AhRESS基因)，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化煙草生產(chǎn)品種翠碧一號(CB-1)，經(jīng)PCR鑒定獲得了轉(zhuǎn)AhRESS基因煙草，通過RT-PCR技術(shù)分別分析轉(zhuǎn)基因煙草的根、莖、葉表明AhRESS只在煙草的根特異表達(dá)，不在莖和葉表達(dá)，通過HPLC分析各器官的白藜蘆醇含量發(fā)現(xiàn)花生白藜蘆醇只在煙草根部表達(dá)。這為利用煙草根系生產(chǎn)白藜蘆醇奠定了基礎(chǔ)，并可大大提高煙草生產(chǎn)的價值。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種煙草根特異啟動子NtR2驅(qū)動AhRESS基因產(chǎn)白藜蘆醇的方法，包括以下步驟: 包括以下步驟:
(1)克隆煙草根特異啟動子NtR2和花生AhRESS基因；
(2)煙草根特異啟動子NtR2驅(qū)動花生AhRESS基因表達(dá)載體pBI121-NtR2-AhRESS的構(gòu)建；
(3)pBI121-NtR2-AhRESS經(jīng)根癌土壤桿菌C58介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株，并對其進(jìn)行分子鑒定；
(4)對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子檢測，利用HPLC檢測根中白藜蘆醇的含量。
[0007]所述步驟(1)中煙草根特異啟動子NtR2的序列為如SEQ ID No: 1所示。
[0008]所述步驟(1)中花生AhRESS基因的序列如SEQ ID No:2所示。
[0009]所述步驟(2)中煙草根特異啟動子NtR2驅(qū)動花生白藜蘆醇合酶基因AhRESS表達(dá)載體的出發(fā)載體為PBI121質(zhì)粒載體，所述的根特異啟動子驅(qū)動花生白藜蘆醇合酶基因AhRESS表達(dá)載體的啟動子是煙草根特異性啟動子NtR2，所述的煙草根特異性啟動子基因NtR2下游包含花生AhRESS基因。
[0010]步驟(2)具體方法包括以下步驟:
1)克隆煙草根特異啟動子NtR2，并連接至pMD18-T載體中，得到pMD18_NtR2載體；
2)pBI121-NtR2-GUSA載體構(gòu)建:將pBI 121載體進(jìn)行酶切，切除該載體上的GUSA基因，從pCAMBIA-1301載體中克隆GUSA基因連接至pBI121載體上，構(gòu)建pBI121-GUSA;將pBI121-GUSA載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，切除35S啟動子，將pMD18-NtR2載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，將NtR2啟動子連接至pB 1121 -GUSA載體中，得到pB 1121 _NtR2_GUSA載體；
3)pBI121-NtR2-AhRESS載體的構(gòu)建:克隆花生AhRESS基因，并連接到pBI121-NtR2-⑶SA載體中，得到pB 1121 -NtR2-AhRESS載體。
[0011]所述步驟(3)中pBI121-NtR2-AhRESS載體的遺傳轉(zhuǎn)化采用根癌土壤桿菌C58介導(dǎo)的葉盤法；用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片的DNA進(jìn)行PCR分子檢測；用改良的CTAB法分別提取轉(zhuǎn)基因植株葉片和根RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR，進(jìn)行目的基因表達(dá)模式分析。
[0012]所述步驟(4)中轉(zhuǎn)基因煙草根中白藜蘆醇HPLC檢測色譜條件為:色譜柱0DS，流動相乙腈:水=25:75，流速1.0 mL/min，檢測波長306 nm，柱溫25°C，進(jìn)樣量10 yL。
[0013]具體為:
1.煙草根特異啟動子NtR2的克隆
利用CTAB法提取煙草葉片基因組DNA，以煙草根特異啟動子NtR2特異引物NtR2_ Hindm-promter-F(5’ ACCAAAGCTTGAATATCTTCAGTATATTCGTTGTG 3’)，NtR2_ Xbal-promter-R(5’ ACCATCTAGAGTCTCCTTCTTAATTTTCTATCAAAG 3’)進(jìn)行PCR擴增，所得到的特異片段即為NtR2啟動子。所述煙草根特異啟動子NtR2的序列為如SEQ ID No:1所示。
[0014]花生AhRESS基因的克隆
利用CTAB法提取花生葉片基因組DNA，以花生白藜蘆醇合酶基因特異引物RS- BamH1-primer-F( 5’ TCGTGGATCCGCC ACCATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC 3’)，RS_Sac1-primer-R(5’ TCCTGAGCT CTTATATGGCCACACTGCGGAGAACG 3’)進(jìn)行PCR檢測。其回收產(chǎn)物即為花生RES基因編碼框DNA序列。所述花生AhRESS基因的序列如SEQ ID No:2所示。
[0015]煙草根特異啟動子NtR2驅(qū)動花生白藜蘆醇合酶基因AhRESS表達(dá)載體pBI 121-NtR2-AhRESS 的構(gòu)建
(1)將煙草根特異啟動子NtR2連接至pMD18-T載體中，得到pMD18_NtR2載體；
(2 ) pBI 121 -NtR2-GUSA載體構(gòu)建:利用限制性內(nèi)切酶BamHI及Sac I對pBI 121質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切，切除該載體上的GUSA基因，利用帶有限制性酶切位點的特異引物從pCAMBIA1301載體中克隆GUSA基因，連接至酶切后的pB 1121載體上，得到pB 1121 -GUSA載體;利用限制性內(nèi)切酶Hindm及Xhol將pBI121-GUSA載體進(jìn)行酶切，切除35S啟動子;將pMD18-NtR2載體利用限制性內(nèi)切酶Hindm及Xhol進(jìn)行酶切，獲得NtR2啟動子，