專利名稱：：人腫瘤特異性Ki67基因啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、癌癥生物學(xué)等。具體是人腫瘤特異性Ki67啟動(dòng)子的克隆及功能鑒定，該啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞或組織中有較高的轉(zhuǎn)錄活性，從而使外源基因在腫瘤細(xì)胞或組織中特異性表達(dá)，因此可以廣泛用于腫瘤靶向基因治療。
背景技術(shù)：
：腫瘤嚴(yán)重危害人類健康。雖然化療、放療和手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)使腫瘤治療效果取得很大改觀，但效果仍不理想，而且腫瘤常常最終對(duì)化療、放療耐受。近年來(lái)腫瘤基因治療研究取得較大進(jìn)展，給人類戰(zhàn)勝腫瘤帶來(lái)希望。臨床上基因治療包括多種，如腫瘤自殺基因、抑癌基因、細(xì)胞凋亡基因、細(xì)胞因子、反義核苷酸、小干擾RNA等，雖然已經(jīng)取得了一定的療效[1]，但單純上述基因的應(yīng)用缺乏腫瘤特異性，限制了基因治療在臨床上的應(yīng)用范圍及治療效果。為了將治療基因產(chǎn)物限制在腫瘤細(xì)胞中，可以通過腫瘤特異性啟動(dòng)子控制治療基因表達(dá)，使其局限在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，而不在正常細(xì)胞中表達(dá)，實(shí)現(xiàn)治療基因靶向轉(zhuǎn)錄，此即為腫瘤的耙向基因治療P"41。腫瘤特異性啟動(dòng)子的活力和特異性決定腫瘤靶向基因治療的效果和安全性[5]。很多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)通過組織特異性啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向基因治療，如AFP是原發(fā)性肝癌的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)受AFP啟動(dòng)子調(diào)控，在腺病毒中插入該啟動(dòng)子，可使病毒僅在表達(dá)AFP的肝癌細(xì)胞內(nèi)增殖^。這類啟動(dòng)子尚有前列腺癌PSA啟動(dòng)子、黑色素瘤Tyr酶啟動(dòng)子[7]、消化道腫瘤CEA啟動(dòng)子，乳腺癌MUC1啟動(dòng)子。1997年Rodriguez等^構(gòu)建了以PSA啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒ElA區(qū)基因的增殖腺病毒CV706。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CV706對(duì)PSA陽(yáng)性LNCaP細(xì)胞的殺傷能力比PSA陰性DU15細(xì)胞增強(qiáng)400倍。5xl()Spfu的CV706注入小鼠LNCaP種植瘤內(nèi)，2周后腫瘤體積明顯下降，同時(shí)PSA水平顯著下降，6周后，10只鼠中有5只腫瘤完全消失。但這些啟動(dòng)子具有腫瘤類型局限性，只能在該種組織來(lái)源的腫瘤中起作用，使其應(yīng)用受到限制[5]。為此人們開始寄希望于針對(duì)所有腫瘤特征的啟動(dòng)子，如hTERT啟動(dòng)子[9'10'11]、Survivin啟動(dòng)子[12]、環(huán)氧化酶(cyclooxygenase-2，COX-2)啟動(dòng)子[13]等。此類啟動(dòng)子可以使外源基因在多種腫瘤中特異性的表達(dá)，體內(nèi)外研究取得了肯定的治療效果，但是其活性較低，不能令人滿意[14]。因此尋找啟動(dòng)能力更強(qiáng)、特異性更高的腫瘤啟動(dòng)子意義重大。Ki67蛋白是一種與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，1983年被Gerdes""發(fā)現(xiàn)后，經(jīng)多家研究證實(shí)其與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)。幾乎所有的腫瘤細(xì)胞都表達(dá)Ki67蛋白，而正常組織和細(xì)胞不表達(dá)。Ki67在腫瘤組織中表達(dá)越高，預(yù)后越差。復(fù)發(fā)和進(jìn)展期腫瘤Ki67表達(dá)高于原發(fā)性腫瘤[16。Ki67蛋白已成為臨床判斷腫瘤惡性度及預(yù)后最常用的細(xì)胞增殖標(biāo)志。近年研究表明，Ki67基因是一細(xì)胞增殖基因，編碼分子量為345kD和395kD的腫瘤細(xì)胞增殖必需的DNA結(jié)合蛋白。Ki67蛋白在G1中晚期出現(xiàn)，經(jīng)S、G2期在M期達(dá)到高峰，M期后即快速降解。Ki67蛋白磷酸化與染色體的濃縮及染色單體的分離有關(guān)[17]。越來(lái)越多的研究表明Ki67與腫瘤的形成密切相關(guān)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期必不可少的組成部分。1991年Ki67基因被定位在10號(hào)染色體[18]，但由于其初級(jí)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，在生物數(shù)據(jù)庫(kù)中尚未發(fā)現(xiàn)與之同源的序列[19]，也使其生物功能至今仍不清楚，對(duì)于Ki67基因功能以及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制等方面的研究甚少。啟動(dòng)子是基因組中最重要的調(diào)控元件，基因表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，而啟動(dòng)子決定著轉(zhuǎn)錄的起始和轉(zhuǎn)錄的頻率，是闡明基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制和表達(dá)模式的關(guān)鍵。啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)存在諸多的順式作用元件，更能提供研究基因間相互作用、相互調(diào)節(jié)的線索。Ki67基因上游轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚，因此我們克隆并鑒定該基因啟動(dòng)子，通過分析、鑒定維持該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的必需區(qū)域及該區(qū)域內(nèi)的潛在轉(zhuǎn)錄因子，篩選出該啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子。不僅有幫于我們認(rèn)識(shí)Ki67基因表達(dá)調(diào)控，更為重要的是由于Ki67基因在幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中都有很高的表達(dá)，該啟動(dòng)子會(huì)為我們提供一種應(yīng)用范圍極廣的腫瘤靶向基因治療工具
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新型的腫瘤特異性Ki67啟動(dòng)子的克隆，確定該啟動(dòng)子核心功能區(qū)域的核苷酸序列，以及核心啟動(dòng)子的核苷酸序列。為腫瘤的耙向基因治療提供一個(gè)新的調(diào)控元件，為腫瘤治療提供新的技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下通過逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1591bp含有人腫瘤細(xì)胞Ki67基因啟動(dòng)子的Ki67基因5'側(cè)翼序列，該序列包括從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-820至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游起始密碼子ATG之后的+771，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。該段GC含量高達(dá)61.47%，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)前200bp范圍內(nèi)的GC含量更高，達(dá)67.71%。并且在-195、-189、-167、-156起始位置存在潛在轉(zhuǎn)錄因子Spl—致性序列(CCCGCC)，在-53、-6、+3起始位置存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Spl—致性序列(GGGCGG)，-80起始位置存在一個(gè)CHR(cell-cyclegeneshomologyregion,細(xì)胞周期調(diào)控基因的同源區(qū))一致性序列(ATTTGAA)，-48起始位置存在一個(gè)ZF5(humanzincfinger5protein,人類鋅指蛋白5)—致性序列(GGCGCG)，但沒有典型的TATA盒和CAAT盒。提示Ki67基因表達(dá)調(diào)控存在多種因素，從中找出關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域或調(diào)控元件，對(duì)闡明Ki67基因表達(dá)調(diào)控具有重要意義。為尋找Ki67基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，我們使用缺失分析法分別從Ki67基因5'側(cè)翼的5'端逐段缺失，得到9個(gè)不同長(zhǎng)度的截短片段，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)鑒定截短片段在Hela細(xì)胞、BIU-87細(xì)胞、Ketr-3細(xì)胞、A549細(xì)胞四種人腫瘤細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株Huvec中的啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示，-223+771截短片段活性最強(qiáng)。然后對(duì)-223~+771片段自3'端缺失，形成的截短片段表現(xiàn)出較缺失前更強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，-223—30片段的活性在Hela細(xì)胞、BIU-87細(xì)胞、Ketr-3細(xì)胞、A549細(xì)胞內(nèi)分別為-223~+771片段活性的2.9倍、2.6倍、2.4倍、2.7倍。我們將長(zhǎng)度為253bp，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，位于Ki67基因5'端上游-223+30的片斷命名為Ki67核心啟動(dòng)子(Ki67-promoter)。Ki67-promoter在Hela細(xì)胞、BIU-87細(xì)胞、Ketr-3細(xì)胞、A549細(xì)胞四種腫瘤細(xì)胞中的活性均較hTERT啟動(dòng)子、Survivin啟動(dòng)子的活性為強(qiáng)。本發(fā)明還提供了一種含有Ki67核心啟動(dòng)子的載體，該載體能在Ki67基因陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中啟動(dòng)熒光素酶基因的表達(dá)。本發(fā)明還提供了一種以Ki67核心啟動(dòng)子取代腺病毒E1A啟動(dòng)子調(diào)控的條件增殖型腺病毒穿梭質(zhì)粒。本發(fā)明首次鑒定了人Ki67基因啟動(dòng)子位于Ki67基因-820~+771位置，并鑒定出-223~+30區(qū)域?yàn)镵i67基因核心啟動(dòng)子，證明其在多種腫瘤細(xì)胞中的強(qiáng)大活性及很高的腫瘤特異性。本發(fā)明不僅對(duì)研究人Ki67基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有重要意義，更為重要的是因其具有腫瘤特異性和高啟動(dòng)子活性，這些Ki67基因啟動(dòng)子片段是非常有用的腫瘤特異性啟動(dòng)子。此類啟動(dòng)子可以定向插入新的基因治療用載體，在其調(diào)控下，外源治療基因或病毒增殖相關(guān)基因(如腺病毒E1A或E1B)只在腫瘤細(xì)胞中定位表達(dá)，從而在腫瘤的靶向治療中具有較好的應(yīng)用價(jià)值。本文下列實(shí)例僅是用作舉例說(shuō)明，但應(yīng)注意的是并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。本發(fā)明范圍內(nèi)的其他方面、優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)對(duì)本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。圖1Ki67基因5'側(cè)翼序列(-820~+771)正向測(cè)序報(bào)告；圖2Ki67基因5'側(cè)翼序列(-820-+771)反向測(cè)序報(bào)告；圖35'端啟動(dòng)子區(qū)域截短片段示意圖43'端啟動(dòng)子區(qū)域截短片段示意圖；圖5真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建流程圖6Ki67核心啟動(dòng)子克隆載體pGLBK2+(-223+30)正向測(cè)序報(bào)告；圖7pGLBK800在各細(xì)胞系中相對(duì)熒光強(qiáng)度；圖8自5'端缺失的各重組載體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)熒光強(qiáng)度；圖9自5'端缺失的各重組載體在正常細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)熒光強(qiáng)度；圖10自3'端缺失的各重組載體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)熒光強(qiáng)度；圖11自3'端缺失的各重組載體在正常細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)熒光強(qiáng)度；圖12Ki67核心啟動(dòng)子與hTERT、Survivin啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞的活性比較；圖13Ki67核心啟動(dòng)子與hTERT、Survivin啟動(dòng)子在正常細(xì)胞的活性比較；圖14Ki67核心啟動(dòng)子取代腺病毒ElA啟動(dòng)子的條件增殖型腺病毒穿梭質(zhì)粒的PCR鑒定示意圖。圖中A:Ki67啟動(dòng)子片段M:D2000marker。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l含有人Ki67基因啟動(dòng)子的真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1.人Ki67基因5'側(cè)翼序列(-820+771)的克隆及序列鑒定在Genbank中查找Ki67基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)5'側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增Ki67基因起始密碼子上游1591大小片段的一對(duì)引物。在-820-805區(qū)域設(shè)計(jì)上游引物，并引入XhoI酶切位點(diǎn)，在+758+771區(qū)域設(shè)計(jì)下游引物，并引入ffindIII酶切位點(diǎn)。其中上游引物命名為KU800，序列為5'-ttgtctcgagtttttctgtgcttttg-3'，下游引物命名為KD1，序列為5'-tgtgaagctttcgaccccgctcct-3'。應(yīng)用此對(duì)引物，以人腎癌Ketr-3細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出約1.6kb的DNA片段，回收目的片段，XhoI/HindlII雙酶切后，與經(jīng)同樣酶切的載體pGL3-Basic(購(gòu)自美國(guó)Promega公司)連接，pGL3-Basic為螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因前不含啟動(dòng)子的表達(dá)載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，抗性篩選，測(cè)序。測(cè)序結(jié)果證明我們克隆出的Ki67基因5'側(cè)翼序列已定向克隆至pGL3-Basic載體螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因上游(測(cè)序圖譜見圖1、圖2)，該重組質(zhì)粒命名為pGLBK800，核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，包含了長(zhǎng)度為1591bp的Ki67基因5'側(cè)翼序列，包括從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-820至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游起始密碼子ATG之后的+771的序列。該段序列GC含量高達(dá)61.47%，其特性為富含GC，無(wú)TATA盒和CAAT盒。2.Ki67基因啟動(dòng)子核心功能區(qū)域克隆為了鑒定Ki67基因啟動(dòng)子的核心功能區(qū)域，對(duì)Ki67基因5'側(cè)翼序列進(jìn)行缺失分析，由PCR方法獲得啟動(dòng)子區(qū)域截短片段，所用的上游引物如表l所示，下游引物為KD1:5'-tgtgaagctttcgaccccgctcct-3'。所有上游引物均含XhoI酶切位點(diǎn)，下游引物含HindIII酶切位點(diǎn)。上游引物分別與下游引物KD1組成一對(duì)引物，以質(zhì)粒pGLBK800為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到8段長(zhǎng)度不同的片段。將這些片段分別與載體pGL3-Basic相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,進(jìn)行抗性篩選及測(cè)序，即得到一系列真核表達(dá)質(zhì)粒pGLBK600、pGLBK400、pGLBK300、pGLBK200、pGLBK100、pGLBK50、pGLBK10、pGLBKN。自5'端逐段缺失所成的截短片段示意圖見圖3。表1自5'端對(duì)Ki67基因5'側(cè)翼行PCR逐段缺失所用上游引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.Ki67基因核心啟動(dòng)子片段克隆Ki67基因啟動(dòng)子核心功能區(qū)域在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和翻譯起始點(diǎn)之間(+l~+772)存在著700多個(gè)堿基，即5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)。通常情況下，長(zhǎng)的5'-UTR對(duì)翻譯起始有阻礙作用[2()]。為進(jìn)一步檢測(cè)該部分對(duì)Ki67基因啟動(dòng)子活性的影響，將pGLBK200質(zhì)粒中的Ki67基因啟動(dòng)子片段自3'端逐段缺失翻譯起始點(diǎn)至轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)間的堿基，構(gòu)建三個(gè)重組載體pGLBK2-、pGLBK2+0、pGLBK2+。質(zhì)粒構(gòu)建上游引物KU200含XhoI酶切位點(diǎn)，序列為5'-ttgtctcgagatgcgtgagtggctcgcc-3'。下游引物含HindIII酶切位點(diǎn)，序列見表2。具體方法同5'端逐段缺失載體的構(gòu)建，其示意圖見圖4。以上所有真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖見圖5。表2自3'端對(duì)Ki67基因啟動(dòng)子核心功能區(qū)域行PCR缺失所用下游引物引物名稱_引物序列_引物位置擴(kuò)增長(zhǎng)度KD25'-tgtgaagcttgtcagccctccactt-3'-26-12212bpKD35'-tgtgaagcttccgcccgcagcgtcagccc-3'國(guó)19-1223bpKD45'-tgtgaagcttccaccgagtcgagtcct-3'+14+30253bp實(shí)施例2細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和人Ki67基因啟動(dòng)子活性分析各實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒(Ki67啟動(dòng)子片段的真核表達(dá)質(zhì)粒)構(gòu)建成功后，用PureYieldPlasmidMidiprepSystem試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒中量提取，同時(shí)提取陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Contro1(含SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、陰性對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Basic(不含SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)以及內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK(HSV-TK啟動(dòng)子控制下表達(dá)海腎素?zé)晒馑孛?。實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒分別稀釋至100ng/]al，內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK稀釋至20一1。本發(fā)明將各實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、膀胱癌細(xì)胞(BIU-87)、腎癌細(xì)胞(Ketr-3)、肺癌細(xì)胞(A549)及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Huvec)，檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。轉(zhuǎn)染方法如下①脂質(zhì)體準(zhǔn)備將脂質(zhì)體(TmnfastReageat)加入400plNuclease-FreeWater,稀釋至l照4tl，劇烈振蕩10秒鐘，37。C水浴中完全溶解，-3(TC過夜；②質(zhì)粒準(zhǔn)備將各實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒、或陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Basic、或陰性對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Control與phRL-TK內(nèi)參照質(zhì)粒按50:1濃度混合(0.5pg:10ng);③脂質(zhì)體質(zhì)?；旌?nl混合質(zhì)粒，用無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基稀釋后加入3pl脂質(zhì)體，終體積為200^1。室溫孵育10分鐘；④細(xì)胞轉(zhuǎn)染24孔板內(nèi)每孔放置1X1()S個(gè)細(xì)胞，在含10%FCS的培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)24h;移除培養(yǎng)基，使用無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基洗滌1遍，每孔加入200W質(zhì)粒脂質(zhì)體混合液，37'C下孵育1小時(shí)；⑤每孔加入含10%FCS無(wú)雙抗培養(yǎng)基800^1，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收獲細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶活性分析。每組樣品4復(fù)孔，進(jìn)行2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)采用美國(guó)Promega公司生產(chǎn)的Dual-LuciferaseReporterAssaySystem試劑盒分析。將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的貼壁細(xì)胞用1XPBS洗滌一次，去盡殘液，加入100^1新鮮配置的PLB，室溫下振蕩15min以裂解細(xì)胞。將細(xì)胞裂解液移至1.5mlEP管中，室溫下13000xg離心lmin，留取上清。取20^1上清加入含10(HilLARlI溶液的1.5ml離心管中，測(cè)定螢火蟲熒光素酶活性，再向同一離心管中加入lOOpl新鮮配制的STOP液，測(cè)定海腎熒光素酶活性(內(nèi)參照)，計(jì)算出兩種熒光素酶活性的比值，即相對(duì)熒光素酶活性。相對(duì)熒光素酶活性代表啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。Ki67基因5'側(cè)翼序列啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性分析Ki67基因5'側(cè)翼序列的真核表達(dá)質(zhì)粒pGLBK800的轉(zhuǎn)錄活性在Hela細(xì)胞、BIU-87細(xì)胞、Ketr-3細(xì)胞、A549細(xì)胞四種人腫瘤細(xì)胞內(nèi)分別達(dá)到SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子活性的21.0%、31.1%、23.9%禾卩7.2%;在人Huvec細(xì)胞沒有表現(xiàn)出明顯活性(表3、圖7)。說(shuō)明我們克隆出的Ki67基因5'側(cè)翼序列包含Ki67基因啟動(dòng)子，且具有較高的啟動(dòng)子活性和腫瘤特異性。表3Ki67基因5'側(cè)翼序列在不同細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性_相對(duì)熒光素酶活性_細(xì)胞pGL3-BasicpGLBK800pGL3-ControlBIU873.4±0.6131.2±20.1(31.1%)b421.8±139.9Hela0.8±0.1105.6±12.6(21.0o/o)b502.5±148.5Kert32.6±0.489.0±16.3(23.9%)b371.9±159.3A5490.5±0.216.3±8.1(7.2%)b225.9±54.4Huvsc1.0±0.40.7±0.2(0.5%)b141.6±17.2與pGL3-Control質(zhì)粒相對(duì)熒光素酶活性的比值Ki67基因啟動(dòng)子核心功能區(qū)域截短片段轉(zhuǎn)錄活性分析我們檢測(cè)了pGLBK800、pGLBK600、pGLBK400、pGLBK300、pGLBK200、pGLBK100、pGLBK50、pGLBK10和pGLBKN9個(gè)重組載體在四種不同來(lái)源的人腫瘤細(xì)胞和一種人正常細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性，對(duì)Ki67基因啟動(dòng)子核心功能區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行研究。在所有腫瘤細(xì)胞中均表現(xiàn)出以下趨勢(shì)pGLBK800、pGLBK600、pGLBK400的啟動(dòng)子活性逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明這一段含有沉默子序列；pGLBK400、pGLBK300、pGLBK200的活性變化不大，均處于峰值，其中pGLBK200活性最高，在腫瘤BIU87細(xì)胞、Ketr3細(xì)胞、Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞中，pGLBK200活性分別達(dá)到SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子活性的58.0。/。、44.1%、22.7%和13.2%，說(shuō)明在這一段沒有明顯影響轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控元件；自pGLBK200縮短到pGLBK50時(shí)，轉(zhuǎn)錄活性顯著下降，表明在這一區(qū)段存在重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；pGLBK10、pGLBKN不表現(xiàn)啟動(dòng)子活性。在正常細(xì)胞中所有重組載體均無(wú)啟動(dòng)子活性，顯示出Ki67啟動(dòng)子良好的腫瘤特異性(表4，圖8，9)。表4Ki67啟動(dòng)子核心功能區(qū)域片段在各細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性相對(duì)熒光素酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>pGLBK105.1±1.23.5±0.410.2±1.82.3±0.60.8±0.1(1.2%)b(0.7%)b(2.7%)b(1.0%)b(0.6%)bpGLBKN4.2±0.83.2±0.48.9±1.22.0±0.50.3±0.1(1.0%)b(0.6%)b(2.4%)b(0.9%)b(0.2%)bb與pGL3-Control質(zhì)粒相對(duì)熒光素酶活性的比值.Ki67基因核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性分析為檢測(cè)Ki67啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)至翻譯起始點(diǎn)間調(diào)控元件對(duì)啟動(dòng)子活性的影響，我們自3'端逐段缺失翻譯起始點(diǎn)至轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)間的堿基，構(gòu)建了三個(gè)重組載體pGLBK2+、pGLBK2+0、pGLBK2-，并檢測(cè)在四種不同來(lái)源的人腫瘤細(xì)胞和一種人正常細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示，在所有的腫瘤細(xì)胞中三個(gè)重組載體啟動(dòng)子活性均較截短片段pGLBK200有很大程度的提高；而在正常細(xì)胞中與pGLBK200—樣轉(zhuǎn)錄活性均較低。由于pGLBK2十(測(cè)序圖譜見圖6)質(zhì)粒包含了完整的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，因此我們把-223+30位置序列確定為Ki67基因核心啟動(dòng)子，命名為Ki67-promoter(見表5、圖10、11)。表5Ki67基因核心啟動(dòng)子片段在各細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>b與pGL3-Control質(zhì)粒相對(duì)熒光素酶活性的比值實(shí)施例3Ki67-promoter、hTERT啟動(dòng)子、Survivin啟動(dòng)子活性比較為進(jìn)一步驗(yàn)證Ki67-promoter轉(zhuǎn)錄活性的大小，我們將其與目前研究較多的兩種腫瘤特異性啟動(dòng)子hTERT、Survivin啟動(dòng)子相比較。實(shí)驗(yàn)方法及步驟同實(shí)施例2。結(jié)果顯示，在所有腫瘤細(xì)胞中，Ki67-promoter的活性均比hTERT和Survivin啟動(dòng)子的活性強(qiáng)，在正常細(xì)胞中，三種啟動(dòng)子均無(wú)活性(見表6、圖12、13)。Ki67-promoter顯示出更好的啟動(dòng)子活性。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>b與pGL3-Con加l質(zhì)粒相對(duì)熒光素酶活性的比值實(shí)施例4Ki67啟動(dòng)子調(diào)控的條件增殖型腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建腫瘤基因治療至今沒有突破的最主要原因是目前所用病毒載體存在兩大缺陷(1)無(wú)增殖能力，導(dǎo)致抗癌基因表達(dá)不足。(2)無(wú)靶向性，導(dǎo)致抗癌基因不能靶向進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。近年來(lái)?xiàng)l件增殖型腺病毒(Conditionallyreplicativeadenovirus,CRAds)治療腫瘤研究取得重大進(jìn)展。CRAds是指只在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖并將其裂解，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響的腺病毒。利用腫瘤特異性啟動(dòng)子控制病毒復(fù)制的必需基因具有特異性強(qiáng)、安全性高和易操作等優(yōu)點(diǎn)而成為CRAds構(gòu)建最常用的一種方法。腺病毒感染細(xì)胞首先表達(dá)E1A基因然后才能復(fù)制。因此利用腫瘤特異啟動(dòng)子控制EIA基因的表達(dá)，就能控制病毒只在具有該啟動(dòng)子活性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，同時(shí)其選擇性增殖能力可使治療基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增，從而顯著增強(qiáng)殺傷腫瘤作用。Ki67啟動(dòng)子在不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞中活性都很高，而在正常細(xì)胞中幾乎沒有活性，因此它可以用于提高基因、病毒治療的安全性和有效性。Ki67-promoter活性強(qiáng)、長(zhǎng)度短，適用于病毒載體基因表達(dá)的特異性調(diào)控。我們將Ki67-promoter插入腺病毒復(fù)制必需基因E1A前面，構(gòu)建Ki67-promoter調(diào)控的條件增殖型腺病毒。為了能夠方便的將該啟動(dòng)子插入包裝病毒用穿梭質(zhì)粒載體中，我們通過設(shè)計(jì)引物引入合適的酶切位點(diǎn)，上游引物序列為5'-ttgtctcgagatgcgtgagtggctcgcc-3'，包含Xhol酶切位點(diǎn)。下游引物序列為5'-tgtgtacgtaccaccgagtcgagtcctcc-3'，包含SnaBI酶切位點(diǎn)。利用此對(duì)引物以pGLBK2+為模板，PCR拉出Ki67-promoter，將該片段純化、酶切后克隆進(jìn)經(jīng)XhoI/SnaBI酶切過的pZXC2質(zhì)粒(E1A啟動(dòng)子被缺失)，命名為pZKi67。平板初步篩選鑒定具有該重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，PCR鑒定并送測(cè)序。PCR電泳結(jié)果可見一大小為273bp的清晰條帶(圖14)，測(cè)序結(jié)果證明Ki67-promoter已定向克隆至pZXC2質(zhì)粒中。若將pZKi67質(zhì)粒與含有腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHGE3同源重組，即可包裝成條件增殖型腺病毒。權(quán)利要求1.一種人腫瘤特異性Ki67基因啟動(dòng)子，其核苷酸序列選自下組(1)SEQIDNO1所示的核苷酸序列，或(2)SEQIDNO1所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，或(3)SEQIDNO1所示的核苷酸序列中任一部分，或發(fā)生一處或多處缺失突變或替換突變，并具有與所述的堿基序列相似的啟動(dòng)子功能的等價(jià)物，即相似的腫瘤特異性和相似程度的啟動(dòng)子活性；其核心啟動(dòng)子存在于SEQIDNO2所示的核苷酸序列中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人腫瘤特異性Ki67基因啟動(dòng)子，其特征在于SEQIDNO:l所示的核苷酸序列中含有至少一個(gè)控制Ki67基因表達(dá)的調(diào)控元件。3.權(quán)利要求1中的腫瘤特異性Ki67基因啟動(dòng)子的用途，其通過控制治療基因表達(dá)，用于腫瘤基因治療與預(yù)防復(fù)發(fā)。4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腫瘤特異性Ki67基因啟動(dòng)子的用途，其特征在于治療基因是血管抑制基因、腫瘤壞死因子基因、腫瘤自殺基因、促細(xì)胞凋亡基因、抑癌基因、細(xì)胞因子基因、反義核苷酸、或小干擾RNA。5.權(quán)利要求l中的腫瘤特異性Ki67啟動(dòng)子的用途，用于增殖病毒介導(dǎo)的腫瘤治療，利用權(quán)利要求l中的任一項(xiàng)腫瘤特異性Ki67啟動(dòng)子調(diào)控病毒增殖相關(guān)基因如腺病毒E1A或E1B，使病毒僅在腫瘤細(xì)胞或組織中特異性的增殖并殺傷腫瘤。6.—種含有Ki67核心啟動(dòng)子的載體，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的腫瘤特異性Ki67啟動(dòng)子。7.根據(jù)權(quán)利要求7所述的含有Ki67核心啟動(dòng)子的載體，其特征在于，它含有所述的啟動(dòng)子調(diào)控的外源基因。8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的含有Ki67核心啟動(dòng)子的載體，其特征在于所述外源基因是報(bào)告基因。全文摘要本發(fā)明公開了人腫瘤細(xì)胞增殖抗原Ki67蛋白編碼基因的啟動(dòng)子，具體包括該啟動(dòng)子的克隆、序列、功能及其用途。本發(fā)明公布了位于Ki67基因5′側(cè)翼-820～+771位置，包含Ki67基因啟動(dòng)子的1591bp的序列。使用缺失分析法分別從Ki67基因5′側(cè)翼的5′端和3′端逐段缺失，得到不同長(zhǎng)度的DNA截短片段，這些片段被插入螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因上游，構(gòu)建一系列表達(dá)質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染四種腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)，確定了Ki67基因核心啟動(dòng)子位于Ki67基因-223～+30。Ki67基因核心啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞內(nèi)具有高轉(zhuǎn)錄活性和腫瘤特異性，是非常有用的腫瘤特異性啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可用于調(diào)控治療基因表達(dá)，或用于構(gòu)建條件增殖病毒，從而實(shí)現(xiàn)選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，廣泛用于腫瘤靶向治療。文檔編號(hào)A61K48/00GK101319215SQ20081002229公開日2008年12月10日申請(qǐng)日期2008年7月1日優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日發(fā)明者劉曉昀,孫方浩,圓李,望李,裴冬生,鄭駿年,東韓申請(qǐng)人:鄭駿年