本發(fā)明涉及免疫領(lǐng)域，特別是涉及一種雙特異性抗體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雙特異性抗體（bispecificantibody，bsab）是含有兩種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人工抗體，能在靶細(xì)胞和功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，產(chǎn)生導(dǎo)向性的效應(yīng)功能，其在免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。肝癌是發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，死亡率較高，分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，目前的治療方法有手術(shù)治療、放射治療等。如何提供一種用于治療肝癌的雙特異性抗體，對于肝癌治療具有重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種雙特異性抗體及其制備方法和應(yīng)用，雙特異性抗體為fc單鏈構(gòu)型，能夠同時(shí)結(jié)合免疫細(xì)胞和肝癌細(xì)胞，提高殺瘤效率。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種雙特異性抗體的制備方法，包括以下步驟：根據(jù)引物擴(kuò)增出抗體的重鏈恒定區(qū)序列、肝癌細(xì)胞表面抗原gpc3對應(yīng)抗體的序列、免疫細(xì)胞表面抗原對應(yīng)抗體的序列，其中，免疫細(xì)胞為nk細(xì)胞或t細(xì)胞，nk細(xì)胞表面抗原為cd16a，t細(xì)胞表面抗原為cd3；擴(kuò)增出的重鏈恒定區(qū)序列的一端和gpc3對應(yīng)抗體的序列具有相同的酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增出的重鏈恒定區(qū)序列的另一端和免疫細(xì)胞表面抗原對應(yīng)抗體的序列具有相同的酶切位點(diǎn)，利用酶切、連接獲得拼接序列；構(gòu)建包含拼接序列的質(zhì)粒，拼接序列為人源化處理后的序列；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，篩選鑒定，以離子色譜法提取雙特異性抗體。
其中，擴(kuò)增所需的引物為：引物1，forword：cccaagcttagctttctggggcgagccgg，酶切位點(diǎn)為hindiii；引物2，reword：ccggaattcgacccactctgcctccctcat，酶切位點(diǎn)為ecori；引物3，forword：ccgctcgagcctagaaccatgtcaccctgacct，酶切位點(diǎn)為xhoi；引物4，reword：cccaagcttcaaggcgcgacagctgccctag，酶切位點(diǎn)為hindiii；引物5，forword：ccgctcgaggtcctgaasgagtctactccctc，酶切位點(diǎn)為xhoi；引物6，reword：cccaagcttctctccacaagcacaacacgca，酶切位點(diǎn)為hindiii；引物7，forword：ccggaattcgctcatatgtagtgtcgagtgcg，酶切位點(diǎn)為ecori；引物8，reword：ctagtctagagggagcagatgacctagaagcag，酶切位點(diǎn)為xbai。
引物1、引物2用于擴(kuò)增抗體的重鏈恒定區(qū)序列，引物3、引物4用于擴(kuò)增cd3對應(yīng)抗體的序列，引物5、引物6用于擴(kuò)增cd16a對應(yīng)抗體的序列，引物7、引物8用于擴(kuò)增gpc3對應(yīng)抗體的序列。
其中，拼接序列為gpc3對應(yīng)抗體的序列-重鏈恒定區(qū)序列-cd16a對應(yīng)抗體的序列或gpc3對應(yīng)抗體的序列-重鏈恒定區(qū)序列-cd3對應(yīng)抗體的序列。
其中，構(gòu)建質(zhì)粒的載體為pcdna6-myc/hisb。
其中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為中國倉鼠卵巢細(xì)胞。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種上述制備方法制備得到的雙特異性抗體。雙特異性抗體為fc單鏈構(gòu)型。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種雙特異性抗體作為殺死肝癌細(xì)胞基因工程藥物的應(yīng)用。具體地，將雙特異性抗體體外負(fù)載免疫細(xì)胞，而后回輸體內(nèi)，以殺傷肝癌細(xì)胞。
本發(fā)明的有益效果是：區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明的雙特異性抗體的制備方法包括以下步驟：根據(jù)引物擴(kuò)增出抗體的重鏈恒定區(qū)序列、肝癌細(xì)胞表面抗原gpc3對應(yīng)抗體的序列、免疫細(xì)胞表面抗原對應(yīng)抗體的序列，其中，免疫細(xì)胞為nk細(xì)胞或t細(xì)胞，nk細(xì)胞表面抗原為cd16a，t細(xì)胞表面抗原為cd3；擴(kuò)增出的重鏈恒定區(qū)序列的一端和gpc3對應(yīng)抗體的序列具有相同的酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增出的重鏈恒定區(qū)序列的另一端和免疫細(xì)胞表面抗原對應(yīng)抗體的序列具有相同的酶切位點(diǎn)，利用酶切、連接獲得拼接序列；構(gòu)建包含拼接序列的質(zhì)粒，拼接序列為人源化處理后的序列；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，篩選鑒定，以離子色譜法提取雙特異性抗體。本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特點(diǎn)：可同時(shí)識別肝癌細(xì)胞表面抗原和免疫細(xì)胞表面抗原，實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的靶向殺傷，同時(shí)，雙特異性抗體作為橋梁連接免疫細(xì)胞和肝癌細(xì)胞，可增加免疫細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的接觸時(shí)間，有效增強(qiáng)免疫細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷作用；由于同時(shí)結(jié)合兩種抗原，可有效激活免疫細(xì)胞，拉近免疫細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的距離，增加效靶比，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的殺瘤能力；以人源化單抗序列為基本序列，fc單鏈構(gòu)型為基本構(gòu)型，人源化的雙特異性抗體可消除人抗鼠抗體反應(yīng)，fc單鏈構(gòu)型可確保雙特異性抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，同時(shí)使其分子量與普通單抗的分子量相似，且延長其在體內(nèi)的半衰期。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
本實(shí)施例雙特異性抗體的制備方法如下：
a.根據(jù)引物擴(kuò)增抗體的重鏈恒定區(qū)序列、gpc3對應(yīng)抗體的序列、cd16a對應(yīng)抗體的序列。其中，gpc3為肝癌細(xì)胞表面抗原，cd16a為nk細(xì)胞表面抗原。
其中，用于擴(kuò)增抗體的重鏈恒定區(qū)序列的引物為：forword：cccaagcttagctttctggggcgagccgg，酶切位點(diǎn)為hindiii；reword：ccggaattcgacccactctgcctccctcat，酶切位點(diǎn)為ecori。
其中，用于擴(kuò)增gpc3對應(yīng)抗體的序列的引物為：forword：ccggaattcgctcatatgtagtgtcgagtgcg，酶切位點(diǎn)為ecori；reword：ctagtctagagggagcagatgacctagaagcag，酶切位點(diǎn)為xbai。
其中，用于擴(kuò)增cd16a對應(yīng)抗體的序列的引物為：forword：ccgctcgaggtcctgaasgagtctactccctc，酶切位點(diǎn)為xhoi；reword：cccaagcttctctccacaagcacaacacgca，酶切位點(diǎn)為hindiii。
其中，在擴(kuò)增過程中，以人血液總rna反轉(zhuǎn)錄的cdna為模板進(jìn)行擴(kuò)增。
在本實(shí)施例中，gpc3即磷脂酰肌醇蛋白聚糖3。
對于擴(kuò)增的序列，利用酶切、連接獲得拼接序列。
其中，獲得的拼接序列是gpc3對應(yīng)抗體的序列-重鏈恒定區(qū)序列-cd16a對應(yīng)抗體的序列。
構(gòu)建包含拼接序列的質(zhì)粒。
對獲得的拼接序列進(jìn)行人源化處理，并利用載體pcdna6-myc/hisb構(gòu)建質(zhì)粒。
將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，篩選鑒定，以離子色譜法提取雙特異性抗體。
其中，使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為中國倉鼠卵巢細(xì)胞。
在實(shí)際應(yīng)用中，提取純化雙特異性抗體后，對其穩(wěn)定性、親和性進(jìn)行分析，而后體外負(fù)載nk細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞因子檢測、殺瘤效率評估、腫瘤相關(guān)基因表達(dá)檢測，當(dāng)符合安全、有效性評估后，回輸患者體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)有效性、特異性殺肝癌細(xì)胞的目的。
以上所述，本實(shí)施例制備的雙特異性抗體為fc單鏈構(gòu)型，可作為殺死肝癌細(xì)胞的基因工程藥物。
實(shí)施例2
本實(shí)施例雙特異性抗體的制備方法如下：
a.根據(jù)引物擴(kuò)增抗體的重鏈恒定區(qū)序列、gpc3對應(yīng)抗體的序列、cd3對應(yīng)抗體的序列。其中，gpc3為肝癌細(xì)胞表面抗原，cd3為t細(xì)胞表面抗原。
其中，用于擴(kuò)增抗體的重鏈恒定區(qū)序列的引物為：forword：cccaagcttagctttctggggcgagccgg，酶切位點(diǎn)為hindiii；reword：ccggaattcgacccactctgcctccctcat，酶切位點(diǎn)為ecori。
其中，用于擴(kuò)增gpc3對應(yīng)抗體的序列的引物為：forword：ccggaattcgctcatatgtagtgtcgagtgcg，酶切位點(diǎn)為ecori；reword：ctagtctagagggagcagatgacctagaagcag，酶切位點(diǎn)為xbai。
其中，用于擴(kuò)增cd3對應(yīng)抗體的序列的引物為：forword：ccgctcgagcctagaaccatgtcaccctgacct，酶切位點(diǎn)為xhoi；reword：cccaagcttcaaggcgcgacagctgccctag，酶切位點(diǎn)為hindiii。
其中，在擴(kuò)增過程中，以人血液總rna反轉(zhuǎn)錄的cdna為模板進(jìn)行擴(kuò)增。
對于擴(kuò)增的序列，利用酶切、連接獲得拼接序列。
其中，獲得的拼接序列是gpc3對應(yīng)抗體的序列-重鏈恒定區(qū)序列-cd3對應(yīng)抗體的序列。
構(gòu)建包含拼接序列的質(zhì)粒。
對獲得的拼接序列進(jìn)行人源化處理，并利用載體pcdna6-myc/hisb構(gòu)建質(zhì)粒。
將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，篩選鑒定，以離子色譜法提取雙特異性抗體。
其中，使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為中國倉鼠卵巢細(xì)胞。
在實(shí)際應(yīng)用中，提取純化雙特異性抗體后，對其穩(wěn)定性、親和性進(jìn)行分析，而后體外負(fù)載cik細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞因子檢測、殺瘤效率評估、腫瘤相關(guān)基因表達(dá)檢測，當(dāng)符合安全、有效性評估后，回輸患者體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)有效性、特異性殺肝癌細(xì)胞的目的。
以上所述，本實(shí)施例制備的雙特異性抗體為fc單鏈構(gòu)型，可作為殺死肝癌細(xì)胞的基因工程藥物。
綜上所述，本發(fā)明的雙特異性抗體具有以下特點(diǎn)：可同時(shí)識別肝癌細(xì)胞表面抗原和免疫細(xì)胞表面抗原，實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的靶向殺傷，同時(shí)，雙特異性抗體作為橋梁連接免疫細(xì)胞和肝癌細(xì)胞，可增加免疫細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的接觸時(shí)間，有效增強(qiáng)免疫細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷作用；由于同時(shí)結(jié)合兩種抗原，可有效激活免疫細(xì)胞，拉近免疫細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的距離，增加效靶比，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的殺瘤能力；以人源化單抗序列為基本序列，fc單鏈構(gòu)型為基本構(gòu)型，人源化的雙特異性抗體可消除人抗鼠抗體反應(yīng)，fc單鏈構(gòu)型可確保雙特異性抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，同時(shí)使其分子量與普通單抗的分子量相似，且延長其在體內(nèi)的半衰期。
以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
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<110>廣州市拜沃思生物科技有限公司
<120>一種雙特異性抗體及其制備方法和應(yīng)用
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