本發(fā)明涉及鏈球菌保護(hù)性抗原，具體為一種馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原h(huán)p0623及其制備方法。

背景技術(shù)：

鏈球菌病是一種極為常見(jiàn)的動(dòng)物致病菌，根據(jù)群特異性抗原可以將其分為20個(gè)群，從a～v，缺i和j。動(dòng)物病原菌以b群鏈球菌(groupbstreptococci,gbs)和c群鏈球菌(groupcstreptococci,gcs)較多，而人的致病菌則多為a群鏈球菌(groupastreptococci,gas)。

馬鏈球菌獸疫亞種(streptococcuszooepidemicus,sez)屬于蘭氏分群的c群鏈球菌，無(wú)宿主專嗜性，易發(fā)生變異，來(lái)源不同的菌株抗原性可能不同。該菌可以經(jīng)消化道、手術(shù)、外傷、注射疫苗和外傷等途徑感染動(dòng)物，從而引起動(dòng)物的敗血癥、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、腦膜炎和心內(nèi)膜炎等動(dòng)物疫病。人則可能通過(guò)與患病動(dòng)物密切接觸或食用該菌污染的食物而引發(fā)該病的感染。青霉素和阿莫西林等抗生素一直被用于預(yù)防和治療此病，但由于抗生素的大量使用，導(dǎo)致該菌耐藥性的產(chǎn)生和動(dòng)物制品中抗生素的殘留等問(wèn)題。因此，采用疫苗來(lái)防治該病才能夠從根本上解決這些問(wèn)題。但是由于滅活的全菌疫苗常會(huì)引起免疫綜合癥等副作用，因此需要研發(fā)新型的亞單位蛋白疫苗來(lái)預(yù)防該類疾病的發(fā)生。細(xì)胞表面錨定的糖結(jié)合蛋白(hp0623)是馬鏈球菌獸疫亞種細(xì)胞表面的一種新發(fā)現(xiàn)的保護(hù)性抗原，其主要作用于宿主細(xì)胞，因此有望被開(kāi)發(fā)為防治sez的亞單位疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原h(huán)p0623及其制備方法，所述一種馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原h(huán)p0623能有效用于防治馬鏈球菌獸疫亞種。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原h(huán)p0623，所述hp0623重組蛋白為sezhp0623重組蛋白(rhp0623)，由sez_0623基因編碼，由429個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為47.04kda，氨基酸序列如seqidno.2所示。

一種馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原h(huán)p0623的制備方法，包含以下步驟：

1)pcr擴(kuò)增：使用馬鏈球菌獸疫亞種sezc55138株基因組為模板，用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

2)與載體連接：pcr產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后與經(jīng)相同酶酶切的pet-32a載體連接；所述的限制性內(nèi)切酶為bamhi和hindiii；

3)轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)：將上述連接好的載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌(e.colibl21)后，置于37℃搖床培養(yǎng)，待其od值為0.6～1.0時(shí)，加入iptg誘導(dǎo)3-5h；

4)純化：離心收集菌體，經(jīng)pbs重懸后，高壓破碎后離心收集上清，將上清液的目的蛋白經(jīng)過(guò)ni-nta層析柱進(jìn)行純化獲得純化的hp0623重組蛋白。

所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物各有1個(gè)酶切位點(diǎn)。

進(jìn)一步地，所述引物為：

正向引物(seqidno.3)：5’-cccggatccgcttgcctgctagtg-3’，劃線部分為bamhi酶切位點(diǎn)；

反向引物(seqidno.4)：5’-ctcaagcttgaggggaagatcgtatc-3’，劃線部分為hindiii酶切位點(diǎn)；

馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原h(huán)p0623在制備馬鏈球菌獸疫亞種疫苗中的應(yīng)用。

應(yīng)用所述馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原h(huán)p0623制備馬鏈球菌獸疫亞種疫苗的方法為：將成功表達(dá)并經(jīng)過(guò)純化處理的重組蛋白，即馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原h(huán)p0623，與montanidegel01pr(seppic，france)佐劑乳化后作為疫苗，疫苗中所述重組蛋白濃度為100μg/ml，所述濃度為疫苗中重組蛋白的最低有效濃度。

本發(fā)明的技術(shù)效果為：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)基因克隆、表達(dá)、純化等步驟得到純化的馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原h(huán)p0623重組蛋白。本發(fā)明首先通過(guò)pcr技術(shù)獲取目的基因，通過(guò)酶切酶連的方法獲得重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)hp0623重組蛋白，經(jīng)蛋白免疫印記試驗(yàn)，表明該重組蛋白具有良好的免疫原性。hp0623重組蛋白經(jīng)佐劑乳化后免疫小鼠可以為其提供較高的保護(hù)效力，二免小鼠血清可以為小鼠提供較好的被動(dòng)免疫保護(hù)。經(jīng)rhp0623重組蛋白免疫后的小鼠血清經(jīng)elisa測(cè)定其抗體滴度，表明重組蛋白可誘發(fā)高水平的抗體滴度，且免疫反應(yīng)類型以th2為主。hp0623重組蛋白抗體可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的殺菌能力，當(dāng)sez感染小鼠后，在其脾臟組織中所提取的sez的sez_0623基因的轉(zhuǎn)錄水平要高于體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)錄水平，rhp0623可以抑制sez對(duì)hep-2細(xì)胞的粘附和侵染。

附圖說(shuō)明

圖1.表示hp0623蛋白的sds-page和免疫印記圖。

圖1中，泳道1～3分別為重組大腸桿菌誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后和純化后的hp0623蛋白；泳道m(xù)為蛋白預(yù)染marker。

泳道4為rhp0623與sez感染康復(fù)豬血清的westernblot檢測(cè)結(jié)果。

圖2、圖3為重組蛋白免疫小鼠后在小鼠體內(nèi)引起的免疫反應(yīng)elisa檢測(cè)結(jié)果圖。

圖2中為免疫組和陰性對(duì)照組的抗體水平比較；圖3中為hp0623誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)類型比較。

圖4表示免疫組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠，經(jīng)sez攻毒后，小鼠的存活率對(duì)比圖。

圖5表示rhp0623二免血清(實(shí)驗(yàn)組)、sez滅活疫苗二免血清(陽(yáng)性對(duì)照組)和正常血清(陰性對(duì)照組)為小鼠提供被動(dòng)免疫保護(hù)的情況對(duì)比圖。

圖6.顯示了定量pcr的分析結(jié)果圖。

圖6中從左至右分別為三只小鼠各自脾臟內(nèi)細(xì)菌基因表達(dá)情況。

圖7、圖8為.流式細(xì)胞術(shù)分析hp0623在sez的表面分布圖。

圖9.表示小鼠全血致死使用結(jié)果對(duì)比圖。

圖9中，1為實(shí)驗(yàn)組、2為陽(yáng)性對(duì)照組和3為陰性對(duì)照組。

圖10.sez對(duì)hep-2細(xì)胞的粘附檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖來(lái)做進(jìn)一步說(shuō)明。

本發(fā)明實(shí)施例中采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法和條件，未在本發(fā)明中條件是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

實(shí)施例一、菌株與生長(zhǎng)條件

菌株為sezc55138菌株；培養(yǎng)條件為加入5％胎牛血清的tsb培養(yǎng)基或tsa培養(yǎng)基；在37℃震蕩培養(yǎng)約8h，或od600達(dá)到0.6～1.0。載體為大腸桿菌pet-32a，感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌bl21。

所述sezc55138菌株，大腸桿菌pet-32a、胎牛血清和大腸桿菌bl21感受態(tài)細(xì)胞均為市售產(chǎn)品。

實(shí)施例二、制備方法

hp0623蛋白由sez_0623基因編碼，所述hp0623基因正向引物有1個(gè)bamhi酶切位點(diǎn)，反向引物有1個(gè)hindiii酶切位點(diǎn)。所述正向和反向引物由sez基因組序列設(shè)計(jì)，由引物合成公司合成。

馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原h(huán)p0623的制備方法，包含以下步驟：

1)pcr擴(kuò)增：使用c55138菌株的基因組作為模板，使用下述引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增：

正向引物(seqidno.3)：5’-cccggatccgcttgcctgctagtg-3’，劃線部分為bamhi酶切位點(diǎn)；

反向引物(seqidno.4)：5’-ctcaagcttgaggggaagatcgtatc-3’，劃線部分為hindiii酶切位點(diǎn)；

2)與載體連接：pcr產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶酶切后與經(jīng)相同酶酶切的pet-32a載體連接；

3)轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)：將上述連接好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞bl21后，在37℃恒溫?fù)u床中待其到指數(shù)生長(zhǎng)期，加入終濃度為1mm的iptg，誘導(dǎo)3h；同時(shí)做非誘導(dǎo)對(duì)照試驗(yàn)。

4)純化：離心收集誘導(dǎo)后菌體，用無(wú)菌pbs重懸后經(jīng)高壓破碎，離心收集重組蛋白上清，將上清液中的目的蛋白經(jīng)過(guò)ni-nta層析柱純化后獲得的純化的重組蛋白。

免疫印記分析：純化后的重組蛋白，使用感染過(guò)sez的康復(fù)豬血清作為一抗，山羊抗豬igg(h+l)-hrp作為二抗進(jìn)行免疫印跡分析。

所述的c55138菌株的基因組由常規(guī)方法從c55138菌株中提取得到。

引物由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成，所述限制性內(nèi)切酶為bamhi和hindiii。

iptg即異丙基-β-d-硫代半乳糖苷，是β-半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)。基于這個(gè)特性，帶有l(wèi)acz基因載體dna以lacz缺失細(xì)胞為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，它可以作為具有l(wèi)ac或tac等啟動(dòng)子的表達(dá)載體的表達(dá)誘導(dǎo)物使用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

pcr得到sez_0623的基因序列(seqidno.1)，將sezc55138菌株sez_0623基因克隆后，表達(dá)出了429個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(seqidno.2)，分子量為47.04kda。比較誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)菌，可以證明成功表達(dá)了目的蛋白，且目的蛋白的條帶大小與預(yù)測(cè)的大小一致。通過(guò)ni-nta親和層析的方式獲得純化的重組蛋白，通過(guò)免疫分析實(shí)驗(yàn)表明，該蛋白與感染sez的康復(fù)期豬血清表現(xiàn)出良好的免疫反應(yīng)性，如圖1所示，hp0623蛋白大小與預(yù)測(cè)的大小一致，且其具有良好的免疫反應(yīng)原性。

實(shí)施例三、抗體滴度測(cè)定

通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定小鼠血清抗體igg，將純化的重組蛋白hp0623于4℃過(guò)夜包被后，將二免免疫10天后的小鼠采血分離血清，梯度倍比稀釋后，所有稀釋度均取100μl加入酶聯(lián)板，37℃反應(yīng)后加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗鼠igg，待顯色完成后終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取od值，取od值大于對(duì)照血清平均od值+3倍方差sd(標(biāo)準(zhǔn)差)的血清最大稀釋倍數(shù)作為血清抗體。為了推斷免疫類型，進(jìn)一步檢測(cè)igg1和igg2a以確定th2和th1的免疫反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

免疫組的igg滴度的水平顯著高于陰性對(duì)照組的抗體水平，如圖2所示免疫組的抗體滴度明顯高于陰性對(duì)照組。

結(jié)果表明hp0623可以引起顯著的th1/th2免疫反應(yīng)，與產(chǎn)生的igg2抗體相比，igg1抗體滴度占主導(dǎo)地位，如圖3所示在hp0623誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)類型中，th2反應(yīng)占主導(dǎo)地位。

實(shí)施例四、小鼠免疫接種與攻毒試驗(yàn)

1、取30只6～8周齡km雌鼠，隨機(jī)分為3組，每組10只；

2、實(shí)驗(yàn)組：50μg純化的rhp0623用montanidegel01pr(seppic，france)佐劑乳化后，腹腔注射免疫第一組小鼠，間隔14天后，用同樣的方式和劑量對(duì)小鼠進(jìn)行二次免疫；

3、陽(yáng)性對(duì)照組：將sezc55138株滅活，經(jīng)montanidegel01pr(seppic，france)佐劑乳化后，以1×10⁹cfu/ml免疫第二組小鼠，采用腹腔注射的方式，間隔14日后，同樣的方式進(jìn)行二次免疫；

4、陰性對(duì)照組：第三組10只小鼠均腹腔注射經(jīng)montanidegel01pr(seppic，france)佐劑乳化的pbs做對(duì)照；

5、所有小鼠二次免疫10天后，尾靜脈采血離心收集血清，然后所有小鼠均攻毒sezc55138菌株(2×10⁵cfu/ml)；

6、觀察并記錄所有小鼠的生長(zhǎng)情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1)實(shí)驗(yàn)組的10只小鼠，攻毒后第三天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，存活的小鼠表現(xiàn)出輕微的臨床癥狀，如精神狀態(tài)較差，消瘦，在6天內(nèi)即全部恢復(fù)正常，最終有4只小鼠死亡；

2)陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠總體均未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，整個(gè)攻毒期間只有1只小鼠出現(xiàn)死亡；

3)陰性對(duì)照組的小鼠在攻毒后第二天即開(kāi)始死亡，存活的小鼠表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，如被毛零亂，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，不好動(dòng)等，并在攻毒后6天內(nèi)逐漸死亡，最終只有1只存活。

如圖4所示，陽(yáng)性對(duì)照組和免疫組均能為小鼠提供較高的免疫保護(hù)，且陽(yáng)性對(duì)照組要高于實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果表明重組rhp0623蛋白可以為小鼠提供免疫保護(hù)，抵御sez強(qiáng)毒株的感染。

實(shí)施例五、被動(dòng)保護(hù)試驗(yàn)分析

為了證實(shí)保護(hù)是歸功于hp0623特殊的刺激免疫反應(yīng)，用rhp0623二免血清被動(dòng)免疫小鼠，然后再進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。

1、30只6周齡km雌鼠，隨機(jī)分為3組，每組10只；

2、陽(yáng)性對(duì)照組：用sez滅活疫苗二免血清靜脈注射免疫第一組小鼠；

3、陰性對(duì)照組：用正常小鼠血清靜脈注射免疫第二組小鼠；

4、實(shí)驗(yàn)組：用rhp0623二免血清靜脈注射免疫第三組小鼠；

5、免疫24h后，所有小鼠均用sezc55138菌株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)(2×10⁵cfu/ml)；

6、觀察并記錄所有小鼠的生長(zhǎng)情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1)陽(yáng)性對(duì)照組小鼠在攻毒試驗(yàn)中均未表現(xiàn)出臨床癥狀，整個(gè)攻毒期間有1只小鼠最終死亡；

2)陰性對(duì)照組小鼠在攻毒后主要表現(xiàn)為精神萎靡，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲緩、被毛粗亂等癥狀，且在3天內(nèi)均陸續(xù)死亡；

3)實(shí)驗(yàn)組小鼠在攻毒后主要表現(xiàn)為精神萎靡，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲緩、被毛粗亂等癥狀，但3天后基本恢復(fù)正常，小鼠的最終的存活率為70％。

如圖5所示，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)小鼠的被動(dòng)保護(hù)能力明顯強(qiáng)于陰性對(duì)照組。

實(shí)施例六、熒光定量pcr分析

為了評(píng)估sezsez_0623基因在小鼠體內(nèi)外的表達(dá)水平，通過(guò)熒光定量pcr技術(shù)定量檢測(cè)sez_0623基因體內(nèi)外的轉(zhuǎn)錄水平。

1、從感染sez的小鼠脾臟內(nèi)獲得體內(nèi)增殖細(xì)菌，無(wú)菌收集脾臟組織，碾磨后于4℃，850×g離心5min，取上層清液于4℃，15500×g離心5min，沉淀即為脾臟組織內(nèi)的細(xì)菌；體外培養(yǎng)的細(xì)菌待其生長(zhǎng)到指數(shù)中期后離心收集沉淀即可；

2、用酸酚法提取細(xì)菌總rna；

3、將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdnas，以cdna樣品為模板進(jìn)行定量pcr反應(yīng)，所有反應(yīng)進(jìn)行三個(gè)重復(fù)；

在實(shí)時(shí)熒光定量pcr中，使用下述引物對(duì)sez_0623基因進(jìn)行定量分析：

正向引物(seqidno.5)：5’-cggtatagtatagccaagc-3’；

反向引物(seqidno.6)：5’-gcatttctcccaacga-3’；

在實(shí)時(shí)熒光定量pcr中，使用下述引物對(duì)16srrna基因進(jìn)行定量分析：

正向引物(seqidno.5)：5’-atccgaactgagattggc-3’；

反向引物(seqidno.6)：5’-cccttatgacctgggcta-3’；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖6所示，結(jié)果表明小鼠脾臟內(nèi)提取的sez的sez_0623基因的轉(zhuǎn)錄水平要明顯高于體外培養(yǎng)的sez的轉(zhuǎn)錄水平。

實(shí)施例七、流式細(xì)胞術(shù)分析

1、用pbs/bsa(含1％bsa的pbs)重懸細(xì)菌，取菌液200μl；

2、實(shí)驗(yàn)組加入經(jīng)rhp0623免疫的小鼠血清100μl，對(duì)照組加入經(jīng)pbs免疫的小鼠血清100μl，4℃孵育15min，然后室溫孵育30min；

3、5000rpm離心3min，收集細(xì)菌；

4、用pbs/bsa洗3次，加入fitc-山羊抗鼠二抗，室溫下孵育45min；

5、用pbs/bsa洗3次，用500μl的pbs重懸，加入到流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖7、圖8所示，相對(duì)于空白對(duì)照組，sezhp0623抗體能在sez表面引起更加強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，對(duì)照組細(xì)菌平均熒光強(qiáng)度較弱，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌的平均熒光強(qiáng)度有較大的提升，表明hp0623蛋白分布于sez的表面。

實(shí)施例八、全血致死量分析

為測(cè)定hp0623抗體的殺菌活性，吧小鼠血液肝素化后，使用rhp0623二免血清或?qū)φ昭迮c血液中存活的sez孵育后進(jìn)行評(píng)估。

1、待sezc55138菌株生長(zhǎng)至指數(shù)中期，離心收集菌體，用無(wú)菌pbs將細(xì)菌濃度調(diào)整為10⁴cfu/ml；

2、陽(yáng)性對(duì)照組：取900μl健康小鼠經(jīng)肝素抗凝全血，與100μlsez滅活疫苗二免血清混合；

3、陰性對(duì)照組：取900μl健康小鼠經(jīng)肝素抗凝全血，與100μl正常小鼠血清混合；

4、實(shí)驗(yàn)組：取900μl健康小鼠經(jīng)肝素抗凝全血，與100μl重組rhp0623二免血清混合；

5、分別向混合液中加入100μlsez菌液，置于37℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)90min；

6、每組分別取100μl樣品，涂布于tsa平板中，進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，計(jì)算孵化前后存活的細(xì)菌量；

7、存活率計(jì)算為剩下細(xì)菌量相對(duì)于開(kāi)始細(xì)菌量的百分比。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

陰性對(duì)照組殺菌率為9.21±1.29％；陽(yáng)性對(duì)照組殺菌率為91.6±1.35％；實(shí)驗(yàn)組殺菌率為61.08±1.60％。

如圖9所示，結(jié)果表明anti-rhp0623抗體可以誘導(dǎo)高水平的殺菌能力，anti-hp0623抗體能夠?qū)ez具有較強(qiáng)的殺傷能力。

實(shí)施例九、粘附抑制試驗(yàn)

為檢測(cè)hp0623對(duì)sez粘附hep-2細(xì)胞的影響，通過(guò)hep-2細(xì)胞的粘附試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，主要步驟如下：

1、在24孔板中加入含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)hep-2細(xì)胞，將其置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其長(zhǎng)至80％左右；

2、使用預(yù)冷的pbs/bsa洗滌細(xì)胞3次；

3、每孔加入200μg/ml的純化的rsec_205孵育2h，相同的細(xì)胞加入200μg/ml的bsa孵育作為對(duì)照組；

4、孵育完成后，用pbs/bsa洗滌3次，然后向各孔中加入1ml5×10⁷cfu/ml的sezc55138株在37℃，5％co2條件下孵育2h；

5、用pbs/bsa洗去未粘附的細(xì)菌，然后用1mlpbs(含0.2％的tritonx-100)將細(xì)胞吹散，稀釋后平板計(jì)數(shù)；

6、hp0623對(duì)sez粘附hep-2細(xì)胞的抑制率通過(guò)如下公式計(jì)數(shù)：

抑制率＝[1-(hp0623處理的細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)/bsa處理的細(xì)胞的細(xì)菌數(shù))]×100％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：rhp0623能夠抑制sez對(duì)hep-2細(xì)胞的粘附，如圖10所示，相較于對(duì)照組，抑制率為14.9％。

從上述實(shí)施例可以看出，本發(fā)明所述馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原h(huán)p0623的制備方法，包括目的基因克隆、酶切酶連、誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白純化。重組hp0623蛋白經(jīng)蛋白免疫印記分析，表明其具有良好的免疫反應(yīng)原性。重組蛋白免疫后的小鼠血清中抗體滴度明顯高于陰性對(duì)照組小鼠，且免疫小鼠產(chǎn)生的抗體類型中，igg1滴度要高于igg2a。rhp0623免疫小鼠后可以為小鼠提供較強(qiáng)的保護(hù)效力，anti-rhp0623小鼠二免血清對(duì)小鼠有明顯的被動(dòng)保護(hù)力，anti-rhp0623抗體可以誘導(dǎo)高水平的殺菌能力。sez_0623基因在sez感染的小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平要高于體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)錄水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，hp0623位于sez表面，rhp0623可以抑制sez對(duì)hep-2細(xì)胞的粘附，抑制率為14.9％。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為本發(fā)明專利范圍的限制。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變性和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>湖北大學(xué)

<120>一種馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原h(huán)p0623及其制備方法

<130>2017.5

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>753

<212>dna

<213>馬鏈球菌獸疫亞種

<400>1

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caacaaaagcacaaaaaaggcttagactcatcagccactattttagacgaattaggacgt660

gtgatttctgacattagtggtcataaaggtatgcttccttttaatcgtaagatcagcttt720

aaagcacatcaggtcagatacgatcttcccctc753

<210>2

<211>429

<212>prt

<213>馬鏈球菌獸疫亞種

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151015

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130135140

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420425

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<400>5

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<213>人工序列primer32

<400>8

cccttatgacctgggcta18