專利名稱：表達(dá)馬鏈球菌獸疫亞種類m蛋白的重組豬痘病毒載體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種重組豬痘病毒載體疫苗，具體而言，涉及一種表達(dá)馬鏈球菌獸疫亞種(SEZ)類M蛋白(SzP)的重組豬痘病毒(rSPV-SzP)載體疫苗，該疫苗能提供針對SEZ的免疫保護(hù)作用，及減少養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。
背景技術(shù)：
gljli求胃·禾中(Streptococcus equi subsp zooepidemicus SEZ) 鏈球菌病的重要病原之一，同時(shí)也是一種重要的人畜共患病病原。其引發(fā)的豬鏈球菌病曾在我國華南、西南和華東等地區(qū)廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成較大的危害，豬鏈球菌病也是嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的一種重要的細(xì)菌性傳染病，并可引起人類的感染。類 M 蛋白(M_Like Protein)是馬鏈球菌獸疫亞種(Sti^ptococcus equi subsp zooepidemicus SEZ)細(xì)胞壁表面一種纖絲狀表面蛋白，是該菌重要的毒力因子和保護(hù)性抗原(Timoney J F，Walker J，Zhou M，et al. Cloning and sequence analysis of a protective M-Iike gene from streptococcus equi subsp. Zooepidemicus. Infect， Immune，1995，63 :1440-1445)。馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白(SzP)高度抗酸，具有多種生物學(xué)功會邑(Timoney JFiArliushin SC,Boschwitz JS. Comparison of the sequences and functions of Streptococcus equi M-Iike protein Sem and SzPse. Infect Immun,1997, 65(9) :3600 3605)。其表面有調(diào)理素表位，能剌激機(jī)體產(chǎn)生抗調(diào)理素抗體(Timoney JF， Mukhtar M. Varability in the M proteins of the equine strains of Streptococcus equi subsp zooepidemicus，P. 15 20In W. PlowrightiP D Rossdale,and J F Wade(ed)， Equine Infectious diseases VI， Cambridge 1991， R&W Publications， Newmarket, Englmd)；能抑制補(bǔ)體C3b在菌體表面沉積，從而抑制機(jī)體補(bǔ)體系統(tǒng)的活化(Boschwitz JS, Timoney JF. Inhibition of C3 deposition of Streptococcus equi by M protein a mechanism for survival in equine blood. Infect Immun,1994，62 :3515 3520)； 能結(jié)合機(jī)體的纖維蛋白原，使其具有抗吞噬細(xì)胞的吞噬活性(Boschwitz JS，Timoney JF. Characterization of the antiphagocytic activity of equine fibrinogen for Streptococcus, zooepidemicus. Microb Pathog，1994，17 :121 129)。類 M 蛋白與 SEZ 致病性和機(jī)體的免疫保護(hù)作用密切相關(guān)，一直是研制鏈球菌疫苗的焦點(diǎn)。重組痘病毒載體疫苗已經(jīng)有近30年的安全應(yīng)用，作為表達(dá)載體，痘病毒有許多特有的優(yōu)點(diǎn)(1)凍干疫苗較穩(wěn)定、費(fèi)用低、容易進(jìn)行生產(chǎn)和使用。(2)疫苗有多種用藥途徑， 包括口服，尤其是針對野生動物進(jìn)行免疫預(yù)防時(shí)。(3)痘病毒作為基因重組活疫苗的載體， 不需佐劑即可免疫動物，病毒在體內(nèi)增殖過程中產(chǎn)生的外源蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，不僅誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，而且誘導(dǎo)很強(qiáng)的細(xì)胞免疫。接種一次就能獲得長期的免疫效果，能誘導(dǎo)抗外來抗原的抗體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。(4)基因組容易組裝，允許大片段的基因丟失或刪除，以及外源DNA的插入.(5)重組痘病毒疫苗能區(qū)分天然感染和接種的動物并與之兼容。(6)與其它哺乳動物病毒表達(dá)載體相比，被表達(dá)的外源蛋白在感染細(xì)胞中能
3忠實(shí)地進(jìn)行修飾具有較高的表達(dá)效率。通過對動物接種重組痘病毒的辦法，能了解外源蛋白對個(gè)體的作用以及機(jī)體的免疫應(yīng)答。應(yīng)用重組痘病毒已經(jīng)成功地表達(dá)了來源于動植物，乃至人類的許多種基因。表達(dá)抗原基因的重組痘病毒作為基因重組疫苗。目前用作表達(dá)載體的痘病毒主要有痘苗病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒等。使用豬痘病毒作為載體構(gòu)建重組疫苗迄今尚無成功報(bào)道，更無利用重組豬痘病毒載體表達(dá)馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白基因的重組疫苗的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研制一種能夠有效控制豬鏈球菌病的重組疫苗。一方面，本發(fā)明提供了一種重組豬痘病毒(rSPV-SzP)，該重組豬痘病毒是在豬痘病毒載體中插入本發(fā)明所述SzP基因重組制備得到的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述SzP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明通過動物免疫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的重組豬痘病毒能夠在免疫動物體內(nèi)大量增殖，表達(dá)目的蛋白SzP，能夠誘導(dǎo)動物體內(nèi)產(chǎn)生較高效價(jià)的抗體，并對免疫動物產(chǎn)生良好的保護(hù)作用因此，另一方面，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，其中含有本發(fā)明所述的重組豬痘病毒和一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體或佐劑。該重組豬痘病毒包含豬痘病毒載體和本發(fā)明所述的SzP基因。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的SzP基因具有如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的豬痘病毒載體為VR-363。另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述的重組豬痘病毒及含有其的疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療馬鏈球菌獸醫(yī)亞種引發(fā)的疾病的藥物中的用途，優(yōu)選用于制備預(yù)防和/ 或治療馬鏈球菌獸醫(yī)亞種引發(fā)的豬鏈球菌病的藥物中的用途。本發(fā)明所述聯(lián)合免疫的接種途徑包括但不限于肌肉注射等。另一方面，本發(fā)明提供了一種制備重組豬痘病毒的方法，該方法包括(1)利用特異性引物對擴(kuò)增馬鏈球菌獸疫亞種(SEZ)類M蛋白(SzP)的編碼基因；(2)把SzP基因克隆入穿梭載體pUSZll/P28M中，然后通過PCR和酶切鑒定，獲得含有SzP基因的穿梭載體PUSZ11/P28S ；(3)讓含有SzP基因的穿梭載體pUSZl 1/P28S與豬痘病毒同源重組，獲得重組豬痘病毒 rSPV-SzP。(4)純化重組豬痘病毒rSPV-SzP。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述特異性引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述讓含有SzP基因的穿梭載體pUSZl 1/P28S 與豬痘病毒同源重組具體操作為用豬痘病毒(SPV)感染PK15單層細(xì)胞，2小時(shí)后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法加入穿梭載體PUSZ11/P28S，二者發(fā)生同源重組。PK15細(xì)胞在常規(guī)條件下培養(yǎng)4 天后，反復(fù)凍融3次，獲得最初的重組豬竇病毒rSPV-SzP。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述純化重組豬痘病毒rSPV-SzP的具體操作為將所述重組豬痘病毒rSPV-SzP經(jīng)倍比稀釋，接種PK15單層細(xì)胞，使其在3_4天內(nèi)形成獨(dú)立的藍(lán)色噬斑，挑取單獨(dú)的病毒噬斑，適當(dāng)稀釋后再次接種PK15單層細(xì)胞，重復(fù)6次，直至最后得到的重組豬痘病毒能夠穩(wěn)定遺傳。另一方面，本發(fā)明提供了一種將上述重組豬痘病毒制成疫苗的方法，該方法包括(1)將純化的重組豬痘病毒rSPV-SzP在PK15細(xì)胞上連續(xù)傳代30次，檢測其SzP 基因的表達(dá)情況，至SzP穩(wěn)定表達(dá)，且重組豬痘病毒的毒價(jià)穩(wěn)定在106PFU/mL。(2)在擴(kuò)大培養(yǎng)過程中取用保存的rSPV-SzP按5M0I接種長成單層的PK15細(xì)胞， 當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)70-90%時(shí)收毒，經(jīng)反復(fù)凍融2次，即可獲得表達(dá)SzP的重組豬痘病毒載體疫
田ο有益效果1.本發(fā)明首次成功構(gòu)建了表達(dá)SzP的重組豬痘病毒，該重組豬痘病毒突破了 SEZ 常規(guī)滅活疫苗和弱毒疫苗的局限性。該重組疫苗兼具弱毒疫苗的復(fù)制特性和滅活疫苗的安全性，而且對人、豬等動物沒有致病性，容易通過安全性評價(jià)。2.試驗(yàn)證明，本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)SzP的重組豬痘病毒對外源蛋白表達(dá)穩(wěn)定，種毒的毒價(jià)穩(wěn)定在106PFU/mL。通過小鼠免疫試驗(yàn)和攻毒保護(hù)試驗(yàn)證明了該重組豬痘病毒產(chǎn)生了針對SEZ的抗體，對ICR小鼠的免疫保護(hù)率高達(dá)62. 5%。3.重組豬痘病毒對動物不致病，并可以通過多種途徑進(jìn)行傳播，能夠使混養(yǎng)豬發(fā)生感染。這種特性可以使沒有免疫或漏免的豬也獲得免疫，使群體的抗體水平較一致，能夠更好的抵抗外源病毒的攻擊。與現(xiàn)在應(yīng)用的SEZ的弱毒疫苗和滅活疫苗相比，該病毒能在豬體內(nèi)復(fù)制增殖并且不斷表達(dá)SzP蛋白，使機(jī)體持續(xù)受到SzP的刺激，不斷產(chǎn)生針對SzP的中和抗體，這樣就能對豬體提供持久的保護(hù)力，因此在SEZ的防治方面具有廣闊的應(yīng)用前
旦
ο
四

圖1為穿梭載體PUSZ11/P28S結(jié)構(gòu)示意圖。其中，LF和RF分別為豬痘病毒的左、 右同源交換序列；Pll和P28為痘病毒啟動子；LacZ為報(bào)告基因；szp為目的蛋白基因圖2圖示的是免疫小鼠血清抗體效價(jià)測定結(jié)果。圖3圖示的是攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果下列實(shí)施例的給出是為了更好地理解和闡述本發(fā)明，而決不應(yīng)理解為對本發(fā)明的任何限制。除另有說明外，本申請中的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。本申請中引用的任一專利、專利申請和出版物在此引入作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例ISzP基因的擴(kuò)增、克隆、鑒定和測序分析1. IPCR引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)SEZ標(biāo)準(zhǔn)毒株ATCC 35246的基因序列設(shè)計(jì)了一對針對SzP基因(GenBank EU624402)的特異性引物，在引物的5’端分別含有限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI的酶切位點(diǎn)。引物由上海invitrogen生物公司合成。SzPl 5' -gtc gac gat tct gtt gag tea get aag-3' (SEQ ID NO 1)SzP2 5' -gga tcc tta tta gtt ttc ttt gcg tct tg_3，(SEQ ID NO :2)。L2PCR 擴(kuò)增取2*Taq PCR Mix 25. O μ L, SzPll. O μ L，SzP21. Ομ L, SEZ 菌(ATCC35246)液 3. O μ L，用無菌超純水補(bǔ)至總體積50. O μ L0在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性 5min ；94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸lOmin。 PCR產(chǎn)物進(jìn)行(g/mL)瓊脂糖凝膠電泳。1. 3PCR產(chǎn)物回收與純化PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切下含目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，用 DNA快速回收純化試劑盒回收凝膠中的目的片段。具體操作步驟按Geneaid公司凝膠回收試劑盒的說明書進(jìn)行。1. 4PCR產(chǎn)物酶切與純化酶切反應(yīng)總體積為40 μ L =PCR 回收片段 30. OyL, 10XT buffer 6. 0 μ L, BamHI 2. 0 μ L, Sail 2. Ομ L。37°C作用3. 0h，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行回收，方法同上。1. 5pUSZll/P28M 酶切純化酶切反應(yīng)總體積為40yL :pUSZll/P28M 質(zhì)粒 30. 0yL，10XT buffer 6. 0 μ L, BamHI2. OyL, Sail 2. 0 μ L。37°C作用3. Oh,然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行回收，方法同上。1. 6目的片段SzP與酶切pUSZll/P28M的連接酶切回收PCR產(chǎn)物6. 0μ L，載體pUSZll/P28M酶切回收產(chǎn)物2. 0μ L，10*Τ4連接酶緩沖液1. 0 μ L，T4DNA連接酶1. 0 μ L，混勻各產(chǎn)物后在16°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α。1. 7大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)菌的制備和轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)菌的制備及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化過程詳見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。1. 8重組質(zhì)粒的提取和鑒定用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒pUSZll/P28S并用PCR和雙酶切鑒定，在PCR和雙酶切鑒定中都可以見到目的條帶。1. 9目的基因SzP序列分析測序工作由invitrogen公司協(xié)助完成。測序結(jié)果如SEQ ID NO 3所示，克隆入的基因完全符合載體閱讀框要求。實(shí)施例2重組豬痘病毒的制備及測定2. 1PK15細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)與凍存在37°C水浴中輕輕振蕩融化一管凍存的PK15細(xì)胞；用70%的酒精仔細(xì)洗滌外壁后放入超凈工作臺中；把細(xì)胞轉(zhuǎn)入一個(gè)無菌的15mL的離心管中，加入10%血清的MEM，600g 離心5min，以沉淀細(xì)胞；棄去上清，用10. OmL的10%的新生牛血清的MEM重懸細(xì)胞，然后加入IOOmL的細(xì)胞瓶中；37°C 5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至形成單層，再用胰酶在室溫下消化l-3min分離細(xì)胞；輕敲細(xì)胞瓶壁使細(xì)胞移動，用倒置顯微鏡來觀察細(xì)胞是否變圓和分離；用新的營養(yǎng)液對細(xì)胞按需要分瓶。為了保存細(xì)胞亞型的特殊表型，建立細(xì)胞貯存庫的細(xì)
6胞密度必須低于50%。把健康生長處于對數(shù)期的細(xì)胞完全消化下來；離心，沉淀細(xì)胞；用少量含10%血清的MEM重懸細(xì)胞；用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行記數(shù)；用50% MEM+10% DMS0+40%新生牛血清使每毫升細(xì)胞密度達(dá)到1 X IO6個(gè)；在1. SmL的凍存管分裝1. OmL的細(xì)胞；把凍存管放在泡沫盒內(nèi)置低溫冰箱24h ；24h后迅速把低溫冰箱的細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮中。2. 2重組豬痘病毒的獲取用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法使穿梭載體PUSZ11/P28S與豬痘病毒(SPV)株VR-363 (購自 ATCC)發(fā)生同源重組。提前一天將PK15細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，使其長成單層細(xì)胞。先用0. 05M0I的SPV感染PK15單層細(xì)胞，Ih后將脂質(zhì)體與穿梭載體的混合液加入到 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。PK15細(xì)胞繼續(xù)在37°C 5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，待能看到明顯的病毒噬斑后，將其反復(fù)凍融3次，收獲重組豬痘病毒rSPV-SzP原液。2. 3重組豬痘病毒的噬斑純化在6孔細(xì)胞板的每一個(gè)孔接種3. OX IO5個(gè)細(xì)胞，5 %的二氧化碳溫箱中靜止培養(yǎng)；待細(xì)胞長成完全單層后，把重組病毒原液按1 5倍比稀釋接種到單層細(xì)胞上，37°C吸附1. 5h ；棄去感染液，用DHanks緩沖液輕輕地洗兩次；在一無菌的100. OmL的玻璃瓶中加入10. OmL的2XMEM和10. OmL的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖，充分混勻后置37°C水浴鍋中；按每孔 3. OmL加入6孔板中，37°C 5 %的二氧化碳溫箱中靜止培養(yǎng)3_5天，觀察噬斑；待能觀察到明顯的噬斑后，按每孔2. OmL加入含80 μ g/mL X-gal和2%低熔點(diǎn)瓊脂糖的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1-2天，重組病毒中的LacZ基因充分表達(dá)后，病毒噬斑部分將會形成藍(lán)色的斑點(diǎn)；用滅菌槍頭挑取含藍(lán)色噬斑的瓊脂糖凝膠塊放入無菌離心管中，加入200. 0μ L的無菌 PBS，將瓊脂塊搗碎后反復(fù)凍融三次；12000rpm離心5min ；收獲的病毒接種于一新的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，重復(fù)7次。2. 4重組豬痘病毒滴度的測定按病毒學(xué)操作手冊介紹的方法，用含青霉素和鏈霉素的DHanks緩沖液將病毒作 10倍梯度稀釋。然后分別接種于長滿PK15細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度接種 8個(gè)孔，每孔接種100 μ L。同時(shí)設(shè)定陰、陽性對照。3715%0)2溫箱培養(yǎng)2h后，換維持液繼續(xù)培養(yǎng)。逐日觀察細(xì)胞病變，并按Reed-Muech法計(jì)算病毒滴度。滴度為106 24PFU/mL。2. 5PCR檢測重組豬痘病毒取出同步接種重組豬痘病毒的PK15細(xì)胞和接種野生型豬痘病毒的PK15細(xì)胞各一管，用Geneaid病毒核酸提取試劑盒按其說明提取病毒DNA，以提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR 檢測SzP基因。結(jié)果表明重組豬痘病毒中含有SzP基因片段，而對照的豬痘病毒野毒中擴(kuò)增不出SzP基因。2. 6ffestern bloting檢測目的蛋白SzP的表達(dá)按5M0I將重組豬痘病毒rSPV-SzP接種到PK15細(xì)胞單層上，37°C 5%的二氧化碳溫箱中培養(yǎng)2天，使病毒大量增殖；棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，并用滅菌PBS沖洗兩次，加入少量滅菌 PBS，用細(xì)胞刮子將單層細(xì)胞刮下，收獲細(xì)胞；反復(fù)凍融兩次，使重組豬竇病毒充分釋放，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，同時(shí)設(shè)SPV野毒感染的陰性對照和PK15細(xì)胞空白對照；再將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上；然后用5%脫脂奶封閉，置4°C冰箱中過夜；次日將膜放入含1 5000稀釋的含一抗(SzP單抗)的封閉液中置37°C搖床中50rpm作用lh，將膜取出用TBST洗三次，每次5min，再將膜放入含1 10000稀釋的含酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記的SPA)的封閉液中，同樣條件作用lh，再用TBST洗三次，每次5min，將膜放入“沉淀型TMB單組份底物”中，使其顯色。結(jié)果表明目的蛋白SzP在重組豬痘病毒中有較高效率的表達(dá)，而在陰性對照和空白對照中則沒有目的蛋白出現(xiàn)。2. 7間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上接種PK15細(xì)胞，使其長成細(xì)胞單層；用DHanks緩沖液將重組豬痘病毒進(jìn)行稀釋，按15PFU/孔接種細(xì)胞，同時(shí)設(shè)定陰性對照；在37°C 5%的二氧化碳溫箱中溫育60h ；棄去營養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞，然后棄去PBS ；加入-20°C預(yù)冷的甲醇，固定 IOmin ；用PBST沖洗3次后加入含10% BSA的PBST，37°C封閉Ih ；加入抗SzP的單抗，37°C 孵育Ih ；PBST沖洗3次，加入羅丹明標(biāo)記的羊抗小鼠IgG-R 二抗，37°C作用0. 5h ；最后用 PBST沖洗3次后，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果表明A組接種了重組豬痘病毒，感染的PK15細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)了明顯的熒光； 而陰性對照組B組接種了豬痘病毒野毒，未觀察到熒光。實(shí)施例3重組豬痘病毒疫苗的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)3. 1重組豬痘病毒的小白鼠免疫試驗(yàn)取32只4周齡健康清潔級ICR小白鼠隨機(jī)分成四組，每組8只；一組用2*107PFU 的重組豬痘病毒rSPV-SzP肌肉注射免疫，其余三組分別為用野生型豬痘病毒免疫的陰性對照、用滅活的ATCC 35246菌體免疫的陽性對照及用PBS免疫的空白對照；在初次免疫后的第14天和第35天按相同方法分別進(jìn)行二免和三免；每天觀察實(shí)驗(yàn)小鼠，以記錄其免疫反應(yīng)；在初次免疫的前一天及第6、13、20、27、34、41和48天小鼠眼眶采血，分離血清，用間接 ELISA法測其抗體效價(jià)。結(jié)果見圖2。結(jié)果表明重組豬竇病毒免疫的小鼠血清抗體效價(jià)明顯高于其他三組。3. 2攻毒保護(hù)試驗(yàn)最后一次免疫后兩周，所有的小鼠均腹腔接種對數(shù)生長期的SEZ 0. 2mL，約為5倍的LD50(5*104CFU)；每天觀察小鼠的變化，并記錄死亡率，連續(xù)觀察10天；10天仍未死亡的小鼠，施以安樂死；對死亡小鼠進(jìn)行剖檢并分離病原菌，染色及PCR檢測均證明是馬鏈球菌獸疫亞種。結(jié)果(圖3)表明重組豬痘病毒疫苗對小鼠的免疫保護(hù)率可高達(dá)62. 5%。綜上所述，本發(fā)明所述的重組豬痘病毒疫苗能夠在免疫動物體內(nèi)大量增殖，表達(dá)目的蛋白SzP，能夠誘導(dǎo)動物體內(nèi)產(chǎn)生較高效價(jià)的抗體，并對免疫動物產(chǎn)生良好的保護(hù)作用，是一種理想的新型疫苗。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和/或治療馬鏈球菌獸疫亞種引發(fā)疾病的疫苗組合物，其中含有重組豬痘病毒和一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體或佐劑，該重組豬痘病毒包含豬痘病毒載體和馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的編碼基因。
2.權(quán)利要求1中所述的重組豬痘病毒，該重組豬痘病毒包含豬痘病毒載體和馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的編碼基因。
3.權(quán)利要求1或2所述的疫苗組合物，其中所述的馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
4.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其中所述的豬痘病毒載體為VR-363。
5.權(quán)利要求2所述的重組豬痘病毒在制備用于預(yù)防和/或治療馬鏈球菌獸疫亞種引發(fā)疾病的藥物中的用途。
6.權(quán)利要求5所述的用途，其中所述的馬鏈球菌獸疫亞種引發(fā)疾病為豬鏈球菌病。
7.一種制備重組豬痘病毒的方法，該方法包括(1)利用特異性引物對擴(kuò)增馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的編碼基因；(2)把SzP基因克隆入穿梭載體pUSZl1/P28M中，然后通過PCR和酶切鑒定，獲得含有 SzP基因的穿梭載體pUSZll/P28S ；(3)讓含有SzP基因的穿梭載體pUSZll/P28S與豬痘病毒同源重組，獲得重組豬痘病毒 rSPV-SzP。(4)純化重組豬痘病毒rSPV-SzP。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的特異性引物對的核苷酸序列分別如SEQID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示
9.權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述的讓含有SzP基因的穿梭載體PUSZ11/P28S 與豬痘病毒同源重組的具體操作為用豬痘病毒(SPV)感染PK15單層細(xì)胞，2小時(shí)后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法加入穿梭載體PUSZ11/P28S，二者發(fā)生同源重組。PK15細(xì)胞在常規(guī)條件下培養(yǎng) 4天后，反復(fù)凍融3次，獲得最初的重組豬竇病毒rSPV-SzP。
10.權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的純化重組豬痘病毒rSPV-SzP的具體操作為將所述重組豬痘病毒rSPV-SzP經(jīng)倍比稀釋，接種PK15單層細(xì)胞，使其在3_4 天內(nèi)形成獨(dú)立的藍(lán)色噬斑，挑取單獨(dú)的病毒噬斑，適當(dāng)稀釋后再次接種PK15單層細(xì)胞，重復(fù)6次，直至最后得到的重組豬痘病毒能夠穩(wěn)定遺傳。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種重組疫苗，其中含有重組豬痘病毒和一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體和/或佐劑，該重組豬痘病毒包含豬痘病毒載體和馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的編碼基因。本發(fā)明所述的重組豬痘病毒疫苗能夠在免疫動物體內(nèi)大量增殖，表達(dá)目的蛋白SzP，能夠誘導(dǎo)動物體內(nèi)產(chǎn)生較高效價(jià)的抗體，并對免疫動物產(chǎn)生良好的保護(hù)作用。
文檔編號A61P31/04GK102198268SQ20111007656
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月29日
發(fā)明者范紅結(jié), 藺輝星, 陸承平 申請人:范紅結(jié), 藺輝星, 陸承平