專利名稱：一種海豚鏈球菌三價dna疫苗及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及疫苗學領域，具體的說是一種海豚鏈球菌三價DNA疫苗及其構建方法。
背景技術：
海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)是一種革蘭氏陽性菌,能夠感染多種養(yǎng)殖海水和淡水魚類，包括牙鲆、羅非魚、石斑、美國紅魚等，因此長期以來在我國以及國際上被認為是一種主要魚類病原菌。另外，海豚鏈球菌是一種人畜共患性病原，能夠通過患病動物而 傳染人類，因此其免疫防治研究具有重要意義。目前，由于缺乏有效的疫苗，我國海豚鏈球菌病防治主要依賴抗生素等藥物的使用。在這種情況下，針對該菌的有效疫苗研發(fā)已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種海豚鏈球菌三價DNA疫苗及其構建方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為一種海豚鏈球菌三價DNA疫苗，以海豚鏈球菌G26為模板分別經(jīng)引物F1/R1、F2/R2 和F3/R3進行PCR擴增，產(chǎn)物與載體pCN3質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒等體積混合，即為三價DNA
疫苗；所述引物為Fl :5，-CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3 ‘ ；Rl :5’ -CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3’ ；F2 :5’ -CCCGGGACCACCATGAGTTTTATCGAGATTCAAA-3 ；R2 :5’ -GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’ ； F3 :5， -CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3，；R3 :5 ’ -CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3，。以海豚鏈球菌G26為模板分別經(jīng)引物Fl/Rl、F2/R2和F3/R3進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物分別于用SmaI酶切的質(zhì)粒pCN3連接，連接液分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后分別在含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，所得轉(zhuǎn)化子等體積混合，即為三價DNA疫苗。海豚鏈球菌三價DNA疫苗的構建方法，以海豚鏈球菌G26為模板分別經(jīng)引物Fl/Rl、F2/R2和F3/R3進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物分別于用SmaI酶切的質(zhì)粒pCN3連接，連接液分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后分別在含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，所得轉(zhuǎn)化子等體積混合，即為三價DNA疫苗；所述引物為Fl :5，-CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3 ‘ ；Rl :5’ -CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3’ ；
F2 :5’ -CCCGGGACCACCATGAGTTTTATCGAGATTCAAA-3 ；R2 :5’ -GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’ ；F3 :5， -CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3，；R3 :5，-CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3，。所述三價DNA疫苗在PBS中稀釋至終濃度為150 μ g/ml,即為疫苗制備液。本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明的三價DNA疫苗在免疫后一個月和兩個月時對海豚鏈球菌感染的保護效應高達90%以上。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而 非以任何形式對本發(fā)明進行限制。在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法I.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應試劑盒。2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)；3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于“北京，紐英倫生物技術有限公司”。實施例I三價DNA疫苗S3D的構建I)質(zhì)粒pCNF的構建以海豚鏈球菌G26為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增，PCR條件為94°C 60s預變性模板DNA，然后94°C 40s, 50°C 60s, 72°C 60s，5個循環(huán)后改為94°C 40s, 62°C 60s, 72°C 60s, 25個循環(huán)后再在72°C延伸反應lOmin。PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化。將質(zhì)粒pCN3(pCN3構建過程參見Jiao XD, Zhang M，Hu YH,Sun L. Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tardaantigens. Vaccine 2009 ；27 :5195 202.)用 SmaI 酶切，回收 5. 4kb 片段，將其與上述純化的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含氨芐青霉素(100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pCNF。所述菌株G26保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCJi址北京市海淀區(qū)中關村北一條13號，保藏日期2007年3月22日。保藏編號為CGMCCNo. 1984,分類命名為海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)。所述弓丨物為Fl :5’ -CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3’和 Rl :5’ -CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3，。所述LB組成成分按重量百分比計I. O %蛋白胨，0. 5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5%蒸餾水·2)質(zhì)粒pCNG的構建pCNG的構建過程與上述pCNF的構建完全相同，唯一區(qū)別在于所用 PCR 引物為 F2 :5’ -CCCGGGACCACCATGAGTITTATCGAGATTCAAA-3’ 和 R2 :5’ -GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’。3)質(zhì)粒pCNI的構建pCNI的構建過程與上述pCNF的構建完全相同，唯一區(qū)別在于所用 PCR 引物為 F3 :5’ -CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3’ 和 R3 :5’ -CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3，。4)三價DNA疫苗S3D的構建將上述質(zhì)粒pCNF、pCNG和pCNI以等比例混合，即為三價DNA疫苗S3D。實施例2疫苗的應用步驟I)疫苗制備液的制備。將上述DNA疫苗S3D在PBS中稀釋至終濃度為150 μ g/ml，即為疫苗制備液。
所述PBS組成成分按重量百分比計0. 8 % NaCl,O. 02 % KCl,O. 358 %Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO4,余量為水。步驟2)疫苗的接種。將100條牙鲆(每條重約11. 4g)隨機分為4組，每組25條。將這4組分別命名為A、B、C和D。將A和C組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟I)的疫苗制備液，將B和D組(對照組)的每條魚分別腹腔注射IOOul PBS。步驟3)海豚鏈球菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)海豚鏈球菌G26至0D600為
O.9，然后離心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為lxl08cfu/ml，即為海豚鏈球菌懸液。步驟4)疫苗的免疫保護效應檢測。在步驟2)免疫注射后的第30天，用上述步驟3)的海豚鏈球菌懸液腹腔注射步驟2)的A和B組魚，每條魚的注射量為IOOul ;在步驟2)免疫注射后的第60天，用上述步驟3)的海豚鏈球菌懸液腹腔注射步驟2)的C和D組魚，每條魚的注射量為lOOul。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目A組，2條；B組，22條；C組，2條；D組，20條。利用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS)RPS = IOOx (I-免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)故三價DNA疫苗S3D在免疫后一個月和兩個月時對海豚鏈球菌的免疫保護效率分別為91%和90%。由此得出DNA疫苗S3D對海豚鏈球菌具有非常好的免疫保護效應。
權利要求
1.一種海豚鏈球菌三價DNA疫苗，其特征在于以海豚鏈球菌G26為模板分別經(jīng)引物Fl/Rl、F2/R2和F3/R3進行PCR擴增，產(chǎn)物與載體pCN3質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒等體積混合，即為三價DNA疫苗； 所述引物為Fl :5’ -CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3 ‘ ；Rl :5’ -CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3’ ；F2 :5’ -CCCGGGACCACCATGAGTTTTATCGAGATTCAAA-3 ；R2 :5’ -GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’ ；F3 :5’ -CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3’ ；R3 :5’ -CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3’。
2.按權利要求I所述的海豚鏈球菌三價DNA疫苗，其特征在于以海豚鏈球菌G26為模板分別經(jīng)引物F1/R1、F2/R2和F3/R3進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物分別于用SmaI酶切的質(zhì)粒PCN3連接，連接液分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后分別在含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，所得轉(zhuǎn)化子等體積混合，即為三價DNA疫苗。
3.—種權利要求I所述的海豚鏈球菌三價DNA疫苗的構建方法，其特征在于以海豚鏈球菌G26為模板分別經(jīng)引物Fl/Rl、F2/R2和F3/R3進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物分別于用SmaI酶切的質(zhì)粒PCN3連接，連接液分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后分別在含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，所得轉(zhuǎn)化子等體積混合，即為三價DNA疫苗； 所述引物為Fl :5’ -CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3 ‘ ；Rl :5’ _CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3’ ；F2 :5’ -CCCGGGACCACCATGAGTTTTATCGAGATTCAAA-3 ；R2 :5’ -GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’ ；F3 :5’ -CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3’ ；R3 :5’ -CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3’。
4.權利要求I所述的海豚鏈球菌三價DNA疫苗的構建方法，其特征在于所述三價DNA疫苗在PBS中稀釋至終濃度為150 μ g/ml,即為疫苗制備液。
全文摘要
本發(fā)明涉及疫苗學領域，具體的說是一種海豚鏈球菌三價DNA疫苗及其構建方法。以海豚鏈球菌G26為模板分別經(jīng)引物F1/R1、F2/R2和F3/R3進行PCR擴增，產(chǎn)物與載體pCN3質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒等體積混合，即為三價DNA疫苗；本發(fā)明所得疫苗在免疫后一個月和兩個月時對海豚鏈球菌感染的保護效率高達90％以上。
文檔編號A61K39/116GK102716499SQ201210152378
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權日2012年5月16日
發(fā)明者孫云, 孫黎, 胡永華 申請人:中國科學院海洋研究所