專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)生肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae)莢膜多糖的縮短的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及自肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)血清型的細(xì)胞溶解產(chǎn)物去除過(guò)多可溶蛋白和其它雜質(zhì)的方法，所述方法用于產(chǎn)生純化的肺炎球菌多糖。

背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌是革蘭氏(Gram)陽(yáng)性刀形球菌，其通常成對(duì)出現(xiàn)(雙球菌)，但也可以短鏈形式或單細(xì)胞形式出現(xiàn)。其易于在血液瓊脂板上生長(zhǎng)為閃光菌落并表現(xiàn)α溶血，而在厭氧生長(zhǎng)時(shí)其表現(xiàn)β溶血。其對(duì)可裂解細(xì)胞壁的膽汁鹽以及細(xì)胞自身的酶(自溶素)的存在敏感。所述有機(jī)體是兼性厭氧菌并且由于其具有復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)需求，因此其需要復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)。
大多數(shù)肺炎球菌血清型的細(xì)胞具有莢膜，其為每個(gè)細(xì)胞周?chē)亩嗵前?。由于此莢膜可通過(guò)阻止抗體附接至細(xì)菌細(xì)胞來(lái)干擾吞噬作用，因此其為人類(lèi)的毒力決定因素?，F(xiàn)已確認(rèn)90種莢膜血清型，其中23種血清型引發(fā)約90％的侵襲性疾病。多糖作為疫苗可賦予具有已發(fā)育或未受損免疫系統(tǒng)的個(gè)體以適當(dāng)程度的針對(duì)肺炎鏈球菌的免疫力。然而，當(dāng)使多糖與諸如CRM197等高分子量蛋白質(zhì)偶聯(lián)并將其調(diào)配為含有多血清型偶聯(lián)物的疫苗時(shí)，所述偶聯(lián)疫苗使得可在肺炎球菌感染的風(fēng)險(xiǎn)同樣為最高的嬰兒和老人體內(nèi)引發(fā)免疫應(yīng)答。
用于疫苗產(chǎn)品的每種肺炎鏈球菌血清型的莢膜多糖都是通過(guò)在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)有機(jī)體來(lái)產(chǎn)生。經(jīng)常使所述有機(jī)體種群自一個(gè)種瓶放大至多個(gè)種瓶，并使其通過(guò)一或多個(gè)可增加體積的種發(fā)酵罐直至發(fā)酵體積達(dá)到生產(chǎn)規(guī)模?？赏ㄟ^(guò)一或多種方式來(lái)確定生長(zhǎng)周期的終點(diǎn)，在此時(shí)通過(guò)添加洗滌劑或其它可幫助裂解細(xì)胞壁并釋放自溶素的試劑來(lái)溶解細(xì)胞，所述自溶素可在細(xì)胞到達(dá)靜止期時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞溶解。然后收獲培養(yǎng)液用于下游(純化)處理。主要污染物是細(xì)胞蛋白、核酸、C-多糖和培養(yǎng)基組份。對(duì)于當(dāng)前市售7-價(jià)肺炎球菌偶聯(lián)(7vPnC)疫苗(普雷夫那(Prevnar)

)以及新研發(fā)的13-價(jià)肺炎球菌偶聯(lián)(13vPnC)疫苗的大多數(shù)血清型來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有純化方法需要十六個(gè)步驟，其涉及許多昂貴的、勞動(dòng)密集的并且需要技術(shù)性的操作，例如色譜法和多膜分離。先前改良用于肺炎鏈球菌多糖的純化方法的嘗試包括(例如)在發(fā)酵和回收期間調(diào)節(jié)pH(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)案第2006/0228381號(hào))和溶劑與洗滌劑沉淀。然而，在這些方法中去除雜質(zhì)仍需要多個(gè)勞動(dòng)密集的高成本步驟。由于可溶蛋白的物理和化學(xué)特性，蛋白質(zhì)含量是最難滿足的技術(shù)要求。
因此，業(yè)內(nèi)需要可降低肺炎鏈球菌溶解產(chǎn)物中的可溶蛋白質(zhì)含量并且不具有現(xiàn)有純化方法無(wú)效性的經(jīng)簡(jiǎn)化純化方法，以產(chǎn)生適合納入肺炎球菌偶聯(lián)疫苗中的基本上純化的莢膜多糖。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及自肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)生基本上純化的莢膜多糖的方法。所述方法包含以下步驟 (a)提供包含可產(chǎn)生所選肺炎鏈球菌血清型的細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液； (b)用溶解劑溶解步驟(a)中的細(xì)菌細(xì)胞，由此產(chǎn)生包含細(xì)胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細(xì)胞溶解產(chǎn)物； (c)使用離心或過(guò)濾來(lái)去除細(xì)胞碎片以澄清步驟(b)中的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，由此產(chǎn)生澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物； (d)超濾并透析過(guò)濾步驟(c)中的澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物以去除低分子量雜質(zhì)并提高多糖濃度，由此產(chǎn)生滲余物； (e)使步驟(d)中滲余物的pH降低至4.5以下以使蛋白質(zhì)與核酸沉淀，由此形成酸化滲余物溶液； (f)將步驟(e)中形成的酸化滲余物溶液保持足夠長(zhǎng)時(shí)間以使沉淀物沉降，之后過(guò)濾或離心酸化滲余物溶液，由此產(chǎn)生澄清多糖溶液； (g)通過(guò)活性炭過(guò)濾器過(guò)濾步驟(f)中的澄清多糖溶液； (h)超濾并透析過(guò)濾步驟(g)產(chǎn)生的經(jīng)過(guò)濾溶液，由此產(chǎn)生經(jīng)濃縮純化多糖溶液；和 (i)使用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾步驟(h)產(chǎn)生的經(jīng)濃縮純化多糖溶液； 由此產(chǎn)生呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。本發(fā)明此實(shí)施例中所選實(shí)例性非限制性肺炎鏈球菌血清型是1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一特定實(shí)施例中，步驟(e)的pH降低至約3.5。在另一實(shí)施例中，步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約5.5至約7.5之間。在另一實(shí)施例中，步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.0至約7.5之間。在另一實(shí)施例中，步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.4。在又一實(shí)施例中，步驟(e)自步驟(d)的滲余物去除至少98％的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，步驟(g)自步驟(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，步驟(g)的活性炭過(guò)濾器包含木質(zhì)磷酸-活性炭。在另一實(shí)施例中，步驟(f)包含將步驟(e)中形成的酸化滲余物溶液保持至少2小時(shí)。在又一實(shí)施例中，步驟(b)中的溶解劑為脫氧膽酸鈉(DOC)。在另一實(shí)施例中，步驟(b)中的溶解劑為非動(dòng)物源性溶解劑。在又一實(shí)施例中，步驟(b)中的溶解劑為非動(dòng)物源性溶解劑N-月桂酰肌氨酸鈉(NLS)。
通過(guò)本發(fā)明方法自肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)生的基本上純化的莢膜多糖可用于產(chǎn)生肺炎球菌疫苗，優(yōu)選地產(chǎn)生含有與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)的多糖的肺炎球菌疫苗。
本發(fā)明也涉及自包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)生基本上純化的莢膜多糖的方法。所述方法包含以下步驟 (a)提供包含可產(chǎn)生肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液； (b)用溶解劑溶解步驟(a)中的細(xì)菌細(xì)胞，由此產(chǎn)生包含細(xì)胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細(xì)胞溶解產(chǎn)物； (c)使用離心或過(guò)濾來(lái)去除細(xì)胞碎片以澄清步驟(b)中的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，由此產(chǎn)生澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物； (d)在室溫和中性pH下于無(wú)鹽介質(zhì)中超濾并透析過(guò)濾步驟(c)中的澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物以去除低分子量雜質(zhì)并提高多糖濃度，由此產(chǎn)生無(wú)鹽滲余物； (e)使步驟(d)中無(wú)鹽滲余物的pH降低至4.5以下以使蛋白質(zhì)與核酸沉淀，由此形成酸化滲余物溶液； (f)將步驟(e)中形成的酸化滲余物溶液在室溫下保持至少2小時(shí)以使沉淀物沉降，之后過(guò)濾或離心酸化滲余物溶液，由此產(chǎn)生澄清多糖溶液； (g)通過(guò)活性炭過(guò)濾器過(guò)濾步驟(f)中的澄清多糖溶液； (h)超濾并透析過(guò)濾步驟(g)產(chǎn)生的經(jīng)過(guò)濾溶液，由此產(chǎn)生經(jīng)濃縮純化多糖溶液；和 (i)使用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾步驟(h)產(chǎn)生的經(jīng)濃縮純化多糖溶液； 由此產(chǎn)生包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。在一特定實(shí)施例中，步驟(e)的pH降低至約3.5。在另一實(shí)施例中，步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約5.5至約7.5之間。在另一實(shí)施例中，步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.0至約7.5之間。在另一實(shí)施例中，步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.4。在又一實(shí)施例中，步驟(e)自步驟(d)的滲余物去除至少98％的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，步驟(g)自步驟(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，步驟(g)的活性炭過(guò)濾器包含木質(zhì)磷酸-活性炭。在又一實(shí)施例中，步驟(b)中的溶解劑為脫氧膽酸鈉(DOC)。在另一實(shí)施例中，步驟(b)中的溶解劑為非動(dòng)物源性溶解劑。在又一實(shí)施例中，步驟(b)中的溶解劑為非動(dòng)物源性溶解劑N-月桂酰肌氨酸鈉(NLS)。
本發(fā)明也涉及自包含血清型19A的肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)生基本上純化的莢膜多糖的方法。所述方法包含以下步驟 (a)提供包含可產(chǎn)生肺炎鏈球菌血清型19A的細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液； (b)用溶解劑溶解步驟(a)中的細(xì)菌細(xì)胞，由此產(chǎn)生包含細(xì)胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細(xì)胞溶解產(chǎn)物； (c)使用離心或過(guò)濾來(lái)去除細(xì)胞碎片以澄清步驟(b)中的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，由此產(chǎn)生澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物； (d)在約4℃和約6的pH下于磷酸鈉緩沖液中超濾并透析過(guò)濾步驟(c)中的澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物以去除低分子量雜質(zhì)并提高多糖濃度，由此產(chǎn)生滲余物； (e)使步驟(d)中滲余物的pH降低至4.5以下以使蛋白質(zhì)與核酸沉淀，由此形成酸化滲余物溶液； (f)將步驟(e)中形成的酸化滲余物溶液在約4℃下保持至少2小時(shí)以使沉淀物沉降，之后過(guò)濾或離心酸化滲余物溶液，由此產(chǎn)生澄清多糖溶液； (g)將步驟(f)中的澄清多糖溶液的pH調(diào)節(jié)至約6，由此產(chǎn)生pH經(jīng)調(diào)節(jié)的澄清多糖溶液； (h)通過(guò)活性炭過(guò)濾器過(guò)濾步驟(g)中的pH經(jīng)調(diào)節(jié)的澄清多糖溶液； (i)超濾并透析過(guò)濾步驟(h)中產(chǎn)生的經(jīng)過(guò)濾溶液，由此產(chǎn)生經(jīng)濃縮純化多糖溶液；和 (j)使用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾步驟(i)中產(chǎn)生的經(jīng)濃縮純化多糖溶液； 由此產(chǎn)生包含血清型19A的呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。在一特定實(shí)施例中，步驟(e)的pH降低至約3.5。在另一實(shí)施例中，步驟(i)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約5.5至約7.5之間。在另一實(shí)施例中，步驟(i)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.0至約7.5之間。在另一實(shí)施例中，步驟(i)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.4。在又一實(shí)施例中，步驟(e)自步驟(d)的滲余物去除至少98％的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，步驟(h)自步驟(g)的pH經(jīng)調(diào)節(jié)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，步驟(h)的活性炭過(guò)濾器包含木質(zhì)磷酸-活性炭。在另一實(shí)施例中，步驟(d)中的磷酸鈉緩沖液為25mM磷酸鈉。在又一實(shí)施例中，步驟(b)中的溶解劑為脫氧膽酸鈉(DOC)。在另一實(shí)施例中，步驟(b)中的溶解劑為非動(dòng)物源性溶解劑。在又一實(shí)施例中，步驟(b)中的溶解劑為非動(dòng)物源性溶解劑N-月桂酰肌氨酸鈉(NLS)。



圖1展示使用本發(fā)明縮短的純化方法時(shí)血清型5的平均工序間多糖(PS)產(chǎn)率、蛋白質(zhì)/PS比率、和核酸(NA)/PS比率。展示每個(gè)純化步驟的結(jié)果。
圖2展示得自現(xiàn)有純化方法的血清型4 PS NMR波譜(A)與得自縮短純化方法的血清型4PS NMR波譜(B)的對(duì)比。在兩個(gè)波譜間未觀察到顯著差異。兩個(gè)波譜中從右邊數(shù)第二個(gè)峰都為丙酮酸鹽，并且在兩個(gè)波譜中丙酮酸鹽基團(tuán)的峰高相當(dāng)。
圖3展示使用本發(fā)明縮短純化方法時(shí)血清型4的平均工序間PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)/PS比率、和NA/PS比率。展示每個(gè)純化步驟的結(jié)果。
圖4展示使用本發(fā)明縮短純化方法時(shí)血清型19A的平均工序間PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)/PS比率、和NA/PS比率。展示每個(gè)純化步驟的結(jié)果。
圖5展示使用本發(fā)明縮短純化方法時(shí)血清型7F的平均工序間PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)/PS比率和NA/PS比率。展示每個(gè)純化步驟的結(jié)果。
圖6展示使用本發(fā)明縮短純化方法時(shí)血清型6B的平均工序間PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)/PS比率和NA/PS比率。展示每個(gè)純化步驟的結(jié)果。
圖7展示使用本發(fā)明縮短純化方法時(shí)血清型6A的平均工序間PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)/PS比率和NA/PS比率。展示每個(gè)純化步驟的結(jié)果。
圖8展示使用本發(fā)明縮短純化方法時(shí)血清型1的平均工序間PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)/PS比率和NA/PS比率。展示每個(gè)純化步驟的結(jié)果。
圖9展示使用本發(fā)明縮短純化方法時(shí)血清型14的平均工序間PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)/PS比率和NA/PS比率。展示每個(gè)純化步驟的結(jié)果。
圖10展示使用本發(fā)明縮短純化方法純化的血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F的工序間PS產(chǎn)率的對(duì)比。
圖11展示使用本發(fā)明縮短純化方法純化的血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F的蛋白質(zhì)/PS比率的對(duì)比。比較每個(gè)純化步驟的結(jié)果。
圖12展示使用本發(fā)明縮短純化方法純化的血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F的NA/PS比率的對(duì)比。比較每個(gè)純化步驟的結(jié)果。
圖13展示本發(fā)明縮短純化方法中酸化步驟產(chǎn)生的蛋白質(zhì)去除效率。相對(duì)于酸化前初始蛋白質(zhì)濃度繪示血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F批次酸化前后蛋白質(zhì)濃度(SDS-PAGE)的差異。用蛋白質(zhì)濃度差異除以初始蛋白質(zhì)濃度來(lái)反應(yīng)酸化步驟的蛋白質(zhì)去除率。
圖14展示本發(fā)明縮短純化方法中炭吸附步驟產(chǎn)生的蛋白質(zhì)去除效率。相對(duì)于初始蛋白質(zhì)載量繪示血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F批次的蛋白質(zhì)去除(吸附在炭上)量。用蛋白質(zhì)去除量除以初始蛋白質(zhì)載量來(lái)反映炭吸附步驟的蛋白質(zhì)去除率。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明涉及可在肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物中降低可溶蛋白質(zhì)含量以產(chǎn)生適合納入肺炎球菌偶聯(lián)疫苗中的基本上純化的莢膜多糖的縮短純化方法。對(duì)于當(dāng)前市售7-價(jià)肺炎球菌偶聯(lián)(7vPnC)疫苗(普雷夫那

)以及新研發(fā)的13-價(jià)肺炎球菌偶聯(lián)(13vPnC)疫苗的大多數(shù)血清型來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有多糖純化方法需要多達(dá)十六個(gè)步驟。這些步驟涉及許多昂貴的、勞動(dòng)密集的并且需要技術(shù)性的操作，例如色譜法和多膜分離。本發(fā)明方法在達(dá)成相同純化的同時(shí)取消了這些步驟中的多達(dá)八個(gè)步驟，并且不需要實(shí)施色譜法。因此，本發(fā)明涉及更有效的純化方法，其成本較低，用時(shí)較短，并且涉及的步驟較少。
本發(fā)明縮短的純化方法涉及以下發(fā)現(xiàn)超濾并透析過(guò)濾澄清肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物培養(yǎng)液，之后將經(jīng)濃縮溶解產(chǎn)物培養(yǎng)液的pH酸化至4.5以下，優(yōu)選地酸化為約3.5，從而可沉淀溶液中至少98％的蛋白質(zhì)而不嚴(yán)重影響多糖產(chǎn)率。通過(guò)超濾并透析過(guò)濾經(jīng)溶解的澄清發(fā)酵培養(yǎng)液，之后將pH酸化至4.5以下、優(yōu)選地約3.5，可消除蛋白質(zhì)的“鹽溶”效應(yīng)并提高“鹽析”蛋白質(zhì)的比例?！胞}溶”是指蛋白質(zhì)的溶解度提高，而“鹽析”是指在溶液中的蛋白質(zhì)到達(dá)其等電點(diǎn)時(shí)發(fā)生沉淀。超濾和透析過(guò)濾步驟也可阻止當(dāng)將經(jīng)碳酸鈉處理的培養(yǎng)液酸化至甚至pH 5.0時(shí)觀察到的起泡(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)案第2006/0228381號(hào))。因此，對(duì)澄清溶解產(chǎn)物培養(yǎng)液實(shí)施超濾和透析過(guò)濾使得可在肺炎鏈球菌血清型發(fā)酵期間使用任何諸如碳酸鈉等低分子量pH滴定劑，并在將pH酸化至4.5以下時(shí)阻止澄清溶解產(chǎn)物培養(yǎng)液起泡。
“澄清溶解產(chǎn)物培養(yǎng)液“是指已進(jìn)行離心或過(guò)濾來(lái)去除細(xì)胞碎片的溶解產(chǎn)物培養(yǎng)液。
“透析過(guò)濾(diafiltering、diafiltration、DF)“和類(lèi)似術(shù)語(yǔ)是指(例如)使用具有適當(dāng)物理和化學(xué)特性的半透膜自溶液中去除小分子。
“超濾(ultrafiltering、ultrafiltration、UF)”和類(lèi)似術(shù)語(yǔ)是指(例如)使用具有適當(dāng)物理和化學(xué)特性的半透膜區(qū)分溶液中的各種分子，并將相同分子濃縮至較小體積溶液中。
在本發(fā)明方法中，超濾和透析過(guò)濾通常包含“橫向流”或“切向流”過(guò)濾以避免阻塞濾膜。在“橫向流”過(guò)濾中，使欲過(guò)濾溶液橫向經(jīng)過(guò)膜表面。將穿過(guò)膜的物質(zhì)稱(chēng)作滲透物。未穿過(guò)膜的物質(zhì)稱(chēng)作滲余物。將滲余物再循環(huán)至進(jìn)料庫(kù)中以供再過(guò)濾。
只要可達(dá)成低于4.5、具體來(lái)說(shuō)約3.5的pH，本文所用任何酸都可用于降低經(jīng)超濾和透析過(guò)濾的溶解產(chǎn)物培養(yǎng)液的pH。因此，有機(jī)和礦物酸二者都可用于本發(fā)明方法中。本文所用術(shù)語(yǔ)“礦物酸”是指通過(guò)化學(xué)反應(yīng)衍生自無(wú)機(jī)礦物質(zhì)的與有機(jī)酸相反的酸?？捎糜诒景l(fā)明方法中的礦物酸的實(shí)例性非限制性實(shí)例包括鹽酸、硝酸、磷酸、和硫酸。在特定實(shí)施例中，使經(jīng)濃縮溶解產(chǎn)物培養(yǎng)液的pH降低至低于4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1或3.0。在其它實(shí)施例中，使經(jīng)濃縮溶解產(chǎn)物培養(yǎng)液的pH降低至約4.4、約4.3、約4.2、約4.1、約4.0、約3.9、約3.8、約3.7、約3.6、約3.5、約3.4、約3.3、約3.2、約3.1、約3.0、約2.9、約2.8、約2.7、約2.6、約2.5、約2.4、約2.3、約2.2、約2.1或約2.0。
本發(fā)明縮短的純化方法也涉及以下發(fā)現(xiàn)結(jié)合上述濃縮和降低pH的步驟，使用活性炭過(guò)濾可使剩余蛋白質(zhì)中的至少90％沉淀而不嚴(yán)重影響多糖產(chǎn)率。在特定實(shí)施例中，發(fā)現(xiàn)使用得自鋸末或其它木質(zhì)產(chǎn)品并且經(jīng)磷酸活化的炭實(shí)施炭過(guò)濾可比現(xiàn)有炭過(guò)濾方法中所用的炭更有效地減少或去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)。
因此，本發(fā)明涉及自肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)生基本上純化的莢膜多糖的方法，其包含以下步驟 (a)提供包含可產(chǎn)生所選肺炎鏈球菌血清型的細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液； (b)用溶解劑溶解步驟(a)中的細(xì)菌細(xì)胞，由此產(chǎn)生包含細(xì)胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細(xì)胞溶解產(chǎn)物； (c)使用離心或過(guò)濾來(lái)去除細(xì)胞碎片以澄清步驟(b)中的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，由此產(chǎn)生澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物； (d)超濾并透析過(guò)濾步驟(c)中的澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物以去除低分子量雜質(zhì)并提高多糖濃度，由此產(chǎn)生滲余物； (e)使步驟(d)中滲余物的pH降低至4.5以下、具體來(lái)說(shuō)約3.5以使蛋白質(zhì)與核酸沉淀，由此形成酸化滲余物溶液； (f)步驟(e)中形成的酸化滲余物溶液在攪拌或不攪拌的情況下保持足夠長(zhǎng)時(shí)間、具體來(lái)說(shuō)至少2小時(shí)以使沉淀物沉降，之后過(guò)濾或離心酸化滲余物溶液，由此產(chǎn)生澄清多糖溶液； (g)通過(guò)活性炭過(guò)濾器、具體來(lái)說(shuō)包含木質(zhì)磷酸-活性炭的活性炭過(guò)濾器來(lái)過(guò)濾步驟(f)中的澄清多糖溶液； (h)超濾并透析過(guò)濾步驟(g)產(chǎn)生的經(jīng)過(guò)濾溶液，由此產(chǎn)生經(jīng)濃縮純化多糖溶液；和 (i)使用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾步驟(h)產(chǎn)生的經(jīng)濃縮純化多糖溶液； 由此產(chǎn)生呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。步驟(i)中的無(wú)菌過(guò)濾可用于自經(jīng)濃縮純化多糖溶液去除細(xì)菌和顆粒。本發(fā)明此實(shí)施例中所選實(shí)例性非限制性肺炎鏈球菌血清型為1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一特定實(shí)施例中，步驟(e)自步驟(d)中的滲余物去除至少98％的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，步驟(g)自步驟(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約5.5至約7.5之間。然而，為改良在長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間基本上純化的莢膜多糖的穩(wěn)定性，步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.0至約7.5，并且更具體來(lái)說(shuō)調(diào)節(jié)至約7.4。
本文所用術(shù)語(yǔ)“含有基本上純化的莢膜多糖的溶解產(chǎn)物“或”含有基本上純化的莢膜多糖的溶液“是指肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物或溶液，其中已去除蛋白質(zhì)從而使得蛋白質(zhì)與多糖的百分比比率(蛋白質(zhì)/PS)小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％并且核酸與多糖的百分比比率(NA/PS)小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在特定實(shí)施例中，在包含指定血清型并含有基本上純化的莢膜多糖的溶解產(chǎn)物或溶液中，蛋白質(zhì)/PS和NA/PS的百分比比率如下所述對(duì)于血清型1，蛋白質(zhì)/PS比率小于2％并且NA/PS比率小于2％；對(duì)于血清型4，蛋白質(zhì)/PS比率小于3％并且NA/PS比率小于2％；對(duì)于血清型5，蛋白質(zhì)/PS比率小于或等于7.5％并且NA/PS比率小于或等于2％；對(duì)于血清型6A，蛋白質(zhì)/PS比率小于2％并且NA/PS比率小于2％；對(duì)于血清型6B，蛋白質(zhì)/PS比率小于4％并且NA/PS比率小于1％；對(duì)于血清型7F，蛋白質(zhì)/PS比率小于5％并且NA/PS比率小于2％；對(duì)于血清型9V，蛋白質(zhì)/PS比率小于2％并且NA/PS比率小于1％；對(duì)于血清型14，蛋白質(zhì)/PS比率小于3％并且NA/PS比率小于2％；對(duì)于血清型18C，蛋白質(zhì)/PS比率小于2％并且NA/PS比率小于2％；對(duì)于血清型19A，蛋白質(zhì)/PS比率小于2％并且NA/PS比率小于2％；對(duì)于血清型19F，蛋白質(zhì)/PS比率小于3％并且NA/PS比率小于2％；并且對(duì)于血清型23F，蛋白質(zhì)/PS比率小于2％并且NA/PS比率小于2％。量化細(xì)胞溶解產(chǎn)物或溶液中蛋白質(zhì)、多糖和核酸濃度的方法為業(yè)內(nèi)所熟知并且包括(例如)SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析、HPLC(高效液相色譜)和SEC(尺寸排阻色譜)、修改的勞里(Lowry)分析、分光光度法、SEC-MALLS(分子排阻色譜/多角度激光散射)、和NMR(核磁共振)。
在本發(fā)明方法中，可使用任何溶解劑來(lái)溶解細(xì)菌細(xì)胞?！叭芙鈩笆前?例如)洗滌劑在內(nèi)的任何可幫助細(xì)胞壁裂解并釋放自溶素的試劑，所述自溶素可導(dǎo)致細(xì)胞溶解。本文所用術(shù)語(yǔ)“洗滌劑”是指能誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞溶解的任何陰離子型或陽(yáng)離子型洗滌劑。用于本發(fā)明方法中的所述洗滌劑的代表性實(shí)例包括脫氧膽酸鈉(DOC)、N-月桂酰肌氨酸(NLS)、鵝脫氧膽酸鈉和皂苷。
在本發(fā)明一實(shí)施例中，用于溶解細(xì)菌細(xì)胞的溶解劑為DOC。DOC是膽汁酸脫氧膽酸的鈉鹽，其一般得自諸如母牛或公牛等生物來(lái)源。DOC活化LytA蛋白，其為肺炎鏈球菌細(xì)胞壁生長(zhǎng)和分裂中涉及的自溶素。LytA蛋白在其C-末端部分具有膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且已知lytA基因的突變可產(chǎn)生對(duì)DOC溶解具有抗性的LytA突變體。
盡管沒(méi)有證據(jù)表明在肺炎鏈球菌多糖純化期間使用DOC會(huì)造成健康危險(xiǎn)，但使用所述生物源試劑可能會(huì)產(chǎn)生潛在的調(diào)控問(wèn)題。因此，在本發(fā)明一實(shí)施例中，用于溶解細(xì)菌細(xì)胞的溶解劑是非動(dòng)物源性溶解劑。用于本發(fā)明方法中的非動(dòng)物源性溶解劑包括作用模式與DOC類(lèi)似(即影響LytA功能并導(dǎo)致肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解)的來(lái)自非動(dòng)物源的試劑。所述非動(dòng)物源性溶解劑包括(但不限于)DOC類(lèi)似物、表面活性劑、洗滌劑和膽堿的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，并且可使用下文實(shí)驗(yàn)部分中所述的程序來(lái)確定。在一實(shí)施例中，非動(dòng)物源性溶解劑選自由以下組成的群組癸烷磺酸、叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇(例如伊格保(Igepal)

CA-630，CAS編號(hào)9002-93-1，購(gòu)自西格瑪-奧德里奇(SigmaAldrich)，密蘇里州圣路易斯(St.louis，MO))、辛基苯酚氧化乙烯縮合物(例如曲拉通(Triton)

X-100，購(gòu)自西格瑪-奧德里奇，密蘇里州圣路易斯)、N-月桂酰肌氨酸鈉(NLS)、亞氨基二丙酸月桂酯、十二烷基硫酸鈉、鵝脫氧膽酸鹽、豬脫氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽、?；敲撗跄懰猁}、牛磺鵝脫氧膽酸鹽、和膽酸鹽。在另一實(shí)施例中，非動(dòng)物源性溶解劑是NLS。
本發(fā)明也涉及對(duì)上述方法的血清型特異性修改。例如，由于血清型19A多糖不穩(wěn)定并且其分子量在純化期間發(fā)生變化，因此發(fā)現(xiàn)對(duì)所述方法進(jìn)行修改可用于穩(wěn)定19A多糖。這些修改包括在酸化前在約4℃和約6的pH下于磷酸鈉緩沖液中實(shí)施超濾和透析過(guò)濾步驟，在約4℃下將酸化滲余物溶液保持至少2小時(shí)以使沉淀物沉降，以及在實(shí)施活性炭過(guò)濾步驟之前將澄清多糖溶液的pH調(diào)節(jié)至6。相反，人們發(fā)現(xiàn)對(duì)于血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F來(lái)說(shuō)，當(dāng)在酸化前于諸如水等無(wú)鹽介質(zhì)中實(shí)施超濾和透析過(guò)濾步驟時(shí)，可達(dá)成較少多糖損失和較高蛋白質(zhì)去除，并且此步驟可在室溫和中性pH下實(shí)施。
因此，本發(fā)明也涉及自包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)生基本上純化的莢膜多糖的方法，其包含以下步驟 (a)提供包含可產(chǎn)生肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液； (b)用洗滌劑溶解步驟(a)中的細(xì)菌細(xì)胞，由此產(chǎn)生包含細(xì)胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細(xì)胞溶解產(chǎn)物； (c)使用離心或過(guò)濾來(lái)去除細(xì)胞碎片以澄清步驟(b)中的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，由此產(chǎn)生澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物； (d)在室溫和中性pH下于無(wú)鹽介質(zhì)中超濾并透析過(guò)濾步驟(c)中的澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物以去除低分子量雜質(zhì)并提高多糖濃度，由此產(chǎn)生無(wú)鹽滲余物； (e)使步驟(d)中無(wú)鹽滲余物的pH降低至4.5以下、具體來(lái)說(shuō)約3.5以使蛋白質(zhì)與核酸沉淀，由此形成酸化滲余物溶液； (f)將步驟(e)中形成的酸化滲余物溶液在室溫和攪拌或不攪拌的情況下保持至少2小時(shí)以使沉淀物沉降，之后過(guò)濾或離心酸化滲余物溶液，由此產(chǎn)生澄清多糖溶液； (g)通過(guò)活性炭過(guò)濾器、具體來(lái)說(shuō)包含木質(zhì)磷酸-活性炭的活性炭過(guò)濾器來(lái)過(guò)濾步驟(f)中的澄清多糖溶液； (h)超濾并透析過(guò)濾步驟(g)產(chǎn)生的經(jīng)過(guò)濾溶液，由此產(chǎn)生經(jīng)濃縮純化多糖溶液；和 (i)使用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾步驟(h)產(chǎn)生的經(jīng)濃縮純化多糖溶液； 由此產(chǎn)生包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。在一特定實(shí)施例中，步驟(e)自步驟(d)中的無(wú)鹽滲余物去除至少98％的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，步驟(g)自步驟(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約5.5至約7.5之間。然而，為改良在長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間基本上純化的莢膜多糖的穩(wěn)定性，步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.0至約7.5，并且更具體來(lái)說(shuō)調(diào)節(jié)至約7.4。
本發(fā)明也涉及自包含血清型19A的肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)生基本上純化的莢膜多糖的方法，其包含以下步驟 (a)提供包含可產(chǎn)生肺炎鏈球菌血清型19A的細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液； (b)用洗滌劑溶解步驟(a)中的細(xì)菌細(xì)胞，由此產(chǎn)生包含細(xì)胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細(xì)胞溶解產(chǎn)物； (c)使用離心或過(guò)濾來(lái)去除細(xì)胞碎片以澄清步驟(b)中的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，由此產(chǎn)生澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物； (d)在約4℃和約6的pH下于磷酸鈉緩沖液(25mM磷酸鈉)中超濾并透析過(guò)濾步驟(c)中的澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物以去除低分子量雜質(zhì)并提高多糖濃度，由此產(chǎn)生滲余物； (e)使步驟(d)中滲余物的pH降低至4.5以下、尤其約3.5以使蛋白質(zhì)與核酸沉淀，由此形成酸化滲余物溶液； (f)將步驟(e)中形成的酸化滲余物溶液在約4℃和攪拌或不攪拌的情況下保持至少2小時(shí)以使沉淀物沉降，之后過(guò)濾或離心酸化滲余物溶液，由此產(chǎn)生澄清多糖溶液； (g)將步驟(f)中的澄清多糖溶液的pH調(diào)節(jié)至約6，由此產(chǎn)生pH經(jīng)調(diào)節(jié)的澄清多糖溶液； (h)通過(guò)活性炭過(guò)濾器、具體來(lái)說(shuō)包含木質(zhì)磷酸-活性炭的活性炭過(guò)濾器來(lái)過(guò)濾步驟(g)中的pH經(jīng)調(diào)節(jié)的澄清多糖溶液； (i)超濾并透析過(guò)濾步驟(h)中產(chǎn)生的經(jīng)過(guò)濾溶液，由此產(chǎn)生經(jīng)濃縮純化多糖溶液；和 (j)使用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾步驟(i)中產(chǎn)生的經(jīng)濃縮純化多糖溶液； 由此產(chǎn)生包含血清型19A的呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。在一特定實(shí)施例中，步驟(e)自步驟(d)中的滲余物去除至少98％的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，步驟(h)自步驟(g)的pH經(jīng)調(diào)節(jié)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，步驟(i)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約5.5至約7.5之間。然而，為改良在長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間基本上純化的19A多糖的穩(wěn)定性，步驟(i)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.0至約7.5，并且更具體來(lái)說(shuō)調(diào)節(jié)至約7.4。
提供以下實(shí)例以舉例說(shuō)明而非限制本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn) 以下實(shí)例闡述使用本發(fā)明經(jīng)改良方法以10L的規(guī)模純化肺炎鏈球菌多糖血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F的結(jié)果，并將所述結(jié)果與現(xiàn)有純化方法的結(jié)果進(jìn)行比較。
實(shí)例1.用于肺炎鏈球菌多糖血清型1、4、5、6A、6B、7F、14和19A的縮短的純化方法 用脫氧膽酸鈉(DOC)溶解的肺炎鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)液是在其收獲或儲(chǔ)存于4℃下之后兩天內(nèi)獲得，并在隨后一周內(nèi)加以處理。如下所述，本發(fā)明純化方法相對(duì)于現(xiàn)有純化方法包括以下變化 1)將酸化步驟自開(kāi)始時(shí)移至第一超濾/透析過(guò)濾(UF/DF)步驟后，并且將pH調(diào)節(jié)至3.5而非5； 2)將透析過(guò)濾緩沖液自0.025M磷酸鹽變?yōu)槿ルx子(DI)水；3)將炭吸附變?yōu)槭褂媚举|(zhì)磷酸-活性炭的2CUNO R32SP碳盤(pán)(坤諾(CUNO)公司，韋恩(Wayne)，NJ)，并且將吸附時(shí)間自4次翻轉(zhuǎn)延長(zhǎng)至12次反轉(zhuǎn)(每次反轉(zhuǎn)為22分鐘)；和4)在最后的30K透析過(guò)濾步驟期間當(dāng)透析過(guò)濾約5次時(shí)將pH調(diào)節(jié)至7.4。相同純化程序適用于血清型1、4、5、6A、6B或7F。對(duì)于血清型19A，進(jìn)一步修改所述步驟并且在冷凍室中實(shí)施純化，如下所述。
純化步驟 所有步驟都是在室溫下實(shí)施，但19A型例外，在此情況下所述方法是在4℃下于冷凍室中實(shí)施。
溶解產(chǎn)物的澄清此步驟的目的是去除細(xì)胞碎片并澄清培養(yǎng)液。此步驟是通過(guò)離心或過(guò)濾來(lái)完成的。在20℃下(19A型為4℃)將培養(yǎng)液以10,000g離心30min或直至培養(yǎng)液變澄清，或用添加有賽普爾(Celpure)

助濾劑(美理勤公司(AdvancedMinerals)，圣巴巴拉，CA)的微孔預(yù)濾器(Millipore Prefilter)(密理博(Millipore)公司，比爾里卡，MA)將其過(guò)濾。收集澄清溶解產(chǎn)物以供進(jìn)一步處理并棄去沉淀。
第一UF/DF(超濾/透析過(guò)濾)此步驟提供體積降低和緩沖液交換并且也去除低分子量雜質(zhì)。將澄清溶解產(chǎn)物濃縮為初始體積的大約1/8。使用約10體積DI水(pH 6，19A為25mM磷酸鹽)來(lái)實(shí)施透析過(guò)濾。
酸化在此步驟中去除超過(guò)98％的蛋白質(zhì)。將濃磷酸謹(jǐn)慎地?cái)嚢杼砑又翝B余物中。將滲余物的pH調(diào)節(jié)至pH 3.5的目標(biāo)值。將酸化滲余物攪拌半小時(shí)并在室溫下陳化過(guò)夜(將19A在4℃下陳化2小時(shí))，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和核酸沉淀。
酸化滲余物的澄清此步驟是在酸化后去除沉淀的澄清步驟。在20℃下于轉(zhuǎn)子中以10,000rpm(17,000相對(duì)離心力或RCF)將酸化溶液的漿液離心一小時(shí)(6B例外，在此情況下于37℃下離心6小時(shí))。收集上清液并棄去沉淀。在此步驟中也可使用以添加有賽普爾

助濾劑(美理勤公司，圣巴巴拉，CA)的微孔預(yù)濾器(密理博公司，比爾里卡，MA)實(shí)施的深度過(guò)濾。
炭吸附在大多數(shù)情況下，在對(duì)酸化100K滲余物實(shí)施離心后其為淡黃色。使用木質(zhì)磷酸-活性炭通過(guò)炭吸附來(lái)達(dá)成顏色去除。此步驟也去除在酸化后剩余的殘留蛋白。使澄清多糖溶液經(jīng)5-6小時(shí)或過(guò)夜再循環(huán)經(jīng)過(guò)炭過(guò)濾器(對(duì)于19A，在炭吸附前將pH調(diào)節(jié)至6)。
最終30K UF/DF這是將溶液濃縮為＞2g/L的最終多糖(PS)濃度的另一次濃縮和緩沖液交換步驟，其中將所述溶液透析過(guò)濾至去離子(DI)水中。濃縮炭過(guò)濾PS溶液。然后用DI水將濃縮物透析過(guò)濾10X。在透析過(guò)濾期間將pH調(diào)節(jié)至7.4。
最終0.2μm無(wú)菌過(guò)濾用0.22μm過(guò)濾器或可棄式無(wú)菌過(guò)濾器單元對(duì)最終PS溶液實(shí)施無(wú)菌過(guò)濾并將其儲(chǔ)存于4℃冰箱中。
分析方法 蛋白質(zhì)、PS、和核酸濃度的量化是使用業(yè)內(nèi)熟知的方法來(lái)實(shí)施，包括SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析、HPLC(高效液相色譜)和SEC(尺寸排阻色譜)、修改的勞里分析、分光光度法、SEC-MALLS(分子排阻色譜/多角度激光散射)、和NMR(核磁共振)。
結(jié)果與討論 5型經(jīng)縮短純化批次表1中展示使用經(jīng)縮短方法純化5型的三個(gè)批次與使用現(xiàn)有方法的最終PS產(chǎn)率、PS分子量和主要雜質(zhì)水平的對(duì)比。所有起始培養(yǎng)液皆為DOC溶解的高細(xì)胞密度發(fā)酵批次，其多糖濃度(約0.5g/L)高于標(biāo)準(zhǔn)SOP發(fā)酵培養(yǎng)液(約0.3g/L)。使用30K或50K膜來(lái)進(jìn)行第一UF/DF步驟。使用雜質(zhì)/PS比率來(lái)計(jì)算雜質(zhì)水平。使用相同方法來(lái)量化本文所述所有其它血清型。

如表1中的數(shù)據(jù)所示，所有使用經(jīng)縮短純化方法的三個(gè)批次的蛋白質(zhì)比率都滿足≤7.5％的技術(shù)要求，并且也與現(xiàn)有方法相當(dāng)。核酸(NA)以及C-多糖(C-PS)比率也分別遠(yuǎn)低于≤2.0％和≤35％的技術(shù)要求，并且與現(xiàn)有方法相當(dāng)。表1中所示三個(gè)批次的最終PS產(chǎn)率和雜質(zhì)水平的結(jié)果表明經(jīng)縮短方法具有可再現(xiàn)性和穩(wěn)定性。
令人關(guān)心的是多糖在3.5的較低pH下是否會(huì)水解。因此在純化方法期間監(jiān)測(cè)PS保留時(shí)間的變化，并測(cè)量最終經(jīng)純化PS的分子量。在HPLC色譜中未觀察到血清型5的PS保留時(shí)間有顯著變化。根據(jù)MALLS測(cè)量，通過(guò)經(jīng)縮短方法與現(xiàn)有方法(284kg/mol)純化的PS的分子量也沒(méi)有顯著差異。因此可斷定經(jīng)縮短純化方法對(duì)經(jīng)純化PS的分子量無(wú)不良影響。
三個(gè)經(jīng)縮短方法批次中每個(gè)處理步驟的工序間多糖產(chǎn)率、蛋白質(zhì)/多糖比率和核酸/多糖比率概述于表2中。



在任一純化方法中的每個(gè)步驟期間產(chǎn)物總會(huì)有所損失。對(duì)于這三個(gè)經(jīng)縮短方法的批次來(lái)說(shuō)，PS損失主要發(fā)生在第一UF/DF步驟和酸化步驟中。在第一UF/DF步驟中，PS因膜表面對(duì)PS或PS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的吸附而損失?？赏ㄟ^(guò)在透析過(guò)濾后用DI水沖洗膜的滲余物側(cè)并將沖洗物與初始滲余物合并來(lái)將這種損失降至最低。在酸化步驟中PS可能因以下兩種原因而損失沉淀固體對(duì)PS的物理吸附，以及在酸化期間多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合而共沉淀。進(jìn)一步研究此第二種可能性并且結(jié)果證實(shí)了PS/蛋白質(zhì)的結(jié)合。
圖1展示在每個(gè)純化步驟中蛋白質(zhì)/PS比率的降低。盡管離心步驟去除小部分蛋白質(zhì)，但大部分蛋白質(zhì)是在酸化步驟中去除。甚至蛋白質(zhì)含量最高的批次在pH 3.5下處理后也僅檢測(cè)到痕量的蛋白質(zhì)。
與蛋白質(zhì)/PS比率類(lèi)似，核酸/PS比率表明各批次的雜質(zhì)水平之間具有差異性。與相同步驟中的蛋白質(zhì)去除相比，30/50K UF/DF步驟可去除大量核酸。不希望受限于理論，這種情況可能是因核酸的分子大小小于蛋白質(zhì)所致，從而使其相對(duì)更容易通過(guò)30/50K UF/DF步驟來(lái)去除。第一離心和酸化步驟也去除大量核酸。
表2顯示，活性炭吸附步驟也可降低蛋白質(zhì)/PS和NA/PS水平。所述百分比降低不如最初兩個(gè)步驟顯著，但此步驟對(duì)去除溶液顏色具有重要作用并確保雜質(zhì)水平符合技術(shù)要求。
4型經(jīng)縮短純化批次4型的三個(gè)經(jīng)縮短純化批次概述于表3中。所有三個(gè)批次的進(jìn)料培養(yǎng)液都經(jīng)DOC溶解。

4型的PS產(chǎn)率也在50-60％之間。蛋白質(zhì)/PS比率和核酸/PS比率完全符合其技術(shù)要求。C-PS比率也完全符合技術(shù)要求。所有三個(gè)批次的分子量都接近約300kg/mol。通過(guò)現(xiàn)有方法使用類(lèi)似發(fā)酵培養(yǎng)液純化的血清型4PS也具有285kg/mol的較低分子量。來(lái)自發(fā)酵培養(yǎng)液與最終純化溶液的PS的HPLC色譜對(duì)比顯示，PS保留時(shí)間沒(méi)有差異。這表明，分子量差異的差異不是由于方法改變所致，而是由發(fā)酵方法的內(nèi)在性質(zhì)所致。
4型PS在經(jīng)純化分子中含有丙酮酸鹽基團(tuán)，并且此丙酮酸鹽對(duì)用于肺炎球菌偶聯(lián)疫苗中的偶聯(lián)具有重要作用。為確保酸處理對(duì)丙酮酸鹽數(shù)量無(wú)有害影響，實(shí)施NMR分析。圖2展示標(biāo)準(zhǔn)4型PS與批次L29276-47的NMR波譜。兩個(gè)波譜之間未觀察到顯著差異。兩個(gè)波譜中從右邊數(shù)第二個(gè)峰都為丙酮酸鹽，并且在兩個(gè)波譜中丙酮酸鹽基團(tuán)的峰高相當(dāng)。所有三個(gè)經(jīng)縮短方法批次的丙酮酸鹽比率都為0.8mol/mol，并且符合＞0.7mol/mol的技術(shù)要求。
三個(gè)4型批次的工序間PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)/PS和NA/PS比率概述于表4中。PS損失主要發(fā)生在第一離心、酸化和活性炭吸附步驟中，平均分別損失10％、8％和20％?？侾S產(chǎn)率與5型接近，約為55％。


圖3展示表4所示三個(gè)批次中每個(gè)純化步驟的平均PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)/PS和NA/PS比率變化。正如人們所預(yù)期，蛋白質(zhì)去除主要發(fā)生在酸化步驟中。第一離心和UF/DF步驟也共同去除了一定量的蛋白質(zhì)，但蛋白質(zhì)減少量小于酸化步驟。
與5型類(lèi)似，核酸/PS比率降低主要發(fā)生在50/100K UF/DF、第一離心和酸化步驟中，并且第一UF/DF步驟中的NA降低遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)降低。同樣，如圖3所示，活性炭步驟去除一定量的蛋白質(zhì)和NA并且使雜質(zhì)水平低于技術(shù)要求。其同樣去除溶液顏色。
19A型經(jīng)縮短純化批次在純化期間19A型多糖不穩(wěn)定并且分子量有所變化。稍微修改經(jīng)縮短純化方法以穩(wěn)定19A多糖。這些修改概述如下1)主要在4℃下于冷凍室中實(shí)施純化步驟；2)使用25mM磷酸鹽緩沖液(4℃，pH 6)而非使用具有室溫的水來(lái)冷凍第一100K透析過(guò)濾物；3)將酸化保持時(shí)間自過(guò)夜縮短至2小時(shí)；和4)在澄清經(jīng)酸化100K滲余物后，將pH調(diào)節(jié)至6并在pH 6而非pH 3.5下實(shí)施活性炭吸附。
通過(guò)經(jīng)縮短純化方法純化的兩個(gè)19A批次的結(jié)果展示于表5中。

兩個(gè)經(jīng)縮短純化批次的PS產(chǎn)率分別為62％和76％。最終蛋白質(zhì)/PS比率、核酸比率和C-PS比率都符合其各自的技術(shù)要求。兩個(gè)批次多糖的最終分子量分別為525kg/mol和488kg/mol，并且接近于用于III期臨床試驗(yàn)中的19A PS的分子量(486kg/mol)。
兩個(gè)批次的蛋白質(zhì)/PS比率都符合＜2％的技術(shù)要求。兩個(gè)批次的NA和C-PS比率二者都完全符合其技術(shù)要求。
每個(gè)純化步驟中的PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)和NA的降低展示于表6和圖4中。結(jié)果顯示，除第一離心步驟外每個(gè)純化步驟中都發(fā)生PS損失。與血清型5和4類(lèi)似，蛋白質(zhì)和NA去除主要發(fā)生在最初三個(gè)步驟中，并且在酸化后幾乎檢測(cè)不到任何蛋白質(zhì)和NA殘留。盡管活性炭吸附步驟不能大量去除蛋白質(zhì)和NA(可能是因?yàn)樵谒峄蟮鞍踪|(zhì)和NA濃度極低)，但顏色去除仍需要這個(gè)步驟。

7F型經(jīng)縮短純化批次7F型是非離子型多糖，與上述血清型相比，其在使用現(xiàn)有方法純化期間通常需要改變步驟。然而，本發(fā)明經(jīng)縮短純化方法可成功適用于血清型7F而不需修改方法。使用經(jīng)縮短方法來(lái)純化兩個(gè)批次的7F型培養(yǎng)液。一個(gè)批次是標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵培養(yǎng)液(L29276-107)并且另一個(gè)批次是高細(xì)胞密度培養(yǎng)液(L29276-157)。兩個(gè)批次的結(jié)果概述于表7中。

7F型的PS產(chǎn)率實(shí)際上高于其它血清型，這可能是因?yàn)榉请x子型聚合物與帶電荷蛋白質(zhì)分子結(jié)合較少。最終蛋白質(zhì)、NA和C-PS比率都完全符合其技術(shù)要求。7F型的分子量與標(biāo)準(zhǔn)批次相當(dāng)，并且即使7F分子量相當(dāng)高，PS溶液也不會(huì)非常粘稠，因?yàn)榉请x子型聚合物的排除體積較小。
各純化步驟中的7F型PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)和NA比率展示于表8中并且兩個(gè)批次的平均值繪示于圖5中。

在每個(gè)純化步驟中都發(fā)生一些7F型PS損失?？傊?，PS損失少于血清型5和4。主要通過(guò)第一離心、100K UF/DF和酸化步驟來(lái)降低蛋白質(zhì)和NA比率。與其它血清型類(lèi)似，100K UF/DF去除NA比率去除蛋白質(zhì)更有效。盡管活性炭吸附步驟因酸化后雜質(zhì)水平極低而不能大量去除蛋白質(zhì)和NA，但顏色去除仍需要此步驟。
6B型經(jīng)縮短純化批次使用經(jīng)縮短純化方法來(lái)純化兩個(gè)批次的6B。人們發(fā)現(xiàn)澄清經(jīng)酸化100K滲余物需要消耗比其它血清型更長(zhǎng)的時(shí)間(6小時(shí)而非1小時(shí))。除此差異外，所述純化方法與血清型的純化方法類(lèi)似。兩個(gè)批次的結(jié)果展示于表9中。


所有雜質(zhì)水平(蛋白質(zhì)、NA和C-PS)都完全符合其技術(shù)要求。與其它血清型相比，PS產(chǎn)率相對(duì)較高，并且蛋白質(zhì)和NA比率也相對(duì)較高。
各純化步驟中的工序間PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)和NA比率展示于表10和圖6中。

與19A類(lèi)似，在每個(gè)純化步驟中都發(fā)生PS損失，但第一離心步驟除外，其中PS稍微增加。主要通過(guò)第一離心、第一100K UF/DF和酸化步驟來(lái)達(dá)成蛋白質(zhì)和NA的去除。然而，在活性炭吸附步驟中蛋白質(zhì)和NA比率也有所降低。
6A型經(jīng)縮短純化批次使用經(jīng)縮短純化方法來(lái)純化兩個(gè)批次的6A型。最終溶液的PS產(chǎn)率、雜質(zhì)水平和分子量概述于表11中。

兩個(gè)6A批次的最終PS產(chǎn)率都＞70％，這是使用經(jīng)縮短方法處理的血清型中最高的產(chǎn)率。蛋白質(zhì)、NA和C-PS比率都完全符合技術(shù)要求。
表12和圖7展示各純化步驟中的工序間PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)和NA比率變化。在第一離心和100K UF/DF步驟中幾乎沒(méi)有任何PS損失。在酸化和活性炭吸附步驟中發(fā)生約10-15％的PS損失，這與其它血清型接近。主要通過(guò)第一離心、100K UF/DF和酸化來(lái)降低蛋白質(zhì)和NA比率。在酸化后，蛋白質(zhì)和NA比率二者都已低于其技術(shù)要求。對(duì)于蛋白質(zhì)，酸化是最有效的步驟，而對(duì)于NA，100K UF/DF降低NA/PS比率的程度最大。盡管活性炭吸附步驟因酸化后雜質(zhì)水平極低而不能大量去除蛋白質(zhì)和NA，但顏色去除仍需要此步驟。

1型經(jīng)縮短純化批次通過(guò)經(jīng)縮短方法純化的兩個(gè)批次的1型概述于表13中。自高細(xì)胞密度發(fā)酵培養(yǎng)液來(lái)純化批次L29276-170并且自標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵培養(yǎng)液來(lái)純化L29276-173。

兩個(gè)批次的PS產(chǎn)率為約50％，并且蛋白質(zhì)、NA和C-PS的雜質(zhì)水平完全符合其技術(shù)要求。
每個(gè)純化步驟后的工序間PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)和NA比率展示于表14和圖8中。其趨勢(shì)與所純化的其它血清型類(lèi)似。PS損失主要發(fā)生在酸化和活性炭吸附步驟中，并且蛋白質(zhì)和NA去除主要發(fā)生在最初三個(gè)步驟中。在100K UF/DF步驟中去除的NA多于蛋白質(zhì)。盡管活性炭吸附步驟因酸化后雜質(zhì)水平極低而不能大量去除蛋白質(zhì)和NA，但顏色去除仍需要此步驟。


14型經(jīng)縮短純化批次使用方法未修改的經(jīng)縮短純化方法來(lái)純化兩個(gè)批次的血清型14。最終PS產(chǎn)率和雜質(zhì)水平概述于表15中。

與血清型7F類(lèi)似，血清型14是非離子型多糖，并且其現(xiàn)有純化方法與其它血清型略有不同。然而，本發(fā)明經(jīng)縮短純化方法可成功適用于血清型14而不需要所述額外步驟。兩個(gè)經(jīng)縮短純化方法批次的PS產(chǎn)率為50-60％，并且蛋白質(zhì)和NA比率完全符合其技術(shù)要求。經(jīng)純化PS的分子量也符合技術(shù)要求。
工序間PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)和NA比率概述于表16和圖9中。觀察到與上述所測(cè)試其它血清型類(lèi)似的PS損失、蛋白質(zhì)和NA去除趨勢(shì)。



實(shí)例2不同血清型(血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F)的比較 為比較使用本發(fā)明經(jīng)縮短純化方法對(duì)不同血清型進(jìn)行的純化，在圖10的一個(gè)圖中繪示實(shí)例1中所述所有血清型以及血清型9V、18C和19F的PS去除。大多數(shù)血清型在每個(gè)純化步驟中遵循類(lèi)似的PS損失趨勢(shì)。6B型在第一離心步驟中的PS產(chǎn)率和14型在酸化步驟中的PS產(chǎn)率有所提高。不同血清型的PS損失百分比各不相同。5型似乎在酸化步驟中損失最多PS，4型則在活性炭吸附步驟中損失最多。
每種血清型在每個(gè)純化步驟中的蛋白質(zhì)/PS比率展示于圖11中。所述圖顯示，不同血清型的初始蛋白質(zhì)/PS比率各不相同，其中1、4、5、9V、19F、和18C型具有最高初始蛋白質(zhì)/PS比率。即使在第一UF/DF步驟后1、4、5、9V、19F和18C型的蛋白質(zhì)/PS比率遠(yuǎn)高于其它血清型，酸化步驟也可顯著降低蛋白質(zhì)/PS比率，并且在此步驟后蛋白質(zhì)殘留很少。
如圖12中所示，不同血清型的NA/PS比率也各不相同。1和5型具有最高NA/PS比率，18C和4型次之。第一離心和UF/DF步驟去除這些血清型中的大量NA，并且對(duì)于1型似乎最有效。在酸化步驟后僅殘留極少量NA。
實(shí)例3酸化和活性炭吸附步驟效率分析(血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F)。
對(duì)于PnC多糖的純化，最多最難去除的雜質(zhì)是蛋白質(zhì)。為更好地理解經(jīng)縮短方法的雜質(zhì)去除效率，分析兩個(gè)主要純化步驟酸化和活性炭吸附的蛋白質(zhì)去除。對(duì)于酸化步驟，相對(duì)于使用本發(fā)明經(jīng)縮短純化方法酸化血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F之前的初始蛋白質(zhì)濃度來(lái)繪示酸化前后的蛋白質(zhì)濃度(SDS-PAGE)差異(圖13)。
由于在酸化步驟前后溶液體積變化相對(duì)較小，因此用蛋白質(zhì)濃度差異除以初始蛋白質(zhì)濃度可反映酸化步驟的蛋白質(zhì)去除率。圖13展示相對(duì)于初始蛋白質(zhì)濃度(通過(guò)SDS-PAGE分析來(lái)測(cè)量)線性擬合蛋白質(zhì)濃度差異的斜率。觀察到在蛋白質(zhì)濃度變化與初始濃度之間存在極明確的線性關(guān)系，其中R2接近于1。斜率為0.9876，其對(duì)應(yīng)于98.76％的蛋白質(zhì)去除(假定可忽略溶液體積變化)。因此，對(duì)于所研究的所有血清型來(lái)說(shuō)，酸化步驟極為有效并且其平均去除超過(guò)98％的蛋白質(zhì)。
與酸化步驟類(lèi)似，同樣通過(guò)相對(duì)于初始蛋白質(zhì)載量繪示所去除的蛋白質(zhì)數(shù)量(吸附在炭上)來(lái)評(píng)估活性炭吸附步驟的效率(圖14)。觀察到在所去除蛋白質(zhì)與初始蛋白質(zhì)載量之間存在明確的線性關(guān)系，但R2(0.9723)不如酸化步驟高。因?yàn)榇司€性擬合的斜率對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)去除率，所以活性炭吸附步驟導(dǎo)致93.87％的蛋白質(zhì)去除。
根據(jù)對(duì)酸化和活性炭吸附步驟的分析，在實(shí)施所述兩個(gè)步驟后溶液中僅殘留約0.1％的蛋白質(zhì)。
實(shí)例1-3的結(jié)論 人們研發(fā)出經(jīng)縮短純化方法來(lái)代替用于肺炎鏈球菌莢膜多糖的現(xiàn)有純化方法。經(jīng)縮短純化方法可直接應(yīng)用于血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C和19F，并且稍加修改即可應(yīng)用于血清型19A。所述方法是以10L的規(guī)模使用經(jīng)DOC溶解的發(fā)酵培養(yǎng)液來(lái)實(shí)施。包括蛋白質(zhì)/PS、NA/PS和C-PS/PS比率在內(nèi)的雜質(zhì)水平都符合其各自的技術(shù)要求。PS產(chǎn)率超過(guò)50％并且與現(xiàn)有純化方法相當(dāng)。繪示工序間PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)/PS和NA/PS比率以比較不同血清型的性質(zhì)。根據(jù)實(shí)施100K UF/DF步驟前后的蛋白質(zhì)/PS比率，人們發(fā)現(xiàn)血清型1、5、9V、19F和18C最難純化。
步驟分析顯示，酸化和活性炭吸附步驟分別去除超過(guò)98％和90％的蛋白質(zhì)(通過(guò)SDS-PAGE來(lái)測(cè)量)。
實(shí)例4.在多糖產(chǎn)生中用非動(dòng)物源性溶解劑取代脫氧膽酸鈉 此實(shí)例研究是否可在上述產(chǎn)生基本上純化的肺炎鏈球菌莢膜多糖的方法中使用非動(dòng)物源性溶解劑作為脫氧膽酸鈉(DOC)的取代物。如上所述，DOC活化LytA蛋白，其為肺炎鏈球菌細(xì)胞壁生長(zhǎng)和分裂中所涉及的自溶素。LytA蛋白在其C-末端部分具有膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且已知lytA基因的突變可產(chǎn)生對(duì)DOC溶解具有抗性的LytA突變體。
實(shí)施快速微量滴定板分析來(lái)確定通過(guò)與DOC類(lèi)似的機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞溶解的化合物。已確定若干種DOC的非動(dòng)物源性替代物，其在殺滅肺炎鏈球菌細(xì)胞并釋放多糖方面與DOC同等有效。在使用標(biāo)準(zhǔn)條件處理后，用非動(dòng)物源性化合物產(chǎn)生的多糖的大小和純度與用DOC產(chǎn)生的多糖相同。
方法 細(xì)胞溶解以0.1-0.01％(v/v)的終濃度將欲測(cè)試化合物添加至發(fā)酵培養(yǎng)液中，并將溶液在37℃下培育一小時(shí)。然后將溶液在2-8℃下儲(chǔ)存過(guò)夜。第二天早上將溶液離心以去除所有細(xì)胞碎片。通過(guò)SEC-HPLC來(lái)分析無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液以測(cè)定所釋放多糖的濃度?？稍?-37℃之間的任一溫度下、優(yōu)選地在6.0-7.5的pH范圍下實(shí)施溶解。根據(jù)具體洗滌劑，洗滌劑的濃度通常介于0.05-0.2％之間。
微量滴定分析實(shí)施快速微量滴定板分析以檢驗(yàn)不同洗滌劑或表面活性劑對(duì)肺炎球菌的lytA依賴(lài)性溶解。在分析中使用兩對(duì)肺炎鏈球菌的等基因菌株；每對(duì)中的一個(gè)成員具有野生型lytA基因，而另一種菌株的lytA基因中有缺失。因此，如果溶解依賴(lài)于活性lytA功能，那么所述洗滌劑不能溶解突變體菌株。在Hy-大豆(HySoy)培養(yǎng)基中將四種菌株R6X、R6X ΔlytA、D39和D39 ΔlytA大致培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(OD600為約0.2-0.8；OD600＝600nm下的光密度)。然后離心細(xì)胞并使細(xì)胞沉淀再懸浮于Hy-大豆培養(yǎng)基中。向微量滴定板的各孔中添加100μL細(xì)胞懸浮液以及10μL洗滌劑原液或?qū)φ沼盟?。?6℃下保持約15分鐘后，用斯白麥克斯(Spectramax)

分光光度計(jì)(分子裝置公司(Molecular Devices)，森尼韋爾，CA)來(lái)測(cè)量樣品的OD600。對(duì)于新制備的細(xì)胞或冷凍并解凍的細(xì)胞觀察到以下結(jié)果暴露于DOC、十二烷基硫酸鈉、曲拉通

X-100和N-月桂酰肌氨酸中的野生型細(xì)胞的OD值都與培養(yǎng)基空白相當(dāng)，這表明發(fā)生溶解。另一方面，在這些洗滌劑存在下ΔlytA細(xì)胞未溶解，這表明這些洗滌劑溶解細(xì)胞需要LytA的功能。
用于對(duì)比分析研究的PS的分離使培養(yǎng)物在10L生物反應(yīng)器中于Hy-大豆培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)。使用NaOH或Na2CO3將pH控制在7.0左右。在生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)(表現(xiàn)為光密度不再進(jìn)一步增加)，用0.12％DOC或0.1％NLS處理培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物培育12-16小時(shí)。通過(guò)將經(jīng)處理培養(yǎng)液的樣品平鋪于TSA-血液瓊脂板上來(lái)證實(shí)殺滅細(xì)胞的效力。自澄清溶解產(chǎn)物使用標(biāo)準(zhǔn)程序(如上所述)來(lái)純化多糖。使用各種適合測(cè)定物質(zhì)純度和性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)來(lái)檢驗(yàn)經(jīng)純化多糖。
使用與折射率(RI)檢測(cè)器偶聯(lián)的SEC-HPLC來(lái)測(cè)定溶解產(chǎn)物的PS含量。
使用血清型1和6B來(lái)篩選非動(dòng)物源性溶解劑 使肺炎鏈球菌血清型1和6B在基于Hy-大豆的培養(yǎng)基中分開(kāi)生長(zhǎng)。分開(kāi)收獲各培養(yǎng)物并將其分別分配于試管中。為了篩選與DOC具有相當(dāng)?shù)娜芙饣钚缘姆莿?dòng)物源性化合物，將其制備為原液(存于適宜溶劑中)并添加至培養(yǎng)物中。在培育過(guò)夜后，對(duì)各試管實(shí)施離心并通過(guò)SEC-HPLC來(lái)測(cè)定每種血清型溶解產(chǎn)物中的PS含量，并將其與DOC對(duì)比。
使用lytA突變體來(lái)篩選非動(dòng)物源性溶解劑 使含有l(wèi)ytA突變的成對(duì)等基因菌株在基于Hy-大豆的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。收獲細(xì)胞并將其分配于微量滴定板的各孔中。添加測(cè)試化合物并培育培養(yǎng)物。在36℃下保持15min后，使用斯白麥克斯

板讀數(shù)器(分子裝置公司，森尼韋爾，CA)來(lái)測(cè)定各孔的光密度(OD600)(參見(jiàn)表17和18，其概述實(shí)例性化合物的兩個(gè)單獨(dú)測(cè)試的結(jié)果)。



根據(jù)上述篩選研究，確定DOC的以下非動(dòng)物源性溶解劑替代物癸烷磺酸、伊格保

CA-630(叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇；CAS編號(hào)9002-93-1；可購(gòu)自西格瑪-奧德里奇，密蘇里州圣路易斯)、N-月桂酰肌氨酸鈉(NLS)、亞氨基二丙酸月桂酯、十二烷基硫酸鈉、曲拉通

X-100、鵝脫氧膽酸鹽、豬脫氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽、?；敲撗跄懰猁}、?；蛆Z脫氧膽酸鹽、和膽酸鹽。
DOC溶解的PS與NLS溶解的PS的對(duì)比 以10L的規(guī)模根據(jù)實(shí)例1和2中所述使用本發(fā)明經(jīng)改良方法來(lái)純化肺炎鏈球菌多糖血清型1、4、5、6A、6B和7F。然而，在一組中使用NLS(0.1％)作為溶解劑，而在另一組中使用DOC(0.12％)作為溶解劑。
如上所述來(lái)測(cè)量PS產(chǎn)率、蛋白質(zhì)/PS比率、NA/PS比率和PS分子量，并且結(jié)果概述于表19中。這些結(jié)果顯示，在本發(fā)明純化方法中使用NLS作為溶解劑可獲得相對(duì)較高的PS產(chǎn)率和相對(duì)較低的蛋白質(zhì)和核酸水平。事實(shí)上，對(duì)于大多數(shù)所測(cè)試血清型來(lái)說(shuō)，使用NLS作為溶解劑獲得的PS產(chǎn)率高于使用DOC。

說(shuō)明書(shū)中所提及的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)案均表現(xiàn)出本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)案均以引用方式并入本文中，其程度如同表明將每一個(gè)別出版物或?qū)＠暾?qǐng)案明確地分別以引用方式并入本文中一般。
盡管為了清晰理解起見(jiàn)上文已通過(guò)闡釋和實(shí)例的方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行較詳細(xì)的描述，但是顯然可在隨附權(quán)利要求的范圍內(nèi)實(shí)施某些改變或修改。
權(quán)利要求
1、一種自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)細(xì)胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)生基本上純化的莢膜多糖的方法，所述方法包含以下步驟
(a)提供包含可產(chǎn)生選定肺炎鏈球菌血清型的細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液；
(b)用溶解劑溶解所述步驟(a)中的細(xì)菌細(xì)胞，由此產(chǎn)生包含細(xì)胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細(xì)胞溶解產(chǎn)物；
(c)使用離心或過(guò)濾去除細(xì)胞碎片來(lái)澄清所述步驟(b)中的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，由此產(chǎn)生澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物；
(d)超濾并透析過(guò)濾所述步驟(c)中的澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物以去除低分子量雜質(zhì)并提高多糖濃度，由此產(chǎn)生滲余物；
(e)使所述步驟(d)中的滲余物的pH降低至4.5以下以使蛋白質(zhì)與核酸沉淀，由此形成酸化滲余物溶液；
(f)將所述步驟(e)中形成的酸化滲余物溶液保持足夠長(zhǎng)時(shí)間以使所述沉淀物沉降，之后過(guò)濾或離心所述酸化滲余物溶液，由此產(chǎn)生澄清多糖溶液；
(g)通過(guò)活性炭過(guò)濾器過(guò)濾所述步驟(f)中的澄清多糖溶液；
(h)超濾并透析過(guò)濾所述步驟(g)產(chǎn)生的經(jīng)過(guò)濾溶液，由此產(chǎn)生經(jīng)濃縮純化多糖溶液；和
(i)使用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾所述步驟(h)產(chǎn)生的經(jīng)濃縮純化多糖溶液；
由此產(chǎn)生呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。
2、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選定肺炎鏈球菌血清型選自由以下組成的群組1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。
3、如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中使所述步驟(e)的pH降低至約3.5。
4、如權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其中所述步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約5.5至約7.5之間。
5、如權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其中所述步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.0至約7.5之間。
6、如權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其中所述步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.4。
7、如權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(e)自所述步驟(d)中的滲余物去除至少98％的蛋白質(zhì)。
8、如權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(g)自所述步驟(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質(zhì)。
9、如權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述步驟(g)中的活性炭過(guò)濾器包含木質(zhì)磷酸-活性炭。
10、如權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(f)包含將所述步驟(e)中形成的酸化滲余物溶液保持至少2小時(shí)。
11、如權(quán)利要求1至10中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述步驟(b)中的溶解劑是脫氧膽酸鈉。
12、如權(quán)利要求1至10中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述步驟(b)中的溶解劑為非動(dòng)物源性溶解劑。
13、如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述非動(dòng)物源性溶解劑選自由以下組成的群組癸烷磺酸、叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇、辛基苯酚氧化乙烯縮合物、N-月桂酰肌氨酸鈉(NLS)、亞氨基二丙酸月桂酯、十二烷基硫酸鈉、鵝脫氧膽酸鹽、豬脫氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽、牛磺脫氧膽酸鹽、?；蛆Z脫氧膽酸鹽、和膽酸鹽。
14、如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述非動(dòng)物源性溶解劑是N-月桂酰肌氨酸鈉。
15、一種自包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)生基本上純化的莢膜多糖的方法，所述方法包含以下步驟
(a)提供包含可產(chǎn)生肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液；
(b)用溶解劑溶解所述步驟(a)中的細(xì)菌細(xì)胞，由此產(chǎn)生包含細(xì)胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細(xì)胞溶解產(chǎn)物；
(c)使用離心或過(guò)濾去除細(xì)胞碎片來(lái)澄清所述步驟(b)中的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，由此產(chǎn)生澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物；
(d)在室溫和中性pH下于無(wú)鹽介質(zhì)中超濾并透析過(guò)濾所述步驟(c)中的澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物以去除低分子量雜質(zhì)并提高多糖濃度，由此產(chǎn)生無(wú)鹽滲余物；
(e)使所述步驟(d)中的無(wú)鹽滲余物的pH降低至4.5以下以使蛋白質(zhì)與核酸沉淀，由此形成酸化滲余物溶液；
(f)將所述步驟(e)中形成的酸化滲余物溶液在室溫下保持至少2小時(shí)以使所述沉淀物沉降，之后過(guò)濾或離心所述酸化滲余物溶液，由此產(chǎn)生澄清多糖溶液；
(g)通過(guò)活性炭過(guò)濾器過(guò)濾所述步驟(f)中的澄清多糖溶液；
(h)超濾并透析過(guò)濾所述步驟(g)產(chǎn)生的經(jīng)過(guò)濾溶液，由此產(chǎn)生經(jīng)濃縮純化多糖溶液；和
(i)使用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾所述步驟(h)產(chǎn)生的經(jīng)濃縮純化多糖溶液；
由此產(chǎn)生包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。
16、如權(quán)利要求15所述的方法，其中使所述步驟(e)中的pH降低至約3.5。
17、如權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約5.5至約7.5之間。
18、如權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.0至約7.5之間。
19、如權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述步驟(h)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.4。
20、如權(quán)利要求15至19中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(e)自所述步驟(d)中的無(wú)鹽滲余物去除至少98％的蛋白質(zhì)。
21、如權(quán)利要求15至20中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(g)自所述步驟(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質(zhì)。
22、如權(quán)利要求15至21中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述步驟(g)中的活性炭過(guò)濾器包含木質(zhì)磷酸-活性炭。
23、如權(quán)利要求15至22中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述步驟(b)中的溶解劑是脫氧膽酸鈉。
24、如權(quán)利要求15至22中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述步驟(b)中的溶解劑為非動(dòng)物源性溶解劑。
25、如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述非動(dòng)物源性溶解劑選自由以下組成的群組癸烷磺酸、叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇、辛基苯酚氧化乙烯縮合物、N-月桂酰肌氨酸鈉(NLS)、亞氨基二丙酸月桂酯、十二烷基硫酸鈉、鵝脫氧膽酸鹽、豬脫氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽、?；敲撗跄懰猁}、?；蛆Z脫氧膽酸鹽、和膽酸鹽。
26、如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述非動(dòng)物源性溶解劑是N-月桂酰肌氨酸鈉。
27、一種自包含血清型19A的肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)生基本上純化的莢膜多糖的方法，所述方法包含以下步驟
(a)提供包含可產(chǎn)生肺炎鏈球菌血清型19A的細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液；
(b)用溶解劑溶解所述步驟(a)中的細(xì)菌細(xì)胞，由此產(chǎn)生包含細(xì)胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細(xì)胞溶解產(chǎn)物；
(c)使用離心或過(guò)濾去除細(xì)胞碎片來(lái)澄清所述步驟(b)中的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，由此產(chǎn)生澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物；
(d)在約4℃和約6的pH下于磷酸鈉緩沖液中超濾并透析過(guò)濾所述步驟(c)中的澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物以去除低分子量雜質(zhì)并提高多糖濃度，由此產(chǎn)生滲余物；
(e)使所述步驟(d)中的滲余物的pH降低至4.5以下以使蛋白質(zhì)與核酸沉淀，由此形成酸化滲余物溶液；
(f)將所述步驟(e)中形成的酸化滲余物溶液在約4℃下保持至少2小時(shí)以使所述沉淀物沉降，之后過(guò)濾或離心所述酸化滲余物溶液，由此產(chǎn)生澄清多糖溶液；
(g)將所述步驟(f)中的澄清多糖溶液的pH調(diào)節(jié)至約6，由此產(chǎn)生pH經(jīng)調(diào)節(jié)的澄清多糖溶液；
(h)通過(guò)活性炭過(guò)濾器過(guò)濾所述步驟(g)中的pH經(jīng)調(diào)節(jié)的澄清多糖溶液；
(i)超濾并透析過(guò)濾所述步驟(h)中產(chǎn)生的經(jīng)過(guò)濾溶液，由此產(chǎn)生經(jīng)濃縮純化多糖溶液；和
(j)使用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾所述步驟(i)中產(chǎn)生的經(jīng)濃縮純化多糖溶液；
由此產(chǎn)生包含血清型19A的呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。
28、如權(quán)利要求27所述的方法，其中使所述步驟(e)中的pH降低至約3.5。
29、如權(quán)利要求27或28所述的方法，其中所述步驟(i)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約5.5至約7.5之間。
30、如權(quán)利要求27或28所述的方法，其中所述步驟(i)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.0至約7.5之間。
31、如權(quán)利要求27或28所述的方法，其中所述步驟(i)的透析過(guò)濾包含將pH調(diào)節(jié)至約7.4。
32、如權(quán)利要求27至31中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(e)自所述步驟(d)中的滲余物去除至少98％的蛋白質(zhì)。
33、如權(quán)利要求27至32中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(h)自所述步驟(g)的pH經(jīng)調(diào)節(jié)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質(zhì)。
34、如權(quán)利要求27至33中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述步驟(h)中的活性炭過(guò)濾器包含木質(zhì)磷酸-活性炭。
35、如權(quán)利要求27至34中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述步驟(d)中的磷酸鈉緩沖液為25mM磷酸鈉。
36、如權(quán)利要求27至35中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述步驟(b)中的溶解劑是脫氧膽酸鈉。
37、如權(quán)利要求27至35中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述步驟(b)中的溶解劑為非動(dòng)物源性溶解劑。
38、如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述非動(dòng)物源性溶解劑選自由以下組成的群組癸烷磺酸、叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇、辛基苯酚氧化乙烯縮合物、N-月桂酰肌氨酸鈉(NLS)、亞氨基二丙酸月桂酯、十二烷基硫酸鈉、鵝脫氧膽酸鹽、豬脫氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽、?；敲撗跄懰猁}、?；蛆Z脫氧膽酸鹽、和膽酸鹽。
39、如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述非動(dòng)物源性溶解劑是N-月桂酰肌氨酸鈉。
40、一種制造肺炎球菌疫苗的方法，其包含通過(guò)如權(quán)利要求1至39中任一權(quán)利要求所述的方法自肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)生基本上純化的莢膜多糖，以及將所述基本上純化的莢膜多糖用于肺炎球菌疫苗的制造中。
41、如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述肺炎球菌疫苗含有與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)的多糖。
全文摘要
本文闡述自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)細(xì)胞溶解產(chǎn)物培養(yǎng)液產(chǎn)生含有基本上純化的莢膜多糖的溶液的經(jīng)縮短方法。超濾并透析過(guò)濾澄清肺炎鏈球菌溶解產(chǎn)物，之后將pH調(diào)節(jié)至4.5以下、優(yōu)選地約3.5，從而使溶液中至少98％的蛋白質(zhì)沉淀而不嚴(yán)重影響多糖產(chǎn)率。此外，在超濾和透析過(guò)濾并酸化至低于4.5的pH后，使用活性炭進(jìn)行過(guò)濾，使至少90％的剩余蛋白質(zhì)沉淀而不嚴(yán)重影響多糖產(chǎn)率?？墒褂帽景l(fā)明經(jīng)縮短方法來(lái)純化的實(shí)例性非限制性肺炎鏈球菌血清型為1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一個(gè)實(shí)施例中，使用脫氧膽酸鈉(DOC)溶解肺炎鏈球菌細(xì)胞；而在另一實(shí)施例中溶解劑為非動(dòng)物源性溶解劑，例如N-月桂酰肌氨酸鈉(NLS)。
文檔編號(hào)C08B37/00GK101663327SQ200880012946
公開(kāi)日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2008年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月23日
發(fā)明者袁詠惠, 馬克·魯彭, 孫偉強(qiáng), 玲 楚, 約翰·辛普森, 詹姆斯·帕奇, 帕梅拉·芬克沙博諾, 賈斯廷·K·莫蘭 申請(qǐng)人:惠氏公司