一種a群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗 的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm)是腦膜炎和爆發(fā)性敗血癥的首要 致病菌，流行性腦脊髓膜炎（以下簡(jiǎn)稱為流腦）的發(fā)病常呈散發(fā)性，各病例之間并無(wú)明顯關(guān) 聯(lián)，通常以小規(guī)模方式爆發(fā)，在一些地區(qū)可轉(zhuǎn)變?yōu)闉?zāi)難性的、難以預(yù)料的地方性流行病。全 球每年流腦發(fā)病人數(shù)約為50萬(wàn)，死亡5萬(wàn)。Nm為需氧菌，革蘭染色陰性，有莢膜，一般成 對(duì)出現(xiàn)（雙球菌）。Nm根據(jù)莢膜多糖的化學(xué)組成可將其分成13個(gè)血清群，根據(jù)外膜蛋白 (Outer mem一brane protein，（MP)PorB和POrA的抗原性差異，又可分成不同的血清型和 血清亞型。A、B、C、Y和W135群腦膜炎球菌是主要的致病血清群，且血清群分布有顯著的地 理差異。在我國(guó)90 %以上的流腦病例是由A群腦膜炎奈瑟氏菌引起的。
[0003] 研究表明，A群腦膜炎球菌的莢膜多糖疫苗適用于2歲以上的兒童和成人。對(duì)于 小于18月齡的兒童，這種采用PRP的疫苗的有效率極低。
[0004] A群流腦結(jié)合疫苗的研制成功解決了疫苗在嬰幼兒中無(wú)效的問(wèn)題。結(jié)合疫苗比以 往的多糖疫苗具有更強(qiáng)的免疫原性和更好的免疫效果，在嬰幼兒中非常有效，即使在小年 齡嬰兒中使用A群流腦結(jié)合疫苗，也是安全有效的。
[0005] 在A群流腦結(jié)合疫苗制備的過(guò)程中，目前普遍運(yùn)用的制備方法是：利用液體發(fā)酵 的方法制備A群流腦菌液，殺菌后再經(jīng)CDAP沉淀、乙醇沉淀、冷酚抽提、無(wú)水乙醇和丙酮洗 滌等步驟獲得精制A群流腦莢膜多糖，再用CNBr活化Hib莢膜多糖后連接己二酰肼，然后 在碳二亞胺的催化作用下A群流腦莢膜多糖通過(guò)己二酰肼的橋連作用與破傷風(fēng)類毒素蛋 白結(jié)合，最后經(jīng)凝膠過(guò)濾層析純化收集高分子多糖蛋白結(jié)合物，即為多糖蛋白結(jié)合疫苗原 液。
[0006] 目前，A群流腦結(jié)合疫苗制備的過(guò)程中，A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的結(jié)合 多糖收率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制 備方法，以克服現(xiàn)有A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的結(jié)合多糖收率低的問(wèn)題。
[0008] 此外，本發(fā)明還包括一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明解決上述問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是： 一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，包括以下步驟： Bl :將A群流腦莢膜多糖用注射用水稀釋成8mg/ml的溶液，恒溫至20°C，調(diào)節(jié)pH至 10. 50； B2 :加入與Bl所述多糖等質(zhì)量的溴化氰進(jìn)行活化處理，維持pHlO. 5活化20分鐘，調(diào) 節(jié)pH至8. 5 ; B3 :加入與BI所述多糖溶液等體積、等濃度的癸二酸二酰肼溶液進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，維持 pH8. 5反應(yīng)15分鐘； B4 :將B3所得的反應(yīng)物多次稀釋-超濾濃縮，去掉殘余溴化氰，得到A群流腦多糖-癸 二酸二酰肼衍生物； B5 :在M所得的A群流腦多糖-癸二酸二酰肼衍生物中加入與與Bl所述多糖等質(zhì)量 的破傷風(fēng)類毒素蛋白溶液，再用注射用水稀釋，使多糖終濃度為3mg/ml ; B6:將B5所得溶液混勻后置冰浴中，加入碳二亞胺粉末至終濃度為30 mmol / L，維 持pH5. 5,于2~8°C反應(yīng)60分鐘，調(diào)PH至7. 0置2~8°C靜置10小時(shí)； B7:將B6所得的反應(yīng)物經(jīng)S印harose 4FF凝膠柱分離純化，收集V。附近的洗脫液，將 收集到的洗脫液除菌過(guò)濾，得到A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。
[0010] 在莢膜多糖與破傷風(fēng)類毒素蛋白結(jié)合過(guò)程中，橋連劑是非常重要的，通過(guò)橋連作 用可以克服莢膜多糖與破傷風(fēng)類毒素蛋白的空間位阻，使多糖更容易與破傷風(fēng)類毒素蛋白 通過(guò)共價(jià)鍵連接在一起。現(xiàn)有的結(jié)合疫苗使用的橋連劑是己二酰肼，己二酰肼分子兩端各 具有一個(gè)酰肼基，容易與活化后的多糖(或破傷風(fēng)類毒素）生成酰胺鍵，共價(jià)連接在一起，目 前，A群流腦結(jié)合疫苗制備的過(guò)程中，己二酰肼連接到莢膜多糖上的效率很低，需要過(guò)量添 加，而制得的莢膜多糖-己二酰肼衍生物與破傷風(fēng)類毒素蛋白結(jié)合的效率也不高，造成一 定的資源浪費(fèi)，導(dǎo)致A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的結(jié)合多糖收率低，本發(fā)明將傳統(tǒng) 使用的偶聯(lián)劑己二酰肼替換成癸二酸二酰肼，癸二酸二酰肼是一種結(jié)構(gòu)與己二酰肼相似的 小分子化合物，區(qū)別在于碳鏈上多2個(gè)亞甲基，分子鏈更長(zhǎng)，用作結(jié)合疫苗連接劑，更能克 服生物大分子相互間的空間位阻，提高結(jié)合收率。
[0011] -種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法的應(yīng)用，將一種A群腦膜炎球 菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法應(yīng)用于A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯(lián)物的制備。
[0012] 綜上，本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明將癸二酸二酰肼作為A群流腦結(jié)合疫苗制備的過(guò)程中的偶聯(lián)劑，癸二酸二酰肼 相比己二酰肼在碳鏈上多2個(gè)亞甲基，分子鏈更長(zhǎng)，更能克服生物大分子相互間的空間位 阻，提尚結(jié)合收率。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步地的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0014] 實(shí)施例： 一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，包括以下步驟： Bl :將A群流腦莢膜多糖用注射用水稀釋成8mg/ml的溶液，恒溫至20°C，調(diào)節(jié)pH至 10. 50 ； B2:加入與Bl所述多糖等質(zhì)量的溴化氰進(jìn)行活化處理，維持pHlO. 5活化20分鐘，調(diào) 節(jié)pH至8. 5 ; B3:加入與Bl所述多糖溶液等體積、等濃度的癸二酸二酰肼溶液進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，維持 pH8. 5反應(yīng)15分鐘； B4:將B3所得的反應(yīng)物多次稀釋-超濾濃縮，去掉殘余溴化氰，得到A群流腦多糖-癸 二酸二酰肼衍生物； B5 :在M所得的A群流腦多糖-癸二酸二酰肼衍生物中加入與與Bl所述多糖等質(zhì)量 的破傷風(fēng)類毒素蛋白溶液，再用注射用水稀釋，使多糖終濃度為3mg/ml ; B6 :將B5所得溶液混勻后置冰浴中，加入碳二亞胺粉末至終濃度為30 mmol / L，維 持pH5. 5,于8°C反應(yīng)60分鐘，調(diào)PH至7. 0置8°C靜置10小時(shí)； B7 :將B6所得的反應(yīng)物經(jīng)S印harose 4FF凝膠柱分離純化，收集V。附近的洗脫液，將 收集到的洗脫液除菌過(guò)濾，得到A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。
[0015]-種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法的應(yīng)用，將一種A群腦膜炎球 菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法應(yīng)用于A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯(lián)物的制備。
[0016]對(duì)得到的A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯(lián)物取樣按藥典方法檢測(cè)多糖含量、 蛋白含量、游離多糖、相對(duì)分子質(zhì)量，于8°C保存，共制備3批，結(jié)果如表1所示： 表1
另按同樣的方法使用己二酰肼作為偶聯(lián)劑，進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，制備結(jié)合疫苗原液即A群 流腦英I吳多糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，各項(xiàng)指標(biāo)如表2所;^;: 表2
本發(fā)明制備A群流腦莢膜多糖結(jié)合物的多糖收率在30%以上，與傳統(tǒng)結(jié)合方法15~ 20%的收率對(duì)比，多糖收率有很大的提高，節(jié)省了生產(chǎn)原料，使單劑成品疫苗的人力、原料、 能源成本得到很大程度的降低。
[0017]如上所述，可較好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： Bl :將A群流腦莢膜多糖用注射用水稀釋成8mg/ml的溶液，恒溫至20°C，調(diào)節(jié)pH至 10. 50 ； B2 :加入與Bl所述多糖等質(zhì)量的溴化氰進(jìn)行活化處理，維持pHlO. 5活化20分鐘，調(diào) 節(jié)pH至8. 5 ; B3 :加入與Bl所述多糖溶液等體積、等濃度的癸二酸二酰肼溶液進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，維持 pH8. 5反應(yīng)15分鐘； B4 :將B3所得的反應(yīng)物多次稀釋-超濾濃縮，去掉殘余溴化氰，得到A群流腦多糖-癸 二酸二酰肼衍生物； B5 :在M所得的A群流腦多糖-癸二酸二酰肼衍生物中加入與與Bl所述多糖等質(zhì)量 的破傷風(fēng)類毒素蛋白溶液，再用注射用水稀釋，使多糖終濃度為3mg/ml ; B6 :將B5所得溶液混勻后置冰浴中，加入碳二亞胺粉末至終濃度為30 mmol / L，維 持pH5. 5,于2~8°C反應(yīng)60分鐘，調(diào)PH至7. 0置2~8°C靜置10小時(shí)； B7 :將B6所得的反應(yīng)物經(jīng)S印harose 4FF凝膠柱分離純化，收集V。附近的洗脫液，將 收集到的洗脫液除菌過(guò)濾，得到A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。2. -種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要 求1所述的一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法應(yīng)用于A群流腦莢膜多糖與 載體蛋白的偶聯(lián)物的制備。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法及應(yīng)用，制備方法包括以下步驟：A群流腦莢膜多糖的稀釋、活化、與癸二酸二酰肼偶聯(lián)到A群流腦多糖-癸二酸二酰肼衍生物；再將A群流腦多糖-癸二酸二酰肼衍生物與破傷風(fēng)類毒素溶液在碳二亞胺的催化反應(yīng)得到A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。本發(fā)明將癸二酸二酰肼作為A群流腦結(jié)合疫苗制備的過(guò)程中的偶聯(lián)劑，癸二酸二酰肼相比己二酰肼在碳鏈上多2個(gè)亞甲基，分子鏈更長(zhǎng)，更能克服生物大分子相互間的空間位阻，提高結(jié)合收率。
【IPC分類】A61P31/04, A61K39/385, A61K39/095
【公開號(hào)】CN105031643
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510543858
【發(fā)明人】伍長(zhǎng)華, 王乾, 李洪光
【申請(qǐng)人】成都?xì)W林生物科技股份有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年8月31日