一種鴨疫里默氏菌莢膜抗原蜂膠疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鴨疫里默氏菌莢膜抗原蜂膠疫苗的制備方法，屬于獸醫(yī)傳染病學(xué)領(lǐng)域。它由鴨疫里默氏菌莢膜抗原與蜂膠制成，其含莢膜蛋白量為1.0~2.0mg/mL，含蜂膠干物質(zhì)10~15mg/mL。它主要通過制備鴨疫里默氏菌莢膜抗原、制備蜂膠佐劑、配制菌苗來獲得疫苗，其免疫產(chǎn)生期為10d，免疫持續(xù)期長達(dá)90d。制成的疫苗對鴨、鵝等具有較好安全性，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)。
【專利說明】一種鴨疫里默氏菌莢膜抗原蜂膠疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鴨疫里默氏菌莢膜抗原蜂膠疫苗的制備方法，屬于獸醫(yī)傳染病學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨疫里默氏菌O?.也稱為鴨疫里氏桿菌，是一種革蘭氏陰性的小桿菌,屬黃桿菌科anatipestifer屬,可形成莢膜,無芽胞,無鞭毛。鴨疫里默氏菌病是由該菌引起的一種嚴(yán)重危害雛鴨、雛火雞和雛鵝等多種禽類的高致病性、接觸性傳染病，I~8周齡的雛禽易感，呈急性或慢性敗血癥經(jīng)過，病變以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎和腦膜炎為特征，俗稱傳染性衆(zhòng)膜炎{Infectious Serositis ),導(dǎo)致感染禽死亡、消瘦、胴體品質(zhì)下降等造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病于1904年Riemer首次報(bào)道在鵝群中發(fā)生，于1932年Hendrickson報(bào)道在美國紐約長島的三個(gè)鴨場爆發(fā)。在我國，1975年鄺榮祿等首次在廣州發(fā)現(xiàn)了該病，1982年郭玉璞等首次成功分離鑒定出該菌?，F(xiàn)在該病呈世界性分布，在我國所有集約化養(yǎng)鴨、養(yǎng)鵝地區(qū)均有發(fā)生，是當(dāng)前危害水禽養(yǎng)禽業(yè)尤其是養(yǎng)鴨業(yè)的主要細(xì)菌性傳染病之一。
[0003]多種藥物在鴨疫里默氏菌病的防控中起了積極作用，但隨著藥物的長期應(yīng)用，鴨疫里默氏菌的耐藥性也越來越嚴(yán)重。耐藥菌的出現(xiàn)使得藥物的防控效果大打折扣，為提高療效，多種藥物超劑量或超療程應(yīng)用的情況屢見不鮮，一方面導(dǎo)致水禽產(chǎn)品中的藥物殘留增加，攝入人體后影響人類的健康；另一方面，水禽場排泄物向周圍環(huán)境排放，排泄物中的藥物殘留又成為環(huán)境污染物，給生態(tài)環(huán)境帶來不利影響。隨著藥物治療的弊端、藥物殘留及環(huán)境問題的日益凸顯，隨著人們對綠色食品日益迫切的需要，養(yǎng)殖業(yè)必須走可持續(xù)發(fā)展的道路，而免疫接種結(jié)合生物安全措施才是最理想的防制方法。
[0004]目前國內(nèi)外應(yīng)用最多的是滅活苗，值得注意的是，由于鴨疫里默氏菌各血清型之間缺乏交叉保護(hù)，應(yīng)選擇與流行菌株相同的血清型來制備滅活菌苗。滅活菌苗的安全性較好，不會(huì)引起排毒，但保護(hù)效力不如弱毒疫苗，另外，滅活苗必須注射、價(jià)格較貴、對水禽的應(yīng)激也大。弱毒疫苗免疫效果好，在美國和加拿大已廣泛應(yīng)用。但其可發(fā)生潛伏感染，并有散毒的危險(xiǎn)，國內(nèi)還未見應(yīng)用的報(bào)道。新型疫苗如基因工程苗等還處在探索階段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種鴨疫里默氏菌莢膜抗原蜂膠疫苗的制備方法，通過該方法制得疫苗能夠有效保護(hù)鴨疫里默氏菌的攻擊，可使目前我國大量水禽生產(chǎn)者減少經(jīng)濟(jì)損失、提聞養(yǎng)殖效益。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:鴨疫里默氏菌購于國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。
[0007]其制備方法包括:
I)培養(yǎng)基的制備:改良LB培養(yǎng)基:稱取胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 5 g，加蒸餾水800 mL，搖勻溶解，用I M NaOH調(diào)pH值為7.5-7.7，補(bǔ)足蒸餾水至1000 mL，10-20磅高壓20-30 min，待其自然冷卻至室溫后加入體積比為2%的新生牛血清，分裝，2°C~8°C保存；
改良TSA平板:稱取胰蛋白胨大豆瓊脂粉4 g，加入100 mL蒸餾水中，煮沸溶解，10-20磅高壓20-30 min，待其自然冷卻至55-65°C時(shí)加入2 mL的新生牛血清，混勻后分裝制成平板，2°C~8°C保存；
2)菌種制備:取滅菌注射器吸2.5 mL的改良LB培養(yǎng)基，加入鴨疫里默氏菌菌種凍干瓶中，將溶解的菌種液劃線接種于I個(gè)改良TSA平板上，置體積分?jǐn)?shù)5%C02培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)24-26 h;挑選圓形微突起、表面光滑奶油狀半透明的特征單菌落疒3個(gè)，接種于20 mL改良LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16 -18 h后取出，作為一級(jí)種子，2°C~8°C可保存5 d ;取一級(jí)種子I mL接種于100 mL改良LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16 -18 h后取出，作為二級(jí)種子，2°C~8°C可保存5 d ；
3)莢膜提取:按1%體積比，將二級(jí)種子接種于改良LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16-18h后取出，10000 g離心20 -30 min，棄上清，按菌泥濕重每I g加入20 mL脫膜液，吹打混勻，于55-57°C水浴鍋中用電動(dòng)攪拌器不間斷攪拌1-2 h，然后將脫膜液相繼用冷水浴、冰水浴，分成小份于冰箱中冷卻，直至液體發(fā)白但確保不能結(jié)冰，10000 g離心50-60 min，取上清，裝入透析袋內(nèi)，緊塞透析管口，懸掛于盛有蒸餾水的透析箱橫梁上，2°C 靜置，每12h換水I次，換3-4次水，最后換水12 h后收集透析袋內(nèi)液體，即為鴨疫里默氏菌莢膜抗原；
4)鴨疫里默氏菌莢膜提原的蛋白濃度測定:用紫外吸收法快速計(jì)算莢膜抗原中的蛋白濃度，測定3次，取平均值；
5)莢膜提原蜂膠疫苗的制備:取純度在80%以上的蜂膠，磨碎，溶解于無水乙醇中，根據(jù)要求配成10(Tl50 mg/mL濃度的蜂膠乙醇溶液，將鴨疫里默氏菌莢膜抗原和蜂膠乙醇溶液混合配成混懸液，確保莢膜抗原的終濃度為1.0-2.0 mg/mL,蜂膠干物質(zhì)含量為10-?5mg/mL，無菌分裝于100 mL的疫苗瓶內(nèi)`，密封保存，2°C~8°C保存。
[0008]所述的脫膜液配方為NaCl 290 g，十二烷基硫酸鈉25 g，加入10000 mL蒸餾水中，10-20磅高壓20-30 min，室溫保存。
[0009]所述方法制得的鴨疫里默氏菌莢膜抗原蜂膠疫苗。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:1、與傳統(tǒng)的全菌體滅活疫苗相比，該疫苗僅含有鴨疫里默氏菌最外層的莢膜(其主要成分為蛋白質(zhì)和多糖)，不含有鴨疫里默氏菌內(nèi)的任何可能導(dǎo)致對禽類有毒性的物質(zhì)，所以安全性更好。
[0011]2、細(xì)菌的蛋白成分很多，有的具有免疫原性，大部分不具有免疫原性。全菌體滅活疫苗使用時(shí)，眾多不具有免疫原性的蛋白會(huì)干擾機(jī)體對免疫原性蛋白的免疫應(yīng)答。而該疫苗的抗原成分僅為具有免疫原性的鴨疫里默氏菌的莢膜，免疫機(jī)體后不存在雜蛋白的干擾問題。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1
1、細(xì)菌的來源:鴨疫里默氏菌購于國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心
2、鴨疫里默氏菌莢膜抗原的提取2.1培養(yǎng)基的制備:
2.1.1改良LB培養(yǎng)基:稱取胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 5 g，加蒸餾水800 mL,搖勻溶解，用I M NaOH調(diào)pH值為7.6，補(bǔ)足蒸餾水至1000 mL，15磅高壓30 min，待其自然冷卻至室溫后加入體積比為2%的新生牛血清，分裝，4°C保存。
[0013]2.1.2改良TSA平板:稱取胰蛋白胨大豆瓊脂粉(TSA) 4 g，加入100 mL蒸餾水中，煮沸溶解，15磅高壓3 min，待其自然冷卻至60°C左右時(shí)加入2 mL的新生牛血清，混勻后分裝制成平板，4°C保存。
[0014]2.2菌種制備:取滅菌注射器吸2.5 mL的改良LB培養(yǎng)基，加入菌種凍干瓶中，將溶解的菌種液劃線接種于I個(gè)改良TSA平板上，置5%C02培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)24 h。挑選圓形微突起、表面光滑奶油狀半透明的特征單3個(gè)，接種20 mL改良LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16 h后取出，作為一級(jí)種子，4°C可保存5 d。取一級(jí)種子I mL接種于100 mL改良LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16 h后取出，作為二級(jí)種子，4°C可保存5 d。
[0015]2.3莢膜提取:按1%體積比，將二級(jí)種子接種于改良LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16 h后取出，10000 g離心20 min，棄上清，按菌泥濕重每I g加入脫膜液20 mL(稱取NaCl290 g，十二烷基硫酸鈉25 g，加入10000 mL蒸餾水中，15磅高壓30 min，室溫保存)，吹打混勻，于56°C水浴 鍋中用電動(dòng)攪拌器不間斷攪拌1.5 h。然后將脫膜液相繼用冷水浴、冰水浴、分成小份于冰箱中冷卻，直至液體發(fā)白但確保不能結(jié)冰。10000 g離心50 min，取上清，裝入透析袋內(nèi)，緊塞透析管口，懸掛于盛有蒸餾水的透析箱橫梁上，4°C靜置，每12 h換水I次，共換3次水。最后換水后12 h收集透析袋內(nèi)液體，即為鴨疫里默氏菌莢膜抗原。
[0016]3、鴨疫里默氏菌莢膜提原的蛋白濃度測定:用紫外吸收法快速計(jì)算莢膜抗原中的蛋白濃度。設(shè)備選擇Thermo公司的NanoDrop超微量分光光度計(jì)，吸取2 μ L莢膜抗原按操作說明書進(jìn)行。測定3次，取平均值。
[0017]4、莢膜提原蜂膠疫苗的制備:取80%純度的蜂膠，磨碎，溶解于無水乙醇中，根據(jù)要求配成適當(dāng)濃度的蜂膠乙醇溶液，將莢膜抗原和蜂膠乙醇混合配成混懸液，確保莢膜抗原的終濃度為2.0 mg/mL，蜂膠干物質(zhì)含量為15 mg/mL，無菌分裝于100 mL的疫苗瓶內(nèi)，密封保存，4 °C保存。
[0018]5、莢膜提原蜂膠疫苗的檢驗(yàn):
5.1無菌檢驗(yàn):按《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中的規(guī)定配制無菌硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(每瓶50 mL)、T.G (硫乙醇酸鹽)小管、2支G.A (酪胨瓊脂)斜面和I支G.P(葡萄糖蛋白胨湯)小管。無菌吸取I mL疫苗，沿著瓶壁注入50 mL無菌硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，蓋好蓋子，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3 do將培養(yǎng)瓶稍傾斜，從瓶中吸取I ml液體(注意避免油滴，吸取表面上清)，然后分別加入2支T.G小管、2支G.A斜面和I支G.P小管，每支0.2 mL，均沿小管壁緩慢加入，注意加好斜面時(shí)，輕輕晃動(dòng)幾下，讓其鋪滿斜面。取I支T.G小管、I支G.A斜面和I支G.P小管放置25°C培養(yǎng)；另取I支T.G小管和I支G.A斜面放置37°C培養(yǎng)，均培養(yǎng)5 d后觀察，均應(yīng)無細(xì)菌生長。
[0019]5.2安全檢驗(yàn):用5~10日齡健康櫻桃谷鴨10羽，各頸部背側(cè)皮下注射疫苗2 mL,觀察7 d，觀察是否出現(xiàn)疫苗引起的局部或全身不良反應(yīng)。試驗(yàn)鴨局部會(huì)有I或2 d的觸痛，3 d后觸痛消失。所有試驗(yàn)鴨均不會(huì)出現(xiàn)全身不良反應(yīng)。
[0020]5.3效力檢驗(yàn):采用免疫攻毒法，用7日齡健康易感櫻桃谷鴨20羽，其中10羽各頸部背側(cè)皮下注射疫苗I HiL為免疫組，另10羽不處理作為陰性對照，同條件隔離飼養(yǎng)。免疫后14 d，所有鴨每羽皮下注射制苗用活菌，攻菌后觀察5 d，記錄死亡數(shù)并從死亡鴨腦組織中分離細(xì)菌。觀察期滿撲殺所有存活鴨，檢查病變，同時(shí)見心包炎和肝周炎的存活鴨判為嚴(yán)重病變鴨，與死亡鴨合并計(jì)算死亡率。計(jì)算對照組的死亡率和免疫組的保護(hù)率。對照組的死亡率為80%，免疫組的保護(hù)率為80%。
[0021]5.4免疫產(chǎn)生期測定:采用免疫攻毒法，用7日齡健康易感櫻桃谷鴨60羽，其中30羽各頸部背側(cè)皮下注射疫苗I mL為免疫組，另30羽不處理作為陰性對照，同條件隔離飼養(yǎng)。免疫后4 d、7 d、10 d，取免疫組和對照組各10羽鴨，每羽皮下注射制苗用活菌，攻菌后觀察5 d，記錄死亡數(shù)并從死亡鴨腦組織中分離細(xì)菌。觀察期滿撲殺所有存活鴨，檢查病變，同時(shí)見心包炎和肝周炎的存活鴨判為嚴(yán)重病變鴨，與死亡鴨合并計(jì)算死亡率。試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1，從中可以看出，免疫后10 d，免疫組的保護(hù)率為70%，即免疫產(chǎn)生期為10 d。
[0022]表1免疫產(chǎn)生期試驗(yàn)
【權(quán)利要求】
1.一種鴨疫里默氏菌莢膜抗原蜂膠疫苗的制備方法，其特征在于:其制備方法包括: 1)培養(yǎng)基的制備: 制備改良LB培養(yǎng)基及改良TSA平板。 2)菌種制備:取滅菌注射器吸2.5 mL的改良LB培養(yǎng)基，加入鴨疫里默氏菌菌種凍干瓶中，將溶解的菌種液劃線接種于I個(gè)改良TSA平板上，置體積分?jǐn)?shù)5%C02培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)24-26 h;挑選圓形微突起、表面光滑奶油狀半透明的特征單菌落疒3個(gè)，接種于20 mL改良LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16 -18 h后取出，作為一級(jí)種子，2°C~8°C可保存5 d ;取一級(jí)種子I mL接種于100 mL改良LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16 -18 h后取出，作為二級(jí)種子，2°C~8°C可保存5 d ； 3)莢膜提取:按1%體積比，將二級(jí)種子接種于改良LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16-18h后取出，10000 g離心20 -30 min，棄上清，按菌泥濕重每I g加入20 mL脫膜液，吹打混勻，于55-57°C水浴鍋中用電動(dòng)攪拌器不間斷攪拌1-2 h，然后將脫膜液相繼用冷水浴、冰水浴，分成小份于冰箱中冷卻，直至液體發(fā)白但確保不能結(jié)冰，10000 g離心50-60 min，取上清，裝入透析袋內(nèi)，緊塞透析管口，懸掛于盛有蒸餾水的透析箱橫梁上，2°C 靜置，每12h換水I次，換3-4次水，最后換水12 h后收集透析袋內(nèi)液體，即為鴨疫里默氏菌莢膜抗原； 4)鴨疫里默氏菌莢膜提原的蛋白濃度測定:用紫外吸收法快速計(jì)算莢膜抗原中的蛋白濃度，測定3次，取平均值； 5)莢膜提原蜂膠疫苗的制備:取純度在80%以上的蜂膠，磨碎，溶解于無水乙醇中，根據(jù)要求配成10(Tl50 mg/mL濃度的蜂膠乙醇溶液，將鴨疫里默氏菌莢膜抗原和蜂膠乙醇溶液混合配成混懸液，確保莢膜抗原的終濃度為l.(T2.0 mg/mL，蜂膠干物質(zhì)含量為10-?5mg/mL，無菌分裝于100 mL的疫苗瓶內(nèi)，密封保存，2°C~8°C保存。
2.一種如權(quán)利要求1所述方法制得的鴨疫里默氏菌莢膜抗原蜂膠疫苗。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK103656636SQ201310678083
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】程龍飛, 黃瑜, 陳紅梅, 傅光華, 施少華, 萬春和, 傅秋玲, 林建生 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所