豬鏈球菌SBP_bac_5基因缺失株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細菌基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種不含抗性標(biāo)記的豬鏈球菌血清7型 SBP_bac_5基因缺失株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬鏈球菌（Streptococcus suis，S. suis)為革蘭氏陽性球菌，是一種重要的人畜 共患病病原菌。我國曾于1998年和2005年暴發(fā)了兩次較大規(guī)模的豬及人感染S. suis病的 事件，累計報告人感染S. suis病例達204例，其中死亡38例，嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生安全。至 今為止，對此病的預(yù)防仍缺乏有效的疫苗。目前研宄表明S. suis莢膜抗原血清型有35種 以上，其中血清2型為世界范圍內(nèi)的主要致病菌型。然而，近幾年在全世界病豬檢測中頻繁 報導(dǎo)S. suis 7型，其所占的比例有增多趨勢，在某些地區(qū)甚至超過了 2型，特別是近幾年湖 北省境內(nèi)就已有7型感染增多的報道。根據(jù)本實驗室的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，現(xiàn)地流行的血 清型呈多樣性存在，血清7型的比例有增高的趨勢，基于上述現(xiàn)象，對S. suis 7型各方面特 性的研宄也就顯得非常必要。
[0003] 文獻報道，SBP_bac_5蛋白具有類似分子伴侶的活性，在病毒感染過程中發(fā)揮重要 作用。如分子伴侶蛋白具有促進病毒蛋白發(fā)生正確折疊和集合的功能，并且對腺病毒、痘苗 病毒和乳頭瘤病毒的生長具有重要作用，已有研宄證實SBP_bac_5是一個假定的毒力相關(guān) 因子，具有類似分子伴侶的活性，在感染過程中發(fā)揮重要的作用，而其在細菌中的作用至今 仍無報道。我們通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)和熒光定量PCR檢測表明SBP_bac_5在S.suis7型 強弱毒株的表達量顯著差異，即SBP_bac_5蛋白在S.suis7型強毒株WC-ss7中表達量比 在弱毒株M13中表達量多。通過預(yù)測軟件分析SBP_bac_5蛋白有轉(zhuǎn)運蛋白活性，且為假定 分泌蛋白，其分子功能是直接運輸物質(zhì)如大分子、小分子、離子等進出細胞；這更進一步提 示SBP_bac_5基因與S.suis致病力的相關(guān)性。
[0004]目前商品化的全菌滅活疫苗和亞單位疫苗能夠減輕同源血清型菌引起的臨床癥 狀并降低死亡率，但不能阻止組織病變、慢性感染，對異源血清型菌的感染也不能提供完全 的交叉保護。因此，采用滅活苗和亞單位疫苗免疫不是最好的選擇，迫切需要更安全、更高 效的新型疫苗來預(yù)防和控制該傳染病的發(fā)生與流行。而且弱毒活疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有能 夠重復(fù)提呈抗原和持續(xù)性刺激免疫應(yīng)答的優(yōu)點。因此通過缺失毒力因子構(gòu)建弱毒活疫苗已 成為國內(nèi)外疫苗研宄的熱點。
[0005] 鑒于上述背景，為準(zhǔn)確闡明SBP_bac_5在細菌中的生物活性及功能，采用RecA同 源重組系統(tǒng)，利用溫敏自殺質(zhì)粒pSET4s作為敲除的載體構(gòu)建我國流行的S. suis 7型菌株 的SBP_bac_5基因缺失株，研宄其對動物的致病性和免疫原性，為S. suis的防治及S. suis 疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的之一是提供一種不含抗性標(biāo)記的豬鏈球菌血清7型SBP_bac_5基因缺 失株，該缺失株是將豬鏈球菌菌株SBP_bac_5編碼的基因進行敲除的菌株。
[0007] 本發(fā)明的豬鏈球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株衍生于本試驗室研宄人員分離 的S. suis血清7型WC-ss7流行株（保藏號為CGMCC No. 3343)，將其基因組上的SBP_bac_5 基因缺失，使SBP_bac_5蛋白不表達，獲得了不含抗性標(biāo)記的SBP_bac_5基因缺失突變株。
[0008] 本發(fā)明的豬鏈球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株為不含抗性標(biāo)記的SS A SBP_ bac_5,其分類命名為豬鏈球菌Streptococcus suis，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國微生物研宄所，保藏編號 為：CGMCC No. 10076,保藏日期為2014年11月28日。
[0009] 本發(fā)明目的之二是提供一種構(gòu)建所述的不含抗性標(biāo)記的豬鏈球菌血清7型SBP_ bac_5基因缺失株的方法，其特征是將含有待敲除的目的基因的上、下游同源臂基因DNA片 斷的pSET4s質(zhì)粒導(dǎo)入所述的豬鏈球菌血清7型菌株，經(jīng)同源重組而實現(xiàn)的。其中，所述的 DNA片斷從上游至下游依次是SBP_bac_5上游同源臂、SBP_bac_5下游同源臂，與所述的豬 鏈球菌7型菌株的SBP_bac_5蛋白編碼基因的上游序列和下游序列發(fā)生同源重組，得到的 SBP_bac_5基因缺失株SS A SBP_bac_5。具體構(gòu)建方法如下：
[0010] 1、以S. suis血清7型WC-SS7株基因組為模板，以SBP_bac_5K0Pl/2為引物擴增 上游同源臂，以SBP_bac_5K0P5/6為引物擴增下游同源臂，以2段PCR產(chǎn)物為模板，以SBP_ bac_5K0Pl/6為引物，通過融合PCR方法擴增上下游同源臂的融合片段。純化該融合產(chǎn)物， 克隆至PMD-18T載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細胞，經(jīng)過PCR和酶切鑒定后測序。將測 序正確的目的片段，連接到pSET4s載體上，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細胞，再經(jīng)PCR和酶 切鑒定，最終獲得敲除載體。pSET4s載體圖譜如圖1所示。
[0011] 2、取10yL基因敲除載體電轉(zhuǎn)化100yLWC-ss7株感受態(tài)細胞，經(jīng)30°C、C02孵箱 內(nèi)培養(yǎng)40h，在帶壯觀霉素抗性Sp^^THB平板上長出幾十個菌落，挑選正確的克隆先后 經(jīng)過30°C雙交換和40°C質(zhì)粒丟失，最后同時涂布在沒有抗性和有Spc抗性的平板篩選突 變體，如在有抗性的板上不生長、在無抗性的平板上生長，挑取在無抗性平板上單克隆進行 PCR篩選，獲得基因敲除突變體。以提取的突變株基因組為模板，分別用不同引物進行PCR 鑒定，將鑒定正確的定義為SS A SBP_bac_5。將SBP_bac_5基因缺失株接種動物，根據(jù)接種 動物的臨床表現(xiàn)和存活情況分析，SSASBP_bac_5的毒力弱于親本株WC-ss7。
[0012] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，所述的SBP_bac_5編碼基因的序列如SEQN0. 1所示， SBP_bac_5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0013] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，擴增上游同源臂序列的引物在5'端引入了 Sal I酶 切位點，斜體部分是與下游同源臂序列相融合部分，序列如下所示：
[0014] SBP_bac_5K0Pl ：GCCGTCGACAAAATGAGAAAATGATGA
[0015] SBP_bac_5K0P2 ： TACACCTTTATCTTTACCTTTCACATCA
[0016] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，擴增下游同源臂序列的引物在5 '端引入了 BamH I 酶切位點，斜體部分是與上游同源臂序列相融合部分，序列如下所示：
[0017] SBP_bac_5K0P5 ：GTGAAAGGTAAAGATAAAGGTGTAGTGGCA
[0018] SBP_bac_5K0P6 ： TTAGGATCCGATTCCCCTACAATTGCC
[0019] 本發(fā)明的目的之三是提供所述的豬鏈球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株為科研 工作者在試驗中作為標(biāo)準(zhǔn)的豬鏈球菌7型菌株的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的目的之四是提供所述的豬鏈球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株在制備 預(yù)防豬鏈球菌疫苗中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明的目的之五是提供一種豬鏈球菌疫苗，其主要活性成分是本發(fā)明不含抗性 基因的豬鏈球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株。
[0022] 本發(fā)明是采用RecA同源重組系