一種重組菌株與制備堿性β-甘露聚糖酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種重組菌株以及利用該重組菌株制備 堿性甘露聚糖酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 0 -甘露聚糖酶（0 -mannanase，EC3. 2. 1. 78)是一種半纖維素酶，可以水解甘露 聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖(參見Tipdon，R. S. et al. :Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry，32:299-316,Academic Press，New York，1976.)。甘露聚糖是自然界中存在的一種較為豐富的半纖維素資源，數(shù)量 僅次于纖維素。豆科植物種子、針葉樹木材、綠色咖啡豆等都含有大量的甘露聚糖，一些植 物膠，如田青膠、角豆膠、魔芋精粉等幾乎完全是由半乳糖或葡萄糖與甘露糖組成的甘露聚 糖。利用甘露聚糖酶對上述植物材料進(jìn)行深加工和綜合利用具有很大的應(yīng)用潛力。國 內(nèi)外現(xiàn)主要用于造紙工業(yè)紙漿的漂白、油井的破膠、降解植物膠生產(chǎn)低聚糖用作雙歧桿菌 促生長因子，防病抗衰老的保健食品以及飼料工業(yè)中作為抗?fàn)I養(yǎng)因子。
[0003] P_甘露聚糖酶按其最適pH值的不同有酸性、中性、堿性之分，其中堿性0-甘露 聚糖酶的研究相對較晚，發(fā)現(xiàn)主要由嗜堿芽孢桿菌（alkaliphilieBacillus)產(chǎn)生，某些地 衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis)也產(chǎn)生堿性甘露聚糖酶，如楊文博等報道了一 株地衣芽孢桿菌NK-27,其最適pH值為9. 0。一般情況下枯草芽孢桿菌，放線菌等產(chǎn)生中性 3 -甘露聚糖酶，而霉菌產(chǎn)生酸性0 -甘露聚糖酶。第一個堿性0 -甘露聚糖酶由Akino等 發(fā)現(xiàn)。馬延和等于1991報道了嗜堿芽孢桿菌N16-5的三個胞外堿性0 -甘露聚糖酶的純化 及酶學(xué)性質(zhì)，并于2004年報道了其中一種嗜堿甘露聚糖酶的基因序列。Takeda等于2004 年發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌屬的一個菌株JAMB-602產(chǎn)堿性0 -甘露聚糖酶，此酶屬于GH家族5,最 適pH為9。目前所發(fā)現(xiàn)的嗜堿甘露聚糖酶的最適pH值最高為10,由Takeda等于2004年 報道。
[0004] 堿性甘露聚糖酶不僅可以生產(chǎn)用作雙歧桿菌促生長因子的低聚糖，而且在需 堿性環(huán)境的紙漿漂白等工業(yè)方面具有廣泛的應(yīng)用前景。但到目前為止，堿性甘露聚糖 酶的制備仍舊是限制其工業(yè)應(yīng)用的瓶頸，前人的報道中無論是使用堿性0 -甘露聚糖酶的 原產(chǎn)菌株還是使用重組菌株生產(chǎn)，其產(chǎn)量都比較低，或者需要發(fā)酵較長的時間。如馬延和報 道了由嗜堿芽孢桿菌N16-5菌株經(jīng)培養(yǎng)優(yōu)化后，產(chǎn)量達(dá)到500U/ml (參見CN1266096A)。朱 泰承等用畢赤酵母表達(dá)來自嗜堿芽孢桿菌N16-5基因，發(fā)酵120小時左右堿性0 -甘露聚 糖酶的酶含量達(dá)6000U/ml (參見CN102433267A)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠較高水平的表達(dá)堿性P-甘 露聚糖酶的重組菌株以及利用該菌株制備堿性3 _甘露聚糖酶的方法。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種重組菌株，該重組菌株為含有編 碼堿性甘露聚糖酶的基因的重組大腸桿菌，且所述基因的堿基序列如SEQ ID N0:1所 /_J、i〇
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供了一種制備堿性甘露聚糖酶的方法，該方法包括將第 一方面所述的重組菌株接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，獲得含有堿性3 -甘露聚糖酶 的發(fā)酵液。
[0008] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明的重組菌株能夠高水平地表達(dá)堿性3 -甘露聚糖酶， 所需發(fā)酵的時間較短。采用本發(fā)明的方法制備堿性甘露聚糖酶，最終得到的發(fā)酵液中 的酶含量可達(dá)6000U/ml。
[0009] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0010] 附圖是用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0011] 圖1是發(fā)酵液中酶含量和蛋白濃度隨發(fā)酵時間的變化曲線。
【具體實施方式】
[0012] 以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描 述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0013] 在本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，"酶含量"用每ml發(fā)酵液中含有的酶活力 單位（U)數(shù)來表示，單位為U/ml，且在37°C、pH值為9. 0的條件下，每分鐘降解甘露聚糖釋 放1 U mol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位U ;"溶氧量"用溶氧電極測得的結(jié)果表 示，且定義發(fā)酵開始時的溶氧量為100%。
[0014] 本發(fā)明提供了一種重組菌株，該重組菌株為含有編碼堿性甘露聚糖酶的基因 的重組大腸桿菌，且所述基因的堿基序列如SEQ ID N0:1所示。本發(fā)明的重組菌株可以采 用常規(guī)的基因工程技術(shù)獲得，例如，獲取堿基序列如SEQ ID NO: 1所示的基因，構(gòu)建含有堿 基序列如SEQ ID NO: 1所示的基因的表達(dá)載體，再將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中即可獲得。 可以從嗜堿芽孢桿菌N16-5的總DNA中擴(kuò)增獲得堿基序列如SEQ ID NO: 1所示的基因，且 可以采用"上游引物序列如SEQ ID N0:2所示且下游引物序列如SEQ ID N0:3所示"的引 物進(jìn)行擴(kuò)增。
[0015] agttcaggcttttatgttgatggcaatacgttatatgacgcaaacgggcaaccatttgtcatgaaaggc attaaccatggacatgcttggtataaagacaccgcttcaacagctattcctgccattgcagagcaaggcgcgaacac gatacgtattgttttatcagatggcggtcaatgggaaaaagacgacattgacaccgttcgtgaagttattgagcttg cggagcaaaataaaatggtggctgtcgttgaagtteatgatgccacgggccgtgattcacgcagtgatttagategg gcagtcgattattggatagagatgaaagatgcacttatcggcaaagaggatactgtcattattaacattgcaaacga atggtatggcagttgggatggcgccgcttgggctgatggctacattgatgtcattccgaagcttcgcgatgccggct taacacacaccttaatggttgatgcagcaggatgggggcaatatccgcaatctatteatgattacggacaagatgtg tttaatgcagatccgttaaaaaatacgatattctccatccatatgtatgagtatgctggtggtgatgctaacactgt tagatcaaatattgatagagtcatagatcaagaccttgctctcgtaataggtgagttcggtcatagacacactgatg gcgatgttgatgaagatacaatccttagttattctgaagaaactggcacaggatggctcgcttggtcttggaaaggc aacagtgccgaatgggattatttagacctttcagaagattgggctggtaaccatttaactgattggggaaataggat tgtccacggggcaaatggcttgcaggaaacctccaaaccatccaccgtatttacagatgataacggtggtgcccctg aaccgccaactactactaccttgtatgactttgaaggaagcacacaagggtggcatggaagcaacgtgatgggtggc ccttggtccgtaacagaatggggtgcgtcaggcaactactctttaaagggcgatgtcaatttaagctcaaattcttc acatgaactgtatagtgaacaaagtcgtaatctacacggatactctcagctaaatgcaaccgttcgccatgccaatt ggggaaatcccggtaatggcatgaatgcaagactttacgtgaaaacgggctctgattatacatggtatagcggtcct tttacacgtatcaatagctccaactcaggtacaacgttatcttttgatttaaacaacatcgaaaatagtcatcatgt tagggaaataggtgtgcaattttcagctgcagataatagcagcggtcaaactgctctatacgttgataatgttactt taaga (SEQ ID N0:1)
[0016] 根據(jù)本發(fā)明，所述重組菌株可以為各種常規(guī)的用于構(gòu)建基因工程菌的大腸桿菌， 優(yōu)選地，所述重組菌株的出發(fā)菌株為大腸桿菌BW25113 (即阿拉伯糖合成缺陷菌株，可以通 過商購獲得)。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述重組菌株含有表達(dá)載體，所述表達(dá)載體為在pBAD載體 (如pBAD-HisB載體）的Ncol酶切位點(diǎn)和Xhol酶切位點(diǎn)之間插入堿基序列如SEQ ID NO: 1 所示的基因而得到的表達(dá)載體。即，編碼堿性甘露聚糖酶的基因存在于表達(dá)載體上，能 夠自主復(fù)制和表達(dá)。所述表達(dá)載體中的啟動子優(yōu)選為阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子。
[0018] 本發(fā)明提供的制備堿性甘露聚糖酶的方法包括將上述重組菌株接種至液體 發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，獲得含有堿性3 _甘露聚糖酶的發(fā)酵液。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明，可以采用常規(guī)方式進(jìn)行發(fā)酵，優(yōu)選情況下，所述發(fā)酵的方式為：在 35-38 °C下，將所述重組菌株培養(yǎng)至發(fā)酵液的0D_值達(dá)45-55,然后，在28-32 °C下，往發(fā)酵 液中添加阿拉伯糖，繼續(xù)發(fā)酵8-35h (優(yōu)選10-30h)。發(fā)酵過程(包括繼續(xù)發(fā)酵）中，可以控 制通氣量為1.5-2. 5vvm。其中，0D_值是指發(fā)酵液在600nm波長處的吸光值，能夠反應(yīng)菌 株在發(fā)酵液中的濃度（即菌濃)。
[0020] 其中，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基可以為液體LB培養(yǎng)基，優(yōu)選情況下，所述液體發(fā)酵培 養(yǎng)基的配方為：8_10g/L的KH 2P04,3-5g/L的（NH4)2HP04,4-6g/L的酵母提取物。液體發(fā)酵 培養(yǎng)基的pH值可以為6. 6-6. 7。
[0021] 本發(fā)明中，在發(fā)酵液的〇D_值達(dá)45-55之前，如果發(fā)酵液總的葡萄糖耗盡，可以適 當(dāng)?shù)亓骷悠咸烟?，以促使發(fā)酵液的〇D_值達(dá)到45-55。對葡萄糖的流加方式?jīng)]有特別的要 求，例如，可以每分鐘流加0. 6-1. 2g/L發(fā)酵液的葡萄糖。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，為了更好地維持重組菌株的生長以使其更佳地表達(dá)堿性0 -甘露聚