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重組細(xì)胞、以及異戊二烯的生產(chǎn)方法

文檔序號(hào):8908814閱讀:655來源:國(guó)知局
重組細(xì)胞、以及異戊二烯的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種能夠由甲醇等生產(chǎn)異戊二烯的重組細(xì)胞、及使用該重組細(xì)胞的異 戊二烯的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 異戊二烯為合成聚異戊二烯的單體原料,特別是在輪胎業(yè)界中為重要的原材料。 近年來,由依賴于石油的基礎(chǔ)化學(xué)品的生產(chǎn)工藝向來自植物資源等可再生資源的生產(chǎn)工藝 轉(zhuǎn)換的技術(shù)的開發(fā)和實(shí)用化正在平穩(wěn)地進(jìn)行。關(guān)于異戊二烯,例如已知有以糖為原料的重 組大腸桿菌的生產(chǎn)技術(shù)(專利文獻(xiàn)1、2、非專利文獻(xiàn)1)。
[0003] 另一方面,在C1化合物中,甲醇由合成氣體等廉價(jià)地制造,所述合成氣體為由天 然氣體及生物質(zhì)或城市垃圾等廢棄物得到的一氧化碳、二氧化碳及氫的混合氣體。天然氣 體在化石資源中也大量地存在,且〇) 2的產(chǎn)生量比較少,因此,作為新一代能量源備受關(guān)注, 由現(xiàn)有的石油向天然氣體的轉(zhuǎn)移正在進(jìn)行。甲醇在水中為可溶等、操作或貯藏容易、而且作 為微生物培養(yǎng)的碳源也適合。
[0004] 甲基營(yíng)養(yǎng)菌(Methylotroph)是指將分子內(nèi)不具有C-C鍵的碳化合物、例如甲燒、 甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺等用作唯一的碳源、能量源的C1化合物利用性微生物的總稱 名。被稱為甲烷氧化菌(Methanotroph)、甲烷氧化細(xì)菌、甲醇利用性細(xì)菌、甲醇利用性酵母、 甲醇利用性微生物等的微生物全部屬于甲基營(yíng)養(yǎng)菌。
[0005] 甲基營(yíng)養(yǎng)菌在將甲醇轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┲螅M(jìn)行以將甲醛轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蠧-C鍵的有機(jī)物 的反應(yīng)為主的代謝。如圖1所示,作為經(jīng)由甲醛的碳同化代謝途徑,已知有絲氨酸途徑、核 酮糖單磷酸途徑(Rump途徑)及木酮糖單磷酸途徑(xuMP途徑)。被分類為細(xì)菌的甲基營(yíng) 養(yǎng)菌(甲基營(yíng)養(yǎng)菌細(xì)菌)具有絲氨酸循環(huán)或Rump途徑。另一方面,被分類為酵母的甲基營(yíng) 養(yǎng)菌(甲基營(yíng)養(yǎng)菌酵母)具有XuMP途徑。
[0006] 另外,甲基營(yíng)養(yǎng)菌細(xì)菌根據(jù)甲醇要求性的不同,被分類為專性甲基營(yíng)養(yǎng)菌 (obligate methylotroph)和可以利用其它碳化合物的兼性甲基營(yíng)養(yǎng)菌(facultative methylotroph)〇
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)1 :國(guó)際公開第2009/076676號(hào)
[0010] 專利文獻(xiàn)2 :國(guó)際公開第2009/132220號(hào)
[0011] 非專利文獻(xiàn)
[0012] 非專利文獻(xiàn) 1 :Yang J.,et al.,PLoS0ne 2012, 7(4),e33509

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 發(fā)明所要解決的問題
[0014] 關(guān)于來自可再生資源的生產(chǎn)工藝,其現(xiàn)有技術(shù)的大部分包含上述異戊二烯生產(chǎn)技 術(shù),是依賴于有機(jī)物、特別是糖、甘油或油成分等并利用微生物的生產(chǎn)方法。但是,為了供應(yīng) 來自石油的眾多的基礎(chǔ)化學(xué)品的世界生產(chǎn)量,就來自植物資源等的、現(xiàn)狀可使用的糖質(zhì)、甘 油或油成分的量而言,作為微生物的碳源必定不足。即,依賴于糖質(zhì)或油成分的、利用微生 物的基礎(chǔ)化學(xué)品的生產(chǎn)量在將來也是有限的。另外,這種工藝也有可能產(chǎn)生與食物的競(jìng)爭(zhēng)。
[0015] 作為上述甲基營(yíng)養(yǎng)菌的應(yīng)用例,可列舉來自甲醇的SCP(單細(xì)胞蛋白(singlecell protein))、生物分解性塑料、氨基酸等的生產(chǎn)技術(shù)。但是,還沒有出現(xiàn)被應(yīng)用于制造異戊二 烯等來自石油的基礎(chǔ)化學(xué)品的例子。如上所述,通用高分子材料制品中使用的單體化合物 目前全部依賴于石油,永久且廉價(jià)地供給與目前的石油品質(zhì)相同的石油的可能性非常低, 當(dāng)務(wù)之急是開發(fā)新的有效的代替工藝。需要說明的是,在確保用于利用微生物生產(chǎn)化學(xué)品 的碳源的目的下,也正在研宄對(duì)含有纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等的硬生物質(zhì)進(jìn)行糖化的 技術(shù),但需要用于糖化的酶處理等,在成本方面存在很大的問題。
[0016] 鑒于上述現(xiàn)狀,本發(fā)明的目的在于,提供一種用于由甲醇等生產(chǎn)異戊二烯的一系 列的技術(shù)。
[0017] 用于解決問題的技術(shù)方案
[0018] 用于解決上述的問題的本發(fā)明的1個(gè)方式為一種重組細(xì)胞,其通過將編碼異戊二 烯合成酶的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中而得到,所述宿主細(xì)胞為甲基營(yíng)養(yǎng)菌,該基因在所述宿主 細(xì)胞內(nèi)表達(dá),所述重組細(xì)胞能夠由選自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1種 C1化合物生產(chǎn)異戊二烯。
[0019] 異戊二稀合成酶(異戊二稀合成酶,isoprenesynthase)具有將作為異戊烯基二 磷酸(IPP)的異構(gòu)體即二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)轉(zhuǎn)變?yōu)楫愇於┑淖饔?。異戊烯基?磷酸和二甲基烯丙基二磷酸間的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變中異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶進(jìn)行催化。異戊烯基二 磷酸異構(gòu)酶存在于全部的生物中。
[0020] 而且,本方式的重組細(xì)胞,是通過將編碼異戊二烯合成酶的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中 而得到,所述宿主細(xì)胞為甲基營(yíng)養(yǎng)菌,且該基因在所述宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。而且,能夠由選自 甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1種C1化合物生產(chǎn)異戊二烯。本方式的重 組細(xì)胞可以將在細(xì)胞內(nèi)合成的二甲基烯丙基二磷酸及異戊烯基二磷酸通過異戊二烯合成 酶的作用轉(zhuǎn)變?yōu)楫愇於?。即,根?jù)本方式的重組細(xì)胞,可以由所述的C1化合物生產(chǎn)異戊 二烯。
[0021] 優(yōu)選作為甲醛的固定化途徑,包括選自絲氨酸途徑、核酮糖單磷酸途徑及木酮糖 單磷酸途徑中的至少1種C1碳同化途徑。
[0022] 優(yōu)選進(jìn)一步導(dǎo)入編碼3-己酮糖-6-磷酸合成酶的基因和編碼6-磷酸-3-己酮糖 異構(gòu)酶的基因,該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
[0023] 根據(jù)所述的構(gòu)成,基于核酮糖單磷酸途徑的甲醛固定化能力被賦予或增強(qiáng)。
[0024] 優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌或酵母。
[0025] 優(yōu)選所述酵母畢赤酵母(Pichia)屬、漢遜(Hansenula)酵母屬或假絲酵母菌 (Candida)屬。
[0026] 用于解決同樣問題的本發(fā)明的其它方式為一種重組細(xì)胞,其通過將下列基因?qū)?宿主細(xì)胞中而得到:賦予將甲醇和/或甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿幕颉①x予甲醛固定化能 力的基因和編碼異戊二烯合成酶的基因,該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá),所述重組細(xì)胞能夠由 選自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1種Cl化合物生產(chǎn)異戊二烯。
[0027] 本方式的重組細(xì)胞通過將"賦予將甲醇和/或甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿幕?、"賦 予甲醛固定化能力的基因"及"編碼異戊二烯合成酶的基因"導(dǎo)入宿主細(xì)胞中而得到,這些 基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。而且,能夠由選自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少 1種C1化合物生產(chǎn)異戊二烯。
[0028] 即,由于本方式的重組細(xì)胞導(dǎo)入了"賦予將甲醇和/或甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿?基因"和"賦予甲醛固定化能力的基因",因此,具有與甲基營(yíng)養(yǎng)菌同樣的特性。而且,由于 導(dǎo)入有"編碼異戊二烯合成酶的基因",因此,可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異戊二烯合成酶。其結(jié)果, 可以將在細(xì)胞內(nèi)合成的異戊烯基二磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫愇於?。即,利用本方式的重組細(xì)胞,可以 由所述的C1化合物生產(chǎn)異戊二烯。
[0029] 優(yōu)選作為甲醛的固定化途徑,包括選自絲氨酸途徑、核酮糖單磷酸途徑及木酮糖 單磷酸途徑中的至少1種C1碳同化途徑。
[0030] 解決用于同樣問題的本發(fā)明的其它方式為一種重組細(xì)胞,其通過將下列基因?qū)?具有核酮糖單磷酸途徑的宿主細(xì)胞中:賦予將甲醇和/或甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿幕蚝?編碼異戊二烯合成酶的基因,該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá),所述重組細(xì)胞能夠由選自甲烷、甲 醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1種C1化合物生產(chǎn)異戊二烯。
[0031] 本方式相當(dāng)于例如具有核酮糖單磷酸途徑的非甲基營(yíng)養(yǎng)菌為宿主細(xì)胞的實(shí)施方 式。
[0032] 優(yōu)選賦予將甲醇轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿幕驗(yàn)榫幋a甲醇脫氫酶或醇氧化酶的基因, 賦予將甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿幕驗(yàn)榫幋a甲醛脫氫酶的基因。
[0033] 甲醇脫氫酶(methanol dehydrogenase)和醇脫氫酶(alcoholdehy drogenase) 均具有使甲醇轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑淖饔?。另外,甲醛脫氫酶(formaldehy dedehydrogenase)具有 使甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑淖饔?。這些酶均為屬于細(xì)菌的甲基營(yíng)養(yǎng)菌中的甲烷代謝酶之一。另一 方面,屬于酵母的甲基營(yíng)養(yǎng)菌不具有甲烷氧化活性,具有通過醇氧化酶(Alcohol oxidase) 使甲醇轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑淖饔?。酵母也具有將甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑拿富钚浴?br>[0034] 優(yōu)選進(jìn)一步導(dǎo)入賦予將甲烷轉(zhuǎn)變?yōu)榧状嫉墓δ艿幕?,該基因在宿主?xì)胞內(nèi)表 達(dá)。
[0035] 優(yōu)選賦予將甲烷轉(zhuǎn)變?yōu)榧状嫉墓δ艿幕驗(yàn)榫幋a甲烷單加氧酶的基因。
[0036] 甲燒單加氧酶(methane monooxygenase)具有將甲燒轉(zhuǎn)變?yōu)榧状嫉淖饔谩<谉龁?加氧酶為甲基營(yíng)養(yǎng)菌中的甲烷代謝酶之一。
[0037] 優(yōu)選進(jìn)一步導(dǎo)入編碼3-己酮糖-6-磷酸合成酶的基因和編碼6-磷酸-3-己酮糖 異構(gòu)酶的基因,該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
[0038] 優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌或酵母。
[0039] 優(yōu)選宿主細(xì)胞具有基于甲羥戊酸途徑的異戊烯基二磷酸合成能力,所述重組細(xì)胞 進(jìn)一步導(dǎo)入編碼在甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用的至少1種酶的基因、和/或編碼在非甲羥戊 酸途徑中發(fā)揮作用的酶群的基因,該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
[0040] 根據(jù)所述的構(gòu)成,作為DMAPP供給源的IPP的合成能力增強(qiáng),有效地進(jìn)行IPP及 DMAPP的供給。其結(jié)果,本方式的重組細(xì)胞成為異戊二烯生產(chǎn)能力更高的重組細(xì)胞。
[0041] 優(yōu)選編碼在甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用的至少1種酶的基因來自放線菌。
[0042] 優(yōu)選宿主細(xì)胞具有基于非甲羥戊酸途徑的異戊烯基二磷酸合成能力,進(jìn)一步導(dǎo)入 編碼在甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用的酶群的基因、和/或編碼在非甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用 的至少1種酶的基因,該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
[0043] 根據(jù)所述的構(gòu)成,成為DMAPP的供給源的IPP的合成能力增強(qiáng),有效地進(jìn)行IPP及 DMAPP的供給。其結(jié)果,本方式的重組細(xì)胞成為異戊二烯生產(chǎn)能力更高的重組細(xì)胞。
[0044] 優(yōu)選編碼在非甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用的至少1種酶的基因來自宿主細(xì)胞以外。
[0045] 優(yōu)選所述異戊二烯合成酶來自植物。
[0046] 優(yōu)選編碼所述異戊二烯合成酶的基因編碼下述(a)、(b)或(c)的蛋白質(zhì)。
[0047] (a)由序列號(hào)2表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì);
[0048] (b)由在序列號(hào)2表示的氨基酸序列中,缺失、取代或添加1~20個(gè)氨基酸而得到 的氨基酸序列構(gòu)成、且具有異戊二烯合成酶的活性的蛋白質(zhì);
[0049] (c)具有與序列號(hào)2表示的氨基酸序列顯示60%以上的同源性的氨基酸序列、且 具有異戊二烯合成酶的活性的蛋白質(zhì)。
[0050] 優(yōu)選進(jìn)一步導(dǎo)入編碼異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶的基因,該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
[0051] 由于異戊二烯合成酶的直接的基質(zhì)為二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP),因此,通過增 強(qiáng)異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶活性,從IPP向DMAPP的轉(zhuǎn)變也增強(qiáng),異戊二烯的生產(chǎn)效率提高。
[0052] 優(yōu)選進(jìn)行了抑制櫳牛兒基二磷酸合成酶、橙花基二磷酸合成酶、或法呢基二磷酸 合成酶的表達(dá)量的處理的重組細(xì)胞。
[0053] IPP可以轉(zhuǎn)變?yōu)闄膳夯姿幔℅PP)、橙花基二磷酸(NPP)、或法呢基二磷酸 (FPP)。而且,本方式的重組細(xì)胞進(jìn)行了抑制櫳牛兒基二磷酸(GPP合成酶)、橙花基二磷酸 合成酶(NPP合成酶)、或法呢基二磷酸合成酶(FPP合成酶)的表達(dá)量的處理。根據(jù)所述的 構(gòu)成,可抑制作為DMAPP供給源的IPP的浪費(fèi),異戊二烯生產(chǎn)能力更高。
[0054] 用于解決同樣問題的本發(fā)明的其它方式為一種重組細(xì)胞,其通過將賦予將甲醇和 /或甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿幕蚝唾x予甲醛固定化能力的基因?qū)刖哂挟愇於┖铣擅?的宿主細(xì)胞中而得到,該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá),可以由選自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛 及甲酰胺中的至少1種C1化合物生產(chǎn)異戊二烯。
[0055] 本方式的重組細(xì)胞將"賦予將甲醇和/或甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿幕?及"賦予 甲醛固定化能力的基因"導(dǎo)入具有異戊二烯合成酶的宿主細(xì)胞中,該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表 達(dá)。而且,可以由選自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1種C1化合物生產(chǎn)異 戊二烯。
[0056] 即,由于本方式的重組細(xì)胞導(dǎo)入了"賦予將甲醇和/或甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿?基因"和"賦予甲醛固定化能力的基因",因此,具有與甲基營(yíng)養(yǎng)菌同樣的特性。而且,由于 宿主細(xì)胞自身具有異戊二烯合成酶,因此,可以通過異戊二
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