。
[0206] 由以上的情況顯示：通過向具有RuMP途徑的甲基營養(yǎng)菌導(dǎo)入異戊二烯合成酶基 因，可以由甲醇有效地生產(chǎn)異戊二烯。另外得知：通過導(dǎo)入IDI基因而促進(jìn)異戊二烯合成。
[0207] 實(shí)施例5
[0208] 向大腸桿菌導(dǎo)入甲醇脫氫酶（MDH)基因、HPS基因、PHI基因及IspS基因、和利用 重組體由甲醇生產(chǎn)異戊二烯
[0209] 將實(shí)施例2中制備的表達(dá)載體pHThpmIS作為模板，通過使用序列號(hào)26及27的引 物的PCR，對(duì)含有HPS基因、PHI基因、MDH基因及IspS基因的DNA片段（hpmIS)進(jìn)行擴(kuò)增。 將該擴(kuò)增DNA片段克隆至pT7Blue-T載體，制備pT7hpmIS。用Ncol及BamHI對(duì)pT7hpmIS 進(jìn)行酶切，回收含有hpmIS基因的DNA片段。將該DNA片段導(dǎo)入至pET23d (Novagen株式會(huì) 社）的NcoI/BamHI位點(diǎn)，構(gòu)建大腸桿菌中的表達(dá)載體pThpmIS。將表達(dá)載體pThpmIS導(dǎo)入 大腸桿菌Rosetta(DE3) (Novagen株式會(huì)社），得到大腸桿菌RHPMI株。
[0210] 將實(shí)施例2中制備的表達(dá)載體pHThpIS作為模板，通過使用序列號(hào)26及27的引 物的PCR，對(duì)含有HPS基因、PHI基因及IspS基因的DNA片段（hpIS)進(jìn)行擴(kuò)增。將該擴(kuò) 增DNA片段克隆至pT7Blue-T載體，制備pT7hpIS。用Ncol及BamHI對(duì)pT7hpIS進(jìn)行酶 切，回收含有hpIS基因的DNA片段。將該DNA片段導(dǎo)入至pET23d(N 〇Vagen株式會(huì)社）的 NcoI/BamHI位點(diǎn)，構(gòu)建大腸桿菌中的表達(dá)載體pThpIS。將表達(dá)載體pThpIS導(dǎo)入于大腸桿 菌Rosetta(DE3)，得到大腸桿菌RHPI株。
[0211] 將實(shí)施例2中制備的表達(dá)載體pHThpm作為模板，通過使用序列號(hào)26及28的引物 的PCR，對(duì)含有HPS基因、PHI基因及MDH基因的DNA片段（hpm)進(jìn)行擴(kuò)增。將該擴(kuò)增DNA 片段克隆至pT7Blue-T載體，制備pT7hpm。用Ncol及BamHI對(duì)pT7hpm進(jìn)行酶切，回收含有 hpm基因的DNA片段。將該DNA片段導(dǎo)入至pET23d (Novagen株式會(huì)社）的NcoI/BamHI位 點(diǎn)，構(gòu)建大腸桿菌中的表達(dá)載體pThpm。將表達(dá)載體pThpm導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta (DE3)，得 到大腸桿菌RHPM株。
[0212] 將各自的重組大腸桿菌在含有0. 05mM濃度的IPTG的甲醇營養(yǎng)合成C培養(yǎng)基（1L 含有 H3P0418g、K2S0414. 28g、K0H 3. 9g、CaS04 ? 2H20 0? 9g、MgS04 ? 7H20 11. 7g、CuS04 ? 5H20 8. 4mg、KI 1. lmg、MnS04H20 4. 2mg、NaMo04 ? 2H20 0. 3mg、H3B030. 03mg、CoC12 ? 6H20 0. 7mg、 ZnS04.7H20 28mg、FeS04.7H20 91mg、生物素 0.28mg、甲醇 5mL、氯霉素 34mg 及氨必西林 100mg。）20mL中，在37°C下需氧地進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)液的0D600為1. 0-1. 2的時(shí)刻，回收 菌體。在上述相同組成的合成C培養(yǎng)基中加入回收的總菌體45mL，在利用丁基橡膠栓密封 的125mL容量的玻璃瓶中、在37°C下振動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，利用GC/MS分析氣相 成分。
[0213] 其結(jié)果，僅在RHPMI株中檢測(cè)到異戊二烯。RHPMI中的由被利用的甲醇轉(zhuǎn)換為異戊 二烯的轉(zhuǎn)變效率為14%。需要說明的是，RHPI株完全不能生長。RHPM株雖然生長，但是不 能檢測(cè)到異戊二烯的生成。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組細(xì)胞，其通過將編碼異戊二烯合成酶的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中而得到，所述 宿主細(xì)胞為甲基營養(yǎng)菌， 該基因在所述宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)， 所述重組細(xì)胞能夠由選自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1種Cl化合 物生產(chǎn)異戊二烯。2. 如權(quán)利要求1所述的重組細(xì)胞，其具有選自絲氨酸途徑、核酮糖單磷酸途徑及木酮 糖單磷酸途徑中的至少1種Cl碳同化途徑作為甲醛的固定化途徑。3. 如權(quán)利要求1或2所述的重組細(xì)胞，其進(jìn)一步導(dǎo)入編碼3-己酮糖-6-磷酸合成酶的 基因和編碼6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶的基因，該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。4. 如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌或酵母。5. 如權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞，其中，所述酵母屬于畢赤酵母（Pichia)屬、漢遜酵母 (Hansenula)屬或假絲酵母菌（Candida)屬。6. -種重組細(xì)胞，其通過將下列基因?qū)胨拗骷?xì)胞而得到：賦予將甲醇和/或甲酸轉(zhuǎn) 變?yōu)榧兹┑墓δ艿幕?、賦予甲醛固定化能力的基因和編碼異戊二烯合成酶的基因， 該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)， 所述重組細(xì)胞能夠由選自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1種Cl化合 物生產(chǎn)異戊二烯。7. 如權(quán)利要求6所述的重組細(xì)胞，其具有選自絲氨酸途徑、核酮糖單磷酸途徑及木酮 糖單磷酸途徑中的至少1種Cl碳同化途徑作為甲醛的固定化途徑。8. -種重組細(xì)胞，其通過將下列基因?qū)刖哂泻送菃瘟姿嵬緩降乃拗骷?xì)胞而得到： 賦予將甲醇和/或甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿幕蚝途幋a異戊二烯合成酶的基因， 該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)， 所述重組細(xì)胞能夠由選自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1種Cl化合 物生產(chǎn)異戊二烯。9. 如權(quán)利要求6~8中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其中，賦予將甲醇轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿?基因?yàn)榫幋a甲醇脫氫酶或醇氧化酶的基因，賦予將甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿幕驗(yàn)榫幋a甲 醛脫氫酶的基因。10. 如權(quán)利要求6~9中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其進(jìn)一步導(dǎo)入賦予將甲烷轉(zhuǎn)變?yōu)榧状?的功能的基因，該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。11. 如權(quán)利要求10所述的重組細(xì)胞，其中，賦予將甲烷轉(zhuǎn)變?yōu)榧状嫉墓δ艿幕驗(yàn)榫?碼甲烷單加氧酶的基因。12. 如權(quán)利要求6~11中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其進(jìn)一步導(dǎo)入編碼3-己酮糖-6-磷 酸合成酶的基因和編碼6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶的基因，該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。13. 如權(quán)利要求6~12中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌或酵母。14. 如權(quán)利要求1~13中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其中，宿主細(xì)胞具有基于甲羥戊酸途 徑的異戊烯基二磷酸合成能力，所述重組細(xì)胞進(jìn)一步導(dǎo)入編碼在甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用 的至少1種酶的基因、和/或編碼在非甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用的酶群的基因，該基因在宿 主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。15. 如權(quán)利要求14所述的重組細(xì)胞，其中，編碼在甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用的至少1種 酶的基因來自放線菌。16. 如權(quán)利要求1~13中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其中，宿主細(xì)胞具有基于非甲羥戊酸 途徑的異戊烯基二磷酸合成能力，所述重組細(xì)胞進(jìn)一步導(dǎo)入編碼在甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作 用的酶群的基因、和/或編碼在非甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用的至少1種酶的基因，該基因在 宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。17. 如權(quán)利要求16所述的重組細(xì)胞，其中，編碼在非甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用的至少1 種酶的基因來自宿主細(xì)胞以外。18. 如權(quán)利要求1~17中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其中，所述異戊二烯合成酶來自植 物。19. 如權(quán)利要求1~18中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其中，編碼所述異戊二烯合成酶的基 因編碼下述（a)、（b)或（c)的蛋白質(zhì)： (a) 由序列號(hào)2表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)； (b) 由在序列號(hào)2表示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加1~20個(gè)氨基酸而得到的氨 基酸序列構(gòu)成，且具有異戊二烯合成酶的活性的蛋白質(zhì)； (c) 具有與序列號(hào)2表示的氨基酸序列顯示60%以上的同源性的氨基酸序列，且具有 異戊二烯合成酶的活性的蛋白質(zhì)。20. 如權(quán)利要求1~19中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其進(jìn)一步導(dǎo)入編碼異戊烯基二磷酸 異構(gòu)酶的基因，該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。21. 如權(quán)利要求1~20中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其進(jìn)行了抑制櫳牛兒基二磷酸合成 酶、橙花基二磷酸合成酶、或法呢基二磷酸合成酶的表達(dá)量的處理。22. -種重組細(xì)胞，其通過將下列基因?qū)刖哂挟愇於┖铣擅傅乃拗骷?xì)胞中而得到： 賦予將甲醇和/或甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿幕蚝唾x予甲醛固定化能力的基因， 該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)， 所述重組細(xì)胞能夠由選自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1種Cl化合 物生產(chǎn)異戊二烯。23. 如權(quán)利要求22所述的重組細(xì)胞，其中，賦予將甲醇轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿幕驗(yàn)榫?碼甲醇脫氫酶或醇氧化酶的基因，賦予將甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹┑墓δ艿幕驗(yàn)榫幋a甲醛脫氫酶 的基因。24. 如權(quán)利要求22或23所述的重組細(xì)胞，其進(jìn)一步導(dǎo)入賦予將甲烷轉(zhuǎn)變?yōu)榧状嫉墓δ?的基因，該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。25. 如權(quán)利要求24所述的重組細(xì)胞，其中，賦予將甲烷轉(zhuǎn)變?yōu)榧状嫉墓δ艿幕驗(yàn)榫?碼甲烷單加氧酶的基因。26. 如權(quán)利要求22~25中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其具有選自絲氨酸途徑、核酮糖單 磷酸途徑及木酮糖單磷酸途徑中的至少1種Cl碳同化途徑作為甲醛的固定化途徑。27. 如權(quán)利要求22~26中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其進(jìn)一步導(dǎo)入編碼3-己酮糖-6-磷 酸合成酶的基因和編碼6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶的基因，該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。28. 如權(quán)利要求22~27中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌或酵母。29. 如權(quán)利要求22~28中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其中，宿主細(xì)胞具有基于甲羥戊酸 途徑的異戊烯基二磷酸合成能力，所述重組細(xì)胞進(jìn)一步導(dǎo)入編碼在甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作 用的至少1種酶的基因、和/或編碼在非甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用的酶群的基因，該基因在 宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。30. 如權(quán)利要求29所述的重組細(xì)胞，其中，編碼在甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用的至少1種 酶的基因來自放線菌。31. 如權(quán)利要求22~28中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其中，宿主細(xì)胞具有基于非甲羥戊 酸途徑的異戊烯基二磷酸合成能力，所述重組細(xì)胞進(jìn)一步導(dǎo)入編碼在甲羥戊酸途徑中發(fā)揮 作用的酶群的基因、和/或編碼在非甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用的至少1種酶的基因，該基因 在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。32. 如權(quán)利要求31所述的重組細(xì)胞，其中，編碼在非甲羥戊酸途徑中發(fā)揮作用的至少1 種酶的基因來自宿主細(xì)胞以外。33. 如權(quán)利要求22~32中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其進(jìn)一步導(dǎo)入編碼異戊二烯合成酶 的基因，該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。34. 如權(quán)利要求33所述的重組細(xì)胞，其中，所述異戊二烯合成酶來自植物。35. 如權(quán)利要求33或34所述的重組細(xì)胞，其中，編碼所述異戊二烯合成酶的基因編碼 下述（a)、（b)或（c)的蛋白質(zhì)： (a) 由序列號(hào)2表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)； (b) 由在序列號(hào)2表示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加1~20個(gè)氨基酸而得到的氨 基酸序列構(gòu)成、且具有異戊二烯合成酶的活性的蛋白質(zhì)； (c) 具有與序列號(hào)2表示的氨基酸序列顯示60%以上的同源性的氨基酸序列，且具有 異戊二烯合成酶的活性的蛋白質(zhì)。36. 如權(quán)利要求22~35中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其進(jìn)一步導(dǎo)入編碼異戊烯基二磷酸 異構(gòu)酶的基因，該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。37. 如權(quán)利要求22~36中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其進(jìn)行了抑制櫳牛兒基二磷酸合成 酶、橙花基二磷酸合成酶、或法呢基二磷酸合成酶的表達(dá)量的處理。38. -種異戊二烯的生產(chǎn)方法，該方法包括：使用選自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及 甲酰胺中的至少1種Cl化合物作為碳源，對(duì)權(quán)利要求1~37中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞進(jìn) 行培養(yǎng)，使該重組細(xì)胞生產(chǎn)異戊二烯。39. -種異戊二烯的生產(chǎn)方法，該方法包括：使選自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲 酰胺中的至少1種Cl化合物與權(quán)利要求1~37中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞接觸，使該重組 細(xì)胞由所述Cl化合物生產(chǎn)異戊二烯。
【專利摘要】本發(fā)明要解決的問題在于，提供一種用于由甲醇等生產(chǎn)異戊二烯的一系列的技術(shù)。提供一種重組細(xì)胞，其通過將編碼異戊二烯合成酶的基因?qū)胱鳛榧谆鶢I養(yǎng)菌的宿主細(xì)胞中而得到，該基因在所述宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，所述重組細(xì)胞能夠由選自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1種C1化合物生產(chǎn)異戊二烯。作為甲醛的固定化途徑，優(yōu)選選自絲氨酸途徑、核酮糖單磷酸途徑及木酮糖單磷酸途徑中的至少1種C1碳同化途徑。也提供一種使用了該重組細(xì)胞的異戊二烯的生產(chǎn)方法。
【IPC分類】C12P5/02, C12N1/21, C12N1/19, C12N15/09
【公開號(hào)】CN104884609
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380065571
【發(fā)明人】古谷昌弘, 上西章太, 巖佐航一郎
【申請(qǐng)人】積水化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社
【公開日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2013年12月26日
【公告號(hào)】CA2895094A1, EP2940123A1, US20150337338, WO2014104202A1