一種產(chǎn)漆酶的鮑曼不動(dòng)桿菌及產(chǎn)漆酶的方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)漆酶的鮑曼不動(dòng)桿菌及產(chǎn)漆酶的方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界，屬于條件致病菌。鮑曼不動(dòng)桿菌有莢膜、菌毛，無芽孢和鞭毛；具有較強(qiáng)的粘附力，易于附著于物體表面。鮑曼不動(dòng)桿菌具有復(fù)雜的抗原構(gòu)造，包括菌體抗原以及莢膜抗原，根據(jù)不同的抗原可以將鮑曼不動(dòng)桿菌分為34個(gè)血清型。
[0003]漆酶(Iaccase)是一種含銅的多酚氧化酶，含有19種氨基酸，漆酶有一定的含糖量，真菌漆酶是一種糖蛋白，由肽鏈、糖配基和Cu2+三個(gè)部分組成，分子量在60-390kDa，肽鏈一般由500-550個(gè)氨基酸組成，糖配基有氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖和阿拉伯糖，占整個(gè)分子重量的10% -80%糖配基組成及含量的不同是漆酶分子量存在較大差異的主要原因。漆酶能夠催化酚類、芳胺類、羧酸類、留體類激素、生物色素、金屬有機(jī)化合物和非酚類物質(zhì)生成醌類化合物、羰基化合物和水，屬于銅藍(lán)氧化酶(或稱為銅藍(lán)蛋白酶)中的一小族，廣泛存在于真菌、植物和昆蟲中，有報(bào)道細(xì)菌也能產(chǎn)生漆酶。目前還沒有關(guān)于鮑曼不動(dòng)桿菌也能產(chǎn)漆酶的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)漆酶的鮑曼不動(dòng)桿菌，鮑曼不動(dòng)桿菌能夠產(chǎn)生漆酶。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)漆酶的方法，通過該方法獲得漆酶，用于染料脫色。
[0006]本發(fā)明還提供了漆酶在染料脫色中的應(yīng)用。
[0007]為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0008]一種產(chǎn)漆酶的鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii LMUDac)，其該鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii LMUDac)于 2014 年 5 月 7 日提交保藏，保藏號(hào)為:CCTCCNO:M2014189 ;保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址:中國.武漢.武漢大學(xué)；郵編:430072o
[0009]所述鮑曼不動(dòng)桿菌分離方法步驟如下:
[0010]I)取食品廠排污口土樣，添加到含有CuSO4質(zhì)量濃度為0.05%的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)箱進(jìn)行富集培養(yǎng)40-50小時(shí)；
[0011]2)利用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，然后用固體LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋平板法分離單個(gè)菌落；
[0012]3)利用含有1%質(zhì)量愈創(chuàng)木酚的乙醇溶液和1%質(zhì)量的α -萘酚的乙醇溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，挑選呈現(xiàn)粉紅色或灰黑色菌落進(jìn)行反復(fù)劃線篩選獲取純菌落，接種于斜面培養(yǎng)基并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行形態(tài)、生理生化特征采用Vitek 2系統(tǒng)方法、16sRNA基因分析等進(jìn)行鑒定，鑒定出鮑曼不動(dòng)桿菌。
[0013]本發(fā)明所述的鮑曼不動(dòng)桿菌應(yīng)用于生產(chǎn)漆酶。
[0014]利用本發(fā)明所述的鮑曼不動(dòng)桿菌生產(chǎn)漆酶的方法，包括如下步驟:
[0015]I)培養(yǎng)基處理:在三角瓶中和試管中分別裝入培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6-8，滅菌后備用；
[0016]2)配置硫酸銅溶液:配制4%的硫酸銅溶液，滅菌后備用；
[0017]3)接種:將鮑曼不動(dòng)桿菌接種步驟I)的試管中，在32_45°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后按照5%的接種量將試管中的菌體接種到步驟I)的三角瓶中；三角瓶放置在搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0018]4)發(fā)酵培養(yǎng):然后在三角燒瓶中加入步驟2)配制的硫酸銅溶液，使培養(yǎng)基中的銅離子的濃度為0.02-0.08%，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)5-8h ；
[0019]5)收集4)發(fā)酵培養(yǎng)液，在5000-8000r/min離心5_15分鐘，得到的沉淀物用蒸餾水溶解，在冰浴條件下，利用超聲細(xì)胞破碎儀破碎20-40分鐘后，再用10000-15000r/min高速離心10-30分鐘，丟沉淀取上清液，即為漆酶液。
[0020]具體地，上述方案中，步驟I)和步驟2)中，滅菌溫度為120-125°C，滅菌時(shí)間為15-25min。
[0021]具體地，上述方案中，步驟3)中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時(shí)間為20-25小時(shí)。
[0022]具體地，上述方案中，步驟3)中，培養(yǎng)條件為溫度37-47°C，搖床轉(zhuǎn)速為150-250r/min，培養(yǎng)20-25小時(shí)。
[0023]一種漆酶，其是利用本發(fā)明所述的鮑曼不動(dòng)桿菌通過上述方法獲得。
[0024]一種生物脫色液，包含本發(fā)明所獲得的漆酶液，還包含丁香醛連氮和硫酸銅；該生物脫色液中，所述丁香醛連氮濃度為0.2-0.8mol/L ;銅離子濃度< 0.04% (wt/v)，漆酶濃度為 45000-46000U/L。
[0025]漆酶具有脫色的效果，但是其穩(wěn)定性容易受溫度和pH值的影響，在本發(fā)明的研宄中發(fā)現(xiàn)，在其脫色過程中添加丁香醛連氮不僅能提高其活性還能提高其穩(wěn)定性；因此，當(dāng)漆酶結(jié)合丁香醛連氮使用時(shí)，能夠有效提高其脫色效果。
[0026]在本發(fā)明的研宄過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn):銅離子的存在對(duì)細(xì)菌漆酶產(chǎn)漆酶活性具有明顯的影響，當(dāng)銅離子的濃度在0.02-0.08%這個(gè)范圍時(shí)，能夠明顯提高漆酶酶活。并且，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，銅離子的濃度在0.04%以下，漆酶活性隨著銅離子的濃度增加而逐步增加，但是當(dāng)銅離子濃度大于0.04%以后，漆酶活性卻隨著銅離子的濃度增加而逐步降低，可能原因是銅離子抑制菌體生長而是菌體濃度偏低而導(dǎo)致的漆酶活性降級(jí)。因此，為了提高漆酶活性，作為優(yōu)選的方案，在生物脫色液中銅離子的濃度< 0.04%
[0027]利用本發(fā)明所述的生物脫色液對(duì)結(jié)晶紫脫色的方法，其步驟為:將需要脫色的結(jié)晶紫染料用蒸餾水溶解后加入到上述生物脫色液中，于40-50°C的恒溫水浴鍋中反應(yīng)。
[0028]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于:
[0029]1.本發(fā)明所述的鮑曼不動(dòng)桿菌具有較高的活性，生長速度快，穩(wěn)定性好、不易變異，其發(fā)酵培養(yǎng)后可以獲得漆酶；
[0030]2.本發(fā)明中利用鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)漆酶的方法，操作簡單，成本低；得到的漆酶活性尚;
[0031]3.本發(fā)明中通過當(dāng)漆酶結(jié)合丁香醛連氮作為脫色液，不僅具有高活性，還具有較尚的穩(wěn)定性，進(jìn)而能夠有效提尚漆酶的脫色效果。
[0032]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0033]圖1為銅離子濃度對(duì)漆酶活性影響結(jié)果，其中橫坐標(biāo)為銅離子濃度(wt/v% ),縱坐標(biāo)為酶活性(IU);
[0034]圖2為pH值對(duì)漆酶活性影響結(jié)果，其中橫坐標(biāo)為pH值，縱坐標(biāo)為酶活性(IU)；
[0035]圖3為搖床培養(yǎng)溫度對(duì)漆酶活性影結(jié)果，其中橫坐標(biāo)為搖床培養(yǎng)溫度(°C )，縱坐標(biāo)為酶活性(IU);
[0036]圖4為添加硫酸銅與不添加硫酸銅對(duì)漆酶活性對(duì)照?qǐng)D，其中橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為酶活性(IU)。
【具體實(shí)施方式】
[0037]實(shí)施例1
[0038]產(chǎn)漆酶的鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii LMUDac)，其該鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii LMUDac)于 2014 年 5 月 7 日提交保藏，保藏號(hào)為:CCTCC NO:M2014189 ;保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址:中國.武漢.武漢大學(xué)；郵編:430072ο
[0039]所述鮑曼不動(dòng)桿菌分離方法如下:從廣州益海嘉里有限公司的排污口取土樣lg，添加到含有CuSO4質(zhì)量濃度為0.05%的LB液體培養(yǎng)基10ml中，在37°C培養(yǎng)箱進(jìn)行富集培養(yǎng)48小時(shí)，利用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，然后用固體LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋平板法分離單個(gè)菌落，利用含有I %質(zhì)量愈創(chuàng)木酚的乙醇溶液和1%質(zhì)量的α -萘酚的乙醇溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，挑選呈現(xiàn)粉紅色或灰黑色菌落進(jìn)行反復(fù)劃線篩選獲取純菌落，接種于斜面培養(yǎng)基并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，鑒定其是否產(chǎn)漆酶；對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行形態(tài)、生理生化特征采用Vitek2系統(tǒng)方法、16sRNA基因分析等進(jìn)行鑒定，鑒定為出鮑曼不動(dòng)桿菌。
[0040]實(shí)施例2
[0041]—種漆酶，通過以下方法獲得:
[0042]I)培養(yǎng)基處理:在三角瓶中和試管中分別裝入培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6，于120°C滅菌25min，滅菌后備用；
[0043]2)配置硫酸銅溶液:配制4%的硫酸銅溶液，于125°C滅菌15min，滅菌后備用；
[0044]3)接種:將鮑曼不動(dòng)桿菌接種步驟I)的試管中，在32°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25小時(shí)，然后按照5%的接種量將試管中的菌體接種到步驟I)的三角瓶中；三角瓶放置在搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，培養(yǎng)25小時(shí)；
[0045]4)發(fā)酵培養(yǎng):然后在三角燒瓶中加入步驟2)配