專利名稱：一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及其制備方 法。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(Sia/^j^ococcM aareM)是奶牛乳房炎和醫(yī)源性感染的主要 病原之一。目前的研究表明，金黃色葡萄球菌有11個血清型，臨床病例分離的金黃色葡萄 球菌多為莢膜多糖5型(type 5 capsular polysaccharide，CP5)、莢膜多糖8型(type 8 capsular polysaccharide，CP8)禾口$胃月莫白勺 336 型(type 336 polysaccharides, 336PS), 且不同國家和地區(qū)主要流行血清型不同。Verdier I (2007年)對195株醫(yī)源性金黃色葡 萄球菌的分型結(jié)果表明，CP5型占42%，CP8型占45%，336型占13%。Melles D C (2008年) 等對丹麥分離的162株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌的分型結(jié)果表明，CP5型占28. 4%，CP8 型占53. 7%，336型占17.9%。韓國學者Han H R等(2000年)對該國奶牛乳房炎分離的107 株金黃色葡萄球菌進行血清型分型發(fā)現(xiàn)，無莢膜的336PS型占46. 7%，CP5和CP8均陽性的 菌株為12. l%，CP5/336均陽性菌株為17. 8%，CP5/336均陽性菌株為6. 5%，未能分型的菌株 為4.7%。王登峰等(2010年)對新疆不同地區(qū)5個大型奶牛場分離的117株金黃色葡萄球 菌分型表明，CP5型占10. 36%，CP8型占13. 68%，無莢膜的336型占64. 96%，未能分型菌株 占 11. 11%。目前對金黃色葡萄球菌的感染主要使用抗生素進行治療，但由于該菌容易對抗生 素產(chǎn)生抗性，導致其耐藥性增強，治療效率下降。通過免疫預(yù)防進行該病防制已成為研究的 熱點。但是，由于金黃色葡萄球菌莢膜多糖(CP5、CP8)和胞外多糖(336PQ無免疫原性，直 接使用相應(yīng)的提取物作抗原不能夠刺激機體產(chǎn)生免疫保護。將其分離、純化并與合適的蛋 白偶聯(lián)，可作為抗原制備疫苗，刺激機體產(chǎn)生免疫保護。莢膜多糖CP5、CP8的純化和偶聯(lián)研究較多，但無莢膜型的金黃色葡萄球菌胞外多 糖的化學結(jié)構(gòu)與莢膜多糖CP5、CP8完全不同，其純化和偶聯(lián)方法也有所差異。建立一種無 莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖的純化和偶聯(lián)技術(shù)方法，將為預(yù)防該型金黃色葡萄球菌疫 苗的研制提供技術(shù)支撐。胞外多糖是金黃色葡萄球菌的主要抗原成分和毒力因子，它具有抗吞噬活性，能 阻止中性粒細胞對細菌的吞噬和與相關(guān)抗體的結(jié)合。有關(guān)研究表明，金黃色葡萄球菌胞外 多糖的結(jié)構(gòu)為聚磷酸化核糖醇-N-乙酰葡萄糖胺，與革蘭氏陽性球菌細胞的主要成分壁磷 壁酸類似。該多糖分子量小，免疫原較差，經(jīng)過純化并與合適的載體蛋白偶聯(lián)能夠提高莢膜 多糖免疫原性。目前國外已公開的無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖純化和偶聯(lián)方法主要 采用是 Ali Ibrahim Fattom(專利文獻號 US005770208A，US002194151B1 ；論文-.INFECTION AND IMMUNITY, Vol. 60，No. 2，p. 584-589)的方法。具體方法為培養(yǎng)無莢膜型金黃色葡萄 球菌至吸光度值20. 0 (650nm)，然后用苯酚-乙醇溶液(體積比1:1)低溫處理2小時滅活菌體，離心收集沉淀-70°C凍存。懸浮菌體至0. 5g/mL，加入溶葡萄球菌酶至終濃度100 150 μ g/mL, 37°C處理3小時，在加入DNA酶、RNA酶至終濃度50 μ g/mL,培養(yǎng)4小時，然后用 25% 75%梯度乙醇濃度沉淀多糖。75%乙醇離心收集沉淀，透析凍干。選擇Q Sepharose 柱離子交換層析后，將收集的多糖再經(jīng)溶菌酶的消化殘余的糖肽，再經(jīng)凝膠過濾層析即得 到純化多糖。偶聯(lián)試劑選擇的是ADH和EDAC，但反應(yīng)介質(zhì)是在水。用該方法進行純化和偶 聯(lián)時，純化過程較為繁雜，偶聯(lián)反應(yīng)體系不穩(wěn)定，不易批量化制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備一種可為人類或其它動物無莢膜型金黃色葡萄球菌感染疫 苗研制提供保護性抗原的技術(shù)方法，利用化學手段制備無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖 與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的所述無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多 糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物由無莢膜型金黃色葡萄球菌的胞外多糖在偶聯(lián)試劑作用下與蛋白質(zhì)共 價偶聯(lián)制備而成的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。所述偶聯(lián)試劑是EDAC和Sulfo-NHS或EDAC和ADH。所述蛋白質(zhì)為牛血清蛋白或卵清蛋白或人血清蛋白或白喉毒素。所述的無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備方法，包括以下 步驟
(1)無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖的純化；
(2)用pH值為4.7的lOOmmol/L MES緩沖液將純化后的多糖配成10mg/mL的溶液，取 1. OmL 液體與 400 μ L EDAC (10mg/mL)和 88 μ L Sulfo-NHS (6. 25mg/mL)溶液混合反應(yīng) 4 6小時后，將反應(yīng)物在pH值為7. 5的lmmol/L EDTA的0. lmol/L PBS緩沖液中4°C條件下 透析18小時，收集衍生化的多糖中間體溶液；
(3)向衍生化的多糖中間體溶液中加入蛋白質(zhì)10mg，同時再加入200μ L EDAC(lOmg/ mL)和44 μ L Sulfo-NHS (6. 25mg/mL)溶液進行反應(yīng)12小時，形成多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶 液；
(4)通過凝膠過濾層析法對多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物進行純化并收集波峰部分溶液。所述的無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備方法，還可以按 照以下步驟制備
(1)無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖的純化；
(2)用pH值為5.6的lOOmmol/L MES緩沖液中將純化后的多糖配成10mg/mL的溶液， 取1. OmL溶液，加入ADH和EDAC至0. 36mol/L、0. 015mol/L,反應(yīng)4 6小時用透析袋(分子 截留量為15KDa)4°C透析，去除EDAC和ADH，收集衍生化的多糖中間體溶液；
(3)向衍生化的多糖中間體溶液中加入蛋白質(zhì)10mg，同時再加入200μ L EDAC(lOmg/ mL)溶液進行反應(yīng)18小時，收集多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液；
(4)通過凝膠過濾層析法對多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液進行層析并收集波峰部分溶液。以上制備方法中，所述的無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖的純化包括以下步 驟
(1)將無莢膜型金黃色葡萄球菌菌株接種在含有1氯化鈉的哥倫比亞液體培養(yǎng)基中，
5370C 170轉(zhuǎn)/分鐘在振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 M小時，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集菌體沉淀；
(2)菌體沉淀用pH值為7.5含2mmol/L硫酸鎂的50mmol/LTriS緩沖液懸浮至0. 25g/ mL。加入溶葡萄球菌素至濃度200 μ g/mL, 37°C孵育4小時，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘收
集上清液；
(3)將上清液用聚乙二醇濃縮至體積的1/5，收集多糖濃縮液；
(4)在多糖濃縮液中加入無水乙醇至總體積的25% 30%，混勻后靜置30分鐘，12000 轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘后收集上清液；
(5)向上清液中再次加入無水乙醇至總體積的75%，混勻靜置30分鐘后離心12000轉(zhuǎn) /分鐘收集沉淀，室溫下放置揮發(fā)多余的乙醇，留取粗多糖沉淀物；
(6)將粗多糖沉淀物以lOmg/mL溶解于緩沖液中，加入DNA酶和RNA酶至濃度0.Img/ mL，37°C振蕩培養(yǎng)箱溫育6小時，再加入蛋白酶XIV消化，再次用無水乙醇浸提，獲得粗多 糖；
(7)將粗多糖用去離子水溶解，在去離子水中透析48小時；
(8)采用凝膠過濾層析法對粗多糖進行純化，用可見-紫外分光光度計檢測吸光度值 (206nm),并繪制曲線，收集波峰部分的液體組分，凍干后獲得純化的無莢膜型金黃色葡萄 球菌胞外多糖。本發(fā)明的有益效果(1)簡化了多糖的純化過程，易于操作，且多糖質(zhì)量穩(wěn)定。主 要步驟簡括為培養(yǎng)菌體細胞一溶葡萄球菌酶處理一乙醇浸提一除核酸和蛋白一凝膠層 析；(2)梯度乙醇處理，去除核酸和蛋白，核酸酶和蛋白酶處理，凝膠層析，收集波峰部分的 多糖；(3)本發(fā)明采用的偶聯(lián)方法有兩種①改進的ADH間橋法選擇合適的緩沖液以穩(wěn)定 偶聯(lián)反應(yīng)的PH值，采用ADH偶聯(lián)試劑在EDAC作用下與多糖形成ADH活化的多糖，再將活化 的多糖與牛血清白蛋白通過共價鍵偶聯(lián)，形成多糖-蛋白偶聯(lián)物，該法能使反應(yīng)條件更加 穩(wěn)定，有利于提高偶聯(lián)率 ’②EDAC零距離交聯(lián)法所制備的多糖通過EDAC和Sulf0-NHS作 用下與多糖共價形成Sulfo-NHS活化的多糖中間體，再將活化的多糖與蛋白質(zhì)通過共價鍵 偶聯(lián)，形成多糖-蛋白偶聯(lián)物；(4)選擇了合適的緩沖液，適當增加了偶聯(lián)試劑的濃度，能夠 使偶聯(lián)反應(yīng)條件更加穩(wěn)定，提高最終的偶聯(lián)率；(5) EDAC零距離交聯(lián)法制備的偶聯(lián)抗原，其 反應(yīng)分兩步操作，針對不同的反應(yīng)特性選擇了不同的反應(yīng)緩沖液，可以提高的偶聯(lián)率；(6) 能顯著地改善多糖的抗原性；(7)增加免疫對象的體液免疫水平，提高機體對該菌的免疫 保護能力；(8)上述方法是將金黃色葡萄球菌重要的毒力因子胞外多糖在適應(yīng)的緩沖體系 中與蛋白質(zhì)通過偶聯(lián)試劑共價連接得到的多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。該方法較現(xiàn)有的偶聯(lián)方法 更加穩(wěn)定。用該方法制備無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物可用于預(yù)防該 類型金黃色葡萄球菌感染所致的奶牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎以及醫(yī)源性金黃色葡萄球菌引起 的各種感染性疾病。本發(fā)明所用無莢膜型金黃色葡萄球菌菌株購買于美國標準生物品收藏中心 (ATCC)，其貨物描述為 Staphylococcus aureus subsp. aureus, ATCC 編號為 55804，2007 年 9月委托北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司代理進口，合同號為QC07090068，合同書以其他證明 文件的形式已經(jīng)附在電子申請文件中。本發(fā)明還可應(yīng)用于其它無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖偶聯(lián)物的制備，這里給 出的菌株僅僅是為了例示性說明本發(fā)明。
本發(fā)明中涉及的術(shù)語有MES為2- (N-嗎啉代)乙烷磺酸；PBS為磷酸鹽緩沖液； ADH為乙二酸二酰胼；EDAC為1-乙基_3_ (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺；Sulf0-NHS為 N-羥基硫代琥珀酰亞胺；Tris為三羥甲基氨基甲烷；DNA為脫氧核糖核酸；RNA為核糖核 酸；KDa為千道爾頓；EDTA為乙二胺四乙酸二鈉；無水乙醇為質(zhì)量分數(shù)大于或等于99. 7%的乙醇。


附圖為無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖凝膠過濾層析波峰圖
圖中是用0. 2mol/L氯化鈉溶液洗脫層析柱并收集洗脫液，以1. 4mL/管，共收集120 管，分別測定各管溶液的吸光度值(206nm)，用Excel 2007繪制曲線，收集第14管 第44 管波峰部分樣品。
具體實施例方式下面通過具體的實施例是對本發(fā)明作進一步的描述
實施例1 一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，由無莢膜型金黃色 葡萄球菌的胞外多糖在偶聯(lián)試劑EDAC和SulfO-NHS作用下與牛血清蛋白共價偶聯(lián)制備而 成的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-牛血清蛋白偶聯(lián)物。用EDAC零距離縮合法制備無莢膜型金黃色葡萄球菌多糖-牛血清蛋白偶聯(lián)物的 制備方法，具體如下
(1)無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖的分離與純化
①將金黃色葡萄球菌菌株接種于哥倫比亞液體培養(yǎng)基(含2、氯化鈉)，370C 170轉(zhuǎn)/分 鐘振蕩培養(yǎng)22 M小時，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘收集菌體沉淀，稱重后_75°C凍存。②將收集的菌體沉淀pH值為7. 5的含2mmol/L硫酸鎂的50mmol/L Tris懸浮至 0. 25g/mL,加入溶葡萄球菌素至終濃度200 μ g/mL, 37°C孵育4小時，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30 分鐘收集上清
③將上清液裝入透析袋(分子截留量為12 14KDa)中，用聚乙二醇20000濃縮至原 體積的1/5。④在多糖濃縮液中加入無水乙醇至總體積25% 30%，混勻后靜置30分鐘，12000 轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘收集上清。⑤向上清液中再次加入無水乙醇至總體積的75%，混勻后靜置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心30分鐘收集沉淀，室溫下放置揮發(fā)多余的乙醇，留取粗多糖沉淀物；
⑥將多糖沉淀物以lOmg/mL溶解于pH值為7. 5的2mmol/L硫酸鎂的50mmol/L Tris 緩沖液中，分別加入DNA酶和RNA酶至濃度0. lmg/mL, 37°C振蕩溫育6小時，再加入蛋白酶 XIV，濃度為lmg/mL，37°C振蕩溫育18小時，再次乙醇浸提，方法同上。⑦將多糖用緩沖液溶解，裝入透析袋中，用去離子水透析48小時后凍干。⑧采用凝膠過濾層析法對粗多糖進行純化，凝膠過濾層析柱規(guī)格為2. 5厘米X 50 厘米，填料為kphacryl S-300 HR。填裝好后的柱用0. 2mol/L氯化鈉溶液平衡。將凍干 的胞外多糖用上述平衡溶液溶解并上樣。0. 2mol/L氯化鈉溶液洗脫層析柱并收集洗脫液， 以1. 4mL/管，共收集120管，分別測定各管溶液的吸光度值(206nm)，用Excel 2007繪制曲線，收集第14管 第44管波峰部分樣品，如圖所示。用去離子水4°C透析48小時后凍干， 即為純化的無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖。同時對多糖進行化學檢定，多糖含量測定 采用硫酸-苯酚法，蛋白質(zhì)含量的測定采用改良型BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒，核酸含量的 測定采用紫外分光光度法。如表1所示
權(quán)利要求
1.一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于所述的多 糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物由無莢膜型金黃色葡萄球菌的胞外多糖在偶聯(lián)試劑作用下與蛋白質(zhì)共 價偶聯(lián)制備而成的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于 所述偶聯(lián)試劑是EDAC和Sulfo-NHS或EDAC和ADH。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于 所述蛋白質(zhì)為牛血清蛋白或卵清蛋白或人血清蛋白或白喉毒素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制 備方法，其特征在于該制備方法包括以下步驟(1)無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖的純化；(2)用pH值為4.7的lOOmmol/L MES緩沖液將純化后的多糖配成10mg/mL的溶液，取 1. OmL 液體與 400 μ L EDAC (10mg/mL)禾口 88 μ L Sulfo-NHS (6. 25mg/mL)溶液混合反應(yīng) 4 6小時后，將反應(yīng)物在pH值為7. 5的lmmol/L EDTA的0. lmol/L PBS緩沖液中4°C條件下 透析18小時，收集衍生化的多糖中間體溶液；(3)向衍生化的多糖中間體溶液中加入蛋白質(zhì)10mg，同時再加入200μ L EDAC(lOmg/ mL)和44 μ L Sulfo-NHS (6. 25mg/mL)溶液進行反應(yīng)12小時，形成多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶 液；(4)通過凝膠過濾層析法對多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物進行純化并收集波峰部分溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制 備方法，其特征在于該制備方法包括以下步驟(1)無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖的純化；(2)用pH值為5.6的lOOmmol/L MES緩沖液中將純化后的多糖配成10mg/mL的溶液， 取1. OmL溶液，加入ADH和EDAC至0. 36mol/L、0. 015mol/L,反應(yīng)4 6小時用透析袋(分子 截留量為15KDa)4°C透析，去除EDAC和ADH，收集衍生化的多糖中間體溶液；(3)向衍生化的多糖中間體溶液中加入蛋白質(zhì)10mg，同時再加入200μ L EDAC(lOmg/ mL)溶液進行反應(yīng)18小時，收集多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液；(4)通過凝膠過濾層析法對多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液進行層析并收集波峰部分溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián) 物的制備方法，其特征在于所述的無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖的純化包括以下步 驟(1)將無莢膜型金黃色葡萄球菌菌株接種在含有洲氯化鈉的哥倫比亞液體培養(yǎng)基中， 370C 170轉(zhuǎn)/分鐘在振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 M小時，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集菌體沉淀；(2)菌體沉淀用pH值為7.5含2mmol/L硫酸鎂的50mmol/LTriS緩沖液懸浮至0. 25g/ mL加入溶葡萄球菌素至濃度200 μ g/mL, 37°C孵育4小時，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘收集 上清液；(3)將上清液用聚乙二醇濃縮至體積的1/5，收集多糖濃縮液；(4)在多糖濃縮液中加入無水乙醇至總體積的25% 30%，混勻后靜置30分鐘，12000 轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘后收集上清液；(5)向上清液中再次加入無水乙醇至總體積的75%，混勻靜置30分鐘后離心12000轉(zhuǎn)/分鐘收集沉淀，室溫下放置揮發(fā)多余的乙醇，留取粗多糖沉淀物；(6)將粗多糖沉淀物以lOmg/mL溶解于緩沖液中，加入DNA酶和RNA酶至濃度0.Img/ mL，37°C振蕩培養(yǎng)箱溫育6小時，再加入蛋白酶XIV消化，再次用無水乙醇浸提，獲得粗多 糖；(7)將粗多糖用去離子水溶解，在去離子水中透析48小時；(8)采用凝膠過濾層析法對粗多糖進行純化，用可見-紫外分光光度計檢測吸光度值 (206nm),并繪制曲線，收集波峰部分的液體組分，凍干后獲得純化的無莢膜型金黃色葡萄 球菌胞外多糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及其制備方法。所述的多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物由無莢膜型金黃色葡萄球菌的胞外多糖在偶聯(lián)試劑作用下與蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)制備而成的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。其制備方法采用改進的ADH間橋法或EDAC零距離交聯(lián)法制備。無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備將為預(yù)防金黃色葡萄球菌疫苗的研制提供了強有力的技術(shù)支撐。
文檔編號C07K14/31GK102120761SQ20101060435
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者吳建勇, 楊學云, 王治才, 王登峰 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學院獸醫(yī)研究所