專利名稱：特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA及其應用。
背景技術：
癌癥是人類健康的第二大殺手，目前臨床上使用化療藥物過程中經常出現抗藥性，癌細胞往往殺不死，腫瘤經常復發(fā)轉移而導致死亡。其中很重要的原因之一是這部分癌細胞中的凋亡抑制基因(Bcl2基因)高表達，使腫瘤細胞抗凋亡而不死亡，從而常出現腫瘤復發(fā)轉移。因此抑制腫瘤Bcl2基因表達的作用是提高化療藥物療效、徹底殺死癌細胞和防止腫瘤復發(fā)轉移的重要途徑之一。國外已經有采用反義寡核苷酸技術抑制腫瘤Bcl2基因 的創(chuàng)新藥物(G3139)進入三期臨床研究，但是對慢性淋巴細胞白血病和黑色素瘤的三期臨床研究結果不理想而沒有得到美國FDA的批準，對食道癌、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、腸癌的三期臨床研究還在進行中，這可以證明對Bcl2基因的作用靶點沒有問題，只是反義寡核苷酸技術敏感性可能低于小核酸干擾技術藥物，療效仍需要提高。而一般文獻報道認為小核酸干擾技術藥物比反義寡核苷酸技術敏感性要高10-1000倍，毒副作用卻明顯減小，因此國際上已經出現用小核酸干擾技術藥物取代反義寡核苷酸技術藥物的趨勢。目前小核酸干擾技術(RNAi)是生物科技和創(chuàng)新藥物研究中最熱門的領域之一，它已經吸引了許多大型制藥公司的投資。2006年贏得諾貝爾醫(yī)學獎的科學成果就是以小核酸干擾技術為基礎的。科學界普遍認為，通過利用小核酸干擾技術，有可能產生出前景不錯的治療藥物，用于治療癌癥這類采用通常技術難以提高療效的疾病。目前國際上已有12個對稱性小核酸干擾siRNA藥物進入一到三期臨床試驗，但是絕大部分是外用和局部給藥，只有二項是全身靜脈給藥，其中靶向腫瘤相關基因核糖核苷酸還原酶M2亞基的CALAA-Ol對稱小核酸干擾藥物和抑制肝癌相關基因的ALN-VSP，已被FDA批準進入腫瘤靜脈給藥的I期臨床試驗。總體來說，對稱小核酸干擾siRNA藥物在穩(wěn)定性和靜脈給藥技術的遞藥系統(tǒng)上也還存在部分技術瓶頸性問題。而不對稱小核酸干擾研究起步更晚，2008年12月，Sunet al在NATUREBI0TECHN0L0GY上最早提出了新一代不對稱RNA干擾技術。而采用化學合成修飾的不對稱小核酸干擾藥物asiRNA，設計簡便、作用迅速、效果明顯，穩(wěn)定性好，活性更穩(wěn)定，毒副作用更小，更容易進入腫瘤細胞達到靶向抑制作用，因此應用前景更好。經CCK8法、qRT-PCR法、流式細胞儀檢測、細胞毒性檢測、生長曲線測定、荷瘤小鼠藥效學和生存率實驗、靶向腫瘤分布實驗等，這種asiRNA抑制Bcl2表達的作用更明顯，并明顯抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠生存期。與以往藥物和siRNA比較，asiRNA是一種作用機理新穎、高效快速、特異穩(wěn)定、靶向性好、副作用小新的抗腫瘤藥物分子
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現有技術的上述不足，提供特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA。本發(fā)明的另一目的是提供該asiRNA的應用。特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA，所述的asiRNA是通過如下方法設計，并經化學合成得到的從Bcl2基因對稱性小核酸干擾分子siRNA出發(fā)，通過將siRNA正義鏈或反義鏈5’或3’端裁減l_5nt堿基，并于每條鏈3’端用兩個脫氧核糖核酸dTdT突出的核苷酸，形成兩條鏈堿基長度不一致，每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，具有14-21nt的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈不對稱小核酸干擾分子 asiRNA。 所述的asiRNA優(yōu)選自下列七種asiRNA的其中一種或幾種A :5，GG AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3，3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5，；B :5’ CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ ；C :5’ G CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’3， dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5，；D :5’ GG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’3， dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5，；E :5，AGG CUG GGAUGC CUU U dTdT 3’3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5，；F :5’ G AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5，；G :5’ CGGAGG CUG GGAUGC CUU U dTdT 3’3， dTdT C UCC GAC CCU ACG GAA A 5，；進一步優(yōu)選F :5’ G AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’3， dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5，?；蛘?，所述的特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA優(yōu)選通過如下方法設計，并經化學合成得到的從Bcl2基因對稱性小核酸干擾分子siRNA出發(fā)，通過將siRNA正義鏈或反義鏈5’或3’端裁減l_5nt堿基，于每條鏈3’端用兩個脫氧核糖核酸dTdT替代3’端突出的核苷酸，并采用膽固醇、硫代、甲基化、磷酸化、氟代對正義鏈或/和反義鏈進行化學修飾，形成兩條鏈的堿基長度不一致，每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，具有14-21nt的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈不對稱小核酸干擾分子 asiRNA。所述的特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA進一步優(yōu)選下列九種asiRNA的其中一種或幾種H :5’ choI-GAGGCUGGGAUGCCUUUdTdT 3’3’ dTdTGCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；I :5，chol-G-s-A-s-G-s-GCUGGGAUGC-s-C-s-(FU)-s-(FU)-S-(FU)dTdT 3，3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；
J :5，chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3，3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；K : 5 ’ choI-GAGGC (FU)GGGA (FU)GCC (FU) (FU) (FU)dT-s-dT 3，
3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；L :5，chol-G-s-A-s-GGCUGGGAUGCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3，3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；M :5’ choI-G-s-A-s-GGC(FU)GGGA(FU)GCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；N :5’ chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’3’ dT-s-dT G-s-C-s-C-s-(mU)-s-C-s-CGACCCUACGGAAA-P 5’ ；0 :5’ chol-(mG) (mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’3， dT-s-dTGCC(mU)CCGACCC(mU)ACGGA(mA)A 5’；P :5’ chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；更進一步優(yōu)選J :5，chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3，3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；或P :5’ chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；其中，chol為膽固醇修飾、s為硫代修飾、m為甲基化修飾、P為磷酸化修飾、F為氟代修飾。所述的特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA在制備抗腫瘤藥物中的應用。有益效果本發(fā)明提供的從siRNA設計裁減堿基和用化學合成法合成正義鏈與反義鏈長度不一致的能誘發(fā)RNA干擾的不對稱小核酸干擾asiRNA，并采用膽固醇、或/和硫代、或/和甲基化、或/和磷酸化、或/和氟代堿基化學修飾正義鏈或/和反義鏈的堿基，使不同結構的asiRNA較之對稱的siRNA更加穩(wěn)定，抑制Bcl2表達的活性更強，毒副作用更小，更容易進入腫瘤細胞達到靶向抑制作用。本發(fā)明asiRNA可以用于全身靜脈給藥，制備成穩(wěn)定、有效、低毒的抑制腫瘤Bcl2基因表達的不對稱小核酸干擾基因治療藥物。


圖I :轉染不同siRNA和asiRNA后，qRT-PCR檢測HeLaB2細胞中Bcl_2mRNA的相對表達量。其中control為轉染不相關siRNA的陰性對照，15/21-19/21，為正義鏈縮短的不對稱siRNA，分別對應表I中的B-F ；21/21為常規(guī)對稱siRNA。圖2 :流式細胞儀檢測不同Bcl2_asiRNA對HelaB2細胞中的Bcl2蛋白的抑制效率。其中15/21-19/21對應的樣品同圖I。21/19為反義鏈縮短的不對稱asiRNA，對應表I中G。圖3 CCK8檢測不同Bcl2_asiRNA對HelaB2細胞增殖抑制效率。各組代表的樣品同圖I。
圖4 CCK8 檢測 Bcl2_asiRNA(19/21)和常規(guī) siRNA(21/21)對 HelaB2 細胞毒性影響，其中Bcl2-asiRNA(19/21)對應表I中的F，siRNA及asiRNA的濃度分別為0. 33nM,
3.3mM, 33nM和330nM，以藥物濃度對細胞活性作圖。圖5 :Bcl2_asiRNA (表 I 中 F)及 siRNA (21/21)與順鉬聯合使用對 HelaB2 細胞體外抑制作用。其中各組如下1 =Lipo 2000轉染19/21asiRNA組；2 :Lipo 2000轉染21/21siRNA 組；3 Lipo2000 轉染 19/21 asiRNA+ 低劑量順鉬(I 微克)組；4 =Lipo 2000 轉染21/21siRNA+低劑量順鉬組；5 :低劑量順鉬(I微克)單獨組；6 :增倍劑量順鉬(2微克)組。圖6 :Bcl2_asiRNA和siRNA對化療藥物順鉬耐藥的HelaB2細胞生長的影響，HelaB2組未不進行任何轉染的對照，Control組為轉染不相關siRNA的陰性對照，19/21為正義鏈19bp的asiRNA(表I中的F)，21/21為常規(guī)對稱siRNA。縱坐標為順鉬耐藥HelaB2 細胞的個數。圖7 :流式細胞儀檢測不同修飾的Bcl2_asiRNA對HelaB2細胞中的Bcl2蛋白的抑制效率。其中Control為轉染不相關siRNA的陰性對照；19M0/21-19M6/21M2分別代表對正義鏈19bp的asiRNA進行不同方式的修飾，具體修飾方式對應表I中的H-P。圖8 :靜脈注射修飾的Bcl2-asiRNA(19M2/21，表I中的J)對荷H22肝癌小鼠腫瘤體積的抑制曲線。其中NS為尾靜脈注射生理鹽水的空白對照組；CTX為腹腔注射30mg/kg CTX的陽性對照組；脂質體空白為尾靜脈注射單獨脂質體遞送系統(tǒng)的陰性對照；脂質體-Bcl2-asiRNA-M2為將經過修飾的Bcl2_asiRNA經脂質體遞送系統(tǒng)包裹后，尾靜脈注射后的小鼠腫瘤體積的抑制效果。圖9 :靜脈注射修飾的Bcl2_asiRNA(19M2/21，表I中的J)對荷H22肝癌小鼠生存率的影響。各組注射情況和樣品同圖8。圖10 :靜脈注射修飾的Bcl2_asiRNA(表I中的P)在荷人肝癌裸鼠各器官的分布及靶向腫瘤作用，采用表I中P樣品用熒光Cy5標記，在樣品注射Ih進行活體成像定量觀察各器官asiRNA殘留量(圖IOa)并在Ih處死動物取出內臟進行活體成像觀察(圖IOb)，圖IOb中從左向右依次為心、肝、脾、肺、腎、腫瘤。
具體實施例方式在本發(fā)明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。所用到的引物，均在首次出現時標明，其后所用相同引物，均以首次標明的內容相同。實施例I本發(fā)明利用基因庫中尋找靶向腫瘤凋亡抑制基因Bcl2mRNA的I組siRNA(序列為正義鏈 5’CGGAGGCUGGGAUGCCUUU 3’ (SEQ ID NO. I)，反義鏈 3’GCCUCCGACCCUACGGAAA5’ (SEQ ID NO. 2))為基礎，通過將siRNA正義鏈或反義鏈的5’或3’端裁減I個、或2個、或3個、或4個、或5個堿基，形成兩條鏈堿基長度不一致，每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，具有14-21nt的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA。或者在此基礎上并采用膽固醇、或/和硫代、或/和甲基化、或/和磷酸化、或/和氟代堿基化學修飾正義鏈、或/和反義鏈的堿基、磷酸骨架、核糖，形成兩條鏈堿基長度不一致，每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，具有14-21nt的經化學修飾的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA。所設計的asiRNA見表1，并委托廣州銳博公司專業(yè)合成機構商業(yè)合成。
表l、Bcl2_asiRNA的編號、序列、名稱、修飾類型
權利要求
1.特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA，其特征在于所述的asiRNA是通過如下方法設計，并經化學合成得到的從Bcl2基因對稱性小核酸干擾分子siRNA出發(fā)，通過將siRNA正義鏈或反義鏈5’或3’端裁減l_5nt堿基，形成兩條鏈堿基長度不一致，每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，具有14-21nt的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA。
2.根據權利要求I所述的特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA,其特征在于所述的asiRNA選自下列七種asiRNA的其中一種或幾種A :5’ GG AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ ；B :5’ CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ ；C :5’ G CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ ；D :5’ GG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ ；E :5’ AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ ；F :5’ G AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ ；G :5’ CGG AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’3’ dTdT C UCC GAC CCU ACG GAA A 5’。
3.根據權利要求2所述的特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA，其特征在于所述的asiRNA為F :5’ G AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’ 3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’。
4.根據權利要求I所述的特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA，其特征在于所述的asiRNA是通過如下方法設計，并經化學合成得到的從Bcl2基因對稱性小核酸干擾分子siRNA出發(fā)，通過將siRNA正義鏈或反義鏈5’或3’端裁減l_5nt堿基，并采用膽固醇、硫代、甲基化、磷酸化、氟代對正義鏈或/和反義鏈進行化學修飾，形成兩條鏈的堿基長度不一致，每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，具有14_21nt的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA。
5.根據權利要求4所述的特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA,其特征在于所述的asiRNA選自下列九種asiRNA的其中一種或幾種H:5’ choI-GAGGCUGGGAUGCCUUUdTdT 3’ 3’ dTdTGCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；I :5’ chol-G-s-A-s-G-s-GCUGGGAUGC-s-C-s-(FU)-s-(FU)-S-(FU)dTdT 3’ 3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；J :5’ chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’ 3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；K :5’ choI-GAGGC (FU)GGGA(FU)GCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’ .3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；L :5’ chol-G-s-A-s-GGCUGGGAUGCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’ 3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；M :5’ choI-G-s-A-s-GGC(FU)GGGA(FU)GCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’ 3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；N :5，chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3， .3， dT-s-dT G-s-C-s-C-s-(mU)-s-C-s-CGACCCUACGGAAA-P 5，；.0:5，chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3， 3’ dT-s-dTGCC(mU)CCGACCC(mU)ACGGA(mA)A 5’ ；P :5，chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3， . 3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ； 其中，chol為膽固醇修飾、s為硫代修飾、m為甲基化修飾、P為磷酸化修飾、F為氟代修飾。
6.根據權利要求5所述的特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA，其特征在于所述的asiRNA為J :5’ chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’ 3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ；或 P :5’ cho I-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’ .3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ ； 其中，chol為膽固醇修飾、s為硫代修飾、m為甲基化修飾、P為磷酸化修飾、F為氟代修飾。
7.權利要求I所述的asiRNA在制備抗腫瘤藥物中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述的選自下列七種asiRNA的其中一種或幾種A :5’ GG AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’ (SEQ ID NO I) 3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ (SEQ ID NO 2)B :5’ CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’ (SEQ ID NO 3) 3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ (SEQ ID NO 4)C :5’ G CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’ (SEQ ID NO 5) 3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ (SEQ ID NO 6)D :5’ GG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’ (SEQ ID NO 7) 3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ (SEQ ID NO 8)E :5’ AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’ (SEQ ID NO 9) 3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ (SEQ ID NO 10)F :5’ G AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’ (SEQ ID NO 11) 3’ dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ (SEQ ID NO 12)G :5’ CGG AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’ (SEQ ID NO 13) 3’ dTdT C UCC GAC CCU ACG GAA A 5’ (SEQ ID NO 14)
9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述的選自下列九種asiRNA的其中一種或幾種H:5’ cho I -GAGGCUGGGAUGCCUUUdTdT 3’ (SEQ ID NO 15).3’ dTdTGCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ (SEQ ID NO 16)I:5’chol-G-s-A-s-G-s-GCUGGGAUGC-s-C-s-(FU)-s-(FU)-s-(FU)dTdT 3’ (SEQ ID NO17).3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ (SEQ ID NO 18)J :5’ chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’ (SEQ ID NO 19).3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ (SEQ ID NO 20)K :5’ choI-GAGGC(FU)GGGA(FU)GCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’ (SEQ ID NO 21).3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ (SEQ ID NO 22)L :5’ chol-G-s-A-s-GGCUGGGAUGCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’ (SEQ ID NO 23).3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ (SEQ ID NO 24)M:5，cho I-G-s-A-s-GGC (FU) GGGA (FU) GCC (FU) (FU) (FU) dT-s-dT 3，(SEQ ID NO 25).3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ (SEQ ID NO 26)N :5’ chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’ (SEQ ID NO 27).3， dT-s-dT G-s-C-s-C-s-(mU)-s-C-s-CGACCCUACGGAAA-P 5， (SEQ ID NO 28) .0:5’ chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’ (SEQ ID NO 29).3’ dT-s-dTGCC(mU)CCGACCC(mU)ACGGA(mA)A 5’ (SEQ ID NO 30)P :5’ chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’ (SEQ ID NO 31).3’ dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’ (SEQ ID NO 32) 其中，chol為膽固醇修飾、s為硫代修飾、m為甲基化修飾、P為磷酸化修飾、F為氟代修飾。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，公開了特異性抑制腫瘤凋亡抑制基因Bcl2的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA及其應用。所述的asiRNA是通過如下方法設計，并經化學合成得到的從Bcl2基因對稱性小核酸干擾分子siRNA出發(fā)，通過將siRNA正義鏈或反義鏈5’或3’端裁減1-5nt堿基，并于每條鏈3’端用兩個脫氧核糖核酸dTdT突出的核苷酸，形成兩條鏈堿基長度不一致，每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈不對稱小核酸干擾分子asiRNA。本發(fā)明asiRNA較之常規(guī)的siRNA更加穩(wěn)定，抑制Bcl2表達的活性更強，可在制備抗腫瘤藥物中應用。
文檔編號A61P35/00GK102719432SQ20111007622
公開日2012年10月10日 申請日期2011年3月29日 優(yōu)先權日2011年3月29日
發(fā)明者侯亞義, 傅更鋒, 吳稚偉, 張昌棟, 徐根興, 樊燕蓉, 殷妍, 王慶曉, 王建軍, 郭佳佳, 陳旭 申請人:南京大學