一種水稻種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]啟動(dòng)子是一段位于基因上游區(qū)的DNA序列，參與下游基因的表達(dá)調(diào)控，決定了基 因的轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄效率和時(shí)空特異性。按照啟動(dòng)子的作用方式和功能可以將啟動(dòng)子分為 三大類：組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以及組織特異性啟動(dòng)子。目前組成型啟動(dòng)子在植物 基因工程中應(yīng)用較為廣泛，但在應(yīng)用中逐漸暴露出一些問題，比如說它使外源基因在整個(gè) 植株中表達(dá)，產(chǎn)生大量的外源蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物，打破了植物原有的代謝平衡，加重了植株 的負(fù)擔(dān)，影響了植物的形態(tài)和正常的生長發(fā)育，甚至?xí)?dǎo)致植株死亡，造成資源不必要的浪 費(fèi)。因此，人們正在努力尋找一些植物自身特有的組織特異性啟動(dòng)子，用于轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu) 建。
[0003]組織特異性啟動(dòng)子只在某些特定的器官或組織部位調(diào)控基因表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育 調(diào)節(jié)的特性。其特點(diǎn)在于，在植物發(fā)育過程中，能夠在時(shí)間和空間上有效地調(diào)控目的基因的 表達(dá)，使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在特定的空間區(qū)域積累，按照人們的意愿改進(jìn)代謝途徑，提高 組織中營養(yǎng)物質(zhì)含量，更加便利地獲得工業(yè)新產(chǎn)品和醫(yī)藥新化合物等。因此，組織特異性啟 動(dòng)子已成為轉(zhuǎn)基因研究中最具有發(fā)展前景的外源基因的啟動(dòng)元件。
[0004]水稻為一年生禾本科單子葉植物，是世界上最重要的糧食作物之一。種子是水稻 最主要的營養(yǎng)貯藏器官，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此，種子特異性啟動(dòng)子作為一種重要的順 式作用元件，具有重要的實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種水稻種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供含有上述啟動(dòng)子序列的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因 細(xì)胞系或重組菌。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供用于擴(kuò)增上述水稻種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子序列的 引物對。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述水稻種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種DNA片段，其含有如下（1)-(4)任一項(xiàng)所不的DNA分子： (1) SEQ ID NO. 1所示的DNA分子； (2) SEQ ID NO. 2所示的DNA分子； (3) SEQ ID NO. 3所示的DNA分子； (4) 在嚴(yán)格條件下與（1)或（2)或（3)限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分 子。
[0010]含有以上所述的DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
[0011] 用于擴(kuò)增以上所述DNA片段的全長或其任意片段的引物對。
[0012] 以上所述的DNA片段在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
[0013] 所述目的基因表達(dá)為組織特異性表達(dá)，所述組織為植物種子。
[0014] 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
[0015] 所述單子葉植物為水稻。
[0016] 作為優(yōu)選的，所述目的基因?yàn)樽颉?br>[0017] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明新發(fā)現(xiàn)了三個(gè)可在水稻種子中特異性表達(dá)的啟動(dòng) 子，其可用于啟動(dòng)目標(biāo)基因（如基因）在水稻種子中的特異表達(dá)，使目標(biāo)基因的表達(dá) 產(chǎn)物在特定的空間區(qū)域積累，可以避免目標(biāo)基因在水稻所有組織中組成型表達(dá)影響植株生 長。本發(fā)明的新啟動(dòng)子在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用和市場前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1為主要載體結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為轉(zhuǎn)基因水稻檢測引物位置示意圖； 圖3為水稻各株系RT-PCR結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0020] 以下實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、 DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見《分子 克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第三版）（SambrookJ,RussellDW，JanssenK,ArgentineJ.黃培堂 等譯，2002,北京：科學(xué)出版社），或按照制造廠商所建議的條件。 實(shí)施例
[0021] 一、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1、水稻種子特異性表達(dá)基因的篩選 通過對"水稻基因組標(biāo)注項(xiàng)目（RiceGenomeAnnotationProject，RGAP)"網(wǎng)站 (http://rice.plantbiology.msu.edu/)中的水稻基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫中RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行檢 索，篩選組織特異表達(dá)基因作為候選種子特異表達(dá)基因。RGAP網(wǎng)站由美國國家基金會(huì)資助， 提供水稻亞種"日本晴"的基因組序列和12條染色體的標(biāo)注信息。候選啟動(dòng)子編號(hào)，候選 基因編號(hào)，RNA-seq數(shù)據(jù)，編碼如表1所示。根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫信息，選取基因起始密 碼子ATG上游約2kb作為基因的啟動(dòng)子和5 'UTR區(qū)。其中L0C_0s02g25640基因?yàn)榕呷樘?異表達(dá)（JExpBot, 2008，59 (9): 2417-2424)。
[0022] 表1候選基因在數(shù)據(jù)庫中的RNA-seq結(jié)果
2、野生型水稻日本晴基因組DNA提取 按常規(guī)方法提取野生型水稻日本晴基因組DNA。
[0023] 3、候選啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增及純化 根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物(表2)，從水稻基因組擴(kuò)增獲得相應(yīng)片段。
[0024] 表2擴(kuò)增啟動(dòng)子的引物
采用NEB公司的Phusion高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，日本晴基因組DNA0. 25yg，正向引 物和反向引物各2. 5yL(終濃度為各0. 5ymol/L)，10mMdNTPsIyL，5XHF緩沖液10yL， PhusionDNA聚合酶0. 5yL，加水至50yL。PCR反應(yīng)條件如表3 : 表3Phusion高保真酶擴(kuò)增參數(shù)
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，用美基公司的凝膠回收試劑盒回收DNA片段，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0025] 4、水稻農(nóng)桿菌雙元轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建 用歷和分el酶切p35sCinH和pZH041質(zhì)粒（圖1)，回收相應(yīng)的和載 體骨架片段，T4連接酶16°C連接3小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。利 用常規(guī)PCR方法檢測篩選陽性克隆，獲得pZH051。用歷>?411和AscI切割載體pZH051，回 收大片段載體骨架序列，將啟動(dòng)子替換為組織特異表達(dá)候選啟動(dòng)子(簡稱為P-ts)。
[0026] 表4轉(zhuǎn)化載體與對應(yīng)的啟動(dòng)子和基因編號(hào)
5、 雙元載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中 采用電轉(zhuǎn)化方法將載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌的驗(yàn)證采