花生特異啟動子AhRSP與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及花生特異啟動子AhRSP與應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟作物之一，也是單產(chǎn)、總產(chǎn)、單位面積產(chǎn)油量和 種植業(yè)產(chǎn)值最高的大宗油料作物和出口創(chuàng)匯的優(yōu)勢農(nóng)產(chǎn)品。長期以來，根部病蟲害是影響 花生產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害，如花生的青枯病、根結(jié)線蟲、蠐螬等。花生青枯病是土傳性的 細菌病害，該病害從根部侵入，一旦發(fā)生會給花生生產(chǎn)造成毀滅性性的打擊，該病目前在我 國南方花生產(chǎn)區(qū)，如廣東、福建、江蘇、湖南、湖北、安徽等省份普遍發(fā)生，目前在山東、遼寧、 河北、河南等地也有發(fā)生，危害十分嚴重?；ㄉY(jié)線蟲病是一種世界性病害，幾乎所有種 植花生的國家和地區(qū)都有發(fā)生，其中以山東發(fā)病最為普遍。花生感病后根的吸收功能被破 壞，植株矮小發(fā)黃，結(jié)果少而稀。一般減產(chǎn)20 %?30 %，嚴重的可減產(chǎn)70 %以上，甚至絕收。 除了上述兩種病蟲害，蠐螬也是危害花生的重要蟲害。蠐螬剝食花生主根使植株死亡，導(dǎo)致 嚴重減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)的現(xiàn)象時有發(fā)生。但是對于上述花生根部病蟲害至今沒有特效藥可治。 利用基因工程手段將抗病、抗蟲的基因?qū)牖ㄉ?，提高花生的抗性，是減少花生病害損失 的重要途徑。
[0003] 植物基因工程技術(shù)的成功應(yīng)用不僅需要大量的優(yōu)異基因資源，而且需要驅(qū)動基因 高水平表達的啟動子，需要在特定器官、組織中特異表達的啟動子，以避免在轉(zhuǎn)基因過程 中的不利影響。在植物轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建過程中常用的啟動子主要有2個，第一，花椰菜花 葉病毒CaMV35S啟動子，該啟動子來自花椰菜病毒，是非植物內(nèi)源的組成型啟動子（Odell et al.，1985)，該啟動子能驅(qū)動目的基因在單、雙子葉轉(zhuǎn)基因植物的所有組織中高效表達 (Battraw and Hall，1990)。第二，玉米ZmUbi啟動子，該啟動子來源于玉米泛素，是植物內(nèi) 源的組成型的啟動子，ZmUbi啟動子在單子葉植物許多的細胞中都有很高的活性，能夠調(diào)控 目的基因在根、葉中強烈表達（Cornejo et al.，1993)。但是，組成型啟動子驅(qū)動的基因在 植物的所有組織、所有生長階段都高水平的表達，在實際應(yīng)用過程中會產(chǎn)生一系列的問題 (Napoli et al.，1990)。例如，外源基因在植物體內(nèi)大量表達會產(chǎn)生許多的異源蛋白或者 產(chǎn)生有害物質(zhì)，這些物質(zhì)在植物體內(nèi)積累，會打破植物體內(nèi)原有的代謝平衡，影響植物正常 的生長發(fā)育，造成植物生長延緩、開花延遲、甚至不育或死亡（Pino et al.，2007)。
[0004]目前轉(zhuǎn)基因的安全性受到了受到了廣泛的關(guān)注，并且飽受質(zhì)疑，選擇有效、安全的 啟動子成為了當前轉(zhuǎn)基因育種的熱點與難點。因此，鑒定能在植物特定組織、器官以及特定 時期調(diào)控基因表達的啟動子進行遺傳載體的構(gòu)建，對于作物的遺傳改良顯得尤為必要。對 花生而言，克隆能夠在花生根中特異、高水平表達的啟動子，不僅可以構(gòu)建抗病、抗蟲的表 達載體，通過轉(zhuǎn)基因獲得抗病蟲的轉(zhuǎn)基因植株。而且，花生的抗旱、耐鹽等性狀也和根的生 長發(fā)育相關(guān)，將通過根特異啟動子將抗旱耐鹽的基因在花生根中特異表達，對花生的抗旱、 耐鹽研宄也具有積極的意義。但是目前，在可檢索的資料中花生根特異啟動子的報道很少， 限制了利用基因工程改良花生根部性狀的研宄進程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種花生特異啟動子AhRSP與應(yīng)用。利用特異 啟動子來安全有效的解決花生生產(chǎn)過程中的根部病蟲害，提高花生抗旱、耐鹽的能力。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 一種花生特異啟動子AhRSP，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 一種重組載體，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的花生特異啟動子AhRSP。
[0009] -種重組細胞，含有上述花生特異啟動子AhRSP或者上述重組載體。
[0010] 上述花生特異啟動子AhRSP、重組載體和/或重組細胞在改良花生或其他經(jīng)濟作 物抗病蟲、抗旱、耐鹽轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述應(yīng)用，步驟如下：
[0012] 構(gòu)建由SEQ ID NO. 1所示根特異啟動子驅(qū)動目的基因的植物表達載體，通過農(nóng)桿 菌介導(dǎo)、花粉管導(dǎo)入或者基因槍的方法轉(zhuǎn)入作物中，培育獲得轉(zhuǎn)基因作物。
[0013] 進一步優(yōu)選的，所述的目的基因為抗病、抗蟲、抗鹽或耐旱的基因。
[0014] 進一步優(yōu)選的，所述的作物為花生、大豆或苜蓿。
[0015] 有益效果
[0016] 1、本發(fā)明所述的根部特異啟動子AhRSP，在花生的根部表達量高，而在種子中不表 達，種子是花生的收獲器官、食用器官和經(jīng)濟器官，種子上不表達，能夠提高花生轉(zhuǎn)基因的 安全性；其克服了傳統(tǒng)的基因工程所用的啟動子為組合型35S啟動子或Ubi啟動子，它在植 物所有的組織器官、發(fā)育的不同階段都有表達、容易發(fā)生基因沉默的缺陷，能夠滿足轉(zhuǎn)基因 安全性的要求；
[0017] 2、本發(fā)明所述的根部特異啟動子AhRSP，確定了花生根部特異啟動子的表達特性， 由AhRSP驅(qū)動外源基因只在花生根中表達，不會引起其他不良性狀的產(chǎn)生，為花生抗根莖 部病害和耐鹽抗旱新品種的培育奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0018] 圖1花生根特異基因 Unigene68985的啟動子AhRSP在花生不同器官中表達的柱 狀圖；
[0019] 圖2根特異啟動子AhRSP全長序列克隆的電泳圖；
[0020] 其中：M、DNA分子標準，A、啟動子，B、C、D代表非特異擴增；
[0021] 圖3生物信息學(xué)統(tǒng)計根特異元件在AhRSP啟動子的分布圖；
[0022] 圖4根特異表達基因植物表達載體構(gòu)建示意圖；
[0023] 圖5轉(zhuǎn)基因花生PCR檢測結(jié)果的電泳圖；
[0024] 其中：1，6-12為陽性轉(zhuǎn)化苗，13為質(zhì)粒陽性對照，14為陰性對照，M為DNA分子標 準，其它為陰性轉(zhuǎn)基因苗。 具體實施方案
[0025] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于 此。
[0026] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。
[0027] 魯花14和GX029來源于山東省農(nóng)作物種質(zhì)資源中心，普通市售產(chǎn)品；
[0028] 中花9號來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研宄所，普通市售產(chǎn)品。
[0029] 實施例1 :花生AhRSP啟動子的表達分析
[0030] 以花生品種魯花14,中花9和GX029的根、莖、葉、花、種皮為材料，提取RNA，經(jīng)反 轉(zhuǎn)錄，制得cDNA。用花生Actin引物檢測cDNA質(zhì)量。根據(jù)基因 Unigene68985的序列設(shè)計 定量PCR檢測引物：
[0031] Unigene68985RTF :5' -CAAGGATGACACAATACCAGAACATAG-3' 和
[0032] Unigene68985RTR :5' -GGAAACAGGAATCTCCCCAATC-3' 〇
[0033] 以這三個品種的各組織的cDNA為模版，使用實時熒光定量進行定量分析。定量C 使用FastStart SYBR Green試劑盒（購自Roche公司）進行擴增，配制20 μ L的反應(yīng)體 系，含有IOng的引物和2 μ L的cDNA，在進行實驗前先用半定量的方法對各個組織cDNA濃 度進行估算和平衡。
[0034] 反應(yīng)程序為：95°C預(yù)變性IOmin ;兩步法擴增95°C 15s，60°C lmin，40個循環(huán)；測定 溶解曲線95°C 15s，60°C 15s，95°C 15s。每個反應(yīng)均設(shè)3次重復(fù)。
[0035] 根據(jù)溶解曲線檢測PCR產(chǎn)物的特異性?；虮磉_水平測定使用相對表達，通過2_ AACT方法。定量PCR結(jié)果表明，在不同花生品種中Unigene68985基因均在根中高水平積 累，而在其他組織中幾乎檢測不到，證明是Unigene6898根特異表達基因（圖1)，其啟動子 AhRSP是花生根特異的啟動子。
[0036] 花生不同組織RNA提取的方法如下：
[0037] (1)稱取0. 2g新鮮組織，在液氮中充分研磨至粉末狀，研磨中不斷緩慢加入液氮， 防止材料解凍；
[0038] (2)將研好的組織迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)熱（65°C )的裝有600 μ I CTAB提取液（2% CTAB， 2%PVP，0,1M Tris-Cl，2. OM NaCl，25mM EDTA)的 EP 管中，立即劇烈渦旋振蕩 30s，使其混 勻；
[0039] (3) 65°C水浴2-5min，期間劇烈渦旋振蕩3-5次；
[0040] ⑷稍微冷卻后加入等體積的氯仿/異戊醇（氯仿：異戊醇=24 :1 (V/V)，下同）， 禍旋振蕩 Imin,混勾，4°C，12, OOOrpm 離心 15min ;
[0041] (5)將上清轉(zhuǎn)移到另一新的EP管中，加入2微升的DNase I，37°C水浴15min ;
[0042] (6)再加入等體積的氯仿/異戊醇禍旋振蕩lmin,混勾，4 °C，12000rpm離心 15min ；
[0043] (7)將上清轉(zhuǎn)移到另一新的EP管中，加入1/3體積的8M LiCl，使其終濃度為2M， 4 °C過夜沉淀；
[0044] (8)4°0，12000印111離心2〇1^11，棄上清，分別用70%乙醇，無水乙醇洗沉淀，晾干， 加 30-50 μ I DEPC-H2O 溶解沉淀；
[0045] (9)在微量離心管中加入全部 RNA，DNaseI Buffer 5ul，DnaseI (5U/ μ 1) 5 μ 1， Rnase Inhibitor (40 μ / μ 1)0. 5 μ 1，最后加入 DEPC H2O 使總體積達到 50 μ 1，37°C反應(yīng) I 個小時；
[0046] (10)加入 50 μ I DEPC H2O，混勻；
[0047] (11)加入等量（100 μ 1)的苯酚/氯仿/已戊醇（體積比25:24:1)，充分混勻；
[0048] (12)離心，取上層水相到新離心管中；
[0049] (13)加入等量（100 μ 1)的氯仿/已戊醇（體積比