一種藍(lán)腹庫蠓的特異基因及其分子鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及物種鑒定領(lǐng)域，具體涉及藍(lán)腹庫蠓的特異基因序列及其分子鑒定方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 庫蠓是我國三大吸血蠓之一，可傳播藍(lán)舌病、住球蟲病等多種人獸共患病，是一種 重要的病媒生物。因此，對吸血蠓的鑒定和識別，是監(jiān)測與控制蠓傳疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，也是 疾病預(yù)防控制領(lǐng)域的核心步驟。目前，對吸血蠓的鑒定主要依靠經(jīng)驗(yàn)豐富的分類學(xué)專家識 別形態(tài)學(xué)特征來實(shí)現(xiàn)，一旦遇到近緣種和形態(tài)特征掌握不全的標(biāo)本鑒定就很棘手;而且，對 吸血蠓的形態(tài)鑒定需要通過制作玻片標(biāo)本來完成，操作步驟繁瑣、周期長、難度大，因此，亟 需尋求一種新的方法，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類方法的缺陷。
[0003] DNA條形碼(DNA barcode)是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的，標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異 的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA片段。DNA條形碼技術(shù)是利用生物體DNA中一段保守片段對物種 進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的新興技術(shù)。近幾年來，DNA條形碼技術(shù)已被證明是一個(gè)行之有效的生物 鑒定手段，不僅可對傳統(tǒng)鑒定方法作強(qiáng)有力的補(bǔ)充，而且因?yàn)槠涓陀^、準(zhǔn)確，突破以往對 經(jīng)驗(yàn)的過度依賴，有利于幫助鑒定物種、發(fā)現(xiàn)新種和隱種、重建物種和高級階元的演化關(guān)系 等。
[0004] 作為DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)目的基因，一方面必須足夠保守，便于利用通用引物進(jìn)行 大范圍的擴(kuò)增;另一方面要有足夠的變異來區(qū)分不同物種。因此，鑒定不同的物種類群需要 選擇有效的目的基因。目前，在系統(tǒng)發(fā)育研究中廣泛應(yīng)用的標(biāo)志基因是核糖體12S和16S基 因，但因其存在大量的插入和缺失現(xiàn)象，不宜用做條形編碼基因。線粒體基因組中存在的13 個(gè)蛋白編碼基因中僅細(xì)胞色素氧化酶亞基I(Cytochrome Oxidase Subunit I，C0I)、線粒 體細(xì)胞色素 b(Cytb)、ND4、ND5這4個(gè)基因滿足基因插入和缺失現(xiàn)象較少、長度在900 bp左 右這兩個(gè)條件，但ND4和ND5進(jìn)化太快，難以設(shè)計(jì)出通用引物，限制了它們作為全面DNA鑒 定系統(tǒng)的目標(biāo)基因。故人們最終選定C0I基因中的一個(gè)片段作為DNA條形編碼基因。迄今為 止，已有諸多研究證明C0I基因在鳥類、魚類、鱗翅目昆蟲、蚊類、蟻類和彈尾目等類群的分 類鑒定中行之有效。因此，可采用基于C0I基因的DNA條形碼技術(shù)對吸血蠓進(jìn)行分子鑒定。 該方法與傳統(tǒng)的分類方法互為佐證，不僅可解決鑒定中標(biāo)本殘缺不全等問題，而且可實(shí)現(xiàn) 吸血蠓的快速鑒定。目前，通過該方法已獲得多種吸血蠓的C0I基因序列并上傳 Genbank中， 但至今尚無藍(lán)腹庫蠓的相關(guān)基因序列。本發(fā)明提供的藍(lán)腹庫蠓特異基因序列有利于實(shí)現(xiàn)藍(lán) 腹庫蠓的快速鑒定，縮短鑒定時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種藍(lán)腹庫蠓的特異基因序列及其分子鑒定方法。通過分 子生物學(xué)方法獲取藍(lán)腹庫蠓(Culicoides cyancus)特異基因一C0I基因序列，通過基因序 列相似性的比對，可準(zhǔn)確、快速地鑒定藍(lán)腹庫蠓。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 采用小型昆蟲微量DNA模板制備方法，通過改進(jìn)的PCR反應(yīng)條件，由合成的引物擴(kuò)增 藍(lán)腹庫蠓的C0I基因，PCR產(chǎn)物序列送由專業(yè)生物公司測定。測序結(jié)果通過手工校對、序列拼 接，并在NCBI中進(jìn)行Blast相似性搜索，確保所得序列為目標(biāo)序列。本發(fā)明所述的藍(lán)腹庫 蠓特異基因?yàn)镃0I基因，所述庫蠓的CO I基因序列如SEQ ID No.l所示(不含引物）： Π? V t、' 卜 \ V、*· S'iVrt 八《、'v U、、f、、、K vV、' K V ：# 霄做隊(duì).議為.'觀郷為微漢.:C；臟?麟??飲 < w t v Vi > "、 、?、'> w、 \s '、、'、v、、、、·. \ ' \、 < r ? ^ ' u ' ? . '…t· i、'入~ 0〇負(fù)氣CCX玆樹潑x鉍雜纖 纖麵織械 :纖： FTOOTOl' €?；€α.Μ1Χ?11'；1Μ ：
[0007 ]所述的藍(lán)腹庫蠓C0I基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列為： 正向引物 5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3' 反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。
[0008] 本發(fā)明所述的藍(lán)腹庫蠓的分子鑒定方法，包括： 1)從待測的昆蟲組織中分離提取DNA; 2 )以該DNA為模板，采用的引物為:正向引物5 ' AATCATAAAGATATTGGAAC 3 '，反向引物 5，CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3,，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出該昆蟲的C0I基因； 3) 然后取適量步驟2)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出的C0I基因用瓊脂糖電泳分離，經(jīng)溴乙 錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。若能相應(yīng)地特異性擴(kuò)增出大小 約為643 bp的條帶，送生物公司測序； 4) 根據(jù)測序結(jié)果，若目標(biāo)基因序列與SEQ ID No.l的相似性均在98%以上，即可判斷所 述的待測組織即為藍(lán)腹庫蠓。
[0009] 藍(lán)腹庫蠓的種類鑒定依靠形態(tài)學(xué)鑒定所實(shí)現(xiàn)，并經(jīng)權(quán)威專家復(fù)核，從而保證了結(jié) 果的可靠性。
[0010] 所述引物根據(jù)文獻(xiàn)合成，正向引物5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3'，反向引物5' CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3,。
[0011] 本發(fā)明可用瓊脂糖凝膠電泳檢測方法檢測擴(kuò)增結(jié)果。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為： 1)本發(fā)明采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定與分子分類方法相結(jié)合，對所述庫蠓進(jìn)行鑒定，可確 保物種鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。
[0013] 2)與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，本發(fā)明建立的藍(lán)腹庫蠓分子鑒定方法可有效縮 短藍(lán)腹庫蠓的鑒定時(shí)間。
【附圖說明】
[0014]圖1為藍(lán)腹庫蠓C0I基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳鑒定圖。編號說明如下：泳道1為陰性對 照，泳道2為藍(lán)腹庫蠓雌蟲的⑶I基因，檢出大小約為643 bp的條帶。Μ為DL 2000的DNA marker〇
[0015]圖2為未知庫蠓雌蟲C0I基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳鑒定圖。編號說明如下：泳道1為陰 性對照，泳道2為未知庫蠓雌蟲的⑶I基因，檢出大小約為643 bp的條帶。Μ為DL 2000的DNA marker〇
【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1藍(lán)腹庫蠓(Culicoides cyancus)C0I基因序列的獲取 1、藍(lán)腹庫蠓標(biāo)本的獲取 藍(lán)腹庫蠓為野外采集獲得的標(biāo)本，經(jīng)冷凍處死后直接保存于95%酒精中。標(biāo)本制成玻片 后經(jīng)權(quán)威專家鑒定，確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。標(biāo)本制作前，挑取藍(lán)腹庫蠓胸部末端和腹部前 幾節(jié)置于95%酒精中，供DNA提取。
[0017] 2、DNA模板制備 采用小型昆蟲微量DNA模板制備方法提取藍(lán)腹庫蠓DNA(文禮章主編.昆蟲學(xué)研究方法 與技術(shù)導(dǎo)論[M].北京:科學(xué)出版社，2010. pp278-286)，提取的DNA樣品保存于-20°C備用。
[0018] 3、引物合成 本實(shí)施例所用引物如下： 正向引物 5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3' 反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。
[0019] 4、PCR 擴(kuò)增 本實(shí)施例的PCR反應(yīng)體系如表1所示。
[0020] 表1藍(lán)腹庫蠓C0I基因 PCR反應(yīng)體系（50uL體系）
本實(shí)施例的反應(yīng)程序如表2所示。
[0021 ] 表2藍(lán)腹庫蠓C0I基因 PCR反應(yīng)程序

PCR產(chǎn)物于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0022] 5、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 取5yL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130V電壓，電泳35 min)。溴乙錠染色，凝膠 成像系統(tǒng)檢測，電泳圖譜參見附圖1。
[0023] 6、基因序列測定 選取3-5個(gè)效果較好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送由生物公司純化后測序(測序所用引物與PCR所 用引物相同），所得基因序列經(jīng)校正拼接后即為藍(lán)腹庫蠓的C0|:基因序列一SEQ ID No.1。
[0024] 實(shí)施例2未知庫蠓的鑒定 1、標(biāo)本的采集與保存 采用揮網(wǎng)法或燈誘法進(jìn)行采集，采獲的標(biāo)本經(jīng)冷凍處死后直接保存于95%酒精中。
[0025] 2、DNA模板制備 在解剖鏡或體視顯微鏡下，從采集到的蠓類標(biāo)本中隨機(jī)挑出一只雌性庫蠓，采用小型 昆蟲微量DNA模板制備方法提取庫蠓DNA(文禮章主編.昆蟲學(xué)研究方法與技術(shù)導(dǎo)論[M].北 京:科學(xué)出版社，2010. pp278-286)，提取的DNA樣品于-20°C保存?zhèn)溆茫糠輼?biāo)本一個(gè)編號。
[0026] 3、目的基因序列的獲取 3.1引物合成 以獲得的未知庫蠓DNA為模板，合成引物，所用引物序列如下： 正向引物 5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3' 反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。
[0027] 3.2 PCR擴(kuò)增 本實(shí)施例的PCR反應(yīng)體系如表3所示。
[0028] 表3未知庫蠓C0I基因 PCR反應(yīng)體系（50uL體系） 本實(shí)施例的反應(yīng)程序如表4所示。
[0029] 表4未知庫蠓C0I基因 PCR反應(yīng)程序

PCR產(chǎn)物于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 3.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測與基因序列測定 取5yL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130V電壓，電泳35 min)。溴化乙錠染色。凝 膠成像系統(tǒng)檢測，電泳圖譜參見附圖2。由附圖2看出實(shí)施例2的未知庫蠓也能特異性擴(kuò)增出 大小約為643 bp的產(chǎn)物，將大小約為643 bp的產(chǎn)物送生物公司測序，結(jié)果顯示與基因序 列SEQ ID NO. 1的相似性為99.9%，因而可判定該未知庫蠓為藍(lán)腹庫蠓。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種藍(lán)腹庫蠓特異基因，其特征在于，所述基因?yàn)镃OI基因，為如下所述的基因序列 SEQ ID No.l:2. 權(quán)利要求1所述的庫蠓的COI基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列分別為： 正向引物 5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3' 反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。3. -種藍(lán)腹庫蠓的分子鑒定方法，包括： 1) 從待測的昆蟲組織中分離提取DNA; 2) 以該DNA為模板，對COI基因采用的引物為:正向引物5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3'， 反向引物5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出藍(lán)腹庫蠓⑶I基 因； 3) 然后取適量步驟2)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出的COI基因用瓊脂糖電泳分離，經(jīng)溴乙 錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出大小約為 643 bp的條帶，送生物公司測序； 4) 根據(jù)測序結(jié)果，如果相應(yīng)COI基因序列與SEQ ID No.l的相似性在98%以上，即可判斷 所述的待測組織為藍(lán)腹庫蠓。
【專利摘要】本發(fā)明公開<b>一種藍(lán)腹庫蠓的特異基因及其分子鑒定方法，</b>其特征在于采用分子生物學(xué)方法獲取該庫蠓的COⅠ基因序列，通過基因序列相似性的比對，對該庫蠓進(jìn)行種類鑒定。本發(fā)明提供的藍(lán)腹庫蠓分子鑒定方法，有利于實(shí)現(xiàn)藍(lán)腹庫蠓準(zhǔn)確、快速的鑒定。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105483261
【申請?zhí)枴緾N201610010065
【發(fā)明人】張曉龍, 方志強(qiáng), 黃恩炯, 高博, 滑娜, 梁慧杰
【申請人】中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年1月8日