本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種具有透過細(xì)胞膜或體組織屏障功能的肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，年齡相關(guān)性黃斑病變(age-relatedmaculardegeneration，amd)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabeticretinopathy，dr)等新生血管性眼病已成為主要的致盲性眼病，且其患病率呈上升趨勢。此外，許多眼后節(jié)疾患如高度近視脈絡(luò)膜新生血管、葡萄膜炎、視網(wǎng)膜靜脈阻塞以及眼前節(jié)手術(shù)后誘發(fā)的黃斑囊樣水腫等，也往往嚴(yán)重?fù)p害視功能，給患者、患者家庭和社會(huì)都帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管激光和手術(shù)治療可改善或部分保存患者視功能、延緩病情發(fā)展，但總體上新生血管性眼病對(duì)視功能的損害難以逆轉(zhuǎn)，嚴(yán)重危害患者的視覺質(zhì)量和生活質(zhì)量。

與激光、手術(shù)等治療方法相比，藥物干預(yù)是預(yù)防和治療新生血管性眼病的最佳途徑，但目前廣泛應(yīng)用的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)重組單克隆抗體或融合蛋白類等藥物(ranibizumab、conbercept等)，由于其分子量大(分別為48kda、143kda)，難以穿透血眼屏障，必須經(jīng)眼球穿刺至玻璃體腔注射給藥，出血、感染、非感染性炎癥、血管栓塞、白內(nèi)障、眼壓升高、組織損傷等并發(fā)癥無法避免。

近年來，蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子藥物不斷涌現(xiàn)，已成為藥物研究領(lǐng)域最具劃時(shí)代意義、最具前景的治療藥物之一。然而，親水性強(qiáng)和分子量大使得生物大分子藥物擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜變得十分困難。由此產(chǎn)生了小分子細(xì)胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，cpp)、腺病毒載體等功能性分子，應(yīng)用于增強(qiáng)蛋白質(zhì)、核酸等藥物細(xì)胞內(nèi)遞送能力。腺病毒載體在眼部特別是遺傳性視網(wǎng)膜退行性病變的給藥中受到了廣泛的關(guān)注。但已有研究指出，應(yīng)用重組病毒運(yùn)送脫氧核糖核酸(deoxynucleotideacid，dna)表達(dá)盒至眼內(nèi)，同時(shí)在眼內(nèi)過表達(dá)治療性的基因產(chǎn)物，很可能是弊大于利的，且其存在很大的局限性，如轉(zhuǎn)入效率低，細(xì)胞毒性大等。

本發(fā)明人所在團(tuán)隊(duì)的前期工作中，已經(jīng)獲得了眾多抗新生血管活性的多肽(如kv11等)，此外，還有一些抗炎多肽，以及一些神經(jīng)保護(hù)和抗粘連形成多肽等，若能找到適用于攜帶這些功能肽的引導(dǎo)肽，從而通過無創(chuàng)的方法使得這些小分子功能肽進(jìn)入眼內(nèi)，達(dá)到持續(xù)、穩(wěn)定、有效治療濕性amd、糖尿病黃斑水腫(diabeticmacularedema，dme)、葡萄膜炎、視網(wǎng)膜靜脈阻塞引起的黃斑水腫等疾病的作用，則具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

綜上，亟需找到一種給藥方便、可持續(xù)給藥的藥物遞送方法，從而能夠攜帶治療藥物有效穿透眼屏障，達(dá)到治療的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有透過細(xì)胞膜或體組織屏障功能的肽及其應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種穿膜肽，所述的穿膜肽選自：

(a)具有seqidno:1所示氨基酸序列的多肽；

(b)將(a)所限定的多肽的氨基酸序列經(jīng)過1-3個(gè)(較佳地1-2個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；

(c)與seqidno:1所示的氨基酸序列有至少75％相同性，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；或

(d)包含取自seqidno:1所示氨基酸序列中至少8個(gè)連續(xù)氨基酸序列的多肽片段。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的穿膜肽或編碼該穿膜肽的多核苷酸用途，用于促進(jìn)功能性分子透過細(xì)胞膜或體組織屏障，或用于與功能性分子連接來制備能夠透過細(xì)胞膜或體組織屏障的復(fù)合體，或用于制備能夠透過細(xì)胞膜或體組織屏障的藥物組合物。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的功能性分子包括(但不限于)：功能性生物大分子、功能性多肽、功能性抗體、功能性小分子、功能性核酸片段、熒光示蹤物、顯影劑、脂質(zhì)體、納米制劑、多聚體或病毒載體。

在另一優(yōu)選例中，所述的體組織屏障是眼屏障，較佳地所述的眼屏障包括：眼組織屏障(形成眼球壁的各層組織及其各層組織間的細(xì)胞連接等)，淚液屏障，血眼屏障(血房水屏障、血視網(wǎng)膜屏障)。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種能夠透過細(xì)胞膜或體組織屏障的復(fù)合體，所述的復(fù)合體包括：(1)所述的穿膜肽；和(2)與(1)的穿膜肽操作性連接的功能性分子。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的功能性分子包括(但不限于)：功能性生物大分子、功能性多肽、功能性抗體、功能性小分子、功能性核酸片段、熒光示蹤物、顯影劑、脂質(zhì)體、納米制劑、多聚體或病毒載體。

在另一優(yōu)選例中，所述的功能性多肽包括(但不限于)：抗新生血管生成的多肽，神經(jīng)保護(hù)性多肽，抗粘連形成的多肽；較佳地，所述的抗新生血管生成的多肽包括(但不限于)：kv11。

在另一優(yōu)選例中，所述的穿膜肽與功能性多肽之間，還包括連接肽；較佳地，所述的連接肽是：甘氨酸(如gly3)或賴氨酸(如lys1)。

在另一優(yōu)選例中，所述的操作性連接包括：共價(jià)連接或非共價(jià)連接(如偶聯(lián)、吸附、結(jié)合等)。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種多核苷酸，所述的多核苷酸編碼所述的穿膜肽；或

所述的多核苷酸編碼所述的能夠穿透細(xì)胞膜的復(fù)合體；且，其中與穿膜肽操作性連接的功能性分子是功能性多肽。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體包括所述的多核苷酸。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種基因工程化的細(xì)胞，所述的細(xì)胞包括所述的表達(dá)載體或其基因組中整合有所述的多核苷酸。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種能夠透過細(xì)胞膜或體組織屏障的藥物組合物，所述的藥物組合物包括：所述的穿膜肽，或所述的能夠穿透細(xì)胞膜或體組織屏障的復(fù)合體，或所述的多核苷酸，或所述的表達(dá)載體，或所述的基因工程化的細(xì)胞；和藥學(xué)上可接受的載體。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的藥物組合物是預(yù)防或治療眼部疾病的藥物組合物，其劑型包括：點(diǎn)眼給藥劑型、球結(jié)膜下注射劑型、眼周注射劑型、視網(wǎng)膜下注射給藥劑型、眼球內(nèi)給藥(例如玻璃體腔內(nèi)注射)劑型。

在另一優(yōu)選例中，所述的眼部疾病包括(但不限于)：新生血管性眼病(如vegf引起的血管增生)、退行性眼病、炎癥性眼病、腫瘤性眼病、視神經(jīng)病變性眼病。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種注射用給藥器(如注射用針)或藥盒，所述的注射用給藥器或藥盒中包括：所述的穿膜肽或所述的編碼該穿膜肽的多核苷酸；或所述的能夠透過細(xì)胞膜或體組織屏障的復(fù)合體；或所述的藥物組合物；或所述的表達(dá)載體，或所述的基因工程化的細(xì)胞。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1.m13keph.d^tm系統(tǒng)dna圖譜及限制性位點(diǎn)。

圖2.cc12噬菌體克隆的dna測序圖譜(dna序列：tagatgtttactccgccttctatgattgagcggctt)。

圖3.多肽cc12及其連接肽、對(duì)照肽的細(xì)胞毒性。**表示p<0.01，***表示p<0.001。

圖4.fitc標(biāo)記的多肽cc12及其連接肽、對(duì)照肽的細(xì)胞內(nèi)化攝取呈時(shí)間依賴性。arpe-19細(xì)胞暴露于250μm濃度的多肽中0.5h，1h，3h，6h后熒光顯微鏡拍攝的代表性圖片。標(biāo)尺：200μm。

圖5.a為流式細(xì)胞分析定量檢測進(jìn)入arpe-19細(xì)胞內(nèi)的fitc多肽的熒光強(qiáng)度。b為對(duì)于a的結(jié)果的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，*表示p<0.05，***表示p<0.001。

圖6.家兔離體角膜(a)和離體視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體(b)多肽的透過曲線和表觀透過系數(shù)papp(n＝3，mean±sd)。***表示p<0.001。

圖7.擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)后離體組織毒性評(píng)價(jià)。家兔離體角膜(a)和離體視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體(b)水化值δh，各多肽組與空白對(duì)照組相比無顯著性差異。he組織染色(c)未發(fā)現(xiàn)明顯的空泡化或炎癥免疫反應(yīng)，藥物透過離體組織無明顯滲漏。標(biāo)尺：1mm。

圖8.fitc-多肽或pbs球后注射0.5h后冰凍切片pi染色顯示眼后段組織的熒光強(qiáng)度。標(biāo)尺：50μm。

圖9a.fitc-多肽或pbs球后注射3h、6h和24h后冰凍切片pi染色顯示眼后段組織的熒光強(qiáng)度。cc12、penetratin和cc12-kv11多肽的眼后段穿透性呈時(shí)間依賴性。標(biāo)尺：50μm。

圖9b.fitc-多肽或pbs結(jié)膜囊點(diǎn)眼0.5h和3h后冰凍切片pi染色顯示角膜的熒光強(qiáng)度。標(biāo)尺：50μm。

圖10.激光共聚焦眼后段熒光分布圖(a)及多肽-fitc或pbs球后注射3h、6h和24h后冰凍切片pi染色顯示眼后段組織的熒光強(qiáng)度(b)。cc12、penetratin和cc12-kv11多肽的眼后段穿透性呈時(shí)間依賴性。*、**、***分別表示與kv11-fitc多肽組相比，p<0.05，p<0.01，p<0.001。標(biāo)尺：50μm。

圖11.¹²⁵i-kv11hplc分析報(bào)告。

圖12.¹²⁵i-cc12-kv11hplc分析報(bào)告。

圖13.¹²⁵i-kv11和¹²⁵i-cc12-kv11結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼0.5h(a)和球后注射1h(b)后眼球內(nèi)放射性比活度/劑量(id/g)。***p<0.001。

圖14.連接肽cc12-kv11對(duì)vegf誘導(dǎo)huvecs增殖的影響。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用mts方法檢測24h后不同濃度多肽對(duì)vegf誘導(dǎo)huvecs增殖的作用(mean±sd，n≥3，#表示與空白對(duì)照組相比，p<0.05；*表示與vegf組相比，p<0.05；***表示與vegf組相比，p<0.001)。

圖15.cc12-kv11多肽抑制vegf誘導(dǎo)huvecs趨化。趨化24h后各組transwell小室下室面細(xì)胞遷移情況(a)，除control(圖中簡寫為contr)空白對(duì)照組無vegf外，其余各組transwell小室下層均含有25ng/mlvegf。標(biāo)尺：50μm。趨化24h后各組vegf誘導(dǎo)的遷移細(xì)胞數(shù)量(b，mean±sd，n＝10，###表示與空白對(duì)照組相比，p<0.001；***表示與vegf組相比，p<0.001)。

圖16.cc12-kv11多肽抑制vegf誘導(dǎo)huvecs管腔形成?？瞻讓?duì)照組、vegf組、不同濃度ranibizumab或多肽組管腔樣結(jié)構(gòu)形成情況(a)，標(biāo)尺：50μm。各組相對(duì)管腔形成長度(b，mean±sd，n＝10，###表示與空白對(duì)照組相比，p<0.001；***表示與vegf組相比，p<0.001)。

圖17.cc12-kv11多肽抑制雞胚尿囊膜新生血管。(a-f)分別代表pbs組、cc1250μg組、kv1150μg和10μg、cc12-kv1150μg和10μg組，濾紙片周圍一個(gè)直徑范圍內(nèi)新生血管生長情況(標(biāo)尺：2.5mm)。(g)各組雞胚尿囊膜毛細(xì)血管生長數(shù)量(mean±sd，n＝10～12；ns表示兩組比較無顯著性差異；*表示與pbs組相比，p<0.05；**表示與pbs組相比，p<0.01；***表示與pbs組相比，p<0.001)。

圖18.cc12-kv11多肽抑制高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管。pbs或多肽結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼和球后注射干預(yù)高氧誘導(dǎo)的c57bl/6j小鼠視網(wǎng)膜新生血管圖(a)。血管內(nèi)皮isolectinb4染色，由四個(gè)象限組合而成的完整視網(wǎng)膜血管染色圖，標(biāo)尺：1mm；高氧球后注射(b)、結(jié)膜囊點(diǎn)眼組(c)無灌注面積百分比，以及高氧球后注射(d)、結(jié)膜囊點(diǎn)眼組(e)新生血管簇面積百分比柱狀圖定量分析。ns表示兩組比較無顯著性差異；*表示與pbs組相比，p<0.05；**表示與pbs組相比，p<0.01；***表示與pbs組相比，p<0.001。

圖19.cc12-kv11多肽結(jié)膜囊內(nèi)給藥或球后注射可抑制高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管。高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜病變模型視網(wǎng)膜組織切片he染色(a)。箭頭顯示突出于內(nèi)界膜的新生血管有核細(xì)胞和管腔樣結(jié)構(gòu)，或視網(wǎng)膜內(nèi)出血；標(biāo)尺：50μm。各組血管內(nèi)皮有核細(xì)胞計(jì)數(shù)情況：結(jié)膜囊點(diǎn)眼組(b)和球后注射組(c)，n＝8，###表示與空氣pbs組相比p<0.001，*表示與高氧pbs組相比p<0.05，**表示與高氧pbs組相比p<0.01，***表示與高氧pbs組相比p<0.001，ns表示無顯著性差異。

圖20.高濃度(200mm)多肽球后注射給藥后7天，cc12、kv11和cc12-kv11多肽組大鼠視網(wǎng)膜顯微和超顯微結(jié)構(gòu)比較。石蠟切片he染色后光鏡檢查顯示視網(wǎng)膜顯微結(jié)構(gòu)正常完整，未見明顯水腫、炎癥或其他免疫反應(yīng)(第一排，標(biāo)尺：50μm)；透射電鏡檢查超顯微結(jié)構(gòu)，視細(xì)胞(第二排，標(biāo)尺：5μm)、雙極細(xì)胞(第三排，標(biāo)尺：1μm)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(第四排，標(biāo)尺：1μm)形態(tài)正常，未見明顯水腫、斷裂或空泡等異常改變。

圖21.各組多肽或pbs球后注射前后erg典型波形記錄圖和b波振幅比較，n＝3。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過研究篩選，提供了一種新型的穿膜肽，其能夠穿透細(xì)胞膜或體組織屏障。本發(fā)明的穿膜肽特別適用于穿透眼部的組織屏障，將藥物帶到眼內(nèi)所需給藥的部位。本發(fā)明還提供了包含該穿膜肽的復(fù)合體、包含該穿膜肽的藥物組合物。

如本文所用，所述的“操作性連接”是指兩個(gè)或多個(gè)分子之間的功能性的空間排列。例如：穿膜肽與功能性分子之間通過共價(jià)鍵相互連接，則它們兩者之間發(fā)生操作性連接。

如本文所用，所述的“功能性分子”是指對(duì)于體內(nèi)病癥具有識(shí)別或診斷、預(yù)防或治療功效的物質(zhì)或者可用于攜帶對(duì)于體內(nèi)病癥具有識(shí)別或診斷、預(yù)防或治療功效的物質(zhì)的載體物質(zhì)(穿膜肽可以有效地提高這些物質(zhì)的穿膜效率)。所述的功能性分子包括但不限于：功能性生物大分子、功能性小分子、熒光示蹤物、顯影劑、脂質(zhì)體、納米制劑、多聚體或病毒載體等。

如本文所用，所述的“保守性變異多肽”是指cc12多肽的片段、衍生物和類似物。一般地，該“保守性變異多肽”是與seqidno:1的氨基酸序列相比，有至多5個(gè)，較佳地至多3個(gè)，更佳地至多2個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。

如本文所用，所述的“穿膜肽”、“細(xì)胞穿膜肽”、“引導(dǎo)肽”可以互換使用，均是指cc12多肽或其保守性變異多肽。

如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性)的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。

穿膜肽

本發(fā)明人利用噬菌體展示技術(shù)，進(jìn)行體內(nèi)定向篩選，并通過測序分析，篩選出一系列多肽序列，根據(jù)富集效果和與視網(wǎng)膜靶分子結(jié)合強(qiáng)度，選擇其中一個(gè)具有12個(gè)氨基酸的眼部引導(dǎo)多肽(peptideforoculardelivery，pod)，命名為cc12。

為了驗(yàn)證其功能，本發(fā)明人固相合成了該cc12多肽，并通過體內(nèi)外定性定量實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞內(nèi)化攝取、流式細(xì)胞分析、擴(kuò)散池透過性實(shí)驗(yàn)、冰凍切片、¹²⁵i同位素示蹤法等)，證明了其具有穿透眼屏障特別是視網(wǎng)膜屏障的能力。

本發(fā)明的cc12多肽可以是重組多肽、合成多肽。其可以是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。本發(fā)明的cc12多肽的序列可以是：emftppsmierl(seqidno:1)。

本發(fā)明還包括cc12多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的cc12多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)(如1-3個(gè)或1-2個(gè))保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。

在本發(fā)明中，cc12多肽可以指具有seqidno:1所示序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與cc12多肽相同功能的、seqidno:1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：若干個(gè)(如1-3個(gè)、1-2個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(例如為300個(gè)以內(nèi)，較佳地200個(gè)以內(nèi)，更佳地100個(gè)以內(nèi)，更佳地50個(gè)以內(nèi)，例如40、30、20、10、5、3、2、1)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括cc12多肽的活性片段和活性衍生物。

本發(fā)明中，也包括為了增加多肽的穩(wěn)定性、半衰期、促進(jìn)功效而對(duì)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸加以修飾后構(gòu)成的修飾形式的多肽(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))，包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了抗水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。

本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明cc12多肽或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna可以是編碼鏈或非編碼鏈。也即，“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或cc12多肽的編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。

術(shù)語“表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。

包含上述的適當(dāng)多核苷酸序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)多肽。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞等。

本發(fā)明還提供了所述的穿膜肽的應(yīng)用，用于促進(jìn)功能性分子透過細(xì)胞膜或體組織屏障，或用于與功能性分子連接來制備能夠透過細(xì)胞膜或體組織屏障的復(fù)合體，或用于制備能夠透過細(xì)胞膜或體組織屏障的藥物組合物。所述的功能性分子包括但不限于：功能性生物大分子、功能性多肽、功能性抗體、功能性小分子、功能性核酸片段、熒光示蹤物、顯影劑、脂質(zhì)體、納米制劑、多聚體或病毒載體。所述的眼組織生理結(jié)構(gòu)包括角膜、結(jié)膜、鞏膜、視網(wǎng)膜、等組成的生理屏障以及由位于眼組織的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等各類細(xì)胞組成內(nèi)界膜、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、外叢狀層、內(nèi)核層、外核層、橢圓體帶、視網(wǎng)膜色素上皮/bruch膜復(fù)合體等在內(nèi)的眼組織結(jié)構(gòu)。眼組織屏障則為組成眼球壁的各層生理結(jié)構(gòu)及其的各層組織間的細(xì)胞連接，用于防止外來物質(zhì)進(jìn)入眼球的組織學(xué)屏障，如位于眼球最外層，由堅(jiān)韌致密的纖維組織構(gòu)成的纖維膜層，包含有角膜層、鞏膜層以及角鞏膜緣等；眼球壁中層為葡萄膜層，自前向后分為虹膜、睫狀體和脈絡(luò)膜；眼球壁后層為視網(wǎng)膜層。所述的血眼屏障包括血-房水屏障與血-視網(wǎng)膜屏障。

所述的穿膜肽可以應(yīng)用到穿過眼屏障的分子運(yùn)輸載體以及細(xì)胞穿膜載體的制備中。

復(fù)合體

本發(fā)明還提供了一種能夠透過細(xì)胞膜或體組織屏障的復(fù)合體，所述的復(fù)合體包括：本發(fā)明所述的穿膜肽，以及與所述的穿膜肽操作性連接的功能性分子。所述的功能性分子包括但不限于：功能性生物大分子、功能性小分子、熒光示蹤物、顯影劑、脂質(zhì)體、納米制劑、多聚體或病毒載體；較佳地，所述的功能性生物大分子包括但不限于：功能性多肽、功能性核酸；較佳地所述的功能性多肽包括但不限于：功能性抗體。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述的功能性分子可以是具有示蹤功能的標(biāo)志物，包括但不限于熒光染料、mri造影劑、放射性顯影劑、磁性粒子或具有著色功能的化學(xué)試劑。例如，所述的具有示蹤功能的標(biāo)志物或功能性小分子可以為fitc。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述的功能性分子可以是功能性小分子，包括無機(jī)小分子和有機(jī)小分子，其分子量小于1000道爾頓。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述的功能性分子可以是功能性大分子，例如，可以是功能性多肽(如抗體)、功能性核酸。所述的功能性分子可以為分子量大于1000道爾頓的功能性分子，包括但不限于抗凋亡因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、熒光蛋白或功能性抗體等。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述功能性分子可以是功能性多肽；較佳地，所述功能性多肽包括但不限于具有以下序列(或這些序列基礎(chǔ)上的保守性變異多肽)：ytmnprklfdy(kv11)。

作為本發(fā)明的另一種方式，所述的功能性分子為功能性核酸片段，包括但不限于質(zhì)粒、sirna、dna、寡核苷酸、mirna、反義核酸等。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述功能性分子為具有分子包裝載物功能的制劑，包括但不限于脂質(zhì)體、多聚體、樹突狀分子、納米包裝制劑等。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述的功能性分子為可攜帶遺傳物質(zhì)的病毒載體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體或腺病毒載體等。

本發(fā)明所述的穿膜肽與功能性分子的連接方式可以為共價(jià)連接或非共價(jià)連接。應(yīng)理解，只要能夠保留穿膜肽及功能性分子的功能、保留良好的穿透細(xì)胞膜及體組織屏障的效果，任何連接方式均可包含在本發(fā)明中。共價(jià)連接通常以形成共價(jià)鍵的方式將兩個(gè)分子進(jìn)行連接。而一些非共價(jià)連接(不形成共價(jià)鍵)例如偶聯(lián)、吸附、結(jié)合等也可應(yīng)用。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的穿膜肽與功能性分子之間通過化學(xué)鍵相連；更佳的，所述的化學(xué)鍵是肽鍵。

所述的穿膜肽與功能性分子之間可以直接相連接，或者通過多肽連接子(連接肽)連接。所述的連接子例如包括1-30個(gè)氨基酸；較佳地為1-20個(gè)氨基酸；例如15、10、8、6、5、4、3、2、1個(gè)氨基酸。連接肽的設(shè)置基本上不影響穿膜肽與功能性分子發(fā)揮穿透細(xì)胞膜及體組織屏障效果，也不影響功能性分子的功能。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，在穿膜肽與功能性分子之間之間包括一連接肽，所述的連接肽上包含至少一個(gè)特異性酶切位點(diǎn)。所述的酶切位點(diǎn)選自(但不限于)：腸激酶酶切位點(diǎn)，凝血酶酶切位點(diǎn)，或胰蛋白酶酶切位點(diǎn)。酶切位點(diǎn)的設(shè)置便于后續(xù)將穿膜肽與功能性分子進(jìn)行分離。

穿膜肽與功能性分子之間的連接，若以肽鍵進(jìn)行連接，則根據(jù)需要，功能性分子可以位于穿膜肽的氨基端，也可以位于穿膜肽的羧基端。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述的穿膜肽可以通過氨基、羧基或巰基等化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)與功能性分子的連接，包括但不限于所述多肽與多聚物之間的連接，所述多肽在脂質(zhì)體或納米粒子表面的共價(jià)修飾、酯化反應(yīng)、硫化反應(yīng)等。

所述的非共價(jià)連接為靜電吸附連接或受體配體反應(yīng)。所述的靜電吸附連接包括但不限于所述細(xì)胞穿膜載體與核酸分子的間的靜電連接。所述的受體-配體反應(yīng)指的是分別在細(xì)胞穿膜肽和功能性分子上連接在可以特異性匹配的受體與配體，通過受體與配體的高度專一性，實(shí)現(xiàn)所述多肽與功能性分子的連接。如生物素與親和素之間的專一性匹配。

基于本發(fā)明的穿膜肽可以促進(jìn)功能性分子透過細(xì)胞膜或體組織屏障。因此，任何功能性分子均可被應(yīng)用于與所述的穿膜肽連接，來構(gòu)成復(fù)合體。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的功能性分子是對(duì)于眼部疾病具有預(yù)防或治療作用的分子。

所述眼部疾病包括但不限于：新生血管生成性眼病、退行性眼病、炎癥性眼病、腫瘤性眼病或視神經(jīng)病變性眼病等。

所述新生血管生成性眼病包括但不限于：老年性黃斑變性、視網(wǎng)膜分支靜脈栓塞、視網(wǎng)膜中央靜脈栓塞、糖尿病性的黃斑水腫、黃斑囊樣水腫、葡萄膜炎性黃斑水腫、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變。

所述退行性眼病包括但不限于：視神經(jīng)萎縮、青光眼、白內(nèi)障、干眼癥、飛蚊癥、老花眼、視網(wǎng)膜色素病變、老年性黃斑變性等。

所述炎癥性眼病包括但不限于：角膜炎、眼色素層炎、結(jié)膜炎、鞏膜炎、鞏膜表層炎、眼瞼炎、巨細(xì)胞視網(wǎng)膜炎、后段葡萄膜炎、化膿性眼內(nèi)炎等。

所述腫瘤性眼病包括但不限于：眼瞼、結(jié)膜、眼球各層組織以及眼附件的腫瘤、視神經(jīng)鞘腦膜瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、黑色素瘤等。

所述視神經(jīng)病變性眼病包括但不限于：缺血性視神經(jīng)病變、leber遺傳性視神經(jīng)病變、缺血再灌注性損傷、非動(dòng)脈缺血性視神經(jīng)病變、慢性視神經(jīng)萎縮等。

藥物組合物及藥盒

本發(fā)明還提供一種能夠透過細(xì)胞膜或體組織屏障的藥物組合物，所述的藥物組合物包括：所述的穿膜肽，或所述的能夠穿透細(xì)胞膜或體組織屏障的復(fù)合體，或所述的多核苷酸，或所述的表達(dá)載體，或所述的基因工程化的細(xì)胞；和藥學(xué)上可接受的載體。

合適的藥學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在remington’spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的載體的充分說明。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、磷酸鹽緩沖液、ringer溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液、甘油或山梨醇等。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)和穩(wěn)定劑，如白蛋白等。

在使用時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明所述的穿膜肽，或所述的能夠穿透細(xì)胞膜或體組織屏障的復(fù)合體，或所述的多核苷酸，或所述的表達(dá)載體，或所述的基因工程化的細(xì)胞施用于哺乳動(dòng)物(如人)，其中該安全有效量通常至少約0.01微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。

所述藥物組合物可以通過點(diǎn)眼給藥、球結(jié)膜下注射、眼周注射、視網(wǎng)膜下注射、眼內(nèi)注射的方法實(shí)現(xiàn)給藥。

所述的點(diǎn)眼給藥指的是滴眼劑、眼用凝膠或眼膏等通過無創(chuàng)式的方式在眼表給藥。

所述的眼周注射是為了避開了角膜上皮對(duì)藥物吸收的屏障作用。包括球結(jié)膜下注射、球旁注射和球后注射等。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，給藥方式為球結(jié)膜下注射，藥物吸收主要是通過擴(kuò)散到角膜基質(zhì)層和角鞏膜緣組織入眼，適用于眼前段病變；

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，給藥方式為球旁注射，藥物主要經(jīng)鞏膜滲入，適用于虹膜睫狀體部位的病變；

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，給藥方式為球后注射，在晶狀體虹膜隔以后部位達(dá)到治療濃度，適用于眼后段以及視神經(jīng)疾病。

所述的視網(wǎng)膜下注射，指的是在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層與光感受器層間的藥物注射。

所述的眼內(nèi)注射，包括前房注射、玻璃體腔內(nèi)注射等。

本發(fā)明還提供了一種注射用給藥器(如注射用針)、藥盒或試劑盒，其中包括：所述的穿膜肽或編碼該穿膜肽的多核苷酸；或所述的能夠透過細(xì)胞膜或體組織屏障的復(fù)合體；或所述的藥物組合物。

為了便于臨床應(yīng)用，本發(fā)明的藥物組合物可以包含在注射用給藥器(如注射用針)中，所述的注射用給藥器中，可以包含一次給藥量的所述的藥物組合物。所述的注射用給藥器可以被包含在藥盒中，以方便儲(chǔ)存、使用。

本發(fā)明所述的藥盒或試劑盒中，還可包括使用說明書，以利于本領(lǐng)域技術(shù)人員按照正確的方式使用。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1、體內(nèi)定向進(jìn)化篩選眼部引導(dǎo)肽

本發(fā)明人應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)體內(nèi)定向進(jìn)化的方法，有目的地從重組噬菌體的各種變異體(肽庫，peptidelibrary)中富集特定的重組噬菌體，并通過測序分析，結(jié)合富集效果和與視網(wǎng)膜靶組織親和力的高低，篩選出具有潛在穿透眼屏障能力的優(yōu)勢重組噬菌體肽。

本實(shí)施例中應(yīng)用ph.d.^tm系統(tǒng)(m13ke)，其基于m13單鏈?zhǔn)删w載體(m13mp19)，在其基因giii的5’端引入重組位點(diǎn)，從而將12個(gè)氨基酸殘基組成的多肽的n端融合重組至噬菌體小衣殼蛋白piii。每個(gè)重組噬菌體展示5個(gè)單一克隆的多肽，展示不同12肽的重組噬菌體混合形成肽庫(ph.d.-12library)。

在本實(shí)施例中，本發(fā)明人采用體內(nèi)定向進(jìn)化的方法，通過噬菌體肽庫結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼或球后注射的方式，回收并檢測眼球內(nèi)房水、虹膜、玻璃體、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜中重組噬菌體的含量，并從中挑選單克隆進(jìn)行測序分析。通過高通量的生物淘選(biopanning)，篩選出較易穿透眼屏障的重組噬菌體肽，為進(jìn)一步合成pod，并利用該pod增強(qiáng)功能肽在眼部的藥物遞送奠定基礎(chǔ)。

一、實(shí)驗(yàn)材料

1、噬菌體展示肽庫和e.colier2738宿主菌

12肽噬菌體展示肽庫(dodecapeptidephagedisplaypeptidelibrary，ph.d.-12library)和e.colier2738宿主菌(newengbiolabs公司)，12肽插入重組位點(diǎn)位于m13keph.d^tm系統(tǒng)(圖1)的acc65i/kpni和eagi之間。ph.d.-12肽庫100μl，1×10⁹克隆多樣性(complexities)，-20℃，50％tbs甘油中保存；er2738于50％甘油中培養(yǎng)，-70℃保存。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

spraguedawley大鼠(180-200克)，獲自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

3、主要試劑

96giii測序引物(上海raygene公司)：5′-^hoccctcatagttagcgtaacg-3′。

lb培養(yǎng)基(上海raygene公司)：蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl5g加ddh2o至1l；充分混勻，高壓蒸汽滅菌，室溫保存；其中800mllb培養(yǎng)基中加入2％(16g)瓊脂(agar)，剩余的100ml液態(tài)lb培養(yǎng)基用于搖菌，另100ml用于制備topagar。

topagar(biowest)：100mllb+0.6％(0.6g)瓊脂糖(argrose)，高壓蒸汽滅菌，2.5～3ml/管分裝，室溫固態(tài)保存，用時(shí)微波熔化。

iptg/xgal(上海raygene公司)：0.05giptg+0.04gxgal+1mldmf，4℃避光保存。

lb/iptg/xgalplates：800ml含16g瓊脂的lb培養(yǎng)基，冷卻至低于70℃，加入1mliptg/xgal，快速倒板，每板20ml，4℃避光保存。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.ph.d.-12肽庫給藥及眼組織回收

(1)實(shí)驗(yàn)分組：spraguedawley大鼠分為空白對(duì)照組、ph.d.-12肽庫點(diǎn)眼組、ph.d.-12肽庫球后注射組；

(2)給藥：將ph.d.-12肽庫溶液稀釋100倍至濃度約1×10¹¹pfu/ml。結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼組：用槍頭吸取10μl肽庫溶液或等體積pbs，每10min點(diǎn)眼一次，共給藥6次；球后注射組：采用1ml注射器抽取120μl肽庫溶液或等體積pbs，在眶下緣中外1/3處，沿眶下壁垂直進(jìn)針約0.2cm，越過眼球赤道部后即斜向鼻上方，入針約0.4cm深，確定未刺入眼球內(nèi)后，回抽胰島素針無回血即可緩慢推入肽庫溶液或pbs；注射后輕輕拔出針頭并墊以棉球輕壓眼球片刻，觀察有無球后出血現(xiàn)象(如眼瞼腫脹、眼球突出、運(yùn)動(dòng)受限等)；

(3)眼組織回收：最后一次點(diǎn)眼及球后注射1h后，用1mpbs3～5ml沖洗結(jié)膜囊和角膜表面，每次1min，共沖洗三遍。用50μl微量注射器于角鞏緣處刺入前房，針頭平行于晶體進(jìn)入，注意進(jìn)針勿太過傾斜，以防刺穿角膜或戳入晶體。緩慢抽取25～35μl房水，置于標(biāo)記好的ep管中。之后處死sd大鼠，并取出大鼠眼球，并再次用1mpbs沖洗眼球，每次1min，共沖洗三遍，立即轉(zhuǎn)入作好標(biāo)記的培養(yǎng)皿中。在體式顯微鏡低光下，顯微鑷夾持眼球周圍筋膜組織或視神經(jīng)以固定眼球位置，用1ml注射器針頭，自角鞏緣處向球心方向刺入眼球；拔出注射器針頭，用顯微剪刀沿注射器針孔處平行于角鞏膜緣方向環(huán)形剪開眼球，分離角膜、虹膜組織；小心取出晶體，逐一分離玻璃體、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜，最后鈍性分離鞏膜，注意修剪去除殘余的眼球周圍筋膜組織；將不同眼組織轉(zhuǎn)入標(biāo)記好的eppendorf管待測。

2.噬菌體滴定計(jì)數(shù)(藍(lán)白斑篩選)

(1)接種和搖菌：從培養(yǎng)皿中挑取e.colier2738接種至5～10mllb培養(yǎng)基中，搖菌4～8h，至對(duì)數(shù)增長中期(mid-logphase，od600～0.5)；

(2)處理樣品(前述步驟“1”獲得的不同眼組織樣品)：每個(gè)樣品各取10μl，作為樣品的原濃度，再取10μl用lb稀釋10倍、100倍，每個(gè)樣品一共準(zhǔn)備3個(gè)濃度梯度；

(3)其他準(zhǔn)備：微波熔化topagar，3ml分裝至滅菌的培養(yǎng)管，45℃恒溫水浴維持培養(yǎng)管溫度；將準(zhǔn)備好的lb/iptg/xgalplates37℃預(yù)熱至少1h備用；

(4)感染和鋪板：當(dāng)e.colier2738搖菌至對(duì)數(shù)增長中期，200μl分裝至微量離心管，每管中加入10μl噬菌體樣品感染，震蕩混勻，室溫下培養(yǎng)5min：之后將其一一對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)入含40℃topagar的培養(yǎng)管中；混勻后立即依次倒入預(yù)熱的lb/iptg/xgalplates，輕柔地晃動(dòng)培養(yǎng)皿使topagar均勻地涂布于lb/iptg/xgal培養(yǎng)皿表面，在培養(yǎng)皿底面做好標(biāo)記，并放置5min冷卻。冷卻后倒置培養(yǎng)皿，37℃避光，孵育過夜。

(5)計(jì)數(shù)：過夜后計(jì)數(shù)每個(gè)培養(yǎng)皿上藍(lán)斑的數(shù)量(只計(jì)數(shù)藍(lán)斑，白斑表明有非重組噬菌體污染)，并乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即每10μl樣品中含有的噬菌體數(shù)量。

3.噬菌體單克隆測序及菌落擴(kuò)增、富集

(1)噬菌體單克隆菌落的挑選：完成計(jì)數(shù)后，立即用滅菌的200μltip頭輕碰挑選獨(dú)立的單克隆菌落(一般從<100個(gè)菌落的培養(yǎng)皿中挑選；保證挑選的每一個(gè)斑塊只含單一的dna序列；只挑選藍(lán)斑，白斑表示有環(huán)境中噬菌體污染)至10～20mllb培養(yǎng)液中(～1：200)，37℃搖菌培養(yǎng)約4.5h，從中取200μl進(jìn)行測序，剩余菌液加入50％等體積甘油，-20℃保存，待擴(kuò)增用。

(2)重組噬菌體測序：運(yùn)用bigdyeterminatorv3.1cyclesequencingkit試劑盒sanger法，一代測序篩選出的重組噬菌體單克隆單鏈dna。測序引物為96giii。利用vector8.0軟件將核苷酸序列轉(zhuǎn)換成氨基酸序列，并通過bioedit軟件進(jìn)行序列同源分析。

(3)篩選出的噬菌體的純化、擴(kuò)增傳代：根據(jù)測序結(jié)果，將富集最多的候選重組噬菌體擴(kuò)增傳代。將需要擴(kuò)增的上述剩余菌液轉(zhuǎn)入離心瓶，8000×g離心20min，取80％上清轉(zhuǎn)移至另一離心瓶，每個(gè)離心瓶中加入25ml預(yù)冷的peg/nacl，充分混勻，4℃過夜使噬菌體沉淀；12000×g，4℃離心20min，棄去上清，加入2mlpbs將離心管底部白色沉淀重懸，并轉(zhuǎn)移至eppendorf管，置于冰上冷卻30min；17000×g離心5min，將80％的上清轉(zhuǎn)移至另一eppendorf管中，每管中加入500μlpeg/nacl，充分混勻，置于冰上冷卻30min。17000×g離心30min，棄去上清，沉淀加入0.5～1mlpbs重懸；17000×g離心5min，取上清，將純化后的重組噬菌體依次稀釋成10^-2，10^-4，10^-6，10^-8，10^-9，10^-10，10^-11濃度梯度，注意每個(gè)濃度梯度更換tip頭。取10^-9，10^-10，10^-11濃度梯度的噬菌體重復(fù)上述感染、鋪板、計(jì)數(shù)過程，確定擴(kuò)增后的噬菌體濃度。-20℃保存于50％甘油中，進(jìn)行第二輪點(diǎn)眼/球后注射給藥。

三、結(jié)果

通過結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼和球后注射的方式，體內(nèi)定向篩選進(jìn)入眼內(nèi)并能與視網(wǎng)膜結(jié)合的噬菌體肽。經(jīng)過兩輪的篩選后，本發(fā)明人隨機(jī)挑選了98個(gè)克隆進(jìn)行測序，從中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)富集明顯的噬菌體克隆。挑選這5個(gè)克隆進(jìn)行擴(kuò)增、第三輪富集驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)克隆富集明顯，且測序結(jié)果與給藥的噬菌體肽一致。最終根據(jù)富集效果和與視網(wǎng)膜的結(jié)合強(qiáng)度，確定了以其中1個(gè)優(yōu)勢重組噬菌體肽進(jìn)行下一步的研究，將該重組噬菌體肽含12個(gè)氨基酸的肽段命名為cc12，其dna測序圖譜如圖2所示。其氨基酸序列為：emftppsmierl(seqidno:1)；其測序dna序列為：tagatgtttactccgccttctatgattgagcggctt(seqidno:2)。

序列分析顯示，cc12多肽含有苯丙氨酸(phe，f)這一疏水芳香族氨基酸，脂溶性較強(qiáng)，且其具備親水、疏水氨基酸殘基交錯(cuò)排列的雙親性特性；同時(shí)，cc12多肽可能主要形成隨意卷曲結(jié)構(gòu)，并混有不同比例的聚脯氨酸ii型(polyprolinetypeii，ppii)空間結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其能提供更多氫鍵結(jié)合位點(diǎn)，與細(xì)胞膜的作用更加高效，有利于其在體內(nèi)通過易位或轉(zhuǎn)導(dǎo)作用穿透生物學(xué)屏障。

實(shí)施例2、眼部引導(dǎo)肽cc12及其連接肽的眼屏障通透性測定

眼對(duì)外來物質(zhì)的吸收具有嚴(yán)格的選擇通透性，這一選擇過程主要通過眼部的生物學(xué)屏障實(shí)現(xiàn)。血視網(wǎng)膜屏障是眼部關(guān)鍵的生物學(xué)屏障，能夠有選擇性地調(diào)控外來物質(zhì)進(jìn)入眼內(nèi)組織，因而也限制了藥物從全身血液循環(huán)遞送到眼后段的過程。血視網(wǎng)膜屏障由內(nèi)屏障和外屏障組成，其特點(diǎn)類似于血腦屏障。視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其連接構(gòu)成血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障(innerblood-retinalbarrier，ibrb)，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinalpigmentepithelium，rpe)及其連接組成血視網(wǎng)膜外屏障(outerbrb，obrb)。

透鞏膜擴(kuò)散遞送藥物至外層視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜是通過多孔疏松擴(kuò)散(porousdiffusion)完成的。藥物的分子量越大、直徑越大，其鞏膜透過率越低，且線形分子(例如dextran)比球形分子(例如igg)更不易擴(kuò)散透過鞏膜。

而藥物透過鞏膜屏障后，可通過脈絡(luò)膜毛細(xì)血管或視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的血液進(jìn)入視網(wǎng)膜和玻璃體。由于脈絡(luò)膜血管存在窗孔和滲漏，藥物容易透過脈絡(luò)膜血管，此后，藥物必須跨越rpe(obrb)以到達(dá)神經(jīng)視網(wǎng)膜層和玻璃體。而在視網(wǎng)膜毛細(xì)血管中的藥物則必須跨越毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障(ibrb)。brb的存在削弱甚至阻礙了許多有效的大分子藥物在眼后段中的轉(zhuǎn)運(yùn)：眼周或全身給藥后藥物的內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)，以及玻璃體內(nèi)給藥后藥物的外向滲透。

因而在本實(shí)施例中，本發(fā)明人固相合成了cc12；以penetratin小肽作為穿透性實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照；并與具有明確抑制新生血管活性作用的小肽kv11(zhaoh等，inhibitionofpathologicretinalneovascularizationbyasmallpeptidederivedfromhumanapolipoprotein(a).investophthalmolvissci2009；50(11):5384–5395)作穿透性的比較。此外，本發(fā)明人將cc12連接上kv11，觀察連接肽cc12-kv11的穿透性與kv11相比有無變化。另外，將cc12的氨基酸序列打亂，命名為cc12s，明確cc12的穿透作用是否具有序列依賴性。

在體外invitro實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人通過arpe-19細(xì)胞系觀察rpe細(xì)胞攝取fitc標(biāo)記的不同小肽的效果，并通過流式細(xì)胞分析定量檢測進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。在離體exvivo實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人通過新西蘭白兔離體角膜、視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體表觀滲透率實(shí)驗(yàn)觀察不同小肽的通透性效果。在體內(nèi)invivo實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人通過結(jié)膜囊內(nèi)給藥、球后注射給藥的方式，在熒光或共聚焦顯微鏡下定性觀察冰凍切片中小肽的眼內(nèi)通透性及眼內(nèi)分布；并利用¹²⁵i同位素示蹤的方法，定量分析進(jìn)入眼內(nèi)的小肽含量。

一、實(shí)驗(yàn)材料

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系(humanretinalpigmentepithelialcellline，arpe-19)：購于americantypeculturecollection(atcc)，凍存。

成年新西蘭白兔(2.5千克)：獲自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

spraguedawley大鼠(180-200克)：獲自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.固相合成多肽

利用symphony型12通道多肽合成儀，其自帶軟件(version.201)，根據(jù)多肽的氨基酸序列，計(jì)算所需要配制的保護(hù)氨基酸溶液、縮合試劑和切割試劑的濃度。利用所述多肽合成儀合成cc12肽。

2.cc12-kv11、cc12-fitc，fitc-cc12，penetratin-fitc，kv11-fitc，cc12-kv11-fitc，cc12s-fitc多肽序列

kv11序列：ytmnprklfdy(seqidno:3)；

penetratin序列：rqikiwfqnrrmkwkk(seqidno:4)；

cc12s序列：mfppmiletser(seqidno:5)；

cc12-kv11序列：emftppsmierl-ggg-ytmnprklfdy(seqidno:6)；

為了研究上述多肽在眼屏障的通透性，本發(fā)明人在上述多肽的c端分別連接了一個(gè)賴氨酸(lys，k)，通過賴氨酸側(cè)鏈的氨基進(jìn)行fitc標(biāo)記，獲得cc12-fitc。

在cc12的氨基端，直接進(jìn)行fitc熒光標(biāo)記，獲得fitc-cc12。在氨基酸的羧基端(c端)進(jìn)行fitc熒光標(biāo)記，需在c端加上一個(gè)賴氨酸(lys，k)，再與fitc連接(適用于后續(xù)需要在c端進(jìn)行fitc標(biāo)記的氨基酸)。在penetratin序列的c端加上一個(gè)賴氨酸(lys，k)，再與fitc連接，獲得penetratin-fitc。

將fitc標(biāo)記在kv11序列的c端，獲得kv11-fitc。

fitc標(biāo)記在cc12-kv11的c端，獲得cc12-kv11-fitc。

fitc標(biāo)記在cc12s序列的c端，獲得cc12s-fitc。

在氨基酸的c端進(jìn)行綠色熒光蛋白gfp(238aa，～27kd)標(biāo)記，需在c端加上一個(gè)半胱氨酸(cys，c)。因此將cc12通過半胱氨酸連接到gfp，獲得cc12-gfp。

3.arpe-19細(xì)胞的培養(yǎng)

arpe-19細(xì)胞從-80℃冰箱取出后，立即置于37℃水浴箱內(nèi)，并搖動(dòng)30～60秒，使其融化。吸出細(xì)胞懸液注入離心管，滴加10ml培養(yǎng)液。1000rpm低速離心5分鐘后，去除上清液后重懸，接種于90mm培養(yǎng)皿中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中，次日更換培養(yǎng)液后每2～3天加入新鮮培養(yǎng)基。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞長至80～85％時(shí)，將細(xì)胞傳代或用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞傳代時(shí)，每個(gè)90mm大皿加入1ml胰蛋白酶溶液，1分鐘后，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察到原有的梭型貼壁細(xì)胞逐漸變圓，在未浮起時(shí)加入fbs培養(yǎng)液終止。用吸管將貼壁細(xì)胞吹下，將細(xì)胞懸液吸起分到三個(gè)培養(yǎng)皿中，加入新鮮培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為3～11代細(xì)胞。

4.arpe-19細(xì)胞mts毒性實(shí)驗(yàn)

(1)消化和接種細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長期arpe-19細(xì)胞，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整至5×10⁴/ml，以每孔100μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；37℃培養(yǎng)24h后，更換含0.5％fbs的dmem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)使細(xì)胞饑餓過夜；

(2)實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組，cc12-fitc多肽組，penetratin-fitc多肽組，kv11-fitc多肽組，cc12-kv11-fitc多肽組，cc12s-fitc多肽組。多肽組設(shè)置的濃度梯度均為：10μm、50μm、100μm和300μm；

(3)加藥：過夜后棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，在96孔板中加入含有0.5％fbs的dmem培養(yǎng)基，同時(shí)加入不同濃度的多肽溶液，每個(gè)濃度組至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24h；

(4)mts方法測定吸光度a值：24h后，棄去上述細(xì)胞培養(yǎng)上清，用pbs洗三遍，之后每孔中加入20μlmts試劑，37℃繼續(xù)培養(yǎng)3h，酶標(biāo)儀490nm測定a值。

5.arpe-19細(xì)胞內(nèi)化攝取多肽實(shí)驗(yàn)

(1)消化和接種細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長期arpe-19細(xì)胞，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，按5×10⁴細(xì)胞/孔接種到6孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)24h后，更換含0.5％fbs的dmem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)使細(xì)胞饑餓過夜；

(2)實(shí)驗(yàn)分組：cc12-fitc多肽組，penetratin-fitc多肽組，kv11-fitc多肽組，cc12-kv11-fitc多肽組，根據(jù)mts實(shí)驗(yàn)，選擇250μm作為本實(shí)驗(yàn)中多肽的濃度；

(3)加藥：過夜后棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，在96孔板中加入含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，同時(shí)加入濃度為250μm的多肽溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)；

(4)熒光顯微鏡觀察拍照：37℃孵育0.5h、1h、3h、6h后，棄去細(xì)胞上清，用1000iu/ml肝素和pbs沖洗3遍，以去除細(xì)胞表面的熒光物質(zhì)或結(jié)合的多肽。加入1mlpbs浸沒細(xì)胞，立即將6孔板置于熒光顯微鏡下觀察各孔熒光強(qiáng)度并拍照。

6.arpe-19細(xì)胞攝取多肽流式細(xì)胞定量分析

(1)消化和接種細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長期arpe-19細(xì)胞，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，按1×10⁶細(xì)胞/孔接種到6孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)24h后，更換含0.5％fbs的dmem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)使細(xì)胞饑餓過夜；

(2)實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、cc12-fitc多肽組(50μm、250μm)，kv11-fitc多肽組(250μm)，cc12-kv11-fitc多肽組(50μm、250μm)；

(3)加藥：過夜后棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，在96孔板中加入含10％fbs的dmem培養(yǎng)基，同時(shí)除空白對(duì)照組外，加入不同濃度的多肽溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)；37℃孵育1h、4h后，棄去細(xì)胞上清，用1000iu/ml肝素和pbs沖洗3遍，以去除細(xì)胞外結(jié)合的多肽。加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，當(dāng)光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞呈現(xiàn)將要分離的圓粒狀時(shí)，終止胰酶消化，并將細(xì)胞輕輕吹打均勻，轉(zhuǎn)移至1.5ml的eppendorf管中，1000rpm、離心5min×3次，重懸于1mlpbs中，立即轉(zhuǎn)入流式管中，避光待測。

(4)流式細(xì)胞分析定量檢測熒光強(qiáng)度：流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞攝取多肽的效果進(jìn)行測定，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)約5000個(gè)細(xì)胞，所用激發(fā)波長ex：488nm，發(fā)射波長em：508nm。運(yùn)用flowjo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)算fitc陽性的細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度(fm)。

7.新西蘭白兔離體角膜、視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體透過性實(shí)驗(yàn)

(1)實(shí)驗(yàn)分組：pbs空白對(duì)照組，cc12-fitc多肽組，penetratin-fitc多肽組，kv11-fitc多肽組，cc12-kv11-fitc多肽組，cc12s-fitc多肽組。多肽組藥物濃度為50um。

(2)新西蘭白兔角膜、視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體的取樣：耳緣靜脈注射過量戊巴比妥鈉處死實(shí)驗(yàn)用新西蘭白兔，分離結(jié)膜并離斷肌肉后取出眼球，在距角膜緣約1.5mm的鞏膜處做環(huán)切，小心剝離去除虹膜、睫狀體、晶狀體、玻璃體等眼部組織，得到帶有1.5mm鞏膜環(huán)的角膜和剩余的眼杯——視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體，用pbs沖洗3次備用。

(3)擴(kuò)散池透過性實(shí)驗(yàn)和表觀透過系數(shù)的計(jì)算：眼組織取下后立即進(jìn)行擴(kuò)散池透過性實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)散設(shè)備預(yù)熱并維持在34℃恒溫狀態(tài)后，將新鮮離體角膜和視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體分別小心固定在擴(kuò)散池的供給池與接收池之間，角膜的上皮層、視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體的鞏膜面面向供給池。擴(kuò)散池的內(nèi)口徑為8mm，擴(kuò)散面積為50.24mm²。供給池和接收池內(nèi)各加入34℃的pbs2ml平衡5min。之后小心棄去供給池中的溶液，加入濃度為50μm多肽溶液，并將擴(kuò)散池置于具備恒溫磁力攪拌器的擴(kuò)散設(shè)備中。分別在0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h從接收池中取樣500μl，同時(shí)每次取樣后立即補(bǔ)充等體積等溫的pbs。取200μl樣品進(jìn)行熒光分光光度計(jì)檢測，ex:490nm，em:520nm。記錄熒光強(qiáng)度(fm)，并計(jì)算對(duì)應(yīng)的表觀滲透率papp(cm/s)：

其中δq/δt為單位時(shí)間內(nèi)多肽的摩爾量的變化，可由累計(jì)透過量-時(shí)間曲線穩(wěn)態(tài)部分的斜率求得；c0是供給池中多肽的初始濃度(50μm)；a是擴(kuò)散池的有效透過面積(0.5024cm²)。papp是判斷藥物分子對(duì)生物膜透過能力的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。

(4)離體組織水化值：利用離體組織水化值評(píng)價(jià)藥物對(duì)眼角膜、視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體的組織毒性。上述實(shí)驗(yàn)完成后，將角膜、視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體取下，并沿中軸線切開。一半組織用多聚甲醛固定后，分別行蘇木素-伊紅he染色用于觀察組織完整性，冰凍切片碘化丙啶pi染色進(jìn)一步觀察多肽在組織中的分布；另一半組織分別稱重后(m0)，置于65℃高溫烘箱中干燥48h，稱量剩余組織重量(m1)，從而計(jì)算離體組織水化值(thehydrationvalue，δh)：

8.多肽眼內(nèi)分布研究

(1)實(shí)驗(yàn)分組：pbs空白對(duì)照組，cc12-fitc多肽組，penetratin-fitc多肽組，kv11-fitc多肽組，cc12-kv11-fitc多肽組，cc12s-fitc多肽組。多肽組藥物濃度為500μm；

(2)給藥方法：sd大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼組：用槍頭吸取10μlfitc標(biāo)記的多肽溶液或pbs，輕輕閉合眼瞼使藥物均勻分布，每10min給藥一次，共點(diǎn)眼6次；球后注射組：采用1ml注射器抽取100μlfitc標(biāo)記的多肽溶液或pbs，在眶下緣中外1/3處，沿眶下壁垂直進(jìn)針約0.2cm，越過眼球赤道部后即斜向鼻上方，入針約0.4cm深，確定未刺入眼球內(nèi)后，回抽無回血即可緩慢推入同位素標(biāo)記溶液；注射后輕輕拔出針頭并墊以棉球輕壓眼球片刻，觀察有無球后出血現(xiàn)象(如眼瞼腫脹、眼球突出、運(yùn)動(dòng)受限等)；

(3)制備冰凍切片：上述給藥完成后，于不同時(shí)間點(diǎn)0.5h、3h、6h、24h分別處死大鼠，取出眼球，并用pbs沖洗3遍。之后置于4％多聚甲醛中4℃固定過夜，再分別于10％、20％、30％的蔗糖溶液中4℃梯度脫水，每個(gè)濃度脫水12h。固定脫水后，o.c.t包埋，標(biāo)本放入-20℃冰凍切片機(jī)內(nèi)，行10μm切片制備眼組織冰凍切片。

(4)多肽眼內(nèi)分布觀察和fitc熒光強(qiáng)度半定量測定：采用帶有熒光濾過系統(tǒng)的共聚焦激光掃描顯微鏡或熒光顯微鏡觀察fitc標(biāo)記的多肽在眼內(nèi)的分布，并拍照。各組冰凍切片的熒光強(qiáng)度根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱按照四個(gè)等級(jí)進(jìn)行評(píng)價(jià)：0級(jí)，僅有背景熒光；1級(jí)，弱熒光；2級(jí)，中等熒光；3級(jí)，強(qiáng)熒光。

9.¹²⁵i同位素示蹤實(shí)驗(yàn)

由于放射性核素¹²⁵i標(biāo)記多肽需要有酪氨酸y或組氨酸h的存在，因此本發(fā)明人選取本身含有酪氨酸的兩個(gè)多肽kv11和cc12-kv11標(biāo)記¹²⁵i，并進(jìn)行同位素示蹤實(shí)驗(yàn)。通過同位素點(diǎn)眼和球后注射的方式，定量檢測藥物進(jìn)入眼內(nèi)的含量。

(1)實(shí)驗(yàn)分組和同位素標(biāo)記：將kv11-fitc和cc12-kv11-fitc多肽各500μg多肽溶于500μl雙蒸水，取8μl(含8μg)加入1.65mci¹²⁵i，并加入600μlpbs，于iodogen管中37℃反應(yīng)5min。轉(zhuǎn)移后經(jīng)雙蒸水洗3遍，并將標(biāo)記后的溶液經(jīng)sephadexg-10小柱純化，以去除游離¹²⁵i。之后用帶有放射性檢測器的hplc分析鑒定，記錄標(biāo)記率并計(jì)算比活度；用標(biāo)記后的¹²⁵i-kv11-fitc和¹²⁵i-cc12-kv11-fitc兩組多肽進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

(2)同位素給藥方法：sd大鼠結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼組：用槍頭吸取10μl¹²⁵i標(biāo)記的多肽溶液，每10min點(diǎn)眼一次，共給藥6次；球后注射組：采用1ml注射器抽取100μl溶液，在眶下緣中外1/3處，沿眶下壁垂直進(jìn)針約0.2cm，越過眼球赤道部后即斜向鼻上方，入針約0.4cm深，確定未刺入眼球內(nèi)后，回抽無回血即可緩慢推入同位素標(biāo)記溶液；注射后輕輕拔出針頭并墊以棉球輕壓眼球片刻，觀察有無球后出血現(xiàn)象(如眼瞼腫脹、眼球突出、運(yùn)動(dòng)受限等)；

(3)進(jìn)入眼內(nèi)的放射性檢測：最后一次點(diǎn)眼后0.5h，用3mlpbs沖洗結(jié)膜囊3遍，每次持續(xù)30s，之后過量戊巴比妥鈉處死大鼠，立即取眼球，去除角膜及結(jié)膜組織；球后注射1h后，過量戊巴比妥鈉處死大鼠，立即取眼球，3mlpbs沖洗眼球3遍，每次30s，之后小心去除結(jié)膜組織，沿角鞏緣環(huán)形剪開眼球，去除鞏膜，保留眼前節(jié)、玻璃體、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜。將剩余的眼組織分別稱重，裝入測量管，利用γ-計(jì)數(shù)器檢測樣品的放射性，并換算成單位樣品質(zhì)量的放射性活度(bq/g)和放射性比活度/劑量(id/g)：

放射性比活度＝(放射性計(jì)數(shù)-本底)/(60×e×m)，其中e為測量效率，按50％計(jì)算，m為樣品質(zhì)量；放射性比活度/劑量＝放射性比活度/給藥劑量，其中，1μci＝3.7×10⁴bq。

10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(sd)表示，數(shù)據(jù)處理運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件spss22.0統(tǒng)計(jì)軟件包運(yùn)算(statisticalsoftware，losangeles，ca，usa)或graphpadprism(sandiego，ca，usa)。運(yùn)用two-tailedstudent’st檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，運(yùn)用單因素方差分析(one-wayanova)進(jìn)行多組間變量分析比較，運(yùn)用tukey’smultiplecomparisontest進(jìn)行多重比較，p值小于0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

三、結(jié)果

1、多肽cc12及其連接肽、對(duì)照肽的體外固相合成

噬菌體展示技術(shù)篩選出的cc12多肽由12個(gè)氨基酸組成，為了在其c端標(biāo)記上fitc綠色熒光，本發(fā)明人在c端連接了一個(gè)賴氨酸(lys，k)，通過質(zhì)譜法(massspectrometry，ms)檢測，確定最終的氨基酸分子量為1968.31da。為了說明cc12多肽潛在的穿透眼屏障作用是否具有序列依賴性，本發(fā)明人將cc12多肽氨基酸序列隨機(jī)打亂，并合成出數(shù)個(gè)多肽，其中一個(gè)多肽命名為cc12s，分子量為2081.48da，本發(fā)明人將在后續(xù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中將cc12s作為對(duì)照多肽。同時(shí)本發(fā)明人選取公認(rèn)的、經(jīng)典的16個(gè)氨基酸穿膜肽penetratin作為眼屏障通透性實(shí)驗(yàn)中的陽性對(duì)照多肽，連接fitc后其最終氨基酸序列為rqikiwfqnrrmkwkkk(seqidno:7)-fitc，分子量為2764.33da。另外，本發(fā)明人前期研發(fā)的抗新生血管活性的多肽kv11作為抑制新生血管活性實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照，其氨基酸序列為ytmnprklfdyk(seqidno:8)-fitc，分子量為2078.41da。同時(shí)，通過3個(gè)甘氨酸-ggg-將kv11連接于篩選出的潛在眼部引導(dǎo)肽cc12上，命名為cc12-kv11，標(biāo)記上fitc的cc12-kv11多肽的氨基酸分子量為3682.31da。眼部引導(dǎo)肽及對(duì)照肽的基本信息如表1所示，包括分子量、等電點(diǎn)、荷電量及親水性。

由于多肽分子量小，因而可以經(jīng)體外固相合成方法獲得，并進(jìn)行hplc純化，帶fitc標(biāo)記的多肽凍干后為橙黃色粉末狀，水溶性好。經(jīng)hplc檢測，多肽純度均>95％。

表1、眼部引導(dǎo)肽和對(duì)照肽基本信息

2、多肽cc12及其連接肽、對(duì)照肽的細(xì)胞毒性

采用mts法對(duì)多肽cc12及其連接肽、對(duì)照肽的細(xì)胞毒性進(jìn)行考察。與空白對(duì)照組相比，cc12-fitc、kv11-fitc、cc12-kv11-fitc、cc12s-fitc多肽組在300μm濃度范圍內(nèi)對(duì)arpe-19細(xì)胞的生長幾乎沒有影響；penetratin-fitc多肽組在10μm濃度時(shí)未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，但當(dāng)濃度≥50μm后，它對(duì)arpe-19細(xì)胞的生長有明顯的毒性作用，且其毒性/抑制作用呈劑量依賴性：50μm、100μm、300μm濃度組平均od值分別為1.028±0.054、0.530±0.014、0.259±0.016，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，如圖3所示。penetratin的細(xì)胞毒性可能與其破細(xì)胞膜/穿膜作用有關(guān)。

3、多肽cc12及其連接肽、對(duì)照肽細(xì)胞攝取能力定性評(píng)價(jià)

arpe-19細(xì)胞攝取不同fitc標(biāo)記多肽的能力如圖4所示，熒光強(qiáng)弱在可代表被攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的多肽的多少。結(jié)果顯示，arpe-19細(xì)胞攝取多肽cc12-fitc、penetratin-fitc和cc12-kv11-fitc呈時(shí)間依賴，隨著孵育時(shí)間的延長，細(xì)胞攝取這幾組多肽而呈現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸增加。但cc12-fitc及其連接肽cc12-kv11-fitc在同一時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度不如penetratin-fitc多肽組，考慮多肽cc12和連接肽可能部分通過細(xì)胞內(nèi)吞/攝取作用進(jìn)入細(xì)胞，部分通過細(xì)胞間隙或其他途徑穿透眼屏障。而arpe-19細(xì)胞幾乎不攝取kv11-fitc多肽，但隨著孵育時(shí)間的延長，3～6h時(shí)也可觀察到微弱的綠色熒光。

4、多肽cc12及其連接肽、對(duì)照肽細(xì)胞攝取能力的定量評(píng)價(jià)

流式細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，arpe-19細(xì)胞與多肽共孵育1h，arpe-19對(duì)高濃度cc12-fitc(250μm)及高濃度連接肽cc12-kv11-fitc(250μm)的攝取(細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度)顯著高于高濃度kv11-fitc多肽組(250μm)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.001，p<0.01)。而隨著孵育時(shí)間的延長，4h時(shí)cc12-fitc多肽的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著高于高濃度kv11-fitc多肽組(p<0.001)；而無論高濃度或是低濃度組，連接肽cc12-kv11-fitc多肽的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度均顯著高于高濃度kv11-fitc多肽組(p<0.001或p<0.05)，其中，高濃度cc12-kv11-fitc多肽組與高濃度kv11-fitc多肽組在細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度相比，提高了約10.2倍。孵育時(shí)間延長、藥物濃度提高，細(xì)胞對(duì)這兩組多肽的攝取均逐漸增加。值得一提的是，arpe-19細(xì)胞對(duì)高濃度kv11-fitc小肽也有一定程度的攝取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與熒光顯微鏡照片的結(jié)果一致。

5、多肽cc12及其連接肽、對(duì)照肽表觀透過系數(shù)測定

利用擴(kuò)散池進(jìn)行多肽表觀透過系數(shù)測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，多肽透過離體角膜(圖6a)及離體視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體(圖6b)的過程呈時(shí)間依賴性。隨著測定時(shí)間的延長，fitc標(biāo)記的多肽透過離體生物膜的濃度也隨之升高，利用熒光分光光度計(jì)檢測到的熒光強(qiáng)度也越強(qiáng)。且隨著時(shí)間的推移，cc12、penetratin、cc12-kv11多肽透過離體角膜或視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體的濃度顯著高于kv11、cc12s多肽。根據(jù)測定得到的單位時(shí)間內(nèi)透過的多肽的摩爾量的變化、多肽的初始濃度、有效透過面積，計(jì)算出表觀透過系數(shù)papp值，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，4h內(nèi)離體角膜penetratin的papp值顯著高于其他各組(p<0.001)，但在透過視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體方面，penentratin不如cc12多肽(p<0.001)；而cc12、penetratin、cc12-kv11多肽組的papp值均顯著高于kv11和cc12s組。顯示了cc12多肽在透視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體方面出色的穿屏障作用，同時(shí)，連接上cc12后，無論是透角膜或是透視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體，cc12-kv11多肽的穿屏障作用也較kv11多肽顯著提高(p<0.001)。

6、多肽cc12及其連接肽、對(duì)照肽擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)后離體組織毒性測定

(1)離體組織水化值測定

采用離體組織水化值δh對(duì)多肽的急性毒性組織損傷進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組多肽孵育過的離體角膜或離體視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體與空白組(pbs組)相比均不存在顯著性差異(p>0.05)，表明離體實(shí)驗(yàn)中所選擇的多肽濃度對(duì)離體組織無損傷、刺激性作用，顯示出較好的安全性，如圖7a、7b所示。

(2)組織結(jié)構(gòu)完整性評(píng)價(jià)

采用he組織染色觀察離體組織經(jīng)過擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)后的結(jié)構(gòu)完整性。如圖7c所示，所有多肽組的角膜保持了完整的角膜上皮結(jié)構(gòu)，所有多肽組的視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體也均保持了完整的結(jié)構(gòu)，沒有出現(xiàn)明顯的空泡化、無炎癥或免疫反應(yīng)。表明多肽對(duì)離體眼組織無明顯毒性損傷作用，并由此判斷藥物擴(kuò)散過程中未出現(xiàn)離體組織的破損滲漏。該結(jié)果與離體組織水化值的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

7、多肽cc12及其連接肽、對(duì)照肽的眼內(nèi)分布

通過點(diǎn)眼和球后注射fitc標(biāo)記的多肽，于一定的時(shí)間點(diǎn)(0.5h、3h、6h和24h)取眼球固定脫水，行冰凍切片觀察多肽的眼內(nèi)分布和眼屏障通透性，利用熒光強(qiáng)度評(píng)分對(duì)從眼球外穿透進(jìn)入眼球內(nèi)的fitc-多肽熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。結(jié)果如圖8～10所示。

從圖8、10a中可以看出，球后注射給藥0.5h后，篩選出的cc12多肽、陽性對(duì)照肽penetratin、連接肽cc12-kv11在眼后段組織中，綠色熒光均勻分布于內(nèi)界膜(internallimitingmembrane，ilm)、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglioncelllayer，gcl)、內(nèi)叢狀層(innerplexiformlayer，ipl)和外叢狀層(outerplexiformlayer，opl)，而在內(nèi)核層(innernuclearlayer，inl)和外核層(outernuclearlayer，onl)中也有纖維狀綠色熒光分布。此外，橢圓體帶(ellipsoidzone，ez)和視網(wǎng)膜色素上皮/bruch膜復(fù)合體(rpe/bruch’smembranecomplex，rpe/bm)組織中的熒光強(qiáng)度很高，而最外層脈絡(luò)膜(chororid，chr)中的熒光則相對(duì)較弱。表明這三組多肽經(jīng)球后注射給藥后能夠快速而廣泛地分布于眼內(nèi)，特別是眼后段的各組織中。kv11多肽和cc12s多肽在視網(wǎng)膜內(nèi)層均無明顯的綠色熒光，pbs空白對(duì)照組在眼后段僅有少許本底背景熒光。各組多肽的體內(nèi)穿透能力結(jié)果同前離體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致。另外，如圖9a所示，cc12、penetratin和cc12-kv11多肽的組織熒光強(qiáng)度在3～6h達(dá)到高峰，并可維持至24h。

另一方面，結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼組也可在眼后段組織觀察到熒光信號(hào)；由于角膜的五層特殊結(jié)構(gòu)和其致密性，使得角膜冰凍切片上只能觀察到cc12、penetratin、cc12-kv11多肽熒光滲透至角膜上皮層，3h仍然具有熒光信號(hào)；而kv11和cc12s僅能在給藥0.5h后的角膜冰凍切片中觀察到角膜上皮層極微弱的熒光(圖9b)。推測藥物經(jīng)由結(jié)膜囊內(nèi)進(jìn)入眼內(nèi)，特別是進(jìn)入眼后段的主要途徑為結(jié)膜-鞏膜途徑，僅有小部分藥物可以經(jīng)由角膜途徑進(jìn)入眼內(nèi)。

在熒光強(qiáng)度評(píng)分方面，cc12、penetratin和cc12-kv11多肽經(jīng)球后注射到達(dá)眼后段的熒光強(qiáng)度相近，且在給藥后3～24h均高于kv11和cc12s組，結(jié)果具有顯著性差異，如圖10b所示。進(jìn)一步表明篩選出的cc12多肽能較出色地穿透眼屏障，并攜帶kv11生物肽共同穿越眼球屏障，且眼內(nèi)滯留能力較好，因?yàn)槠湮唇?jīng)過玻璃體就到達(dá)視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜等眼后段組織，因而不容易被水解或代謝消除。

在cc12的氨基端連接fitc的產(chǎn)物，經(jīng)球后注射和結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼可以在眼后段組織檢測到綠色熒光信號(hào)。

cc12與綠色熒光蛋白融合表達(dá)的產(chǎn)物，經(jīng)球后注射和結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼可以在眼后段組織檢測到綠色熒光信號(hào)。

8、kv11、cc12-kv11多肽進(jìn)入眼內(nèi)含量的定量檢測

采用¹²⁵i標(biāo)記多肽的同位素示蹤法定量檢測可標(biāo)記的兩個(gè)多肽kv11和cc12-kv11進(jìn)入眼內(nèi)的含量。標(biāo)記¹²⁵i后的多肽經(jīng)hplc分析鑒定圖如下所示(圖11、12)，kv11標(biāo)記率約為95％，比活度為157μci/μg；cc12-kv11標(biāo)記率約為91％，比活度為126μci/μg。

結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼0.5h后，¹²⁵i-kv11多肽組和¹²⁵i-cc12-kv11多肽組測得的眼球內(nèi)單位樣品質(zhì)量的放射性比活度分別為6674.9±1390.7bq/g，103221.2±12989.4bq/g(p<0.001)，放射性比活度/劑量分別為：0.64±0.13％，5.58±0.70％(p<0.001)。¹²⁵i-cc12-kv11多肽組在點(diǎn)眼0.5h后眼球內(nèi)的放射性比活度/劑量是¹²⁵i-kv11多肽組的8.7倍，如圖13a所示。

而球后注射1h后，¹²⁵i-kv11多肽組和¹²⁵i-cc12-kv11多肽組測得的眼球內(nèi)單位樣品質(zhì)量的放射性比活度分別為3944.0±273.1bq/g，41318.2±4196.3bq/g(p<0.001)，放射性比活度/劑量分別為：0.36±0.025％，3.84±0.39％(p<0.001)。¹²⁵i-cc12-kv11多肽組在球后注射1h后眼球內(nèi)的放射性比活度/劑量是¹²⁵i-kv11多肽組的10.7倍，如圖13b所示。球后注射組與結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼組眼內(nèi)多肽定量檢測結(jié)果同前多肽眼內(nèi)分布及離體組織擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

四、實(shí)施例小結(jié)

本實(shí)施例中，通過體外、離體、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用定性、定量的方法加以證實(shí)，驗(yàn)證了多肽cc12所具備的一定細(xì)胞穿膜能力和較好的穿透離體眼組織及體內(nèi)眼屏障的作用。并通過連接kv11，將有功能的生物肽協(xié)同帶入眼內(nèi)，顯示了小分子多肽cc12及其連接肽cc12-kv11良好的組織屏障穿透性。

在體外細(xì)胞學(xué)水平的評(píng)價(jià)中，選用了代表血視網(wǎng)膜外屏障的rpe(眼后段藥物局部遞送的關(guān)鍵屏障)細(xì)胞arpe-19作為研究對(duì)象，結(jié)果顯示cc12及其連接肽cc12-kv11多肽細(xì)胞學(xué)毒性極低，安全性好，并在細(xì)胞內(nèi)的攝取量相對(duì)較高，流式細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果也表明這兩組多肽的細(xì)胞內(nèi)攝取顯著高于kv11多肽。在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，cc12及cc12-kv11多肽對(duì)rpe細(xì)胞的安全性明顯優(yōu)于penetratin多肽組。雖然在同一時(shí)間點(diǎn)，cc12及cc12-kv11多肽細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度弱于penetratin組，但本發(fā)明人考慮，penetratin的高正電荷性使得它很可能是通過破壞帶負(fù)電的細(xì)胞膜起到穿膜作用(這一點(diǎn)在penetratin對(duì)arpe-19的mts細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中也可得到證實(shí))，而本發(fā)明的多肽基本屬于電中性(表1)，其穿膜作用可能為內(nèi)吞或經(jīng)載體轉(zhuǎn)運(yùn)，且其穿屏障作用更值得關(guān)注。因而推測，實(shí)施例1篩選出的多肽cc12及其連接肽，可能部分通過穿膜作用、部分通過跨細(xì)胞間隙從而顯示出良好的穿屏障作用。

在離體眼組織透過性實(shí)驗(yàn)中，cc12、penetratin、cc12-kv11的papp值均在10^-6cm/s，顯著高于kv11或cc12s多肽，其papp值已接近一些小分子藥物，具有良好的角膜、視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體透過性。

離體組織水化值是評(píng)估藥物對(duì)組織的刺激性、毒性的重要參數(shù)。實(shí)驗(yàn)中各組的離體組織水化值在76.91～84.20％，基本落在正常范圍76～83％之間，且與pbs空白對(duì)照組相比無顯著性差異。同時(shí)，he染色的組織切片也進(jìn)一步證實(shí)了眼組織在4h的多肽溶液浸潤中并未受到明顯損傷，組織結(jié)構(gòu)完整、無滲漏。

cc12多肽的眼內(nèi)分布和定量檢測結(jié)果相近，結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼和球后注射均能快速且廣泛分布于眼組織中，冰凍切片結(jié)果顯示3～6h多肽在眼后段的熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值，直至24h仍可見均勻的綠色熒光分布，推測cc12及其連接肽cc12-kv11入眼可能同時(shí)涉及角膜及非角膜(結(jié)膜鞏膜)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，提示cc12能夠通過結(jié)膜囊內(nèi)頻繁點(diǎn)眼或球后注射的方式應(yīng)用于藥物遞送，治療眼底疾病。

同時(shí)，在本實(shí)施例中，對(duì)多肽的安全性也進(jìn)行了驗(yàn)證(mts細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、離體組織水化值實(shí)驗(yàn)和he染色組織切片)，具有安全性。

實(shí)施例3、眼部引導(dǎo)肽cc12及其連接肽抑制體內(nèi)外新生血管的有效性測定

血管新生是一個(gè)復(fù)雜的過程，目前主要認(rèn)為血管新生有兩種類型：局部新生血管(angiogenesis)和系統(tǒng)性新生血管(vasculogenesis)。血管新生包括在vegf、bfgf等促血管生長因子作用下血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和趨化、毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)形成等一系列復(fù)雜變化。體內(nèi)血管新生受到血管生長促進(jìn)因子和血管生長抑制因子[如色素上皮源性因子(pigmentepithelium-derivedfactor，pedf)、血管抑素(angiostatin)和內(nèi)皮抑素(endostatin)]之間動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控。因此，在血管新生過程中，如果vegf等誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移趨化和管腔形成中一個(gè)或者多個(gè)環(huán)節(jié)受到破壞，異常新生血管生長將得到有效抑制。

在本實(shí)施例中，本發(fā)明人通過經(jīng)典的新生血管的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)加以探索連接肽cc12-kv11抑制體外血管新生的作用效果及其具體作用環(huán)節(jié)：vegf誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移趨化和管腔形成實(shí)驗(yàn)，雞胚尿囊膜(chickchorioallantoicmembrane,cam)新生血管模型、高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型等實(shí)驗(yàn)以闡明cc12-kv11多肽抑制新生血管的有效性。

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.血管內(nèi)皮細(xì)胞

原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells，huvecs)購自美國sciencell公司。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及雞胚

生后1～2d受精雞胚：獲自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

出生7天c57bl/6j乳鼠連同母鼠：獲自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

spraguedawley大鼠(180-200克)：獲自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

3.細(xì)胞培養(yǎng)試劑

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ecm)：獲自sciencell。

內(nèi)皮細(xì)胞生長添加物(ecgs)sciencell。

vegf：采用重組人vegf165：獲自r&d。

mts：獲自promega公司。

growthfactorreducedmatrigel：獲自bd。

4.視網(wǎng)膜血管染色所用試劑

alexafluor568conjugated：獲自molecularprobes。

isolectinb4：獲自invitrogen。

5.其他試劑及藥品

多聚甲醛：獲自sigma。

ranibizumab(lucentis)：獲自novartis公司。

0.4％鹽酸奧布比卡因滴眼液：獲自參天制藥(中國)有限公司。

0.5％金霉素眼膏：獲自上海通用藥業(yè)股份有限公司。

冰凍試劑oct：獲自sakurafinetek。

醋酸可的松：獲自上海信宜藥業(yè)有限公司

6.主要試劑的配制

細(xì)胞消化酶：0.25％trypsin+1mmedta·4na。

4％多聚甲醛配制：先配制ph7.4的0.01mpbs溶液，再以4％的濃度，以pbs為溶劑溶解多聚甲醛(加熱60℃以上溶解)。

0.25％胰蛋白酶消化液：每0.25g胰蛋白酶溶于100ml0.1mtris緩沖液(ph7.8)。

0.5％tritonx-100：取0.25mltritonx-100原液，加入49.75ml1mpbs，充分震蕩混勻。

10μg/mlisoletinb4：500μgisolectinb4溶于1ml1mpbs，50μl/管分裝，使用時(shí)稀釋50倍，離心取上清。

二、方法

1.血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)

huvecs采用含5％fbs、1％ecgs的ecm培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種于預(yù)先包被明膠的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37℃、5％co2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞生長接近融合后，以0.25％胰蛋白酶消化傳代，選取3～8代huvecs細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

(1)消化和接種細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長期huvecs，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整至3.5×10⁴/ml，以每孔100μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；37℃培養(yǎng)24h后，更換含0.5％fbs的ecm培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)使細(xì)胞饑餓過夜；

(2)實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組(無vegf無多肽)，vegf(5ng/ml)組，vegf(5ng/ml)+cc12-fitc多肽(10μm、100μm、200μm)組，vegf(5ng/ml)+kv11-fitc多肽(10μm、100μm、200μm)組，vegf(5ng/ml)+cc12-kv11-fitc多肽(10μm、100μm、200μm)組，vegf(5ng/ml)+ranizumab(0.5mg/ml、5mg/ml)組。

(3)加藥：過夜后棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，在96孔板中加入含有5ng/mlvegf、0.5％fbs的ecm培養(yǎng)基，同時(shí)加入不同濃度的多肽溶液，每個(gè)濃度組至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24h；

(4)mts方法測定吸光度a值：24h后，棄去上述細(xì)胞培養(yǎng)上清，用pbs洗三遍，之后每孔中加入20μlmts試劑，37℃繼續(xù)培養(yǎng)3h，酶標(biāo)儀490nm測定a值。

3.血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)

(1)收集細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長期的huvecs細(xì)胞，以含0.5％fbsecm培養(yǎng)基培養(yǎng)，使細(xì)胞饑餓過夜；第二天胰蛋白酶消化制備細(xì)胞懸液；

(2)平衡transwell小室系統(tǒng)：為了促進(jìn)細(xì)胞貼壁，在使用前用含0.5％fbs的ecm培養(yǎng)基對(duì)小室系統(tǒng)進(jìn)行平衡，在下室和上室分別加入600μl和100μl培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜；

(3)實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組(無vegf無多肽)，vegf(25ng/ml)組，vegf(25ng/ml)+cc12-fitc多肽(100μm)組，vegf(25ng/ml)+不同濃度kv11-fitc多肽(10μm、50μm、100μm)組，vegf(25ng/ml)+不同濃度cc12-kv11-fitc多肽(10μm、50μm、100μm)組，vegf(25ng/ml)+ranizumab(0.5mg/ml、5mg/ml)組；

(4)加藥：加藥前吸棄培養(yǎng)基，取約4×10⁵huvecs細(xì)胞，預(yù)先與不同濃度多肽(0～100μm)混合，37℃預(yù)處理30min；然后將細(xì)胞與多肽的混合懸液(共100μl)加入transwell小室的上室；transwell小室下層加入600μl含25ng/mlvegf的ecm培養(yǎng)基，空白對(duì)照組不加vegf；

(5)染色：37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取出上層小室，使用pbs輕輕沖洗2～3次，放入4％多聚甲醛中室溫固定30min，pbs沖洗3次，晾干。將小室放入蘇木素染液中染色10min，取出小室，pbs沖洗3次，用棉簽輕輕將上層小室上表面的細(xì)胞擦去，剩下的細(xì)胞即為發(fā)生趨化遷移至下表面的細(xì)胞；

(6)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)：光學(xué)顯微鏡下每個(gè)小室膜選取5個(gè)視野，觀察并拍照，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)遷移趨化的細(xì)胞數(shù)。趨化遷移率被矯正為百分比，將vegf組的遷移率設(shè)為100％。

4.血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)

(1)準(zhǔn)備：將96孔板、200μltip頭等提前置于4℃冰箱預(yù)冷待用；將growthfactorreducedmatrigel置于4℃冰箱過夜以使其充分液化；

(2)鋪膠：用預(yù)冷的tip頭吸取充分液化的matrigel加入預(yù)冷的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔50μl，置于37℃靜置30min使matrigel充分凝固；

(3)實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組(無vegf無多肽)，vegf(15ng/ml)組，vegf(15ng/ml)+cc12-fitc多肽(100μm)組，vegf(15ng/ml)+不同濃度kv11-fitc多肽(10μm、50μm、100μm)組，vegf(15ng/ml)+不同濃度cc12-kv11-fitc多肽(10μm、50μm、100μm)組，vegf(15ng/ml)+ranizumab(0.5mg/ml、5mg/ml)組；

(4)細(xì)胞處理：收集對(duì)數(shù)生長期的huvecs，將每孔1×10⁴細(xì)胞預(yù)先與不同濃度的多肽(0～100μm)混合，37℃孵育30min后，向細(xì)胞懸液中加入vegf，使得vegf終濃度為15ng/ml，混勻后加入預(yù)先包被matrigel的96孔板，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6h；

(5)觀察與圖像分析：6h后40倍倒置相差顯微鏡下觀察并拍照，每孔記錄4個(gè)視野。拍照后采用nihimagej1.32圖像分析軟件分析計(jì)算每孔內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)形成的長度。以vegf組管狀結(jié)構(gòu)形成長度為100％，計(jì)算成管率：

成管率＝(多肽處理組管腔形成長度/vegf組管腔形成長度)×100％。

5.雞胚尿囊膜新生血管實(shí)驗(yàn)

(1)實(shí)驗(yàn)分組：pbs組，cc12多肽50μg組，kv11多肽10μg、50μg組，cc12-kv11多肽10μg、50μg組。

(2)雞胚孵育：將生后2天(d)的受精雞蛋，苯扎溴銨溶液消毒后放入37℃、濕度60％～70％的恒溫孵育箱內(nèi)孵育5d，鈍端朝上傾斜45°，每日定時(shí)翻動(dòng)雞蛋兩次。

(3)濾紙片的制備：采用5mm打孔機(jī)，將whatman濾紙制成直徑為5mm的圓形濾紙片，高壓滅菌。用滅菌的雙蒸水將醋酸可的松片配制成5μg/μl的懸濁液，混勻。在每個(gè)濾紙片上加5μl的醋酸可的松懸濁液，風(fēng)干約5min。然后在每個(gè)濾紙片上加5μl不同濃度的多肽溶液或5μlpbs溶液，制備為分別含有pbs，50μgcc12多肽，10μg或50μgkv11多肽，10μg或50μgcc12-kv11多肽的濾紙片，風(fēng)干，備用。

(4)雞胚開窗：用照蛋燈在距雞胚頭前1cm、正對(duì)雞胚的位置(兩條卵黃靜脈之間的卵殼投影部位)以記號(hào)筆劃線作標(biāo)記，在氣室頂端用眼科鑷子在蛋殼上開一個(gè)小孔并穿透氣室殼膜，用眼科鑷子揭去蛋殼，開一個(gè)直徑小于1.0cm的小窗，在殼膜上滴加一滴滅菌的生理鹽水，使尿囊膜與蛋殼分開，撕去卵殼膜。

(5)加藥：觀察雞心的位置和血管走向，沿遠(yuǎn)離雞心的方向繼續(xù)剝開蛋殼至蛋殼和氣室膜相貼處，選擇大血管之間的相對(duì)無血管區(qū)，將分別含有pbs、50μgcc12多肽，10μg或50μgkv11多肽，10μg或50μgcc12-kv11多肽的濾紙片放置在卵黃囊表面。透明膠封閉蛋殼開口，恒溫孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2d后觀察，毋需翻蛋；

(6)結(jié)果觀察：揭去透明膠，環(huán)狀擴(kuò)大蛋殼開口，充分暴露雞胚尿囊膜，使得濾紙片距胚體和蛋殼至少保持5mm的距離。觀察濾紙片周圍2.5mm范圍內(nèi)毛細(xì)血管生長情況，并拍照計(jì)數(shù)毛細(xì)血管數(shù)量。

6.高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管實(shí)驗(yàn)

(1)高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型的建立

1)將出生7d的c57bl/6j乳鼠連同母鼠置于恒溫氧氣箱中，溫度保持在25℃±0.2℃，每天檢測4次氧濃度，使氧濃度保持在75％±5％，氣流速度為1.2～1.5l/min。每兩天更換一次墊料、飼料和飲水。維持12小時(shí)晝夜交替照明規(guī)律，同時(shí)將在正常氧濃度環(huán)境中飼養(yǎng)的乳鼠做為對(duì)照組；

2)恒溫氧箱內(nèi)飼養(yǎng)5d后(即小鼠出生后第12天)，停止氧氣供給，使其處于正常氧濃度的空氣環(huán)境中，溫度仍保持在25℃±0.2℃，繼續(xù)飼養(yǎng)5天；

3)至生后第17天，稱重，若體重>6g，則以過量麻醉處死小鼠，取眼球；若體重<6g，可能存在不正常表型，應(yīng)當(dāng)舍棄。

(2)多肽藥物干預(yù)病理性視網(wǎng)膜新生血管

1)實(shí)驗(yàn)分組：每組包括1窩(5～7只)c57b/6j乳鼠，每只乳鼠取右眼作為實(shí)驗(yàn)眼。按球后注射、結(jié)膜囊點(diǎn)眼分為兩大組，每組又分為：空氣+pbs組，高氧+pbs組、高氧+kv11組、高氧+cc12-kv11組?？諝饨M動(dòng)物自始至終均在環(huán)境空氣中飼養(yǎng)，高氧組如上述高氧誘導(dǎo)建模。

2)小鼠結(jié)膜囊內(nèi)給藥和球后注射方法：為維持小分子藥物在眼部的濃度，最大程度減小其被體內(nèi)蛋白酶降解引入的干擾，在小鼠生后第12天和第14天，均行結(jié)膜囊點(diǎn)眼或球后注射。結(jié)膜囊點(diǎn)眼方法基本同前，每次3μl/眼，10min一次，共頻點(diǎn)6次；球后注射采用胰島素針抽取25μl藥物溶液(500μm)或等體積pbs，在眶下緣中外1/3處，沿眶下壁垂直進(jìn)針約0.1cm，越過眼球赤道部后即斜向鼻上方，入針約0.1cm深，確定未刺入眼球內(nèi)后，回抽胰島素針無回血即可緩慢推入多肽藥物或pbs；注射后輕輕拔出針頭并墊以棉球輕壓眼球片刻，觀察有無球后出血現(xiàn)象(如眼瞼腫脹、眼球突出、運(yùn)動(dòng)受限等)。各組動(dòng)物在生后17d，即視網(wǎng)膜新生血管生成的高峰期處死取眼球，進(jìn)行血管內(nèi)皮染色及視網(wǎng)膜鋪片觀察。

3)視網(wǎng)膜的分離：將取出的眼球立即轉(zhuǎn)入作好標(biāo)記含4％多聚甲醛的培養(yǎng)皿中，室溫固定1～2h后取出。在體式顯微鏡低光下，顯微鑷夾持眼球周圍筋膜組織或視神經(jīng)以固定眼球位置，用1ml注射器針頭，自角鞏緣處向球心方向刺入眼球；拔出注射器針頭，用顯微剪刀沿注射器針孔處平行于角鞏膜緣方向環(huán)形剪開眼球，去除眼前節(jié)組織；在視網(wǎng)膜與其下脈絡(luò)膜鞏膜分離處鈍性分離色素上皮層、脈絡(luò)膜和鞏膜組織至后極部，在視神經(jīng)處，用顯微剪刀剪開視網(wǎng)膜與視神經(jīng)，分離出如小碗狀的視網(wǎng)膜；用小楷毛筆輕輕刷去殘留在視網(wǎng)膜上的色素顆粒和玻璃體。

4)小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性染色和視網(wǎng)膜鋪片：將分離出的視網(wǎng)膜浸于0.5％tritonx-100中，4℃過夜。染色前用pbs沖洗3遍。小心吸棄pbs，立即加入500μlalexafluor568conjugatedisolectinb4(10μg/ml)，避光保存，室溫?fù)u床過夜。pbs洗3～4遍，至少15min，之后將視網(wǎng)膜組織轉(zhuǎn)移至載玻片上(光感受器細(xì)胞面朝下)；用顯微剪刀將視網(wǎng)膜組織按照4個(gè)象限放射狀剪為4份(距視神經(jīng)至少1mm)，使視網(wǎng)膜能夠平鋪在載玻片上；滴加少量30％甘油封片。

5)影像分析及圖像處理：熒光顯微鏡下，觀察視網(wǎng)膜新生血管以及無灌注區(qū)的情況。所有熒光圖片均在統(tǒng)一的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)下攝片。每個(gè)視網(wǎng)膜拍攝4張重疊圖像，每個(gè)圖像包含一個(gè)象限，再通過視盤和主要的放射狀血管將這些圖像組合成完整的視網(wǎng)膜融合圖片。正常的視網(wǎng)膜血管為樹枝狀的淺、深層血管；新生血管簇則顯示為無定形、深染的團(tuán)狀物，突出遠(yuǎn)離正常的血管平面；缺血區(qū)或無灌注區(qū)呈無染色區(qū)。注意在分析過程中辨別操作過程中造成的破損、氣泡等人工偽跡。

(3)小鼠內(nèi)層視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù)

生后17天，取出小鼠眼球固定于4％多聚甲醛，24h后用0.01mpbs沖洗浸泡，去除角膜、晶狀體等眼前節(jié)組織；經(jīng)乙醇梯度脫水，制成石蠟標(biāo)本；每個(gè)小鼠視網(wǎng)膜沿矢狀位方向制作連續(xù)切片10張，切片間每間隔30μm取一5μm切片；切片脫蠟、復(fù)水；1％蘇木素染色10min，鹽酸酒精分化5sec，伊紅染色2min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，50％中性樹膠封片；顯微鏡下觀察并拍照，每張切片取4個(gè)非重疊視野，計(jì)數(shù)突破入視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)眼球10張切片的平均值即為該眼球視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(sd)表示，數(shù)據(jù)處理運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件spss22.0統(tǒng)計(jì)軟件包運(yùn)算(statisticalsoftware，losangeles，ca，usa)或graphpadprism(sandiego，ca，usa)。運(yùn)用two-tailedstudent’sttest進(jìn)行兩組間比較，運(yùn)用單因素方差分析(one-wayanova)進(jìn)行多組間變量分析比較，運(yùn)用tukey’smultiplecomparisontest進(jìn)行多重比較，p值小于0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

三、結(jié)果

1、cc12-kv11多肽對(duì)vegf誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有一定的抑制作用

如圖14所示，mts細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組(無vegf無多肽)平均od值為0.704±0.023；vegf(5ng/ml)組平均od值為0.814±0.025，與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，說明5ng/mlvegf能夠有效誘導(dǎo)huvecs增殖。

vegf+cc12-fitc多肽組在10μm、100μm濃度的平均od值分別為0.772±0.038、0.750±0.033，與vegf組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，說明較低濃度的cc12-fitc多肽不具有抑制vegf誘導(dǎo)huvecs細(xì)胞增殖的作用；而當(dāng)cc12-fitc多肽的濃度達(dá)200μm時(shí)，平均od值為0.694±0.017，與vegf組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，說明高濃度cc12-fitc可在一定程度上抑制vegf誘導(dǎo)的huvecs細(xì)胞增殖；vegf+kv11-fitc多肽(10μm～200μm)組平均od值分別為0.712±0.102、0.532±0.064、0.343±0.042，與vegf組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05或p<0.001)；vegf+cc12-kv11-fitc多肽(10μm～200μm)組平均od值為0.728±0.036、0.547±0.027、0.378±0.032，當(dāng)cc12-kv11-fitc濃度達(dá)到或超過50μm時(shí)，與vegf組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)，說明連接了穿膜肽后的多肽cc12-kv11-fitc多肽仍具有一定的抑制vegf誘導(dǎo)huvecs細(xì)胞增殖的作用。

vegf+ranizumab0.5mg/ml和5mg/ml組平均od值分別為0.615±0.034和0.520±0.027，與vegf組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)，說明ranizumab可以有效抑制vegf誘導(dǎo)的huvecs增殖。

由此可見，連接多肽cc12-kv11在濃度達(dá)到或超過50μm時(shí)，仍具有原多肽kv11抑制vegf誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。

2、cc12-kv11多肽能有效抑制vegf誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化

如圖15所示，vegf誘導(dǎo)huvecs趨化24h后，空白對(duì)照組(無vegf無多肽)平均10.70±6.075個(gè)細(xì)胞發(fā)生趨化，遷移至上室下表面；vegf(25ng/ml)組平均趨化細(xì)胞數(shù)量為177.1±26.07個(gè)，與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)，說明25ng/mlvegf能夠有效誘導(dǎo)huvecs發(fā)生趨化遷移。

vegf+cc12-fitc多肽組，在較高的濃度(100μm)時(shí)仍可見到較多的細(xì)胞趨化，趨化細(xì)胞數(shù)量為171.9±11.39個(gè)，與vegf組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，說明cc12多肽本身不具有抑制vegf誘導(dǎo)huvecs細(xì)胞趨化的作用。vegf+kv11-fitc多肽組，當(dāng)kv11多肽濃度在10μm～100μm范圍時(shí)，huvecs趨化細(xì)胞數(shù)量明顯減少，分別為111.9±18.7個(gè)、69.0±10.61個(gè)和46.40±11.35個(gè)，與vegf組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)，且100μmkv11多肽的抑制效果強(qiáng)于10μmkv11多肽，說明kv11多肽抑制vegf誘導(dǎo)huvecs細(xì)胞趨化的作用具有劑量依賴性；vegf+cc12-kv11-fitc多肽組，當(dāng)cc12-kv11多肽濃度在10μm～100μm范圍時(shí)，huvecs趨化細(xì)胞數(shù)量也逐漸減少，分別為123.7±12.10個(gè)、67.80±12.76個(gè)和50.30±13.21個(gè)，與vegf組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)，且cc2-kv11多肽抑制vegf誘導(dǎo)huvecs細(xì)胞趨化的作用同樣具有劑量依賴性。

vegf+ranizumab組，僅見少量細(xì)胞發(fā)生趨化遷移，0.5mg/ml和5mg/ml組huvecs趨化細(xì)胞數(shù)量分別為22.20±7.913和12.90±9.134，與vegf組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。

由此可見，cc12-kv11連接多肽與kv11多肽相比，在抑制vegf誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化方面的有效性相當(dāng)，并且同樣具有良好的劑量依賴性。

3、cc12-kv11多肽抑制vegf誘導(dǎo)的管腔樣結(jié)構(gòu)形成

huvecs接種到matrigel上6h后，空白對(duì)照組(無vegf無多肽)血管內(nèi)皮細(xì)胞排列形成管腔樣結(jié)構(gòu)少，vegf(15ng/ml)組管腔樣結(jié)構(gòu)形成明顯增多，彼此交錯(cuò)呈網(wǎng)狀，兩組間管腔形成長度相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)，表明15ng/mlvegf能夠有效誘導(dǎo)huvecs管腔樣結(jié)構(gòu)形成(圖16)。

將vegf組管腔樣結(jié)構(gòu)形成長度記為100％，vegf+kv11多肽組濃度為10μm時(shí)，huvecs管腔樣結(jié)構(gòu)形成相對(duì)長度為96.78％±14.30％，與vegf組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；當(dāng)kv11多肽濃度達(dá)到50μm及100μm時(shí)，huvecs管腔樣結(jié)構(gòu)形成依次減少，相對(duì)長度分別為49.30％±19.08％和38.96％±10.53％，與vegf組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)，說明kv11多肽能夠有效抑制vegf誘導(dǎo)huvecs細(xì)胞管腔形成，并且抑制作用具有劑量依賴性；同樣的，vegf+cc12-kv11多肽組濃度為10μm時(shí)，huvecs管腔樣結(jié)構(gòu)形成相對(duì)長度為87.83％±16.83％，與vegf組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；當(dāng)cc12-kv11多肽濃度達(dá)到50μm及100μm范圍內(nèi)時(shí)，huvecs管腔樣結(jié)構(gòu)形成依次減少，相對(duì)長度分別為52.10％±14.69％和40.96％±12.18％，與vegf組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。而vegf+cc12多肽組在較高濃度(100μm)時(shí)仍可見到較多的管腔樣結(jié)構(gòu)形成，相對(duì)管腔長度為83.59％±18.11％，與vegf組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，說明cc12多肽不具有抑制vegf誘導(dǎo)huvecs管腔形成的作用(圖16)。

vegf+ranizumab組，僅見少許管腔樣結(jié)構(gòu)形成，0.5mg/ml和5mg/ml組huvecs管腔形成的相對(duì)長度分別為45.50％±11.14％和24.93％±8.589％，與vegf組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。

基于上述結(jié)果，kv11、cc12-kv11多肽在50～100μm濃度均能有效抑制vegf誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔樣結(jié)構(gòu)形成，并且具有良好的劑量依賴性。

4、cc12-kv11多肽抑制雞胚尿囊膜新生血管

雞胚尿囊膜(chickchorioallantoicmembrane，cam)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖17所示。pbs組濾紙片周圍2.5mm范圍內(nèi)雞胚尿囊膜毛細(xì)血管生長良好(圖17a)，無明顯炎癥反應(yīng)，平均毛細(xì)血管數(shù)量為66.00±20.04。

cc12多肽50μg組，濾紙片周圍相同范圍內(nèi)雞胚尿囊膜毛細(xì)血管生長良好(圖17b)，平均毛細(xì)血管數(shù)量為67.10±14.99，與pbs組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。

kv11和cc12-kv11多肽10μg組，濾紙片周圍2.5mm范圍內(nèi)雞胚尿囊膜毛細(xì)血管數(shù)量減少(圖17c、17d)，平均毛細(xì)血管數(shù)量分別為42.73±11.30、37.09±7.08，與pbs組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05、p<0.001)；kv11和cc12-kv11多肽50μg組，濾紙片周圍2.5mm范圍內(nèi)雞胚尿囊膜毛細(xì)血管數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)部分無血管區(qū)(圖17e、17f)，平均毛細(xì)血管數(shù)量分別為39.90±7.80、36.18±8.26，與pbs組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001、p<0.01)。

由此可見，cc12-kv11多肽能夠有效抑制體內(nèi)新生血管的形成，并且具有一定的劑量依賴性。

5、cc12-kv11多肽抑制高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管

(1)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性染色觀察cc12-kv11多肽結(jié)膜囊內(nèi)給藥和球后注射抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管情況

模型組c57bl/6j小鼠自生后7天至12天被暴露于75％±2％的高氧環(huán)境中，之后轉(zhuǎn)回空氣中繼續(xù)飼養(yǎng)5天。在此期間，各組小鼠對(duì)處理耐受良好，未發(fā)現(xiàn)任何明顯的全身不良反應(yīng)。

alexafluor568conjugatedgriffoniasimplicifoia(bandeiraea)isolectinb4作為一種內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，能夠標(biāo)記最小的毛細(xì)血管和內(nèi)皮細(xì)胞，并除外周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。在isolectinb4染色的鋪片中，正常的視網(wǎng)膜血管分淺層和深層，淺層血管由呈放射狀分布的大血管和樹枝狀分布的小血管組成，深層血管則主要呈現(xiàn)樹枝狀分布。新生血管簇則顯示為無定形、深染的團(tuán)狀物，突出遠(yuǎn)離正常的血管平面；缺血區(qū)或無灌注區(qū)呈無染色區(qū)。

無論是結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼或是球后注射，空氣對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)均正常、排列規(guī)整，未見明顯視網(wǎng)膜無灌注區(qū)或新生血管簇等改變。

高氧pbs組小鼠視網(wǎng)膜可見無灌注(avascular，av)區(qū)，在無灌注區(qū)和周邊有灌注區(qū)交界處可見異常新生血管簇(neovasculartufts)和視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常(intraretinalmicrovascularabnomality，irma)；高氧+kv11多肽組小鼠視網(wǎng)膜也可見少量病理性新生血管簇、av、irma；與高氧+pbs組相比，高氧+cc12-kv11多肽組小鼠視網(wǎng)膜av面積明顯縮小，視網(wǎng)膜異常新生血管減少(圖18)。

結(jié)果表明，kv11經(jīng)點(diǎn)眼或球后注射的穿透眼屏障能力有限，其抑制病理性新生血管的效果弱于直接進(jìn)行玻璃體腔注射；而連接了穿膜肽的cc12-kv11多肽則能夠穿透眼屏障，抑制高氧后相對(duì)缺氧誘導(dǎo)的病理性新生血管，并可同時(shí)改善生理性的視網(wǎng)膜內(nèi)血管修復(fù)，其穿透能力和抗新生血管有效性再次得到印證。

(2)組織切片方法定量觀察cc12-kv11多肽抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管的情況

c57bl/6j小鼠視網(wǎng)膜組織切片he染色觀察并計(jì)數(shù)突出于內(nèi)界膜的有核細(xì)胞數(shù)結(jié)果如圖19所示。結(jié)膜囊內(nèi)給藥，空氣+pbs組突出于視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的有核細(xì)胞數(shù)為1.38±1.85個(gè)；高氧+pbs組可見大量突出于內(nèi)界膜長入玻璃體腔的血管內(nèi)皮有核細(xì)胞，排列成管腔樣結(jié)構(gòu)，突出于視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的有核細(xì)胞數(shù)為24.13±5.92個(gè)，顯著高于空氣+pbs組(p<0.001)，說明高氧能夠有效誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成。

高氧+kv11組仍可見不少突出于視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的有核細(xì)胞核，為20.38±3.58個(gè)，與高氧+pbs組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，考慮與kv11結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼給藥穿透能力有限有關(guān)。而高氧+cc12-kv11組僅見少量突出于內(nèi)界膜長入玻璃體腔的有核細(xì)胞，平均數(shù)量為16.50±4.24個(gè)，與高氧+pbs組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，說明cc12-kv11多肽通過結(jié)膜囊內(nèi)給藥能夠有效抑制高氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管。球后注射組的結(jié)果與上述結(jié)果相近，但cc12-kv11多肽抑制視網(wǎng)膜新生血管的效果優(yōu)于結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼(p<0.001)，結(jié)果如圖19所示。

結(jié)膜囊內(nèi)給藥或球后注射各多肽，均未發(fā)現(xiàn)任何視網(wǎng)膜毒性或炎性反應(yīng)，kv11多肽及其連結(jié)肽cc12-kv11在該給藥濃度具有良好的安全性。

四、實(shí)施例小結(jié)

目前新生血管的研究主要針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，其體外研究的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)包括mts細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、transwell細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)和matrigel細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)等。在本實(shí)施例中，本發(fā)明人采用了上述經(jīng)典的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了cc12肽與kv11通過-ggg-連接后，能夠有效抑制vegf誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移趨化和管腔形成，并且抑制作用具有良好的劑量依賴性。

ranibizumab(商品名lucentis)是人源化的抗vegf重組單克隆抗體，分子量約為48kda。其抗新生血管的主要機(jī)制為與vegf-a1、vegf-a2結(jié)合，從而阻止vegf與內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，進(jìn)而抑制vegf的生物活性，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔樣結(jié)構(gòu)形成，減少血管通透性，阻礙新生血管的形成。目前，玻璃體腔注射ranibizumab被廣泛應(yīng)用于治療視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管性疾病的研究，已被證明具有較好的抑制眼部新生血管的作用。因此本發(fā)明人選擇目前研究較廣泛的抗vegf抗體ranibizumab作為體外血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照組。

雖然體外實(shí)驗(yàn)中，cc12-kv11多肽在趨化和管腔形成方面抑制新生血管的效果稍差于ranibizumab，但是鑒于小分子多肽類藥物無可比擬的獨(dú)特優(yōu)勢：分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，可以通過體外固相化學(xué)合成，便于通過化學(xué)修飾來優(yōu)化藥物特性；對(duì)眼組織通透性強(qiáng)，眼部結(jié)膜囊內(nèi)給藥或球后注射后，可以迅速分布于眼部組織而發(fā)揮藥物作用，毒性低，極少誘發(fā)組織免疫反應(yīng)，安全性高，無內(nèi)毒素殘留等，本發(fā)明人認(rèn)為小分子cc12-kv11多肽是極具臨床應(yīng)用前景的新生血管抑制劑。

本實(shí)施例中，采用cam模型評(píng)估cc12-kv11多肽抑制體內(nèi)新生血管的效果，發(fā)現(xiàn)該多肽具有良好的抑制cam新生血管形成的作用，并且具有一定的劑量依賴性。而在oir新生血管動(dòng)物模型中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，不通過玻璃體腔注射的方式，cc12-kv11多肽也能通過結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼和球后注射的方法，有效抑制oir新生血管的生長，同時(shí)減少視網(wǎng)膜無灌注區(qū)，改善視網(wǎng)膜微血管，這一結(jié)果表明cc12-kv11多肽有望在dr、amd、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、缺血型rvo、腫瘤生長與轉(zhuǎn)移等新生血管性視網(wǎng)膜病變的治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且引起治療方式、給藥途徑的新變革。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，cc12-kv11進(jìn)入眼內(nèi)后不會(huì)影響正常的視網(wǎng)膜血管的構(gòu)建，具有良好的安全性。

但小分子多肽類藥物也存在半衰期短，在體內(nèi)容易被蛋白酶降解等局限性，因此往往需要反復(fù)給藥以維持有效的藥物濃度，達(dá)到較好的抑制體內(nèi)新生血管的作用。本實(shí)施例中，本發(fā)明人在c57bl/6j小鼠出生后第12天和第14天均給予結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼或球后注射，結(jié)果顯示cc12-kv11多肽能夠有效抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管的生長，而單純采用kv11多肽眼外給藥無法達(dá)到其眼內(nèi)玻璃體腔內(nèi)給藥的效果。

綜上，通過經(jīng)典的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)cam、oir新生血管動(dòng)物模型，證明連接上篩選出的cc12多肽后，cc12-kv11多肽仍能夠有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移趨化、管腔形成和新生血管的形成，且在眼部的通透性較kv11增強(qiáng)，是一種安全有效、給藥便捷的多肽類新生血管抑制劑。

實(shí)施例4、眼部引導(dǎo)肽cc12及其連接肽的安全性

在前面的實(shí)施例中，本發(fā)明人已通過多項(xiàng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)部分證實(shí)了眼部引導(dǎo)多肽及其連接肽cc12-kv11的安全性，本實(shí)施例中，本發(fā)明人進(jìn)一步采用光鏡和透射電鏡觀察神經(jīng)視網(wǎng)膜的顯微和超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變，并通過電生理技術(shù)視網(wǎng)膜電流圖(electroretinogram，erg)、視誘發(fā)電位(vep)評(píng)價(jià)球后注射給藥前后視神經(jīng)、視網(wǎng)膜的功能學(xué)變化。

并且，隨著人們對(duì)cpp分子機(jī)制理解的深入，cpp在多種疾病的藥物治療中的應(yīng)用也隨之?dāng)U展，并得到廣泛認(rèn)可。本實(shí)施例采用圓二色(ciculardichroism，cd)譜法對(duì)實(shí)驗(yàn)中涉及的多肽的三維空間構(gòu)型進(jìn)行進(jìn)一步研究，探索、解釋造成多肽眼部透過性差異的機(jī)理。

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.動(dòng)物

成年新西蘭白兔(2.5千克)：獲自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

spraguedawley大鼠(180-200克)：中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

二、方法

1.光鏡檢查

sd大鼠球后注射給藥后7天，處死取眼球，立即4℃固定于4％多聚甲醛中至少24h，并行全層平坦部切口以利于固定液的穿透。后置于蔗糖溶液中梯度脫水，方法同前。眼球在瞳孔至視神經(jīng)切開后行大體標(biāo)本觀察。組織經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋后，行5μm切片he染色，置于光鏡下觀察。

2.透射電鏡檢查

(1)取材和固定：sd大鼠球后注射給藥后7天，處死取眼球，4℃固定于2.5％戊二醛固定液，行全層平坦部切口以利于固定液的穿透。24h后，在冰上迅速去除前節(jié)和玻璃體，在每張視網(wǎng)膜的每個(gè)象限隨機(jī)選取一大小為3mm×2mm的樣本繼續(xù)在2.5％戊二醛中固定2h。0.1mpbs漂洗15min×3遍，4℃固定于1％鋨酸2h。0.1mpbs漂洗15min×3遍。

(2)脫水：將樣本依次浸入50％乙醇15min，70％乙醇(含3％醋酸鈾)15min，90％乙醇15min，90％乙醇和90％丙酮1：1混合液15min，90％丙酮15min，4℃脫水。最后室溫下再將標(biāo)本浸入純丙酮中15min，3遍。

(3)包埋和固化：室溫下，將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至純丙酮和618包埋混合液(體積比2：1)中處理3h，后轉(zhuǎn)至純丙酮和618包埋混合液(體積比1：2)中過夜。37℃轉(zhuǎn)至純618包埋液中包埋3h。置入烘箱內(nèi)，依次設(shè)置烘箱的溫度和時(shí)間：37℃過夜、45℃12h，60℃24h。

(4)切片、染色和電鏡觀察：采用超薄切片機(jī)(lkb-1)行50～60nm切片，3％醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。philipscm-120透射電鏡觀察攝片。

3.電生理檢查

(1)實(shí)驗(yàn)分組：新西蘭大白兔隨機(jī)分為如下幾組：cc12-fitc多肽組，kv11-fitc多肽組，cc12-kv11-fitc多肽組。每只動(dòng)物右眼球后注射多肽作為實(shí)驗(yàn)眼，左眼球后注射等體積的pbs作為對(duì)照眼。于給藥前(day0)和給藥后7天(day7)行明適應(yīng)、暗適應(yīng)erg和閃光vep檢查；

(2)給藥方法：新西蘭大白兔球后注射方法同前，多肽組藥物濃度為200mm。球后注射：采用1ml注射器抽取250μl多肽溶液，在眶下緣中外1/3處行球后注射，確定未刺入眼球內(nèi)后，回抽無回血即可緩慢推入多肽溶液；注射后輕輕拔出針頭并墊以棉球輕壓眼球片刻，觀察有無球后出血現(xiàn)象(如眼瞼腫脹、眼球突出、運(yùn)動(dòng)受限等)；

(3)erg檢查：為了檢測視網(wǎng)膜的功能改變，采用utas-e2000電生理儀記錄各組給藥前后erg的情況，包括暗適應(yīng)反應(yīng)(視桿反應(yīng)，rodresponse)、最大暗適應(yīng)反應(yīng)(視錐和視桿反應(yīng)，maximalresponse)和明適應(yīng)反應(yīng)(視錐反應(yīng)，coneresponse)。計(jì)算10個(gè)反應(yīng)b波振幅的平均值，比較實(shí)驗(yàn)眼和對(duì)照眼的振幅。

(4)vep檢查：進(jìn)行閃光vep檢查方法。測量比較各組vep波幅和潛伏期時(shí)間，并進(jìn)行給藥前后對(duì)比分析。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(sd)表示，數(shù)據(jù)處理運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件spss22.0統(tǒng)計(jì)軟件包運(yùn)算(statisticalsoftware，losangeles，ca，usa)或graphpadprism(sandiego，ca，usa)。運(yùn)用two-tailedstudent’sttest進(jìn)行兩組間比較，運(yùn)用單因素方差分析(one-wayanova)進(jìn)行多組間變量分析比較，運(yùn)用tukey’smultiplecomparisontest進(jìn)行多重比較，p值小于0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

三、結(jié)果

1、cc12及其連接多肽對(duì)正常大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜顯微結(jié)構(gòu)的影響

給藥后7天，光鏡檢查顯示各組多肽以200mm濃度給藥并未影響神經(jīng)視網(wǎng)膜的顯微結(jié)構(gòu)，視網(wǎng)膜組織形態(tài)正常、層次清晰，與正常對(duì)照組相比未發(fā)現(xiàn)任何明顯可見的區(qū)別。正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均未發(fā)現(xiàn)對(duì)視網(wǎng)膜存在任何毒性或炎性反應(yīng)，如圖20。

2、cc12及其連接多肽對(duì)正常大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜超顯微結(jié)構(gòu)的影響

給藥后7天，透射電鏡檢查顯示各組多肽對(duì)視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)無明顯影響，視網(wǎng)膜細(xì)胞排列緊密，自視細(xì)胞層至神經(jīng)纖維層細(xì)胞形態(tài)正常。在視細(xì)胞層(photoreceptorcells)，細(xì)胞輪廓清晰、連續(xù)，線粒體無明顯腫脹，嵴清晰；在內(nèi)層視網(wǎng)膜，如神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(ganglioncells)及其有髓神經(jīng)纖維、雙極細(xì)胞(bipolarcells)和müller均未見明顯水腫、空泡或斷裂等異常改變，如圖20。

3、cc12及其連接多肽對(duì)正常兔神經(jīng)視網(wǎng)膜功能的影響

對(duì)各組多肽處理前后的全視野閃光erg分析比較顯示，cc12、kv11和cc12-kv11多肽實(shí)驗(yàn)眼和pbs對(duì)照眼無顯著性差異(p>0.05)，且給藥前day0和給藥后day7，各組實(shí)驗(yàn)眼在視桿反應(yīng)、最大反應(yīng)和視錐反應(yīng)中的b波形態(tài)和振幅均未見明顯改變，與對(duì)照眼相比，ergb波振幅無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，如圖21。

erg檢查表明，cc12、kv11和cc12-kv11多肽給藥后，對(duì)正常兔視網(wǎng)膜功能無異常影響。

為了進(jìn)一步評(píng)估各組多肽對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或神經(jīng)顯微是否存在潛在毒性作用，本發(fā)明人進(jìn)行了閃光vep檢查。典型的vep波形表現(xiàn)為一個(gè)先出現(xiàn)的負(fù)波和隨之的正波，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，球后注射給藥前和給藥后7天所有多肽處理組及對(duì)照眼的反應(yīng)記錄中，均出現(xiàn)了典型的vep波，且給藥前后的波形和波幅、潛伏期等數(shù)據(jù)接近，提示多肽給藥后未影響視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或神經(jīng)纖維(表2)。因?qū)嶒?yàn)眼數(shù)目有限，故未進(jìn)行進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析。

表2、高濃度(200mm)多肽球后注射給藥前后各組vep的比較

四、實(shí)施例小結(jié)

在本實(shí)施例中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)正常大鼠眼球后注射小分子多肽cc12、kv11和cc12-kv11后，光鏡、透射電鏡檢查視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和超微形態(tài)均未見明顯異常變化。正常兔眼球后注射小分子多肽cc12、kv11和cc12-kv11后，視網(wǎng)膜電生理檢查兔眼神經(jīng)、視網(wǎng)膜功能也未見異常變化，證明了研究中涉及的小分子多肽眼內(nèi)應(yīng)用的安全性。

實(shí)施例5、眼部引導(dǎo)肽cc12的變體的眼屏障通透性的研究

基于眼部導(dǎo)肽cc12的良好的眼部通透性，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)其相關(guān)的變體也具有穿越眼屏障的功能。具體的實(shí)驗(yàn)方法參照實(shí)施例2中多肽眼內(nèi)分布的實(shí)施方法。使用的變體主要包括以下三種類型：

1，與cc12的氨基酸序列經(jīng)過1-3個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，如表3a-e序列；

2，與cc12所示的氨基酸序列有至少75％相同性，如表3a-e序列；

3，包含cc12至少8個(gè)連續(xù)氨基酸序列的多肽片段，如表3f-h序列。

表3、cc12的變體序列

*表中的序列一致性是基于embossneedle方法完成的；a-h的多肽序列與cc12多肽序列比較。

-代表氨基酸殘基的缺失。

以上cc12的變體通過fitc標(biāo)記后，經(jīng)球后注射或結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼后均可以在眼后段組織，如內(nèi)界膜、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、外叢狀層、內(nèi)核層和外核層上檢測到綠色熒光。

綜上所述，藥物的眼內(nèi)遞送至今仍是極具挑戰(zhàn)性和創(chuàng)新性的研究方向，本發(fā)明通過體內(nèi)高通量生物淘選的方式，發(fā)現(xiàn)了一種具有良好的眼部通透性的眼部引導(dǎo)多肽，且該多肽能夠攜帶具有明確生物學(xué)功能的多肽共同穿越眼屏障；連接多肽抑制體內(nèi)外新生血管效果良好且安全、無明顯毒副作用；本發(fā)明為增強(qiáng)多肽類新生血管抑制劑眼內(nèi)的藥物遞送，及其通過無創(chuàng)或微創(chuàng)的方式應(yīng)用于臨床治療新生血管相關(guān)性眼病奠定了基礎(chǔ)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。