本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及植物作為宿主在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用。

背景技術(shù)：

癌癥是世界各地死亡的主要原因，由于人口的增長和老齡化以及其他因素的普遍存在，如空氣，食品等污染，其發(fā)生率正在上升。在治療方法中，手術(shù)，化療和放射形照射依然是現(xiàn)階段治療各種腫瘤類型和階段的主要手段。然而，由于對腫瘤細胞缺乏選擇性，化療方法的成功率有限，且會導致全身毒性和耐藥性。放射性療法也不能全部殺死癌細胞，而且導致病人病體更加虛弱。因為癌細胞具有擴散性，手術(shù)可以切除發(fā)病部位，但是也不能阻擋癌細胞的傳播。目前較先進的療法是根據(jù)腫瘤細胞的分子特征，設計出更好的靶向治療來阻止其生長和傳播。這些療法中的大多數(shù)都是基于容易進入腫瘤細胞的小分子藥物或與其表面上的特定靶標結(jié)合的單克隆抗體(mab)。

基于mab的靶向治療是針對不同目標的免疫療法，例如阻斷致癌途徑，隨后對細胞生長和凋亡的影響，阻斷新血管形成，調(diào)節(jié)對腫瘤細胞的免疫應答，破骨細胞功能的調(diào)節(jié)或細胞毒性藥物的遞送來殺死腫瘤細胞。自從美國食品和藥物管理局(fda)批準第一種單克隆抗體以來，其中包括鼠，嵌合和人源化抗體在內(nèi)的數(shù)百種抗體已被開發(fā)用于癌癥治療。這些單克隆抗體中的一些已經(jīng)被fda批準，并且已經(jīng)可用于日常實踐中的臨床應用，作為單一療法或與標準化療方案組合，而許多其它單克隆抗體仍在不同的臨床試驗中進行測試。

pd-1抗體(pembrolizumab，anti-pd-1,)是一種人源化單克隆抗體，其也與pd-1受體結(jié)合，阻斷其與pd-l1和pd-l2配體的相互作用。在2014年被fda首次批準用于治療不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者疾病治療。2015年，獲得了其他兩個適應癥的批準；在10月份，被用于治療表達pd-l1的轉(zhuǎn)移性nsclc患者在含鉑化療后或其后進行疾病治療，在12月被用于治療不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者。最近在2016年10月，fda批準了基于腫瘤反應率和耐受性的加速批準，用于治療復發(fā)性或轉(zhuǎn)移性頭頸鱗狀細胞癌(hnscc)患者，用于鉑化學療法或后續(xù)的治療。pd-1抗體(keytruda)于2017年3月被批準用于治療霍奇金淋巴瘤(chl)。

pd-l1抗體(anti-pd-l1，阿替珠單抗，atezolizumab，tecentriq^tm)是一種結(jié)合pd-l1并阻斷其與pd-1和b7.1受體相互作用的fc工程化人源化單克隆抗體。它解決了pd-l1/pd-1介導的免疫應答的抑制，包括激活抗腫瘤免疫應答而不誘導抗體依賴性細胞毒性。anti-pd-l1(atezolizumab)于2016年被fda批準用于治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌患者，其在化療期間對轉(zhuǎn)移性癌細胞具有治療效果，并可用于化療后12個月內(nèi)的輔助治療。2016年10月，atezolizumab經(jīng)fda批準，化療期間或之后被用于治療egfr或alk基因組畸變治療的轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌(nscsc)患者。

由于pd-1和pd-l1抗體對癌細胞殺傷力明顯，可以顯著提高癌癥病人的存活率。且因為其廣譜的抗癌作用，fda也在加速批準該抗體對腎癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、血癌、頭頸癌、腸癌和腦瘤等癌癥的臨床二期或三期試驗。目前的pd-1和pd-l1抗體是利用哺乳動物細胞生產(chǎn)，然而其產(chǎn)量低，復雜加工，設備要求高等因素導致其難以滿足癌癥病人的大量需求。

現(xiàn)階段有利用動物細胞生產(chǎn)pd-1以及pd-l1單克隆抗體。但是動物細胞培養(yǎng)需要價格昂貴的培養(yǎng)液，嚴格的廠房條件，操作復雜，時間周期至少兩周，而且動物細胞生產(chǎn)能力低，造成成本極高。有時候動物細胞所帶的病毒可以侵染人類，造成安全性低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了植物作為宿主在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用。本發(fā)明利用植物尤其是生菜作為重組蛋白生產(chǎn)的高效平臺技術(shù)，表達了pd-1和pd-l1抗體。并且在溫和的條件下成功分離出有活性的外源蛋白，證明植物尤其是生菜表達平臺可以成功用來生產(chǎn)pd-1和pd-l1抗體蛋白。時間短(4d)，純化簡單，生產(chǎn)便捷。消除基因污染，消除感染人體的潛在病蟲害等。大大降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品安全性。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了植物作為宿主在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用。優(yōu)選的，所述抗體為單克隆抗體。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述植物選自生菜、煙草、白菜、水稻、玉米、大豆或小麥；所述植物的器官選自種子、葉、根莖或整株植物。本發(fā)明還提供了一種表達載體，包括以下各項中的任意一項以及載體：

ⅰ.pd-1的重鏈序列或輕鏈序列；

ⅱ.pd-l1的重鏈序列或輕鏈序列。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述pd-1的重鏈序列或輕鏈序列為將pd-1重鏈、pd-1輕鏈的密碼子優(yōu)化為植物偏好的密碼子，獲得的優(yōu)化的pd-1的重鏈序列或優(yōu)化的pd-1的輕鏈序列；

所述pd-l1的重鏈序列或輕鏈序列為將pd-l1重鏈、pd-l1輕鏈的密碼子優(yōu)化為植物偏好的密碼子，獲得的優(yōu)化的pd-l1的重鏈序列或優(yōu)化的pd-l1的輕鏈序列。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述優(yōu)化的pd-1的重鏈序列如seqidno.1所示；所述優(yōu)化的pd-1的重鏈的核苷酸序列如seqidno.2所示；

所述優(yōu)化的pd-1的輕鏈序列如seqidno.3所示；所述優(yōu)化的pd-1的輕鏈的核苷酸序列如seqidno.4所示；

所述優(yōu)化的pd-l1的重鏈序列如seqidno.5所示；所述優(yōu)化的pd-l1的重鏈的核苷酸序列如seqidno.6所示；

所述優(yōu)化的pd-l1的輕鏈序列如seqidno.7所示；所述優(yōu)化的pd-l1的輕鏈的核苷酸序列如seqidno.8所示。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述載體為雙元植物載體。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述表達載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：

步驟1：分別將pd-1重鏈、pd-1輕鏈、pd-l1重鏈、pd-l1輕鏈的密碼子優(yōu)化為植物偏好的密碼子，獲得：

ⅰ.優(yōu)化的pd-1的重鏈序列；

ⅱ.優(yōu)化的pd-1的輕鏈序列；

ⅲ.優(yōu)化的pd-l1的重鏈序列；

iv.優(yōu)化的pd-l1的輕鏈序列；

步驟2：在所述優(yōu)化的pd-1的重鏈序列或優(yōu)化的pd-l1的重鏈序列或優(yōu)化的pd-l1的輕鏈序列的5’末端分別加入xbal限制性酶切位點，在3’末端分別加入xhol位點；

在所述優(yōu)化的pd-1的輕鏈序列的5’末端加入xmal限制性酶切位點，在3’末端加入xhol位點；

由genecript克隆到puc57載體中，分別獲得ppd-1h，ppd-1l，ppd-l1h或ppd-l1l克隆載體；

步驟3：通過kpnl/sacl分別從步驟2所得的克隆載體中獲得基因片段，克隆至雙元植物載體pcam35s，分別獲得表達載體p35s-pd-1h，p35s-pd-1l，p35s-pd-l1h或p35s-pd-l1l。

具體的，為了提供外援蛋白在植物中的高效表達，本發(fā)明將人pd-1重鏈(genbankaccession號：5dk3_b)，輕鏈，(genbankaccession號：5dk3_a)pd-l1重鏈(genbankaccession號：aao17823.1)，輕鏈，(genbankaccession號：4dke_l)蛋白序列反翻譯軟件(https://www.idtdna.com/codonopt)將其其密碼子優(yōu)化為植物偏好的密碼子，由genescript公司(南京，中國)合成。在優(yōu)化的pd-1重鏈序列，以及pd-l1輕重鏈序列5’末端分別加入xbal限制性酶切位點，在3’末端分別加入xhol位點。在pd-1輕鏈序列5’末端分別加入xmal限制性酶切位點，在3’末端分別加入xhol位點。并由genecript克隆到puc57載體中(圖1)，分別生成ppd-1h，ppd-1l，ppd-l1h和ppd-l1l克隆載體。基因片段通過kpnl/sacl分別從克隆載體中分離，并克隆到雙元植物載體pcam35s，分別產(chǎn)生植物表達載體p35s-pd-1h，p35s-pd-1l，p35s-pd-l1h和p35s-pd-l1l。

本發(fā)明還提供了所述的表達載體在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用。

此外，本發(fā)明還提供了一種植物作為宿主表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體的方法，將本發(fā)明提供共的表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，通過農(nóng)桿菌介導真空滲透入植物組織后，提取、分離蛋白質(zhì)，獲得pd-1抗體和/或pd-l1抗體。

具體的，將四種植物表達載體p35s-pd-1h，p35s-pd-1l,p35s-pd-l1h和p35s-pd-l1l分別通過用multiporator(eppendorf，hamburg，germany)電穿孔轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌gv3101中。將所得菌株均勻地鋪展在含有卡那霉素抗生素(50mg/l)的選擇性lb平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取單菌落接種到0.5lyeb(酵母提取物肉湯，5g/l蔗糖，5g/l胰蛋白胨，6g/l酵母提取物，0.24g/lmgso4，ph7.2)并補充抗生素液體培養(yǎng)基(50mg/l卡那霉素)。將接種的培養(yǎng)物在振蕩器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通過添加yeb培養(yǎng)基測量od600值并調(diào)節(jié)至3.5～4.5。然后收集培養(yǎng)液，離心(4500轉(zhuǎn)速)10min。將農(nóng)桿菌細胞重懸在滲透培養(yǎng)基(10mmmes，10mmmgso4)中至o.d.600為0.5。

將制備好的含有p35s-pd-1h以及p35s-pd-1l農(nóng)桿菌等量混勻至o.d.600為0.5；同樣將含有p35s-pd-l1h以及p35s-pd-l1l的農(nóng)桿菌等量混勻至o.d.600為0.5。將培養(yǎng)懸浮液置于2l燒杯，并置于干燥器中。將本實驗室保存的生菜倒置(核心向上)并輕輕地旋轉(zhuǎn)于細菌懸浮液中，將干燥器密封。將真空泵(welchvacuum，niles，il，usa)打開以抽空，并且可見滲透液在葉片組織中。保持壓力狀態(tài)30～60s。快速打開該系統(tǒng)以釋放壓力，使?jié)B透液滲入組織內(nèi)的空間。該過程重復2～3次，直到清晰可見滲透液在生菜組織中擴散明顯。然后將生菜組織從滲透液中輕輕取出，并用蒸餾水連續(xù)沖洗三次，然后轉(zhuǎn)移到塑料膜覆蓋的容器中。將處理的樣品在黑暗中保持4d。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述農(nóng)桿菌介導真空滲透包括如下步驟：

步驟1：抽真空25～45s；

步驟2：保持真空(-95kpa)壓力30～60s；

步驟3：釋放壓力使得滲透液滲入所述植物組織；

重復上述步驟2～3次，避光處理4d。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，農(nóng)桿菌具體為根癌土壤桿菌gv3101。

本發(fā)明所述克隆ppd-1h，ppd-1l,ppd-l1h和ppd-l1l基因片段(圖2a，b)，并且構(gòu)建四種雙元植物表達載體p35s-pd-1h，p35s-pd-1l,p35s-pd-l1h和p35s-pd-l1l。在完成構(gòu)建體后，用特異性限制酶消化證實基因片段是完整的。滲透后，絕大多數(shù)生菜組織在真空浸潤過程中淹沒，除了堅固的中肋區(qū)域外，其余部分均在真空滲透4天后顯示淡黃褐色區(qū)域。

提取、分離蛋白質(zhì)具體為：將經(jīng)農(nóng)桿菌真空滲透的生菜樣品用攪拌器攪拌，并用體積比為1:1比例的提取緩沖液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巰基乙醇)攪拌機中高速勻漿1～2min。將勻漿物調(diào)節(jié)至ph8.0，用紗布過濾，過濾物在4℃以10,000g離心15min以除去細胞碎片。收集上清液，與硫酸銨(50％)混合，并在冰上搖動孵育60min。通過離心機(10,000g)在4℃下再次分離15min。將得到的上清液進行第二輪硫酸銨(70％)沉淀，冰上搖動懸浮60min，再次在4℃下以10,000g離心15min。然后，棄去上清液，將處理樣品沉淀蛋白質(zhì)溶于5ml緩沖液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10mmβ-巰基乙醇)中并在4℃下儲存。

sds-page凝膠電泳具體為：收集從農(nóng)桿菌真空滲透生菜提取的純化蛋白質(zhì)，取樣品(5μl)熱變性(95℃)加載緩沖液(biorad，hercules，ca，usa)在4-12％bis-trisplussds-變性凝膠(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑電泳。同樣，在非變性凝膠電泳中檢測抗體的親和程度。然后用考馬斯藍g250(biorad)染色后再次對凝膠進行拍照。

植物來源的重組蛋白質(zhì)的下游加工通常難于并且昂貴，因為纖維素細胞壁難以裂解以及次級植物代謝產(chǎn)物。我們用攪拌機攪拌勻漿，大大節(jié)省勻漿成本以及工藝。重組pd-1抗體以及pd-l1抗體經(jīng)過變性凝膠sds-page分離我們在泳道中觀察到估計分子量大約分別為23kda以及50kda條帶(圖3a)，符合pd-1以及pd-l1抗體輕重鏈的蛋白大小。在非變性的凝膠電泳中觀察到大約150kda(圖3b)的條帶，證明生菜重組輕重鏈成功的結(jié)合為抗體結(jié)構(gòu)，符合pd-1以及pd-l1的抗體蛋白分子量?；赽radford測定法和光密度測定對照組測定純化樣品的蛋白含量大約為0.72mg/g。

經(jīng)癌癥細胞抑制試驗驗證獲得的抗體，人非小細胞肺癌nsclc細胞系a549細胞在補充有10％fbs(gibco，usa)，100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的rpmi-1640培養(yǎng)基(gibco，usa)中生長。所有細胞在37℃的5％co2加濕氣氛中培養(yǎng)，每天更新培養(yǎng)基，并使用0.25％胰蛋白酶每三天傳代細胞。通過胰蛋白酶消化收集a549細胞，并以1×10⁶個細胞/ml的密度重懸浮，加入分別加入純化的10μgpd-1以及pd-l1抗體，72h后用膜聯(lián)蛋白v-熒光素異硫氰酸酯(fitc)和pi用于雙染以評估凋亡細胞的比例。

通過細胞實驗研究純化pd-1以及pd-l1抗體對人非小細胞肺癌(nsclc)細胞對的抑制。通過加入純化的重組pd-1以及pd-l1抗體培養(yǎng)nsclc細胞，在72h的時間點檢查細胞生長結(jié)果表明，沒有任何處理的nsclc細胞生長良好。相比之下，使用純化的重組pd-1以及pd-l1抗體培養(yǎng)的細胞大部分消失(圖4)。這些結(jié)果表明，通過生菜系統(tǒng)瞬間表達的外源pd-1以及pdl-1抗體具有生物學活性并且可以殺死nsclc細胞。結(jié)果表明，植物尤其生菜是一種生產(chǎn)pd-1以及pd-l1抗體的合適的生物反應器。

本發(fā)明利用生菜來瞬時表達pd-1以及pd-l1抗體，在較短的時間內(nèi)(4d)可產(chǎn)生高含量的蛋白質(zhì)。生菜是高等植物，可以進行翻譯后修飾過程，即表達的蛋白自動具有活性。而且這種方法最大限度地減少了生物安全問題，因為處理過的生菜組織通常是在完全封閉的設施或容器中開發(fā)，不存在生物污染問題。生菜基本不含有植物有毒物質(zhì)，而且其本身纖維少，利于下游的蛋白純化。利用生菜系統(tǒng)生產(chǎn)pd-1以及pd-l1單克隆抗體，可以大大縮短生產(chǎn)周期和生產(chǎn)成本。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示克隆載體puc57示意圖；

圖2(a)示pd-1植物雙元表達載體p35s-pd-1h(重鏈)以及p35s-pd-1l(輕鏈)構(gòu)建流程；利用限制性內(nèi)切酶(xbal/xhoi)雙酶切，從圖1克隆載體分別切下pd-1h重鏈，連接入pcam35s的xbal/xhol位點，生成植物雙元表達載體p35s-pd-1h；利用限制性內(nèi)切酶(xmal/xhoi)雙酶切，從圖1克隆載體分別切下pd-1h重鏈，連接入pcam35s的xmal/xhol位點，生成植物雙元表達載體p35s-pd-1l；

lbandrb:ti質(zhì)粒左右邊界；35s，具有煙草花葉病毒(tmv)5‘utr的camv35s啟動子；nptii，用于卡那霉素抗性的編碼nptii基因的表達；nos3’，終止子；

圖2(b)示pd-l1植物雙元表達載體p35s-pd-l1h(重鏈)以及p35s-pd-l1l(輕鏈)構(gòu)建流程；利用限制性內(nèi)切酶(xbal/xhoi)雙酶切，從圖1克隆載體分別切下pd-l1h以及pd-l1l輕重鏈片段，連接入pcam35s的xbai/xhoi位點，生成植物雙元表達載體p35s-pd-l1h以及p35s-pd-l1l；

lbandrb:ti質(zhì)粒左右邊界；35s，具有煙草花葉病毒(tmv)5‘utr的camv35s啟動子；nptii，用于卡那霉素抗性的編碼nptii基因的表達；nos3’，終止子；

圖3(a)示sds-page凝膠電泳結(jié)果；泳道1：pd-1重組抗體；泳道2：pd-l1重組抗體；

圖3(b)示非變性凝膠電泳結(jié)果；泳道3：pd-1重組抗體；泳道4：pd-l1重組抗體；

圖4示通過細胞實驗研究純化pd-1以及pd-l1抗體對人非小細胞肺癌(nsclc)細胞對的抑制。

具體實施方式

本發(fā)明公開了植物作為宿主在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，植物系統(tǒng)尤其是生菜系統(tǒng)是更加經(jīng)濟、高效的表達平臺，是一種快速的瞬時表達重組蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明描述的真空農(nóng)桿菌滲透方法簡單，快速，而且可以提高重組蛋白產(chǎn)量。生菜可以通過承受真空壓力而增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量，并允許每片葉子更完整的滲透。由于生菜易于生長并且可商業(yè)上大量生產(chǎn)，因此比其他瞬時表達植物，如煙草等更容易獲得并且更便宜，并且由于不需要復雜的特殊生產(chǎn)設備，成本可顯著降低。綜上所述，本發(fā)明可以利用生菜系統(tǒng)短時間內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)pd-1以及pd-l1單克隆抗體。

本發(fā)明提供的植物作為宿主在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用中所用原料及試劑均可由市場購得。

下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：

實施例1植物瞬時表達載體的構(gòu)建

為了提供外援蛋白在植物中的高效表達，將人pd-1重鏈(genbankaccession號：5dk3_b)，輕鏈，(genbankaccession號：5dk3_a)pd-l1重鏈(genbankaccession號：aao17823.1)，輕鏈，(genbankaccession號：4dke_l)蛋白序列反翻譯軟件(https://www.idtdna.com/codonopt)將其其密碼子優(yōu)化為植物偏好的密碼子，由genescript公司(南京，中國)合成。在優(yōu)化的pd-1重鏈序列，以及pd-l1輕重鏈序列5'末端分別加入xbal限制性酶切位點，在3'末端分別加入xhol位點。在pd-1輕鏈序列5'末端分別加入xmal限制性酶切位點，在3'末端分別加入xhol位點。并由genecript克隆到puc57載體中(圖1)，分別生成ppd-1h，ppd-1l,ppd-l1h和ppd-l1l克隆載體。基因片段通過kpnl/sacl分別從克隆載體中分離，并克隆到雙元植物載體，pcam35s，分別產(chǎn)生植物表達載體p35s-pd-1h，p35s-pd-1l,p35s-pd-l1h和p35s-pd-l1l。將四種植物表達載體分別通過用multiporator(eppendorf，hamburg，germany)電穿孔轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌gv3101中。將所得菌株均勻地鋪展在含有卡那霉素抗生素(50mg/l)的選擇性lb平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取單菌落接種到0.5lyeb(酵母提取物肉湯，5g/l蔗糖，5g/l胰蛋白胨，6g/l酵母提取物，0.24g/lmgso4，ph7.2)并補充抗生素液體培養(yǎng)基(50mg/l卡那霉素)。將接種的培養(yǎng)物在振蕩器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通過添加yeb培養(yǎng)基測量od600值并調(diào)節(jié)至3.5～4.5。然后收集培養(yǎng)液，離心(4500轉(zhuǎn)速)10min。將農(nóng)桿菌細胞重懸在滲透培養(yǎng)基(10mmmes，10mmmgso4)中至o.d.600為0.5。

克隆獲得ppd-1h，ppd-1l，ppd-l1h和ppd-l1l基因片段(圖2a，b)，并且構(gòu)建四種雙元植物表達載體p35s-pd-1h，p35s-pd-1l,p35s-pd-l1h和p35s-pd-l1l。在完成構(gòu)建體后，用特異性限制酶消化證實基因片段是完整的。滲透后，絕大多數(shù)生菜組織在真空浸潤過程中淹沒，除了堅固的中肋區(qū)域外，其余部分均在真空滲透4天后顯示淡黃褐色區(qū)域。

實施例2農(nóng)桿菌介導的真空滲透

將制備好的含有p35s-pd-1h以及p35s-pd-1l農(nóng)桿菌等量混勻至o.d.600為0.5；同樣將含有p35s-pd-l1h以及p35s-pd-l1l的農(nóng)桿菌等量混勻至o.d.600為0.5。將培養(yǎng)懸浮液置于2l燒杯，并置于干燥器中。將本實驗室保存的生菜倒置(核心向上)并輕輕地旋轉(zhuǎn)于細菌懸浮液中，將干燥器密封。將真空泵(welchvacuum，niles，il，usa)打開以抽空，并且可見滲透液在葉片組織中。保持壓力狀態(tài)30-60秒?？焖俅蜷_該系統(tǒng)以釋放壓力，使?jié)B透液滲入組織內(nèi)的空間。該過程重復2至3次，直到清晰可見滲透液在生菜組織中擴散明顯。然后將生菜組織從滲透液中輕輕取出，并用蒸餾水連續(xù)沖洗三次，然后轉(zhuǎn)移到塑料膜覆蓋的容器中。將處理的樣品在黑暗中保持4天。

實施例3蛋白質(zhì)提取和分離

經(jīng)農(nóng)桿菌真空滲透的生菜樣品用攪拌器攪拌，并用體積比為1:1比例的提取緩沖液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巰基乙醇)攪拌機中高速勻漿1-2分鐘。將勻漿物調(diào)節(jié)至ph8.0，用紗布過濾，過濾物在4℃以10,000g離心15分鐘以除去細胞碎片。收集上清液，與硫酸銨(50％)混合，并在冰上搖動孵育60分鐘。通過離心機(10,000g)在4℃下再次分離15分鐘。將得到的上清液進行第二輪硫酸銨(70％)沉淀，冰上搖動懸浮60分鐘，再次在4℃下以10,000g離心15分鐘。然后，棄去上清液，將處理樣品沉淀蛋白質(zhì)溶于5ml緩沖液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10mmβ-巰基乙醇)中并在4℃下儲存。

植物來源的重組蛋白質(zhì)的下游加工通常難于并且昂貴，因為纖維素細胞壁難以裂解以及次級植物代謝產(chǎn)物。我們用攪拌機攪拌勻漿，大大節(jié)省勻漿成本以及工藝。重組pd-1抗體以及pd-l1抗體經(jīng)過變性凝膠sds-page分離我們在泳道中觀察到估計分子量大約分別為23kda以及50kda條帶(圖3a)，符合pd-1以及pd-l1抗體輕重鏈的蛋白大小。在非變性的凝膠電泳中觀察到大約150kda(圖3b)的條帶，證明生菜重組輕重鏈成功的結(jié)合為抗體結(jié)構(gòu)，符合pd-1以及pd-l1的抗體蛋白分子量?；赽radford測定法和光密度測定對照組測定純化樣品的蛋白含量大約為0.72mg/g。

實施例4sds-page凝膠電泳

收集從農(nóng)桿菌真空滲透生菜提取的純化蛋白質(zhì)，取樣品(5μl)熱變性(95℃)加載緩沖液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％bis-trisplussds-變性凝膠(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑電泳。同樣，在非變性凝膠電泳中檢測抗體的親和程度。然后用考馬斯藍g250(biorad)染色后再次對凝膠進行拍照。

實施例5癌癥細胞抑制實驗

人非小細胞肺癌nsclc細胞系a549細胞在補充有10％fbs(gibco，usa)，100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的rpmi-1640培養(yǎng)基(gibco，usa)中生長。所有細胞在37℃的5％co2加濕氣氛中培養(yǎng)，每天更新培養(yǎng)基，并使用0.25％胰蛋白酶每三天傳代細胞。通過胰蛋白酶消化收集a549細胞，并以1×10⁶個細胞/ml的密度重懸浮，加入分別加入純化的10μgpd-1以及pd-l1抗體，72h后用膜聯(lián)蛋白v-熒光素異硫氰酸酯(fitc)和pi用于雙染以評估凋亡細胞的比例。

結(jié)果顯示，肺癌(nsclc)細胞對的抑制。通過加入純化的重組pd-1以及pd-l1抗體培養(yǎng)nsclc細胞，在72h的時間點檢查細胞生長結(jié)果表明，沒有任何處理的nsclc細胞生長良好。相比之下，使用純化的重組pd-1以及pd-l1抗體培養(yǎng)的細胞大部分消失(圖4)。這些結(jié)果表明，通過生菜系統(tǒng)瞬間表達的外源pd-1以及pdl-1抗體具有生物學活性并且可以殺死nsclc細胞。生菜系統(tǒng)是一種生產(chǎn)pd-1以及pd-l1抗體的合適的生物反應器。

實施例6

對照組：利用動物生產(chǎn)pd-1和pd-l1抗體；

實驗組1：本發(fā)明提供的植物生產(chǎn)pd-1和pd-l1抗體；

實驗組2：利用煙葉生產(chǎn)pd-1和pd-l1抗體；

表1pd-1以及pd-l1抗體

^*示與對照組相比p≤0.05；^**示與對照組相比p≤0.01；

^#示與實驗組2相比p≤0.05；^##示與實驗組2相比p≤0.01；

由表1可知，與對照組的動物系統(tǒng)相比，本發(fā)明提供的生菜瞬時表達pd-1和pd-l1抗體，極顯著(p≤0.01)縮短了生產(chǎn)周期，極顯著(p≤0.01)提高了蛋白含量，顯著(p≤0.05)提高了蛋白活性，簡化了蛋白純化的難易程度，極顯著(p≤0.01)降低了生產(chǎn)成本。

與實驗組2的煙葉系統(tǒng)相比，生菜瞬時表達pd-1和pd-l1抗體，顯著(p≤0.05)縮短了生產(chǎn)周期，顯著(p≤0.05)提高了蛋白含量，顯著(p≤0.05)提高了蛋白活性，簡化了蛋白純化的難易程度，極顯著(p≤0.01)降低了生產(chǎn)成本。

實驗組2與對照組相比，煙葉瞬時表達pd-1和pd-l1抗體比動物系統(tǒng)顯著(p≤0.05)縮短了生產(chǎn)周期，顯著(p≤0.05)提高了蛋白含量，顯著(p≤0.05)提高了蛋白活性，簡化了蛋白純化的難易程度，顯著(p≤0.05)降低了生產(chǎn)成本。

綜合上述試驗結(jié)果表明，植物系統(tǒng)尤其是生菜系統(tǒng)是更加經(jīng)濟、高效的表達平臺。能夠快速瞬時表達重組蛋白質(zhì)，可以在短時間內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)pd-1以及pd-l1單克隆抗體。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。

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<110>深圳惠升生物科技有限公司

<120>植物作為宿主在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用

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