一種妊娠特異性糖蛋白3標準品、其制備方法以及用于制備的重組菌的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種重組妊娠特異性糖蛋白3標準品、其制備方法以及用于制備的重組菌。
[0002]
【背景技術】
[0003]妊娠特異性糖蛋白(PregnancySpecific Glycoprotein, PSG)是一種胎盤多肽，自1971年德國科學家Bohn從人胎盤中分離提純以來，各國學者對其進行了廣泛的研究。發(fā)現(xiàn)PSG與早孕并發(fā)癥、宮內(nèi)胎兒生長狀況及消化道腫瘤疾病關系密切，對臨床上相關疾病的診斷具有指示作用。日本學者報道妊娠特異性糖蛋白l(Pregnancy SpecificGlycoprotein I，PSG1)可在子宮頸癌、子宮體癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤和和胃腸道惡性腫瘤患者的血中測出，進一步研究證實癌細胞漿中存在有PSGl的患者比沒有PSGl患者存活時間短。近年來對妊娠特異性糖蛋白3(Pregnancy Specific Glycoprotein 3，PSG3)的研究受到廣泛關注。PSG3是癌胚抗原(CEA)家族的成員，PSG3蛋白全長428個氨基酸，在胚胎發(fā)育的過程中同胚胎期免疫耐受的建立以及血管生成有關，同時該指標可應用于消化道腫瘤的診斷。
[0004]對于生物制品來說，其質(zhì)量評價的有效性指標多采用生物學方法，這些方法本身變異性較大，因此，標準品是生產(chǎn)中必不可少的組成部分，在生物制品標準化、質(zhì)量控制和效力評價中，標準品是藥品質(zhì)量評價的標尺，起著非常重要的作用。但實驗室現(xiàn)有的PSG3檢測試劑無標準品。而天然PSG3抗原在胎盤中含量又低、來源有限且純化過程較為繁瑣因此建立一種經(jīng)濟、高效的基因工程方法制備PSG3標準品蛋白就顯得尤為重要。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種制備PSG3標準品的重組菌及方法。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
一種制備妊娠特異性糖蛋白3標準品的方法，包括如下步驟:
(I)構建重組菌:將妊娠特異性糖蛋白3的編碼基因連接入基因的表達載體中，并將構建好的基因表達載體導入宿主大腸桿菌菌體中，構建重組菌;其中，編碼妊娠特異性糖蛋白3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008](2)重組菌發(fā)酵誘導培養(yǎng):將重組菌用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷進行發(fā)酵誘導培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；
(3)蛋白純化:將誘導后菌體破碎，取沉淀;經(jīng)蛋白純化即可得重組妊娠特異性糖蛋白3純化后蛋白洛液；
(4)蛋白標準品的獲得:向重組妊娠特異性糖蛋白3純化后蛋白溶液中加入凍干保護劑，經(jīng)真空冷凍干燥，即可制得重組妊娠特異性糖蛋白3標準品。
[0009]本發(fā)明所述的方法，步驟(I)所述基因的表達載體為ρΕΤ_30α。
[0010]本發(fā)明所述的方法，步驟(I)所述宿主大腸桿菌為Ε.coliJM109(DE3)。
[0011]本發(fā)明所述的方法，步驟(2)所述發(fā)酵誘導培養(yǎng)使用含標記物的LB培養(yǎng)基進行克隆培養(yǎng)。
[0012]本發(fā)明所述的方法，所述標記物為卡那青霉素。
[0013]本發(fā)明所述的方法，步驟(3)所述蛋白純化包括變復性純化、陰離子交換層析純化步驟。
[0014]利用權利要求1至6任一所述的方法制備的標準品，所述妊娠特異性糖蛋白3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0015]—種用于制備妊娠特異性糖蛋白3標準品的重組菌，所述重組菌是將妊娠特異性糖蛋白3的編碼基因連接入基因的表達載體中，并將構建好的基因表達載體導入宿主大腸桿菌菌體中得到的，且所述重組菌的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0016]本發(fā)明所述的重組菌，所述基因的表達載體為ρΕΤ_30α。
[0017]本發(fā)明所述的重組菌，所述宿主大腸桿菌為Ε.coliJM109(DE3)。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:
目前國際國內(nèi)均沒有重組PSG3的標準品，本發(fā)明提供一種重組PSG3蛋白生物學活性檢測用標準品的制備方法，為建立重組PSG3蛋白質(zhì)量標準奠定基礎;SDS-PAGE鑒定其純度為98%，相對分子量46kD，HPLC鑒定其純度為99.32% ；此外，本發(fā)明制得的重組PSG3的標準品為凍干制劑，2?8°C可長期保存，在低于25°C室溫下可保存兩年。
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【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明重組PSG3的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖:
其中，泳道M:蛋白Marker ；泳道I:純化后重組PSG3蛋白；
圖2為本發(fā)明重組PSG3的HPLC C18反相層析C蛋白純度檢測結(jié)果圖。
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【具體實施方式】
[0022]為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步描述，以下實施例僅是對本發(fā)明進行說明而非對其加以限定。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0023]1.構建重組菌:將PSG3的編碼基因連接入基因的表達載體ρΕΤ_30α中，并將構建好的基因表達載體pET-30a-PSG3導入宿主大腸桿菌E.coli JM109(DE3)菌體中，構建重組菌JM109(DE3)/pET-30a-PSG3;其中，編碼PSG3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，PSG3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，重組菌的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0024]2.PSG3蛋白溶液的制備
(2-1)將重組PSG3工程菌接種到含有卡那青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C恒溫培養(yǎng)12?24h，挑取克隆接種于3-5ml的LB培養(yǎng)基中，37°C恒溫搖床培養(yǎng)至OD6qq達到1.5?1.8，轉(zhuǎn)速為220r/min；
(2-2將(2-1)獲得的菌液1:100接種到100-2001111的1^培養(yǎng)基中，37°(3恒溫搖床培養(yǎng)至OD6OQ達到1.5?1.8，轉(zhuǎn)速為220r/min，得到發(fā)酵種子液；
(2-3)將配好的LB培養(yǎng)基加到發(fā)酵罐中，連接pH探針、溶氧探針進行原位滅菌，滅菌溫度為121°C，滅菌時間為20min;
(2-4)將發(fā)酵種子液1:100接種于發(fā)酵罐中LB培養(yǎng)基上，設置溫度為37°C、溶氧為30%、轉(zhuǎn)速為220?270r/min、pH為7.2??.4條件下發(fā)酵;當發(fā)酵罐內(nèi)的OD6qq達到1.0~1.2時，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為lmmol/L，調(diào)溫度至32°C，誘