從另選的蔗糖源制備葡聚糖聚合物的制作方法

文檔序號：11109571閱讀：1558來源：國知局

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于多糖合成領域。例如，本發(fā)明涉及利用未完全精制的蔗糖制備不溶性聚α-1，3-葡聚糖。

以電子方式遞交的序列表的引用

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背景技術(shù)：

受到利用酶法合成或微生物的基因工程尋找新結(jié)構(gòu)多糖愿望的驅(qū)使，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以生物降解且可以從可再生資源原料經(jīng)濟地制造的多糖。一種此類多糖是聚α-1，3-葡聚糖，一種特征為具有α-1，3-糖苷鍵的葡聚糖聚合物。

已經(jīng)通過使蔗糖的水性溶液與從唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)分離的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtf)接觸來分離聚α-1，3-葡聚糖(Simpson等人，Microbiology 141：1451-1460，1995)。美國專利7,000,000公開利用唾液鏈球菌gtfJ酶制備多糖纖維。這種纖維的聚合物中至少50％己糖單元是通過α-1，3-糖苷鍵連接。本發(fā)明所公開的聚合物當它在溶劑或包含溶劑的混合物中以高于臨界濃度的濃度溶解時形成液晶溶液。從這一溶液中紡出高度適用于紡織品的連續(xù)的、高強度的、棉花樣纖維，并且使用。

先前已經(jīng)利用白色精制蔗糖進行聚α-1，3-葡聚糖的酶法合成。因為這種形式的蔗糖相對昂貴，希望開發(fā)出利用未精制或以其它方式不完全精制的蔗糖合成聚α-1，3-葡聚糖的新型酶法工藝。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在一個實施方案中，本公開涉及一種反應溶液，所述溶液包含水、蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶，所述溶液合成不溶性聚α-1，3-葡聚糖，其具有至少50％的α-1，3糖苷鍵和至少100的重均聚合度(DP_w)，其中所述蔗糖是未精制或部分精制的。所述反應溶液的聚α-1，3-葡聚糖的收率是在所述反應溶液中轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的蔗糖的重量的至少7％。

在反應溶液的另一個實施方案中，蔗糖來自糖用甜菜，且尚未結(jié)晶。

在反應溶液的另一個實施方案中，蔗糖來自甘蔗，且(i)尚未結(jié)晶，或(ii)已經(jīng)利用不超過三個結(jié)晶步驟結(jié)晶。

在反應溶液的另一個實施方案中，蔗糖具有大于150的ICUMSA值。

在反應溶液的另一個實施方案中，反應溶液的相對反應速率為至少0.8，這是相對于包含水、白色精制蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶的反應溶液的反應速率而言。

在反應溶液的另一個實施方案中，由反應溶液制備的聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。

在另一個實施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：34具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在另一個實施方案中，本公開涉及一種用于制備聚α-1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括接觸水、蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶的步驟，其中蔗糖是未精制或部分精制的。所述接觸步驟中制備的聚α-1，3-葡聚糖具有至少50％的α-1，3糖苷鍵和至少100的重均聚合度(DP_w)。所述方法中制備的聚α-1，3-葡聚糖的收率是在所述接觸步驟中轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的蔗糖的重量的至少7％。所述方法任選地包括分離所述接觸步驟中制備的聚α-1，3-葡聚糖。

在另一個實施方案中，所述方法中使用的蔗糖來自糖用甜菜，且尚未結(jié)晶。

在另一個實施方案中，所述方法中使用的蔗糖來自甘蔗，且(i)尚未結(jié)晶，或(ii)已經(jīng)利用不超過三個結(jié)晶步驟結(jié)晶。

在另一個實施方案中，所述方法中使用的蔗糖具有大于150的ICUMSA值。

在另一個實施方案中，所述方法的接觸步驟中制備聚α-1，3-葡聚糖的相對反應速率為至少0.8，這是相對于使用白色精制蔗糖替代未精制或部分精制蔗糖時的接觸步驟的反應速率而言。

在另一個實施方案中，所述方法中任選地分離的聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。

在另一個實施方案中，所述方法中使用的葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：34具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在另一個實施方案中，本公開涉及通過以上方法制備的分離的聚α-1，3-葡聚糖，其中聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。

序列簡述

表1.核酸和蛋白質(zhì)序列識別號概述

具體實施方式

所有引用的專利和非專利文獻的公開全文以引用方式并入本文。

如本文所用，術(shù)語“發(fā)明”或“本發(fā)明所公開的”不旨在限制但一般適用于權(quán)利要求中所限定的或本文所述的任何發(fā)明。這些術(shù)語在本文中可互換使用。

術(shù)語“聚α-1，3-葡聚糖”、“α-1，3-葡聚糖聚合物”等在本文中可互換使用。聚α-1，3-葡聚糖是包含由糖苷鍵(即葡糖苷鍵)連接在一起的葡萄糖單體單元的聚合物，其中至少約50％的糖苷鍵是α-1，3-糖苷鍵。聚α-1，3-葡聚糖是一類多糖。如本文所用，術(shù)語“α-1，3-糖苷鍵”是指通過在鄰近α-D-葡萄糖環(huán)上的碳1和碳3彼此接合α-D-葡萄糖分子的一類共價鍵。

術(shù)語“糖苷鍵(glycosidic linkage)”和“糖苷鍵(glycosidic bond)”在本文中可以互換使用，且是指將碳水化合物(糖)分子接合至另一基團諸如另一碳水化合物的一類共價鍵。如本文所用，術(shù)語“α-1，3-糖苷鍵”是指通過在鄰近α-D-葡萄糖環(huán)上的碳1和碳3彼此接合α-D-葡萄糖分子的一類共價鍵。

“α-D-葡萄糖”在本文中也可以指“葡萄糖”。

術(shù)語“蔗糖”在本文中指由通過α-1，2-糖苷鍵連接的α-D-葡萄糖分子和β-D-果糖分子組成的非還原二糖。已知蔗糖常作為食糖。

“白色精制”蔗糖在本文中是指包含至少99.0重量％蔗糖的蔗糖。此外或另選地，白色精制蔗糖可以指具有150或更小(例如，45或更小)的ICUMSA值、99.70％的最小偏振和/或至少87.0的L*值的蔗糖。

“ICUMSA”(國際食糖統(tǒng)一分析法委員會)值或“標準ICUMSA”值是用于表示溶液中蔗糖樣品純度的國際單位，且與蔗糖的顏色直接相關(guān)。蔗糖樣品的ICUMSA值越大，蔗糖樣品越深。測定蔗糖樣品的ICUMSA值的方法是本領域中所熟知的，且由國際食糖統(tǒng)一分析法委員會公開在例如ICUMSA Methods of Sugar Analvsis：Official and Tentative MethodsRecommended by the International Commission for Uniform Methods of SugarAnalysis(ICUMSA)(Ed.H.C.S.de Whalley，Elsevier Pub.Co.，1964)中，該文獻以引用的方式并入本文。ICUMSA可以例如通過如由R.J.McCowage、R.M.Urquhart和M.L.Burge(Determination of the Solution Colour of Raw Sugars，Brown Sugars and Coloured Syrups at pH 7.0-Official，Verlag Dr Albert Bartens，2011 revision)所述的ICUMSA方法GS1/3-7測定，該文獻以引用的方式并入本文。ICUMSA值可以表示為“參考基本單位”(RBU)。

本文的ICUMSA值可以通過極其類似于ICUMSA方法GS1/3-7的方法測定，但不同的是利用醋酸纖維素過濾器替代硝酸纖維素過濾器。因此，本文所公開的ICUMSA值可以另外稱作“改良ICUMSA”值?？紤]到ICUMSA是如何測定的，應理解，本文針對固體糖樣品(例如，原蔗糖)提供的ICUMSA值是利用糖樣品的水性溶液(約200g/L)獲得的。

蔗糖樣品的“偏振”(“pol”)在本文中稱為樣品中的表觀蔗糖含量，表示為通過在20℃下穿過含蔗糖樣品的溶液的偏振光的旋光度測量的質(zhì)量百分比。蔗糖樣品的偏振越大，樣品中的蔗糖純度越大。

“未完全精制的”蔗糖(“不完全精制的”蔗糖)在本文中稱為尚未加工成白色精制蔗糖的蔗糖。因此，不完全精制的蔗糖可以是完全未精制或部分精制的。未精制蔗糖的示例是“原蔗糖”(“原糖”)和它的溶液。部分精制的蔗糖的示例尚未經(jīng)歷一個、兩個、三個或更多個結(jié)晶步驟。不完全精制的蔗糖的ICUMSA在本文中大于150。

術(shù)語蔗糖“結(jié)晶”“結(jié)晶步驟”、“分步結(jié)晶”等在本文中可互換使用，且是指從含不完全精制的蔗糖的溶液結(jié)晶出蔗糖，并從上清液(母液)分離蔗糖晶體的過程。由這個過程產(chǎn)生的晶體通常代表比在結(jié)晶步驟之前存在的蔗糖純的蔗糖。然而，需要重點注意的是，已經(jīng)經(jīng)歷一個、兩個、三個或更多個結(jié)晶步驟的不完全精制的蔗糖仍然可以構(gòu)成不完全精制的蔗糖(即，結(jié)晶蔗糖可以不具有白色精制蔗糖的純度)。蔗糖通常需要三個或更多個結(jié)晶步驟來制備白色精制糖，而甜菜汁在一些實施方案中可能只需要一個結(jié)晶步驟就可以達到這種純度。本領域中已知用于使蔗糖結(jié)晶的各種方式，諸如蒸發(fā)、沸騰和/或真空干燥工藝。

如本文中所用，術(shù)語“L*值”是指由國際照明委員會(CIE，Vienna，Austria)指定的CIE 1976(L*，a*，b*)(“CIELAB”)三維色彩空間的明度分量。L*a*b*色彩空間的三個坐標分別代表固體顏色的明度(L*＝0指黑色，且L*＝100指漫射白色)、對象沿著紅色/品紅色與綠色間的標度的顏色(a*，負值指綠色，而正值指品紅色)和對象沿著黃色與藍色間的標度的顏色(b*，負值指藍色，且正值指黃色)。用于指對象的L*a*b*色彩空間的星號(*)的發(fā)音為“星號”(例如，L*是“L-星號”)，且作用是將這個色彩空間與Hunter的L，a，b色彩系統(tǒng)區(qū)分開來。對象的CIELAB色彩空間的L*、a*和b*分量可以利用J.Schwiegerling(Field Guide to Visualand Ophthalmic Optics，SPIE Press，Bellingham，WA，2004)所公開的公式計算，該文獻以引用的方式并入本文。L*、a*、b*值在本文中是針對固體材料諸如干燥蔗糖或干燥聚α-1，3-葡聚糖來說。

如本文所用，“干燥”蔗糖可以表征含不超過2.0、1.5、1.0、0.5、0.25、0.10、0.05或0.01重量％水的蔗糖。

聚α-1，3-葡聚糖的“分子量”在本文中可以表示為數(shù)均分子量(M_n)或重均分子量(M_w)。另選地，分子量可以表示為道爾頓、克/摩爾、DP_w(重均聚合度)或DP_n(數(shù)均聚合度)。本領域中已知用于計算這些分子量測量值的各種方式，諸如利用高壓液相色譜法(HPLC)、尺寸排阻色譜法(SEC)或凝膠滲透色譜法(GPC)。

術(shù)語“葡糖基轉(zhuǎn)移酶”、“gtf酶”、“gtf酶催化劑”、“gtf”、“葡聚糖蔗糖酶”等在本文中可互換使用。本文gtf酶的活性催化底物蔗糖反應以制備產(chǎn)物聚α-1，3-葡聚糖和果糖。gtf反應的其它產(chǎn)物(副產(chǎn)物)可以包括葡萄糖(當葡萄糖從葡糖基-gtf酶中間復合物水解時產(chǎn)生)、各種可溶性低聚糖(例如，DP2-DP7)和明串珠菌二糖(當葡糖基-gtf酶中間復合物的葡萄糖連接至果糖時產(chǎn)生)。明串珠菌二糖是由通過α-1，5鍵連接的葡萄糖和果糖組成的二糖。野生型形式的葡糖基轉(zhuǎn)移酶通常包含(在N-末端至C-末端方向上)信號肽、可變結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和葡聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本文的gtf根據(jù)CAZy(碳水化合物活性酶)數(shù)據(jù)庫(Cantarel等人，Nucleic Acids Res.37：D233-238，2009)歸類在配糖水解酶家族70(GH70)下。

如本文所用，“反應溶液”通常是指包含蔗糖、水、至少一種活性葡糖基轉(zhuǎn)移酶、和可選的其它組分的溶液。另選地，反應溶液可以在本文中稱為例如“葡聚糖合成反應”、“葡聚糖反應”或“gtf反應”。可用在葡聚糖合成反應中的其它組分包括果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖和可溶性低聚糖(例如，DP2-DP7)。應當理解，某些葡聚糖產(chǎn)物(諸如聚合度(DP)為至少8或9的聚α-1，3-葡聚糖)是水不溶性的，且因此在葡聚糖合成反應中不溶解，而是存在于溶液之外。正是在反應溶液中進行使水、蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸的步驟。如本文所用，術(shù)語“在合適反應條件下”是指支持蔗糖通過葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性轉(zhuǎn)化為聚α-1，3-葡聚糖的反應條件。

如本文所用，“對照”反應溶液可以指包含白色精制蔗糖而非不完全精制的蔗糖的反應溶液。對照反應溶液的所有其它特征(例如，蔗糖濃度、溫度、pH、gtf類型)可以與所比較的反應溶液相同。

葡聚糖合成反應的“干燥固體百分比”是指葡聚糖合成反應中所有糖的重量％。gtf反應的干燥固體百分比可以例如基于用于制備反應的蔗糖的量計算。

本文反應溶液的聚α-1，3-葡聚糖的“收率”表示聚α-1，3-葡聚糖產(chǎn)物的重量，表示為反應中被轉(zhuǎn)化的蔗糖底物的重量百分比。例如，如果反應溶液中100g蔗糖轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，且10g產(chǎn)物是聚α-1，3-葡聚糖，那么聚α-1，3-葡聚糖的收率將是10％。這個收率計算可以視為反應針對聚α-1，3-葡聚糖的選擇性的量度。

如本文所用，術(shù)語“相對反應速率”是指特定葡聚糖合成反應與另一種葡聚糖合成反應相比的速率。例如，如果反應A的速率為x，且反應B的速率為y，那么反應A相對于反應B的反應速率的相對反應速率可以表示為x/y(x除以y)。術(shù)語“反應速率”和“反應的速率”在本文中可以互換地指代在單位時間內(nèi)每單位酶下，反應物的濃度/量的變化或者產(chǎn)物的濃度/量的變化。葡聚糖合成反應在本文中的優(yōu)選反應物和產(chǎn)物分別是蔗糖和聚α-1，3-葡聚糖。

本文葡聚糖合成反應的“餾分”是指葡聚糖合成反應的液體溶液部分。餾分可以是葡聚糖合成反應的一部分或全部液體溶液，且已經(jīng)從反應中合成的固體葡聚糖產(chǎn)物分離出來。餾分也可以稱為“母液”。餾分的示例是葡聚糖合成反應的濾液。因為餾分可以包含溶解的糖，諸如蔗糖、果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、可溶性低聚糖(例如，DP2-DP7)，餾分也可以稱為來源于葡聚糖合成反應的“混合糖溶液”。

術(shù)語“濾液”、“葡聚糖反應濾液”、“葡聚糖濾液”等在本文中可互換使用，且是指已經(jīng)從葡聚糖合成反應中合成的固體葡聚糖產(chǎn)物過濾出的餾分。

術(shù)語“體積％”、“體積百分比”、“vol％”、“體積/體積％”等在本文中可互換使用。溶液中溶質(zhì)的體積％可以利用下式測定：[(溶質(zhì)體積)/(溶液體積)]×100％。

術(shù)語“重量％”、“重量百分比(wt％)”以及“重量-重量百分比(重量/重量％)”等在本文中可互換使用。重量％是指物質(zhì)在其被包含在組合物、混合物或溶液中時以質(zhì)量計的百分比。

術(shù)語“提高的”、“增強的”和“改善的”在本文中可互換使用。這些術(shù)語是指更大的數(shù)量或活性，諸如略大于原始數(shù)量或活性的數(shù)量或活性、或大大超出原始數(shù)量或活性的數(shù)量或活性，且包括其間的所有數(shù)量或活性。另選地，這些術(shù)語可以指例如該數(shù)量或活性與和它相比較的數(shù)量或活性相比，提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

如本文所用，相對于多核苷酸或多肽序列的術(shù)語“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比較窗范圍為獲得最大對應而比對時兩條序列中相同的核酸堿基或氨基酸殘基。因此，“序列同一性百分比”或“同一性百分比”指通過在比較窗口上比較兩個最佳比對的序列而測定的值，其中在與參考序列(其不包含添加或缺失)進行比較時，比較窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失(即缺口)以實現(xiàn)兩個序列的最佳比對。通過以下方式計算這種百分比：確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。

在National Center for Biotechnology Information(NCBI)網(wǎng)站在線可用的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)算法可用于例如測量本文所公開的兩個或更多個多核苷酸序列(BLASTN算法)或多肽序列(BLASTP算法)之間的百分比同一性。另選地，序列間的百分比同一性可使用Clustal算法(例如ClustalW或ClustalV)進行計算。對于使用Clustal比對方法的多重比對，默認值可對應于GAP PENALTY＝10、以及GAP LENGTH PENALTY＝10。用Clustal方法進行成對比對和蛋白質(zhì)序列的百分比同一性計算的默認參數(shù)可為KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5、以及DIAGONALS SAVED＝5。對于核酸，這些參數(shù)可為KTUPLE＝2，GAP PENALTY＝5，WINDOW＝4、以及DIAGONALS SAVED＝4。另選地，序列間的百分比同一性可以利用EMBOSS算法(例如，needle)進行，其中參數(shù)諸如GAP OPEN＝10、GAP EXTEND＝0.5、END GAP PENALTY＝false、END GAP OPEN＝10、END GAP EXTEND＝0.5，利用BLOSUM矩陣(例如，BLOSUM62)。

本文公開了多種多核苷酸和多肽序列作為某些實施方案的特征?？墒褂门c本文所公開的序列具有至少約70-85％、85-90％或90％-95％同一性的這些序列的變體。另選地，變體氨基酸序列可與本文所公開的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。變體核苷酸或氨基酸序列具有與本發(fā)明所公開的序列相同的功能/活性，或者具有本發(fā)明所公開的序列的至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的功能/活性。

如某些實施方案中所用，術(shù)語“分離的”是指完全從其原始來源分離的任何細胞組分(例如，分離的多核苷酸或多肽分子)。在一些情況下，分離的多核苷酸或多肽分子是較大組合物、緩沖體系或試劑混合物的一部分。例如，分離的多核苷酸或多肽分子可以異源方式包含在細胞或生物內(nèi)。其它的示例是分離的葡糖基轉(zhuǎn)移酶和分離的聚α-1，3-葡聚糖。據(jù)信，本文所公開的葡糖基轉(zhuǎn)移酶反應過程是合成、非天然存在的過程。

本公開的實施方案涉及一種反應溶液，所述反應溶液包含至少水、蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶，所述反應溶液合成不溶性聚α-1，3-葡聚糖，其具有至少50％的α-1，3糖苷鍵和至少100的重均聚合度(DP_w)，其中所述蔗糖是未精制或部分精制的(即，未完全精制的)。反應溶液制備具有至少50％的α-1，3糖苷鍵和至少100的DP_w的不溶性聚α-1，3-葡聚糖。所述反應溶液的聚α-1，3-葡聚糖的收率是在所述反應溶液中轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的蔗糖的重量的至少7％。

顯著地，這種反應溶液的實施方案制備收率和分子量與通過使用白色精制蔗糖而非不完全精制的蔗糖的反應溶液制備的葡聚糖收率和分子量相當?shù)木郐?1，3-葡聚糖。這些結(jié)果表明，不完全精制的蔗糖中存在的污染物一般不會阻礙它通過葡糖基轉(zhuǎn)移酶用于使聚α-1，3-葡聚糖聚合。

未完全精制的蔗糖可以用在當前公開的反應溶液中。此類蔗糖尚未加工成白色精制蔗糖。示例包括含原蔗糖(原糖)的未精制蔗糖組合物?？捎糜诒疚闹械钠渌问降牟煌耆频恼崽前ㄒ韵滦问剑簛碓从诶绺收?甘蔗屬物種(Saccharum spp.)，諸如甘蔗(S.officenarum))、糖用甜菜(甜菜屬物種(Beta spp.)，諸如甜菜(B.vulgaris))(也可以在本文中稱為“beet”)、棗椰(date palm)(海棗(Phoenix dactylifera))、高粱(高粱屬物種(Sorghum spp.)，諸如高粱(S.vulgare)和雙色高粱(S.bicolor))、糖楓(sugar maple)(糖槭(Acer saccharum))、木薯(cassava)(木薯(Manihot esculenta))或玉米的蔗糖。甘蔗和/或糖用甜菜的蔗糖的不完全精制形式可以用在本文中的優(yōu)選實施方案中。甘蔗汁中含約20％蔗糖，而糖用甜菜汁中含約10％至15％蔗糖。

在某些實施方案中，不完全精制的蔗糖可以來自產(chǎn)蔗糖和任選地種植用于產(chǎn)蔗糖的植物。此類植物(諸如上文所列的那些)可以來自世界上通常種植植物的任何地區(qū)。例如，本文的蔗糖可以來自種植在南美洲(例如，巴西、哥倫比亞、阿根廷、圭亞那)、北美洲(例如，美國、墨西哥、西印度群島、中美洲[例如，伯利茲城])、澳洲、亞洲(例如，印度、中國、俄羅斯、土耳其、泰國、巴基斯坦、菲律賓、印度尼西亞)、非洲(例如，埃及、莫桑比克、津巴布韋)和歐洲(例如，法國、德國、烏克蘭、俄羅斯、土耳其)的植物。

不完全精制的蔗糖可以作為在從含蔗糖的植物(例如，甘蔗或糖用甜菜)的汁純化蔗糖工藝的任何階段獲得的組合物提供。此類工藝公開在例如Handbook of Sugar Refining：A Manual for the Design and Operation of SugarRefining Facilities(Ed.C.C.Chou，John Wiley&Sons，Inc.，2000)、Chen and Chou(Cane Sugar Handbook：A Manual for Cane Sugar Manufacturers and TheirChemists，第12版，John Wiley&Sons，Inc.，1993)和Asadi(Beet-SugarHandbook，第1版，Wiley-Interscience，2006)中，這些文獻全部以引用的方式并入本文。如下討論來自這些參考文獻的一些優(yōu)選組合物和工藝。

本文的不完全精制的蔗糖可以作為蔗糖-純化工藝的任何步驟所產(chǎn)生的組合物提供，諸如(i)初始提取(例如，熱水提取)植物材料的“原汁”；(ii)通過碳酸化純化汁(即，利用石灰和二氧化碳形成使雜質(zhì)共沉淀的碳酸鈣沉淀物)，得到“稀汁”；(iii)蒸發(fā)稀汁的水，得到“濃汁”，和/或(iv)使?jié)庵序v或進行真空濃縮，以使蔗糖結(jié)晶(此類一次結(jié)晶蔗糖通常不是白色精制糖)(可以例如通過離心從上清液去除晶體)。例如，在某些實施方案中，步驟(i)和(ii)的產(chǎn)物可以在進一步加工前過濾。結(jié)晶(iv)的上清液可以再循環(huán)，并與其它上清液和/或濃汁混合，然后使它經(jīng)歷結(jié)晶(得到如步驟[iv]中的晶體，它們也可以用在本文中)。上清液的再循環(huán)最終得到“糖蜜”。因此，不完全精制的蔗糖可以作為原汁、稀汁、濃汁、糖蜜和/或已經(jīng)經(jīng)歷例如不超過一次結(jié)晶的蔗糖晶體提供。這些形式的不完全精制的蔗糖和用于獲得它們的相應工藝步驟優(yōu)選地表征從糖用甜菜獲得的不完全精制的蔗糖的示例，而且可以表征從其它來源諸如甘蔗獲得的蔗糖。

可用在本文中的來自糖用甜菜的不完全精制的蔗糖的示例包括甜菜原汁、甜菜稀汁(含約10重量％-20重量％蔗糖)、甜菜濃汁(含約60重量％-90重量％蔗糖)和糖用甜菜糖蜜(約50重量％-60重量％蔗糖)。在某些實施方案中使用甜菜稀汁和/或濃汁。本文的ICUMSA值：例如對于甜菜稀汁可以是至少1000(例如，～1000-1300)，對于甜菜濃汁可以是至少1300(例如，～1300-1800)，和/或?qū)τ谔鸩颂敲劭梢允侵辽?0000(例如，～50000-60000)。

另選地，本文的不完全精制的蔗糖可以是“原蔗糖”(“原糖”)，它是通過去除原汁的所有水提供(即，原蔗糖是固體)。另選地，本文的不完全精制的蔗糖可以是“VHP蔗糖”(“VHP”、“VHP糖”、“極高偏振”蔗糖)，它是如下提供：首先碳酸化，并過濾原汁，接著蒸發(fā)原汁，以使其中蔗糖的一部分結(jié)晶；從上清液去除的結(jié)晶蔗糖是VHP蔗糖。因此，VHP蔗糖已經(jīng)經(jīng)歷一次結(jié)晶。另選地，本文的不完全精制的蔗糖可以是“VVHP蔗糖”(“VVHP”、“VVHP糖”、“極其極其高偏振”蔗糖)，它是通過將VHP蔗糖溶解在水中，并使蔗糖重結(jié)晶而提供。因此，VVHP蔗糖已經(jīng)經(jīng)歷兩次結(jié)晶。這些形式的不完全精制的蔗糖(原蔗糖、VHP、VVHP)和用于獲得它們的相應工藝步驟優(yōu)選地表征從甘蔗獲得的不完全精制的蔗糖的示例，而且可以表征從其它來源諸如糖用甜菜獲得的蔗糖。

本文的原蔗糖(例如，“原蔗糖”)可以具有94％至97％的偏振值、約600至1200的ICUMSA值和/或低于87.0(例如，小于85、80、75、70、65、60、55或50)的L*值，應當理解，原蔗糖不是“紅糖”，紅糖是混合糖蜜糖漿與白色精制糖，接著干燥所得的產(chǎn)物。本文的VHP蔗糖可以具有例如至少99.30％的偏振值和/或約300至1000的ICUMSA值。VHP蔗糖可以任選地具有以下特性中的任一種：0.15％最大含水量、0.15％最大灰分含量、97％水中溶解度和/或金棕色。本文的VVHP蔗糖可以具有例如至少99.50％的偏振值和/或超過150至約400的ICUMSA值。

本文的不完全精制的蔗糖不是白色精制蔗糖。白色精制蔗糖在本文中是指含至少99.0重量％蔗糖(例如，至少99.5重量％或99.9重量％)的蔗糖。此外或另選地，白色精制蔗糖可以指具有150或更小(例如，45或更小)的ICUMSA值、99.70％(例如，至少99.80％)的最小偏振和/或至少87.0(例如，至少87.5、88.0或88.5)的L*值的蔗糖。在某些實施方案中，白色精制蔗糖也可以具有以下特性中的任一種：0.04％最大含水量、0.04％最大灰分含量、100％水中溶解度、亮白色和/或細化顆粒。

在某些實施方案中，不完全精制的蔗糖尚未結(jié)晶?？梢蕴岬綇奶怯锰鸩税ɡ缣鸩嗽⑻鸩讼≈吞鸩藵庵@得的不完全精制的蔗糖。另選地，本文的不完全精制的蔗糖已經(jīng)具有不超過一個、兩個、三個或更多個結(jié)晶步驟。例如，可以使用來自甘蔗且已經(jīng)具有不超過兩次或三次結(jié)晶的不完全精制的蔗糖。另選地，如果已經(jīng)經(jīng)歷一次、兩次、三次或更多次結(jié)晶但具有大于150的ICUMSA，可以使用不完全精制的蔗糖。結(jié)晶步驟可以包括例如使含蔗糖的水性溶液至少沸騰和/或真空干燥至使溶解的蔗糖開始作為晶體析出溶液的程度。

本文的不完全精制的蔗糖的ICUMSA值可以大于例如150。另選地，不完全精制的蔗糖可以具有例如至少約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000或60000(或介于151和60000之間的任何整數(shù)值)的ICUMSA值。在某些實施方案中，ICUMSA可在約1000-1300的范圍內(nèi)，諸如當不完全精制的蔗糖是甜菜稀汁時。在其它實施方案中，本文的ICUMSA可在約1300-1800的范圍內(nèi)，諸如當不完全精制的蔗糖是甜菜濃汁時，或約50000至60000的范圍內(nèi)，諸如當不完全精制的蔗糖是甜菜糖蜜時。在其它實施方案中，ICUMSA可在約600-1200的范圍內(nèi)，諸如當不完全精制的蔗糖是原蔗糖時；約300-1000的范圍內(nèi)，諸如當不完全精制的蔗糖是VHP蔗糖時；或超過150至約400的范圍內(nèi)，諸如當不完全精制的蔗糖是VVHP蔗糖時。

據(jù)信，本文的蔗糖組合物的ICUMSA值(“改良ICUMSA”)與針對所述組合物利用其它ICUMSA方法測得的ICUMSA值相同或極其類似。

本文的反應溶液是指至少包含不完全精制的蔗糖、水和活性葡糖基轉(zhuǎn)移酶和任選的其它組分的溶液?？梢杂迷谄暇厶呛铣煞磻械钠渌M分包括例如果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、可溶性低聚糖(例如，DP2-DP7)。應當理解，某些葡聚糖產(chǎn)物(諸如DP為至少8或9的聚α-1，3-葡聚糖)可以是水不溶性的，且因此在葡聚糖合成反應中不溶解，而是存在于溶液之外。本文的反應溶液可以是一種除制備不溶性葡聚糖產(chǎn)物以外，制備副產(chǎn)物諸如明串珠菌二糖和/或可溶性低聚糖的溶液。

如本文所公開的反應溶液包含制備具有至少50％的α-1，3糖苷鍵和至少100的DP_w的聚α-1，3-葡聚糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶。此類可用于本文中的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的示例公開在美國專利7000000和美國專利申請公布2013/0244288和2013/0244287(所有這些文獻以引用的方式并入本文)中。可以用在本文的反應溶液中制備聚α-1，3-葡聚糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的其它示例公開在美國專利申請公布2014/0087431(美國專利申請14/036,049)中，該文獻以引用的方式并入本文。例如，本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以(i)包含與SEQ ID NO：4、8、10、12、14、20、26、28、30或34具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其組成，且(ii)具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性。

在某些其它實施方案中，反應溶液包含這樣的葡糖基轉(zhuǎn)移酶，其(i)包含與SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、59、60、61、62、63或64具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其組成，且(ii)具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性。

本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以來源于任何微生物來源，諸如細菌或真菌。細菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶的示例是來源于鏈球菌屬(Streptococcus)菌種、明串珠菌屬(Leuconostoc)菌種或乳桿菌屬(Lactobacillus)菌種的那些葡糖基轉(zhuǎn)移酶。鏈球菌屬菌種的示例包括唾液鏈球菌(S.salivarius)、遠緣鏈球菌(S.sobrinus)、蝙蝠齒鏈球菌(S.dentirousetti)、汗毛鏈球菌(S.downei)、變異鏈球菌(S.mutans)、口腔鏈球菌(S.oralis)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)和血鏈球菌(S.sanguinis)。明串珠菌屬菌種的示例包括腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)、蜜二糖明串珠菌(L.amelibiosum)、阿根廷明串珠菌(L.argentinum)、腸系膜狀明串珠菌(L.carnosum)、檸檬明串珠菌(L.citreum)、乳脂明串珠菌(L.cremoris)、葡聚糖明串珠菌(L.dextranicum)和果糖明串珠菌(L.fructosum。乳桿菌屬菌種的示例包括嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、德氏乳酸桿菌(L.delbrueckii)、瑞士乳桿菌(L.helveticus)、唾液乳桿菌(L.salivarius)、干酪乳桿菌(L.casei)、彎曲乳桿菌(L.curvatus)、植物乳桿菌(L.plantarum)、清酒乳桿菌(L.sakei)、短乳桿菌(L.brevis)、布氏乳桿菌(L.buchneri)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)和羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)。

在一些方面，本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶在葡聚糖合成反應中制備具有至少50％的α-1，3糖苷鍵的聚α-1，3-葡聚糖，其中使用不完全精制的蔗糖。據(jù)信，在某些實施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成這樣的聚α-1，3-葡聚糖，其中至少約60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或介于60％和100％之間的任何整數(shù))的組成糖苷鍵是α-1，3鍵。因此，葡糖基轉(zhuǎn)移酶在上述實施方案中合成這樣的聚α-1，3-葡聚糖，其中少于約50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或0％(或介于0％和50％之間的任何整數(shù)值)的糖苷鍵不是α-1，3。

在本文的其它方面，葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以合成不具有分支點或具有占聚合物中糖苷鍵的百分比少于約10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％分支點的聚α-1，3-葡聚糖。分支點的示例包括α-1，6分支點，諸如存在于突變聚合物中的那些分支點。

在本文的一些方面，葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以合成分子量以DP_n或DP_w計為至少約100的聚α-1，3-葡聚糖。另選地，葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以合成分子量以DP_n或DP_w計為至少約400的聚α-1，3-葡聚糖。另選地，葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以合成分子量以DP_n或DP_w計為至少約100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000(或介于100和1000之間的任何整數(shù))的聚α-1，3-葡聚糖。

在某些方面，可以使用一種或多種不同的葡糖基轉(zhuǎn)移酶。在某些實施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶不具有或具有極小(小于1％的)的葡聚糖蔗糖酶活性、羅伊糖蔗糖酶活性、或交替糖蔗糖酶活性。本文的反應溶液可以包含例如一種、兩種或更多種葡糖基轉(zhuǎn)移酶。

本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以是不依賴引物的或依賴引物的。不依賴引物的葡糖基轉(zhuǎn)移酶不需要存在引物來實施葡聚糖合成。在葡聚糖聚合物合成期間，依賴引物的葡糖基轉(zhuǎn)移酶需要反應溶液中存在引發(fā)分子充當酶引物。如本文所用的術(shù)語“引物”是指能夠用作葡糖基轉(zhuǎn)移酶的引發(fā)劑的任何分子?？梢杂迷谀承嵤┓桨钢械囊锇ɡ缬倚囚推渌谔妓衔锏囊?，諸如水解的葡聚糖。用作引物的右旋糖酐可以是例如右旋糖酐T10(即，分子量為10kD的右旋糖酐)。

本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的示例可以具有本文所公開的任何氨基酸序列，且其還在N-末端和/或C末端包括1-300(或其中的任何整數(shù)[例如，10、15、20、25、30、35、40、45或50])個殘基。此類附加殘基可以來自得到葡糖基轉(zhuǎn)移酶的相應野生型序列，或者可以是例如異源序列，諸如表位標記(在N-末端或C-末端)或異源信號肽(在N-末端)。

本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶通常不含N-末端信號肽。用于產(chǎn)生本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的表達系統(tǒng)可以采用酶編碼多核苷酸，如果需要，其還包含編碼指導胞外分泌的N-末端信號肽的序列。在此類實施方案中，信號肽在分泌過程中從所述酶裂解。信號肽可以與葡糖基轉(zhuǎn)移酶同源或異源?？捎糜诒疚闹械男盘栯牡氖纠且环N來自細菌(例如，芽孢桿菌屬菌種，諸如枯草芽孢桿菌(B.subtilis))或真菌菌種的信號肽。細菌信號肽的示例是aprE信號肽，諸如一種來自芽孢桿菌屬的信號肽(例如，枯草芽孢桿菌，參見Vogtentanz等人，Protein Expr.Purif.55：40-52，該文獻以引用的方式并入本文)。

本文所公開的若干種葡糖基轉(zhuǎn)移酶序列不含N-末端信號肽(以及可變結(jié)構(gòu)域)(參考表1)。為了進行細胞內(nèi)表達，已經(jīng)向每條序列添加N-末端起始甲硫氨酸(氨基酸位置1)(表達的酶可以在例如細胞裂解液中得到)。本領域的技術(shù)人員應理解，可以任選地在起始甲硫氨酸與葡糖基轉(zhuǎn)移酶序列之間添加居間異源氨基酸序列諸如表位和/或信號肽。因此，例如，本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以包含這樣的氨基酸序列，或由其組成：(i)與SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、59、60、61、62、63或64的從位置2開始的氨基酸序列具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，且(ii)具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性。

用于本文葡聚糖合成反應的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以通過本領域內(nèi)已知的任何方式制備。例如，葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以在異源表達系統(tǒng)中重組產(chǎn)生，諸如微生物異源表達系統(tǒng)。異源表達系統(tǒng)的示例包括細菌(例如，大腸桿菌，諸如TOP10或MG1655；芽孢桿菌屬物種)和真核(例如，酵母，諸如畢赤酵母屬物種(Pichia sp.)和酵母屬物種(Saccharomyces sp.))表達系統(tǒng)。

在某些實施方案中，異源性基因表達系統(tǒng)可以是一種設計用于蛋白質(zhì)分泌的表達系統(tǒng)。在此類實施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含信號肽(信號序列)。信號肽可以是其天然信號肽或異源信號肽。

本文所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以以任何純化狀態(tài)(例如，純化或非純化)使用。例如，葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以在使用前純化和/或分離。非純化葡糖基轉(zhuǎn)移酶的示例包括形式為細胞裂解液的那些葡糖基轉(zhuǎn)移酶。細胞裂解液或提取物可以由用于異源表達酶的細菌(例如，大腸桿菌)制備。例如，細菌可以利用弗氏壓碎器經(jīng)受破壞。在另選的實施方案中，細菌可以借助勻化器(例如，APV、Rannie、Gaulin)勻化。葡糖基轉(zhuǎn)移酶通常在這些類型的制劑中可溶。本文的細菌細胞裂解液、提取物、均化物可以在用于從蔗糖制備聚α-1，3-葡聚糖的反應溶液中以約0.15％-0.3％(v/v)使用。

本文葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性可以利用本領域已知的任何方法測定。例如，葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性可以通過測量含蔗糖(50g/L)、右旋糖酐T10(1mg/mL)和磷酸鉀緩沖液(pH 6.5，50mM)的反應溶液中的還原糖(果糖和葡萄糖)的產(chǎn)量來測定，其中將所述溶液保持在22-25℃下持續(xù)24-30小時。可以通過向含1N NaOH和0.1％氯化三苯基四唑的混合物中添加0.01mL反應溶液測量還原糖，然后監(jiān)測OD_480nm下的吸光度在五分鐘內(nèi)的增加來測量還原糖。

如果需要，可以控制本文的反應溶液的溫度。在某些實施方案中，反應溫度在介于約5℃至約50℃之間。在某些其它實施方案中，溫度在介于約20℃至約40℃，或約20℃至約30℃之間(例如，約25℃)。

本文的反應溶液中的蔗糖的初始濃度可以為例如約20g/L至約400g/L。另選地，蔗糖的初始濃度可以為約75g/L至約175g/L，或約50g/L至約150g/L。另選地，蔗糖的初始濃度可以為例如約40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L或160g/L(或介于40g/L和160g/L之間的任何整數(shù)值)。“蔗糖的初始濃度”是指剛添加完所有反應溶液組分(至少水、不完全精制的蔗糖、gtf酶)后gtf反應溶液中的蔗糖濃度。反應溶液中的所有或一部分蔗糖可以來自添加到所述溶液中的不完全精制的蔗糖。雖然優(yōu)選地是所有蔗糖都是不完全精制的，但是可以另外將白色精制蔗糖用于反應溶液中。

應理解，借助某些液體形式的不完全精制的蔗糖組合物(例如，甜菜稀汁、甜菜濃汁、糖蜜)，因此可將此類組合物添加到反應溶液中，以在特定反應體積中達到蔗糖的特定初始濃度。例如，可將來自糖用甜菜(例如，甜菜稀汁、甜菜濃汁、糖蜜)的不完全精制的蔗糖組合物稀釋在反應溶液中，使得反應的初始蔗糖濃度為約70g/L-90g/L或80g/L-85g/L。

在某些實施方案中，葡聚糖合成反應的pH可以在介于約4.0至約8.0之間。另選地，pH可為約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0?？赏ㄟ^添加或摻入合適的緩沖液來調(diào)節(jié)或控制pH，包括但不限于磷酸鹽、tris、檸檬酸鹽或它們的組合。葡聚糖合成反應中的緩沖液濃度可為例如0mM至約100mM、或約10mM、20mM或50mM。可任選地將適量DTT(二硫蘇糖醇，例如，約1.0mM)添加到反應溶液中。

本文的反應溶液可以包含在任何適合施加本文所公開的一個或多個反應條件的容器。例如，本文的反應溶液可以在尺寸適合容納特定反應的不銹鋼、塑料或玻璃容器中。此類容器可以任選地配備有攪拌裝置。

適合進行本文反應溶液的其它條件和組分的示例公開在美國專利7000000和美國專利申請公布2013/0244288、2013/0244287、2013/0196384、2013/0157316和2014/0087431中，所有這些專利均以引用方式并入本文。

本公開的反應溶液的聚α-1，3-葡聚糖的收率是在反應溶液中轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的蔗糖的重量的至少7％。另選地，聚α-1，3-葡聚糖的收率可為至少約8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％或47％。在某些實施方案中，聚α-1，3-葡聚糖在本文的反應溶液中的收率與通過對照反應溶液的聚α-1，3-葡聚糖的收率大致相同，在對照反應溶液中，使用白色精制蔗糖替代不完全精制的蔗糖。所有上述收率都可以利用保持在約20-30℃(例如，25℃)的溫度下的反應溶液和/或利用含例如SEQ ID NO：8的gtf獲得。這些實施方案中的某些實施方案可以使用濃甜菜汁或稀甜菜汁作為不完全精制的蔗糖。

在某些實施方案中，反應溶液的相對反應速率是至少約0.8，這是相對于包含水、白色精制蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶的反應溶液的反應速率而言。例如，反應溶液的相對反應速率是至少約0.8，這是相對于對照反應而言(即，本文的反應溶液的反應速率是對照反應的速率的至少80％)。本文的相對反應速率也可以是例如至少約0.82、0.84、0.86、0.88、0.90、0.92、0.94、0.96、0.98、1.00、1.02或1.04。反應溶液的反應速率可以依據(jù)在單位時間內(nèi)每單位濃度的活性葡糖基轉(zhuǎn)移酶下，反應物(例如，蔗糖)的濃度/量的變化和/或產(chǎn)物(例如，聚α-1，3-葡聚糖)的濃度/量的變化來表示。

本文的反應溶液可以制備L*值小于例如93的聚α-1，3-葡聚糖。另選地，由本文的反應溶液制備的聚α-1，3-葡聚糖的L*值可以小于92、90、88、86、84、82、80、78、76、74、72、70、68、66、64、62或60。本文的聚α-1，3-葡聚糖產(chǎn)物的L*值的范圍的示例可為約82-87(例如，當反應溶液中使用甜菜稀汁或甜菜濃汁時)或80-82(例如，當反應溶液中使用VHP蔗糖時)。可以測定L*值，例如，對于已經(jīng)從反應溶液去除的聚α-1，3-葡聚糖而言，在兩次置換洗滌中用至少一半反應體積的水洗滌(例如，如果反應體積的2L，用至少一份1-L的水洗滌)，然后干燥、碾碎并經(jīng)過60-目篩網(wǎng)篩分。干燥應該在不使聚α-1，3-葡聚糖變色的溫度下進行。因此，聚α-1，3-葡聚糖的任何顏色都應該源自不完全精制的蔗糖。

本文的反應溶液產(chǎn)生具有至少50％的α-1，3糖苷鍵的聚α-1，3-葡聚糖。據(jù)信，在某些實施方案中，制備這樣的聚α-1，3-葡聚糖，其中至少約60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或介于60％和100％之間的任何整數(shù))的組成糖苷鍵是α-1，3鍵。因此，上述實施方案中制備的聚α-1，3-葡聚糖具有少于約50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或0％(或介于0％和50％之間的任何整數(shù)值)的非α-1，3糖苷鍵。

本文的聚α-1，3-葡聚糖產(chǎn)物的糖苷鍵分布可以利用本領域已知的任何方法測定。例如，鍵分布可以利用使用核磁共振(NMR)光譜法(例如，¹³C NMR或¹H NMR)的方法測定。這些方法和可以使用的其它方法公開在Food Carbohydrates：Chemistry，PhsicalProperties，and Applications(S.W.Cui編輯，第3章，S.W.Cui，Structural Analysis of Polysaccharides，Taylor&Francis Group LLC，Boca Raton，F(xiàn)L，2005)中，所述文獻以引用方式并入本文。

本文的反應溶液產(chǎn)生以DP_n或DP_w計的分子量為至少約100的聚α-1，3-葡聚糖。另選地，本文的反應溶液中制備的聚α-1，3-葡聚糖可以具有以DP_n或DP_w計為至少約400的分子量。另選地，聚α-1，3-葡聚糖可以具有以DP_n或DP_w計為至少約100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000(或介于100和1000之間的任何整數(shù))的分子量。

本文的聚α-1，3-葡聚糖的分子量可以利用本領域已知的若干方法中的任一種測量。例如，葡聚糖聚合物的分子量可以利用高壓液相色譜法(HPLC)、尺寸排阻色譜法(SEC)或凝膠滲透色譜法(GPC)測量。

本公開還涉及一種用于制備聚α-1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括使至少水、蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸的步驟，其中蔗糖是未精制或部分精制的(即，不完全精制的)。這種方法中制備的，且可任選地分離的聚α-1，3-葡聚糖具有至少50％的α-1，3糖苷鍵和至少100的重均聚合度(DP_w)。另外，所述方法中制備的聚α-1，3-葡聚糖的收率是通過與水和葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的蔗糖的重量的至少7％。如上文和實施例中所公開的本文反應溶液的任何特征都可以表征所述方法。所述方法的以下特征是示例。

在所述方法的某些實施方案中，不完全精制的蔗糖可以來自糖用甜菜(例如，甜菜稀汁或甜菜濃汁)且尚未結(jié)晶。在另一個示例中，不完全精制的蔗糖來自甘蔗(例如，原蔗糖、VHP或VVHP蔗糖)且已經(jīng)具有不超過兩個或三個結(jié)晶步驟。

所公開的方法中使用的不完全精制的蔗糖可以具有大于例如150的ICUMSA值。

所述方法的某些實施方案中制備的聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值?？梢葬槍缫呀?jīng)從反應溶液去除的聚α-1，3-葡聚糖測定本文的L*值；任選地用水洗滌一次、兩次或更多次；并干燥。

所述方法的接觸步驟中制備聚α-1，3-葡聚糖的相對反應速率為至少0.8，這是相對于使用白色精制蔗糖替代不完全精制蔗糖時的反應速率而言。

本公開的方法包括使至少水、不完全精制的蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸。該接觸步驟可以包括提供包含水、不完全精制的蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶的反應溶液。應當理解，當葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成聚α-1，3-葡聚糖時，考慮到不溶性聚α-1，3-葡聚糖從溶液中析出，如反應變渾濁所指示，反應溶液變成反應混合物。本公開的方法的接觸步驟可以以任意種方式進行。例如，可以首先將所需量的不完全精制的蔗糖溶解或混合在水(任選地，也可以在這個制備階段添加其它組分，諸如緩沖液組分)中，接著添加葡糖基轉(zhuǎn)移酶。溶液可以保持靜置，或經(jīng)由例如攪拌或回轉(zhuǎn)式振蕩攪動。反應可以是且通常是不含細胞的。

在某些實施方案中，可以通過視覺地(不溶性聚α-1，3-葡聚糖不再累積)和/或通過測量溶液中留下的蔗糖的量(殘余蔗糖)確定反應的完成，其中蔗糖消耗百分比超過約90％可以視為反應完成。通常，本發(fā)明所公開的工藝的反應將需要約12、24、36、48、60、72、84或96小時完成，這取決于某些參數(shù)，諸如用于所述反應中的蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶的量。

在本文所公開的方法的某些實施方案中，反應的蔗糖消耗百分比是起初接觸水和葡糖基轉(zhuǎn)移酶的蔗糖的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。另選地，蔗糖消耗百分比可以＞90％或＞95％。

在本文的葡聚糖合成方法的一些方面中制備的聚α-1，3-葡聚糖的收率基于所述反應中轉(zhuǎn)化的蔗糖的重量計可為至少約7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％或47％。

可以任選地分離本公開的方法中制備的聚α-1，3-葡聚糖。例如，可以通過離心或過濾分離不溶性聚α-1，3-葡聚糖。這樣，分離大部分反應溶液的聚α-1，3-葡聚糖，所述反應溶液可包含水、果糖和某些副產(chǎn)物(例如，明串珠菌二糖、可溶性低聚糖DP2-DP7)。該溶液也可包含殘余蔗糖和果糖單體。分離還可以任選地包括用水洗滌聚α-1，3-葡聚糖一次、兩次或更多次，和/或干燥聚α-1，3-葡聚糖。

本公開還涉及通過本文所公開的反應溶液或方法制備的聚α-1，3-葡聚糖。這種聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。如上文和實施例中所公開的聚α-1，3-葡聚糖的任何特征都可以表征該實施方案的聚α-1，3-葡聚糖。以下特征是示例。

可以分離本文的聚α-1，3-葡聚糖產(chǎn)物，且可以任選地以例如干燥形式提供。在某些實施方案中，聚α-1，3-葡聚糖產(chǎn)物是以至少1克(例如，至少100g或500g)的分離的干燥量提供?！案稍铩本郐?1，3-葡聚糖包含不超過例如2.0重量％、1.5重量％、1.0重量％、0.5重量％、0.25重量％、0.10重量％、0.05重量％或0.01重量％的水。

據(jù)信，在某些實施方案中，聚α-1，3-葡聚糖產(chǎn)物可包含以下化合物中的一種或多種：焦糖、蛋白黑素、己糖堿性降解產(chǎn)物(HADP)(在堿性條件下形成的聚合C6糖縮合產(chǎn)物)、多酚-鐵絡合物(例如，鐵兒茶酚絡合物)、黑色素。據(jù)信，與僅使用白色精制蔗糖的反應溶液賦予聚α-1，3-葡聚糖產(chǎn)物的著色(如果有的話)相比，這些化合物中的一種或多種還為聚α-1，3-葡聚糖產(chǎn)物提供更深的著色。此類著色差異可以利用例如L*值測定。

本文所公開的組合物和方法的非限制性示例包括：

1.一種反應溶液，所述反應溶液包含水、蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶，所述反應溶液合成不溶性聚α-1，3-葡聚糖，其具有至少50％的α-1，3糖苷鍵和至少100的重均聚合度(DP_w)，其中所述蔗糖是未精制或部分精制的；

其中所述反應溶液的聚α-1，3-葡聚糖的收率是在所述反應溶液中轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的蔗糖的重量的至少7％。

2.根據(jù)實施方案1所述的反應溶液，其中所述蔗糖來自糖用甜菜，并且尚未結(jié)晶。

3.根據(jù)實施方案1所述的反應溶液，其中所述蔗糖來自甘蔗，并且(i)尚未結(jié)晶，或(ii)已經(jīng)利用不超過三個結(jié)晶步驟結(jié)晶。

4.根據(jù)實施方案1、3或3所述的反應溶液，其中所述蔗糖具有大于150的ICUMSA值。

5.根據(jù)實施方案1、2、3或4所述的反應溶液，其中所述反應溶液的相對反應速率為至少0.8，這是相對于包含水、白色精制蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶的反應溶液的反應速率而言。

6.根據(jù)實施方案1、2、3、4或5所述的反應溶液，其中由所述反應溶液制備的聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。

7.根據(jù)實施方案1、2、3、4、5或6所述的反應溶液，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：34具有至少90％同一性的氨基酸序列。

8.一種用于制備不溶性聚α-1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括：

(a)使至少水、蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸，其中所述蔗糖是未精制或部分精制的，

由此制備聚α-1，3-葡聚糖，其具有至少50％的α-1，3糖苷鍵和至少100的重均聚合度(DP_w)；以及

b)任選地，分離步驟(a)中制備的聚α-1，3-葡聚糖；

其中聚α-1，3-葡聚糖的收率是在步驟(a)中轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的蔗糖的重量的至少7％。

9.根據(jù)實施方案8所述的方法，其中所述蔗糖來自糖用甜菜，并且尚未結(jié)晶。

10.根據(jù)實施方案8所述的方法，其中所述蔗糖來自甘蔗，并且(i)尚未結(jié)晶，或(ii)已經(jīng)利用不超過三個結(jié)晶步驟結(jié)晶。

11.根據(jù)實施方案8、9或10所述的方法，其中所述蔗糖具有大于150的ICUMSA值。

12.根據(jù)實施方案8、9、10或11所述的方法，其中步驟(a)中制備聚α-1，3-葡聚糖的相對反應速率是至少0.8，這是相對于使用白色精制蔗糖替代所述未精制或部分精制的蔗糖時的步驟(a)的反應速率而言。

13.根據(jù)實施方案8、9、10、11或12所述的方法，其中步驟(b)中分離的聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。

14.根據(jù)實施方案8、9、10、11、12或13所述的方法，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：34具有至少90％同一性的氨基酸序列。

15.一種通過根據(jù)實施方案8、9、10、11、12、13或14所述的方法制備的分離的聚α-1，3-葡聚糖，其中所述聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。

實施例

本公開還在下文提供的實施例2-12中進一步舉例說明。應該理解，盡管這些實施例說明了本文的某些優(yōu)選方面，但僅是以例證的方式給出的。通過上述論述和這些實施例，本領域的技術(shù)人員可確定本發(fā)明所公開的實施方案的必要特征，并且在不脫離其實質(zhì)和范圍的前提下，可對本發(fā)明所公開的實施方案進行各種變化和修改以適應多種用途和條件。

一般方法

蔗糖ICUMSA測量

密切根據(jù)ICUMSA方法GS1/3-7進行ICUMSA測量(R.J.McCowage、R.M.Urquhart和M.L.Burge(Determination of the Solution Colour of RawSugars，Brown Sugars and Coloured Syrups at pH 7.0-Official，Verlag Dr Albert Bartens，2011版)，該文獻以引用的方式并入本文。蔗糖樣品的ICUMSA顏色測量的基本步驟如下。將蔗糖添加至到離子水(如果是固體形式諸如蔗糖被溶解，如果是液體形式諸如甜菜汁被稀釋)中至基于預期ICUMSA范圍的指定濃度，如ICUMSA方法GS1/3-7中所指定。過濾蔗糖溶液，以去除任何未溶解的雜質(zhì)，并測量過濾后的蔗糖溶液的吸光度。然后根據(jù)公式1計算溶液的ICUMSA顏色：

其中吸光度(Abs)＝樣品溶液吸光度讀數(shù)；b＝光學單元路徑(cm)；c＝蔗糖濃度，以g/mL計。

上文ICUMSA方法沿循ICUMSA方法GS1/3-7，但作了以下修改：

1.使用醋酸纖維素0.45-微米過濾器(正方形50mm)替代硝酸纖維素0.45-微米過濾器。

2.不計算RDS(“折光干物質(zhì)”)和密度，通過以下步驟測定樣品的蔗糖濃度：利用折射計測量有效ppt鹽度，并利用從公布的數(shù)據(jù)獲得的線性關(guān)系轉(zhuǎn)化為％Brix(％Brix＝0.1258ppt鹽度+0.0152)。對另外稀釋的樣品進行折射率測量，并將Brix值變回用于UV測量的標準濃度。

使用去離子水溶解蔗糖。蔗糖溶液樣品未脫氣，因為溶液中沒觀察到泡沫或氣泡。將醋酸纖維素過濾器預先放置在用于無菌過濾應用的塑料漏斗中。

聚α-1，3-葡聚糖的L*a*b*顏色測量

利用CIE L*a*b*測量系統(tǒng)測量聚α-1，3-葡聚糖顏色。兩種樣品制備方法的使用取決于可用聚α-1，3-葡聚糖的量。兩種方法得出相同L*a*b*測量值。

在第一方法中，在咖啡研磨機中將干燥的聚α-1，3-葡聚糖磨成細粉。將0.77g粉末轉(zhuǎn)移至可排空的13-mm KBr制粒模，并在7000磅下使聚α-1，3-葡聚糖形成顆粒。利用Konica Minolta 2600D分光光度計測量顆粒顏色。

在第二方法中，在咖啡研磨機中將干燥聚α-1，3-葡聚糖磨成細粉。使研磨過的聚α-1，3-葡聚糖經(jīng)過60-目篩網(wǎng)篩分，并填充到1-cm比色管中。利用HUNTERLAB COLORQUEST XE分光光度計測量研磨過的聚α-1，3-葡聚糖的顏色。

制備葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtf)的粗提物

如下制備gtf酶(例如，SEQ ID NO：8))。用含特定gtf-編碼DNA序列的基于的構(gòu)建體使大腸桿菌細胞(Invitrogen，Carlsbad California)轉(zhuǎn)化。每條序列經(jīng)密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌中表達gtf酶。使表達特定gtf酶的單個的大腸桿菌菌株在37℃的含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB(Luria發(fā)酵液)培養(yǎng)基(Becton，Dickinson and Company，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)中生長，同時振蕩，至OD₆₀₀＝0.4-0.5，此時添加IPTG(異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷，Cat.No.I6758，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，至最終濃度為0.5mM。IPTG誘導后，在37℃下培養(yǎng)培養(yǎng)物2-4小時。通過以5,000×g離心15分鐘收獲細胞，并將細胞(以20％重量體積比)重懸于補充有二硫蘇糖醇(DTT，1.0mM)的50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中。使得重懸細胞兩次通過弗氏壓碎器(SLM Instruments，Rochester，NY)以確保＞95％的細胞裂解。在4℃下以12,000×g對裂解細胞離心30分鐘。通過BCA(二喹啉甲酸)蛋白質(zhì)分析(Sigma-Aldrich)和SDS-PAGE分析所得上清液，以確認表達gtf酶，并將上清液保存在-20℃下。

Gtf的相對反應速率

蔗糖通過葡糖基轉(zhuǎn)移酶得到聚α-1，3-葡聚糖的酶促反應遵循Michaelis-Menten動力學。在高蔗糖濃度下，蔗糖的反應速率是零階。在整個反應期間通過HPLC定期測量蔗糖濃度。將反應速率計算為零階反應期間蔗糖消耗速率。即，將反應速率計算為蔗糖濃度-時間圖的線性區(qū)域的負斜率。然后反應速率除以加載到反應器的酶活性，得到歸一化反應速率，這消除了因為酶濃度變動引起的反應速率差異。最后，歸一化反應速率除以白色精制糖的歸一化反應速率，得到相對反應速率。

測定Gtf酶活性

按照諸如以下的方案確認gtf酶(例如，SEQ ID NO：8)活性，所述方案測量gtf反應溶液中的還原糖(果糖和葡萄糖)的產(chǎn)量。通過將gtf粗提物添加到含蔗糖(50g/L或150g/L)、磷酸鉀緩沖液(pH 6.5，50mM)和任選的右旋糖酐(1mg/mL，右旋糖酐T10，Cat.No.D9260，Sigma-Aldrich)的混合物中制備反應溶液；添加gtf提取物至2.5體積％-5體積％。然后在22℃-25℃下培養(yǎng)反應溶液24-30小時，然后進行離心。將上清液(0.01mL)添加至包含1N NaOH和0.1％氯化三苯基四唑(Sigma-Aldrich)的混合物中。溫育混合物五分鐘，然后利用ULTROSPEC分光光度計(Pharmacia LKB，New York，NY)測定其OD_480nm，以估計還原糖果糖和葡萄糖的存在。

測定重均聚合度(DP_W)

利用尺寸排阻色譜法(SEC)測定通過gtf酶(例如，SEQ ID NO：8)合成的葡聚糖產(chǎn)物的DP_W。示例性SEC方案如下。以5mg/mL將干燥聚α-1，3-葡聚糖聚合物溶解于N，N-二甲基-乙酰胺(DMAc)和5％LiCl，同時在100℃下振蕩過夜。SEC系統(tǒng)是來自Waters Corporation(Milford，MA)的耦接三個在線檢測器的Alliance^TM2695分離模塊：來自Waters的差示折射計2410、來自Wyatt Technologies(Santa Barbara，CA)的多角度散光光度計Heleos^TM8+和來自Wyatt的差示毛細管粘度計ViscoStar^TM。用于SEC的柱是四個來自Shodex(Japan)的苯乙烯-二乙烯基苯柱和兩個線性KD-806M、KD-802和KD-801柱，以改善在聚合物分布的低分子量區(qū)域下的分辨率。移動相是具有0.11％LiCl的DMAc。所用的色譜分離條件是50℃柱和檢測器隔室，40℃樣品和注射器隔室，流量0.5mL/min，和注射體積100μL。用于數(shù)據(jù)還原的軟件包是來自Waters的Empower^TM版本3(用廣泛葡聚糖聚合物標準進行校正)和來自Wyatt的版本6(具有柱校正的三重檢測方法)。

測定糖苷鍵

由gtf酶(例如，SEQ ID NO：8)合成的葡聚糖產(chǎn)物中的糖苷鍵可以按照諸如以下的¹³C NMR(核磁共振)測定。在50℃下在攪拌下將干燥葡聚糖聚合物(25-30mg)溶解于1mL含3重量％LiCl的氘代二甲基亞砜(DMSO)。利用玻璃吸移管，將0.8mL溶液轉(zhuǎn)移至5-mm NMR管中。利用配備有CPDUL冷凍探針的Bruker Avance 500-MHz NMR光譜儀(Billerica，MA)，在125.76MHz的光譜頻率下，利用26041.7Hz的光譜窗采集定量¹³C NMR光譜。利用waltz解耦的反向門控解耦脈沖序列，采集時間為0.629秒，脈沖間延遲為5秒，并且脈沖為6000。利用2.0Hz的指數(shù)倍增轉(zhuǎn)化時域數(shù)據(jù)。

實施例1(比較例)

利用白色精制蔗糖制備聚α-1，3-葡聚糖

該實施例描述在gtf-催化的反應中利用白色精制蔗糖制備α-1，3-葡聚糖。

80g/L蔗糖溶液如下制備。將1500g去離子水充入控制在23℃下的帶夾套攪動的2-L玻璃反應器中。將2.7g KH₂PO₄緩沖液加入到反應器中。接下來，將160g白色精制蔗糖(ICUMSA 47；United Sugars Corporation，Bloomington，MN)添加至反應器，此后，用更多去離子水將反應器中的體積調(diào)節(jié)至2L。然后添加(DuPont)(1mL/L反應)，并利用5重量％氫氧化鈉水溶液或5重量％硫酸水溶液將pH調(diào)節(jié)至5.5。通過添加0.3體積％gtf酶(SEQ ID NO：8)粗提物(一般方法)引發(fā)葡聚糖聚合反應，并保持在23℃下。

通過完全消耗蔗糖或測量間的蔗糖濃度無變化確定反應完成后，利用FILTRATEST(Bokela GmbH Karlsruhe，Germany)過濾200mL反應漿液。此過濾操作使母液(濾液)與聚α-1，3-葡聚糖濕餅分離。用去離子水兩次置換洗滌(每次200-L)洗出濕餅中的殘余糖。然后在80℃下將濕餅在對流烘箱中干燥約24小時。用干燥聚合物的最終重量除以反應的蔗糖量計算聚合收率。

通過SEC(一般方法)測量聚α-1，3-葡聚糖產(chǎn)物的分子量，并表示為DP_W(表2)，計算方法為用平均聚合物分子量除以單體分子量。根據(jù)一般方法測量干燥葡聚糖聚合物產(chǎn)物的顏色，并在表2中表示為L*。

實施例2

利用VHP蔗糖制備聚α-1，3-葡聚糖

該實施例描述在gtf-催化的反應中利用VHP制備α-1，3-葡聚糖，VHP是一類不完全精制的蔗糖。

遵循實施例1的聚合過程，不同的是使用VHP蔗糖(ICUMSA 501，Iracema Mill，Brazil)替代白色精制蔗糖。

通過完全消耗蔗糖或測量間的蔗糖濃度無變化確定反應完成后，利用布氏漏斗和真空燒瓶過濾反應漿液。此過濾操作使母液(濾液)與聚α-1，3-葡聚糖濕餅分離。用去離子水兩次置換洗滌(每次1-L)洗出濕餅中的殘余糖。然后在40℃和360mm Hg下將濕餅在真空烘箱中干燥約48小時。用干燥聚合物的最終重量除以反應的蔗糖量計算聚合收率。該過程中制備的聚α-1，3-葡聚糖的分子量、收率和顏色呈現(xiàn)在表2中。

因此，可以在含不完全精制的蔗糖的gtf反應溶液中合成聚α-1，3-葡聚糖。

實施例3

利用VVHP蔗糖制備聚α-1，3-葡聚糖

該實施例描述在gtf-催化的反應中利用VVHP制備α-1，3-葡聚糖，VVHP是一類不完全精制的蔗糖。

遵循實施例2的聚合和聚合物分離過程，不同的是使用VVHP蔗糖(ICUMSA 421，F(xiàn)errari Mill，Brazil)替代VHP蔗糖。這個過程中制備的聚α-1，3-葡聚糖的分子量、收率和顏色呈現(xiàn)在表2中。