羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及一種羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體及其制 備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 視黃酸結(jié)合蛋白5是一種在山羊附睪頭高度表達(dá)的分泌型小分子蛋白質(zhì)，需要有 特定的抗體研究其蛋白的表達(dá)定位特點(diǎn)及其生物學(xué)功能，然而，目前還未見(jiàn)有可用于綿羊 和山羊的視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體及其制 備方法和應(yīng)用。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0005] 羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體，它的核苷酸序列為
[0006] TGCATGAAGGAGAAGAACCAGGCAGTGAAGGGGGACGCCCCTGGGAAGTTCAAG〇
[0007] 本發(fā)明還提供了上述羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體的制備方法，包括如下 步驟：
[0008]S1、將視黃酸結(jié)合蛋白5蛋白N端81-98共18個(gè)氨基酸作為羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋 白5多克隆抗體的抗原表位，合成羊視黃酸結(jié)合蛋白5多肽，純度> 75% ;
[0009] S2、取步驟S1所得的1. 5mg羊視黃酸結(jié)合蛋白5多肽偶聯(lián)到KLH，脫鹽后作為免疫 原備用；
[0010]S3、采用AbMax標(biāo)準(zhǔn)程序（42天），采用步驟S2所得免疫原對(duì)免疫原 KLH-CMKEKNQAVKGDAPGKFK多肽免疫兔子進(jìn)行若干次加強(qiáng)免疫，多肽-BSA的多抗效價(jià)達(dá)到 標(biāo)準(zhǔn)（血清滴度多1 :50000)，第28天每只放血20ml并加強(qiáng)免疫，若動(dòng)物無(wú)異常情況，則 在第42天終放血，得羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體。
[0011] 其中，所述抗原表位的氨基酸序列為CMKEKNQAVKGDAPGKFK。
[0012] 上述所得抗體可以用于山羊和綿羊的免疫組織化學(xué)、免疫熒光化學(xué)和Western Blotting檢測(cè)，用于免疫組織化學(xué)時(shí)濃度為1 : 50-200;用于細(xì)胞免疫熒光化學(xué)時(shí)，濃度為 1 : 50-200;用于Westernblotting時(shí)，濃度為 1 : 500-1000。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0014] 羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體，它的核苷酸序列為
[0015]TGCATGAAGGAGAAGAACCAGGCAGTGAAGGGGGACGCCCCTGGGAAGTTCAAG。
[0016] 本發(fā)明還提供了上述羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體的制備方法，包括如下 步驟：
[0017]S1、將視黃酸結(jié)合蛋白5蛋白N端81-98共18個(gè)氨基酸作為羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋 白5多克隆抗體的抗原表位，合成羊視黃酸結(jié)合蛋白5多肽，純度> 75% ;
[0018]S2、取步驟S1所得的1. 5mg羊視黃酸結(jié)合蛋白5多肽偶聯(lián)到KLH，脫鹽后作為免疫 原備用；
[0019]S3、采用AbMax標(biāo)準(zhǔn)程序（42天），采用步驟S2所得免疫原對(duì)免疫原 KLH-CMKEKNQAVKGDAPGKFK多肽免疫兔子進(jìn)行若干次加強(qiáng)免疫，多肽-BSA的多抗效價(jià)達(dá)到 標(biāo)準(zhǔn)（血清滴度多1 : 50000)，第28天每只放血20ml并加強(qiáng)免疫，若動(dòng)物無(wú)異常情況，則 在第42天終放血，得羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體。
[0020] 其中，所述抗原表位的氨基酸序列為CMKEKNQAVKGDAPGKFK。
[0021] 上述所得抗體可以用于山羊和綿羊的免疫組織化學(xué)、免疫熒光化學(xué)和Western Blotting檢測(cè)，用于免疫組織化學(xué)時(shí)濃度為1 : 50-200;用于細(xì)胞免疫熒光化學(xué)時(shí)，濃度為 1 : 50-200;用于Westernblotting時(shí)，濃度為 1 : 500-1000。
[0022] ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)
[0023] 將0.5mg視黃酸結(jié)合蛋白5多肽偶聯(lián)到BSA，脫鹽后作為檢測(cè)抗原備用。在免疫后 的第25天取血，用視黃酸結(jié)合蛋白5多肽和多肽-BSA包板（lOOng/well)，進(jìn)行ELISA評(píng) 價(jià)，ProteinG純化抗體識(shí)別肽-BSA滴度0. 005ug/ml。
[0024] 多克隆抗體親和純化與評(píng)價(jià)
[0025] 用lmg視黃酸結(jié)合蛋白5多肽制備免疫親和柱，選擇信號(hào)較好的兔血，進(jìn)行免疫 親和純化10-30ml血清，獲得1~3mg免疫親和純化抗體。用視黃酸結(jié)合蛋白5多肽和多 肽-BSA包板（lOOng/well)，通過(guò)ELISA初步評(píng)價(jià)免疫親和純化后抗體效價(jià)，親和純化抗體 識(shí)別肽-BSA滴度達(dá)0· 0001ug/ml。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 用于山羊附睪頭組織的免疫熒光化學(xué)，抗體稀釋比例1 : 50。綠色熒光處為視黃 酸結(jié)合蛋白5強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)區(qū)域。
[0028] 實(shí)施例2
[0029] 用于山羊附睪體免疫組織化學(xué)，抗體稀釋比例1 : 50。褐色區(qū)域處為視黃酸結(jié)合 蛋白5強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)區(qū)域。
[0030] 實(shí)施例3
[0031] 用于不同發(fā)育階段山羊附睪尾組織視黃酸結(jié)合蛋白5Westernblotting的定量分 析，抗體稀釋倍數(shù)為1 : 1000。
[0032]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體，其特征在于，它的核苷酸序列TGCATGAAGGAGA AGAACCAGGCAGTGAAGGGGGACGCCCCTGGGAAGTTCAAGo2. 羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 51、 將視黃酸結(jié)合蛋白5蛋白N端81-98共18個(gè)氨基酸作為羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5 多克隆抗體的抗原表位，合成羊視黃酸結(jié)合蛋白5多肽； 52、 取步驟Sl所得的I. 5mg羊視黃酸結(jié)合蛋白5多肽偶聯(lián)到KLH，脫鹽后作為免疫原備 用； 53、 采用AbMax標(biāo)準(zhǔn)程序（42天），采用步驟S2所得免疫原對(duì)免疫原 KLH-CMKEKNQAVKGDAPGKFK多肽免疫兔子進(jìn)行若干次加強(qiáng)免疫，多肽-BSA的多抗效價(jià)達(dá)到 標(biāo)準(zhǔn)（血清滴度多1 : 50000)，第28天每只放血20ml并加強(qiáng)免疫，若動(dòng)物無(wú)異常情況，則 在第42天終放血，得羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體的制備方法，其特征在 于，所述抗原表位的氨基酸序列為CMKEKNQAVKGDAPGKFK。4. 如權(quán)利要求1所述的羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，該抗 體可以用于山羊和綿羊的免疫組織化學(xué)、免疫熒光化學(xué)和Western Blotting檢測(cè)。5. 如權(quán)利要求4所述的羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，用 于免疫組織化學(xué)時(shí)濃度為1 : 50-200;用于細(xì)胞免疫熒光化學(xué)時(shí)，濃度為1 : 50-200;用于 Western blotting 時(shí)，濃度為 1 : 500-1000。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種羊抗兔視黃酸結(jié)合蛋白5多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用，上述所得抗體可以用于山羊和綿羊的免疫組織化學(xué)、免疫熒光化學(xué)和Western？Blotting檢測(cè)，用于免疫組織化學(xué)時(shí)濃度為1∶50-200；用于細(xì)胞免疫熒光化學(xué)時(shí)，濃度為1∶50-200；用于Western？blotting時(shí)，濃度為1∶500-1000。
【IPC分類(lèi)】C07K16/18, C07K16/06
【公開(kāi)號(hào)】CN105237635
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510744857
【發(fā)明人】張春香, 任有蛇, 郭麗娜, 劉文忠, 白元生, 師周戈, 趙宇瓊, 焦光月
【申請(qǐng)人】山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年10月31日