一種卵類黏蛋白兔多克隆抗體的制備方法及免疫分析方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于大分子蛋白免疫技術領域，尤其是涉及一種卵類黏蛋白兔多克隆抗體 的制備方法及免疫分析方法。
【背景技術】
[0002] 卵類黏蛋白由186個氨基酸組成，它的分子質量約為28DK，卵類黏蛋白含有3個獨 立的同源結構域，這三個功能域是一前一后連續(xù)排列的，并且是分子內的二硫鍵將各個功 能域連接起來的。卵類黏蛋白分子中含有9個分子內二硫鍵，此外還有20 %~25 %的糖基 組分，在三個區(qū)域中致敏性最強的則是第3區(qū)域。卵類黏蛋白在蛋清中的含量是最高的，致 敏性也是最強的。
[0003] 卵類黏蛋白中由于含有糖基組分，所以卵類黏蛋白的穩(wěn)定性最高，它對胰蛋白酶 的降解相當穩(wěn)定，此外對熱處理也相當穩(wěn)定。研宄發(fā)現(xiàn)，對雞蛋短暫的敏感性，與卵類黏蛋 白構象的決定基的IgE含量的有關。卵類黏蛋白是引起免疫反應的成分，當體內攝入卵類 黏蛋白后，血液中會產生更多的IgG與IgE來對抗它。現(xiàn)有的卵類黏蛋白抗體多為單克隆 抗體，對多克隆抗體的研宄較少，有必要研發(fā)一種多克隆抗體，以提高抗體的靈敏度以及特 異性。

【發(fā)明內容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種卵類黏蛋白兔多克隆抗體的制備方法及免疫分析 方法，以提高抗體的靈敏度以及特異性。
[0005] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的：
[0006] 一種卵類黏蛋白兔多克隆抗體的制備方法，包括免疫過程、抗體純化過程兩個步 驟；
[0007] 其中所述免疫過程中，免疫動物選擇兔子，免疫原為卵類黏蛋白，免疫方法采用皮 下和肌肉注射法，初次免疫后進行若干次加強免疫，免疫一周后采用股動脈取全血，進行保 存；所述抗體純化過程，是使用純化柱與蛋白純化儀實現(xiàn)的。
[0008] 優(yōu)選的，所述免疫過程中，初次免疫后進行四次加強免疫，加強免疫分別于初次免 疫后2周、4周和6周和8周，五次免疫一周后米用股動脈取全血，進行保存。
[0009] 優(yōu)選的，所述免疫過程具體包括如下步驟，
[0010] 1)初次免疫：免疫原與弗氏完全佐劑以1 :1的體積混合，經密封性良好的玻璃注 射器乳化充分，直到免疫原與佐劑完全混勻并呈乳白色狀態(tài)為止，免疫劑量為Img/只，進 行動物免疫；
[0011] 2)加強免疫：免疫原和弗氏不完全佐劑等體積混合乳化，進行動物免疫，免疫劑 量為0· 5mg/只；
[0012] 3)免疫完成時將采集到的血液先在37°C下凝固2h，然后保存于4°C冰箱中過夜， 使血塊收縮，上清液析出，取上清，-20 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0013] 優(yōu)選的，所述抗體純化過程，具體包括如下步驟：
[0014] 1)將實驗中所需的所有試劑超聲20分鐘，排除氣泡；
[0015] 2)平衡純化柱：首先用沖洗管路1-2h，選用的試劑為pH 7. 4的磷酸緩沖液，流速 0. 5-1. 5mL/min ;管路沖洗完畢后取純化柱，并將封柱用的一部分乙醇溶液慢慢倒出，留下 柱高度三分之一的乙醇溶液，目的是防止純化過程中將柱純干；將純化柱與蛋白純化儀連 接好，用pH 7. 4的磷酸緩沖液沖洗平衡柱子，流速設定為0. 5-1. 5mL/min ;觀察程序屏幕中 紫外和電導兩條基線為平行線時，即可停止沖柱，此過程大概一個小時左右。
[0016] 3)上樣：取0. 5-1. 5mL待純化的卵類黏蛋白兔多克隆抗體血清與磷酸緩沖液等體 積稀釋，流速設置為〇. 2-0. 8mL/min，然后將混合液上柱?？寡逯械拿庖咔虻鞍滋禺愋缘?吸附在Protein A - Sepharose 4B的結合位點上，而其他雜蛋白、脂肪等雜質不會被吸附， 會隨著緩沖液流出，此時純化儀紫外電導圖中會顯示出雜蛋白峰；
[0017] 4)洗脫：出現(xiàn)雜蛋白峰后，繼續(xù)用磷酸緩沖液沖洗柱子，至基線達到平衡后停 止；用pH 2. 7的甘氨酸-鹽酸緩沖液沖洗柱子，流速0.5-1. 5mL/min，此時與Protein A-Sepharose 4B結合的免疫球蛋白被洗脫下來；
[0018] 5)收集：加入洗脫液后，注意儀器紫外電導圖線的變化，當基線開始發(fā)生變化時 就開始收集洗脫液，每個安道管收集管收集〇. 5-1. 5mL液體，直至曲線不發(fā)生變化，停止收 集；收集液經分光光度計280nm處讀數(shù)，棄去吸光度值〈0. 4的收集液，將吸光度值>0. 4的 液體混勻后立即用Tris-HCl迅速調節(jié)抗體，使其pH至7. 0 ;
[0019] 6)處理純化柱：待抗體純化結束后，用0. 05-0. 2mol/L醋酸迅速沖洗柱子l-3min， 流速3-8mL/min，然后再用磷酸鹽緩沖液平衡柱子，流速l-8mL/min，同時用pH試紙測定 流出緩沖液的pH值，直到其顯示中性為止；最后用質量濃度為20 %乙醇溶液沖洗純化柱 20min，并使柱子中充滿20%乙醇溶液，封存于4°C冰箱中；
[0020] 7)抗體保存：將純化后的卵類黏蛋白抗體在4°C環(huán)境下透析三天，透析液為0.0 lM 的PBS溶液，透析液每天換三到四次，取出后與等體積的丙三醇混勻，分裝后于-20°C冰箱 中保存?zhèn)溆谩?br>[0021] 本發(fā)明還提供了一種使用如上所述的制備方法制備的卵類黏蛋白兔多克隆抗體 的免疫分析方法，包括如下步驟，
[0022] 1)包被：用包被液稀釋卵類黏蛋白標準溶液，將其包被于96孔聚苯乙烯的酶標板 中，100 μ L/孔，于4°C冰箱中孵育12-16h后棄去孔中液體，PBST洗液洗板3次，每2分鐘 一次；
[0023] 2)封閉：每孔加入200 μ 1、0. 5%脫脂乳粉作為封閉液，于37°C烘箱中封閉lh，取 出棄去封閉液，PBST洗液洗板3次，每2分鐘一次；
[0024] 3)加樣：每孔加入50 μ L卵類黏蛋白標準溶液，再加入50 μ L卵類黏蛋白兔多克 隆抗體，于37°C烘箱中競爭反應lh，取出用PBST洗液洗板4次，每2分鐘一次。
[0025] 4)加酶標二抗：辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗用PBS緩沖液稀釋10000倍， 100 μ L/孔加入酶標板中，37°C烘箱反應30min，PBST洗液洗板4次，每分鐘一次。
[0026] 5)顯色：需提前15min將底物A放于底物槽中，總共洗板5次，第四次后加入底物 B，混勻；每孔中加入100 μ L，于37°C烘箱中顯色約15-20min。
[0027] 6)終止：在每孔中加50 μ L終止液終止反應；
[0028] 7)讀數(shù)：用酶標儀讀取吸光度值，采用450-650nm雙波長方式。
[0029] 8)繪制標準曲線：抑制率曲線圖的X軸為卵類黏蛋白濃度值，Y軸為相應的抑制 率，標準曲線是典型的S型曲線，IC50定義為抑制率為50%時對應的卵類黏蛋白濃度；
[0030] 進一步，以上使用的溶液配方如下：
[0031 ] 包被液：0. 05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH為9. 6 :分別準確稱取 Na2CO3L 60g，NaHC032. 91g，然后加雙蒸水定容至lOOOmL，最后調pH至9. 6。
[0032] 底物體系溶液（TMB-過氧化氫脲溶液）
[0033] 底物液A :準確稱取無水醋酸鈉8. 20g，β -糊精2. 50g，溶解于1000 mL的雙蒸水 中，然后準確稱檸檬酸3. 23g調節(jié)pH至5. 0,待所有藥品完全溶解后，準確稱取過氧化氫脲 428. 6mg，并將其加入已配制好的溶液中。于4°C冰箱中保存，使用時需提前15min取出，待 恢復至室溫方可使用。
[0034] 底物液B :準確稱取IOOmg TMB溶解于IOmL DMSO中，在常溫保存，并存放于棕色 瓶暗處。
[0035] 底物液A和底物液B在使用前需混合均勻：分別取14. 60mL底物A溶液和0. 45mL 底物B溶液。
[0036] 終止液：I. 25mol/L 的 H2SO4溶液。
[0037] 相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明所述的卵類黏蛋白兔多克隆抗體的制備方法及免疫分析 方法，具有以下優(yōu)勢：
[0038] (1)通過本發(fā)明所述的卵類黏蛋白兔多克隆抗體的制備方法制備的抗體效價高， 抑制率較好；
[0039] (2)通過本發(fā)明所述的卵類黏蛋白兔多克隆抗體的制備方法制備的抗體具有較好 的靈敏度，IC50 達到 649. 13±35. Ing/mL ;
[0040] (3)本